DE2506260A1

DE2506260A1 - Verfahren zum entfernen pyrogenen materials aus waessrigen loesungen

Info

Publication number: DE2506260A1
Application number: DE19752506260
Authority: DE
Inventors: Roy Walter Grabner
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1974-02-15
Filing date: 1975-02-14
Publication date: 1975-08-21
Also published as: FR2261048A1; CH610760A5; FR2261048B1; JPS5919088B2; JPS50116681A; GB1479851A; US3897309A; NL7500983A

Description

Patentanwälte

Dr. Ing. Waiter Abitz

Dr. Dietor F. Morf '..," , *■■*'■"

Dr. rians-A. Urauns -

8 München oo, i-.-fu.Ji.^uarstr. 28 155/8-

MERCK & CO., INC.

126 East Lincoln Avenue, Rahway, New Jersey 07065,

V.St.A.

Verfahren zum Entfernen pyrogenen Materials aus

wässrigen Lösungen

Die L-Asparaginase ist ein bekanntes Enzym, bei dem die Befähigung erkannt worden ist., die Hydrolyse von Asparagin zu' Asparaginsäure und Ammoniak zu katalysieren. Es hat sich auf diese Veise als sehr vielversprechend als Mittel gegen Tumore erwiesen, die für ihr Wachstum Asparagin benötigen. L-Asparaginase ist generell mikrobiologisch unter Verwendung von Stämmen von Escherichia coli synthetisiert worden. Beim Freisetzen der intrazellularen L-Asparaginase aus Fermentationsgemischen tritt jedoch auch eine Freisetzung wesentlicher Mengen an Endotoxinen oder Pyrogenen aus den E.-coli-Zellen ein. Diese wie auch andere Pyrogene, deren Einführung sich aus Fermentationsmedien oder auf Grund nichtkeimfreier Ar-

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beitsvorgänge ergeben kann, sind aus gereinigter L-Asparaginase schwer zu entfernen, und wenn sie (selbst in Spurenmengen neben L-Asparaginase) zur Verabreichung gelangen, sind beim Patienten gewisse toxische Erscheinungen festzustellen. Untersuchungen auf diesem Gebiet haben zum Ziel gehabt, eine wirksame Methode zum Entfernen dieser Pyrogene aus L-Asparaginase und anderen Enzymen und injektionsfähigen Produkten zu finden, um toxische Nebeneffekte zu minimieren.

Das Verfahren nach US-PS 3 634- 196 sieht eine Entfernung von Spurenpyrogenen aus L-Asparaginase unter Verwendung einer Säule von Tiäthylaminoäthyldextrangel und eines schwach ionischen Puffers vor. Durch Anwendung dieses Verfahrens ist eine L-Asparaginase erhalten worden, die bei einem USP-Kaninchenpyrogentest an Kaninchen bei 200 Einheiten Enzym/kg Tiergewicht einen Temperaturanstieg von 0,48° C ergab.

Im Hinblick auf in der modernen Praxis eingetretene Erhöhungen der' L-Asparaginase-Dosierungen hat sich jedoch gezeigt, dass L-Asparaginase, die dem USP-Kaninchenpyrogentest bei 200 Einheiten/kg genügt, noch gewisse toxische Erscheinungen auf Grund der in ihr verbliebenen Pyrogene herbeiführt. In der Folge ist die Minimaldosierung, bei welcher L-Asparaginase dem USP-Kaninchenpyrogentest genügen muss, auf 1000 Einheiten/ kg erhöht worden, und das Enzym muss auch dem Limuluslysattest bei 2500 Einheiten/ml genügen. Auf diese Weise hat sich die Suche nach einem Prozess fortgesetzt, der es erlauben würde, dieser Testanforderung zu genügen oder sie zu übertreffen, und ein für Arbeiten im praktischen Massstab sichereres Produkt liefert. Darüberhinaus hat sich die Forschung auf Versuche erstreckt, das Verfahren so zu erweitern, dass pyrogenes Material auch aus anderen wässrigen Lösungen als L-Asparaginase-Lösungen entfernt werden kann. Auf diese Weise wird eine Behandlung anderer Enzyme und anderer zur Injektion vorgesehener Produkte zwecks Befreiung derselben von pyrogenem Material möglich.

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Mt der vorliegenden Erfindung ist erreicht worden, sowohl einen speziellen Proze'ss zur Entfernung von Pyrogenen aus L-Asparaginase als auch einen generellen Prozess zur Entfernung pyrogenen Materials aus anderen wässrigen Lösungen als L-Asparaginase-Lösungen verfügbar zu haben.

Die Erfindung ermöglicht die Entfernung von Spurenpyrogenen aus wässrigen Lösungen und erlaubt die Entfernung von Pyrogenen aus wässrigen Lösungen von Enzymen und auch L-Asparaginase. Sie gestattet eine Entfernung von Spurenmengen an Pyrogenen aus L-Asparaginase in einem solchen Grad, dass die anfallende, gereinigte L-Asparaginase die Forderung des USP-Kaninchenpyrogentestes (nachfolgend kurz: Kaninchentest) für 1000 Einheiten/kg und der Limuluslysatbewertung für 2500 Einheiten/ml übertrifft. Die Erfindung ermöglicht eine selektive Adsorption der Spurenpyrogene aus einer Lösung von L-Asparaginase, insbesondere auf einer Säule basischen Anionenaustauschharzes durch Auflösen der unreinen L-Asparaginase in einer Lösung hoher lonenstärke (Ionic Strength). Weitere Vorteile und Zweckangaben der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.

Nach dem Verfahren der US-PS 3 6J4 196 wird L-Asparaginase, die Anteile an Pyrogenen enthält, mit einer schwach ionischen Pufferlösung (0,024-m) behandelt und durch eine Säule von Diäthylaminoäthylsephadexdextrangel geleitet. Während dieses Prozesses wird die L-Asparaginase auf dem Dextrangel adsorbiert und die Säule dann, unter Anwendung eines Konzentrationsgradienten der gleichen schwach ionischen Pufferlösung eluiert, um die Pyrogene von dem Enzym zu trennen. Dieser bekannte Prozess ist jedoch nicht genügend selektiv, um genügend Pyrogene zu entfernen, damit dem Kaninchentest bei dem neu geforderten Wert von 1000 Einheiten/kg genügt wird. Darüberhinaus ist der Prozess kapazitätsmässig beschränkt, da er nur kleine Mengen des Enzyms liefert.

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Der Kaninchentest sieht drei Kaninchen vor, die bei Verabreichung eines Mittels auf Grund des Vorliegens von pyrogenem Material bei jedem einzelnen Tier einen Temperaturanstieg von unter 0,6° C zeigen, wobei die Summe der Temperaturanstiege bei allen drei Kaninchen 1,4° C nicht übersteigen darf.

Eine andere zur spezifischen Bestimmung des Vorliegens von Endotoxin angewandte Testmethode stellt die Limuluslysatbewertung dar, deren Bewertungsreagens aus dem Lysat der sich im Kreislauf bewegenden, amöbenförmigen Zellen des Blutes von Limulus polyphemus (Königskrabbe) besteht. Das Lysatreagens wird (neben zweckentsprechenden Kontrollproben) mit der Testprobe vereinigt und 1/2 bis 1 Stunde bei 37° C inkubiert. Wenn irgendwelches Endotoxin vorliegt, bildet die Testlösung ein Gel. Der Test gilt allgemein als für Endotoxine empfindlicher als der Kaninchentest und findet im Laboratorium Anwendung wegen seiner Schnelligkeit, der geringen benötigten Menge an Testmaterial (0,1 ml), der spezifischen Natur der Bewertung in Bezug auf Endotoxine und der Einfachheit der Bewertung, die keine Spezialeinrichtung erfordert. Einen Vergleich der Arbeitsweisen und Ergebnisse beim Kaninchentest und bei der Limuluslysatbewertung findet sich im Journal of Laboratory & Clinical Medicine, Vol. 78, S. 38 bis 48 (197I).

Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass Pyrogene aus ihren wässrigen Lösungen entfernbar'sind, indem man die wässrige Lösung von hoher Ionenstärke durch ein basisches Anionenaustauschharz leitet. Die Pyrogene werden auf dem basischen Anionenaustauschharz irreversibel adsorbiert; die pyrogenfreie, wässrige Lösung wird von der Säule verdrängt. Der pH-Wert der Lösung wird durch Verwendung zweckentsprechender Mineralsäuren oder Alkali- oder Erdalkalihydroxide, -carbonate oder -bicarbonate auf 6,0 bis 10,0 gehalten.

Speziell hat sich gezeigt, dass beim Auflösen unreiner L-Asparaginase in einer stark ionischen Pufferlösung und Hindurchleiten durch eine Säule eines basischen Anionenaustausch-

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harzes die Pyrogene einer selektiven und irreversiblen Adsorption auf dem Anionenaustauschharz unterliegen, während die (von Pyrogenen freie) L-Asparaginase-Lösung die Säule passiert. Auf diese Weise ist L-Asparaginase gewinnbar, die den Anforderungen des Kaninchentests bei 1000 Einheiten/kg und der Limuluslysatbewertung bei 2500 Einheiten/ml genügt und diese übertrifft.

Bei der Durchführung einer Ausführungsform der Erfindung wird L-Asparaginase, die Spurenmengen an Pyrogenen enthält, in einer Pufferlösung hoher Ionenstärke (0,1- bis 0,2m) gelöst. Vorzugsweise arbeitet man mit einer Konzentration von 0,11- bis 0,14m, wobei die besonders bevorzugte Konzentration 0,12m beträgt. Darüberhinaus kann man ein Sterilisiermittel, wie Formaldehyd, hinzugeben, um das Gel vorzubehandeln und auf diese Weise die Keimfreiheit des chromatographischen Systems zu bewahren. Zur Bildung der Lösung hoher Ionenstärke für die Zwecke der Erfindung kann jedes Standardpuffermittel oder -salz Verwendung finden. Beispielhafte Puffer und Salze sind 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol (TRIS-Puffer), Alkali- und Erdalkalicarbonate, -bicarbonate oder -phosphat, Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, -acetat, -formiat und dergleichen, Alkali- und Erdalkalichiοride und dergleichen. Als Anion des Puffers wird das Phosphation bevorzugt. Im allgemeinen wird man mit Kaliumdihydrogenphosphat arbeiten. Zur Sicherstellung der Stabilität des Enzyms wird der pH-Wert der Pufferlösung sorgfältig überwacht und auf 7,0 bis 7i5 gehalten. Wenn erforderlich, können verdünnte Mineralsäuren oder Alkali- oder Erdalkalihydroxide zugesetzt werden, um den pH-Wert in diesem Bereich zu halten. Die L-Asparaginase wird in einer Pufferlösung im Rahmen der obigen Bedingungen gelost und durch eine Säule eines basischen Anionenaustauschharzes geleitet. Im Rahmen der obigen Konzentration werden die Pyrogene auf dem basischen Anionenaustauschharz selektiv adsorbiert, was zu pyrogenfreier L-Asparaginase führt.

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• - ί.

Bei der Durchführung der Erfindung können verschiedene basisehe Anionenaustauschharze mit einem Grundgerüst von natürlichem oder künstlichem Polymerem und mit an diesem substituierten basischen Gruppen des Quartärammoniums- oder Amintyps Verwendung finden. Beispielhafte Anionenaustauschharze sind Whatman DE-52, Amberlite IRA-938, Dowex 1x2, Sephadex DEAE-A-25 und Sephadex DEAE-A-50. Whatman DE-52 ist ein mikrogranuläres Celluloseharz, das mit Diäthylaminoäthylgruppen substituiert ist (Herstellerin die W & R Baiston Ltd., Maidstone, Kent, England). Amberlite IRA-938 ist ein Polystyrol-Di vinylbenz ο 1-Har ζ mit Trimethylammoniumgruppen-Substitution (Produkt der Rohm and Haas Co., Philadelphia, Pa., V.St.A.). Dowex 1x2 ist ein Polystyrol-Divinylbenzol-Harz mit Trimethylbenzylammoniuingruppen-Substitution (Produkt der Dow Chemical Co., Midland, Michigan, V.St.A.). Sephadex DEAE A-25 und DEAE A-50 sind Dextrangele mit Diäthylaminoäthylgruppen-Substitution (Produkt der Akteibolaget Pharmacia, Uppsala, Schweden).

Das Verfahren gemäss der Erfindung bietet den weiteren Vorteil gegenüber dem Stand der Technik, dass man hochkonzentrierte, wässrige pyrogenhaltige Lösungen durch kurze Säulen (mit einem Verhältnis der Höhe zum Durchmesser von bis zu etwa 1:1) führen und dabei gleich gute Ergebnisse wie bei stärker verdünnten Lösungen erhalten kann. Im !Falle der L-Asparaginase können Lösungen mit einer Konzentration von bis zu etwa 5 % Verwendung finden. Dies ist für technische Zwecke wichtig, da man eine hohe Produktivität und pyrogenfreie Lösungen bei maximalen Strömungsgeschwindigkeiten erhält.

Zur Durchführung des Verfahrens vereinigt man das basische Anionenaustauschharz mit der Pufferlösung hoher Ionenstärke, die, wenn notwendig, auf den richtigen pH-Wert eingestellt wird, und lässt das Harz ins Gleichgewicht kommen. Dann wird das Anionenaustauschharz in die Säule überführt und gepackt und mit der Pufferlösung gewaschen. Hierauf wird die wässrige

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Lösung der zu reinigenden Substanz, wie L-Asparaginase, in dem gleichen Phosphatpuffer mit einer Geschwindigkeit von 1 bis 8 ml/]
geleitet.

bis 8 ml/Stunde je cm Säulenquerschnitt durch die Säule

Da das Enzym nicht auf dem Gel adsorbiert wird, ist es unnötig, die Säule - wie überwiegend beim Stand der Technik unter Anwendung eines Salzkonzentrationsgradienten zu eluieren. Die Pyrogene unterliegen in Pufferlösungen hoher Ionenstärke einer irreversiblen Adsorption auf der Säule, und man braucht lediglich die Einzelkonzentration des Eluierungsmittels anzuwenden, um die pyrogenfreie Lösung von der Säule zu verdrängen.

Nach dem Abnehmen der wässrigen, pyrogenfreien Lösung von der Säule wird die zu reinigende Substanz aus der Pufferlösung nach an sich bekannten Techniken isoliert.

Als Ergebnis der Entfernung der Pyrogene aus der wässrigen Lösung vermittels des Verfahrens gemäss der Erfindung wird eine allgemeine Erhöhung der Einheit der aus der Pufferlösung isolierten Substanz erhalten. Im Falle von L-Asparaginase können in die Säule Enzyme mit einer Reinheit von über 20 Einheiten/mg Protein eingeführt werden. Von der Säule ist L-Asparaginase mit bis zu etwa 4-50 Einheiten/mg verdrängbar. Im allgemeinen ist der Einsatz des Verfahrens gemäss der Erfindung als Schlussstufe bei der Reinigung von L-Asparaginase zu bevorzugen, bei welcher die Enzymbeschickung der Säule schon in einem wesentlichen Grade gereinigt (etwa 200 Einheiten/mg Protein oder mehr) und die einzige vorliegende Verunreinigung das pyrogene. Material ist. Bei einer solchen Arbeitsweise ist das von der Säule extrahierte Enzym genügend von Pyrogenen frei, damit das getrocknete Produkt dann in der Krebs-Chemotherapie einsetzbar ist, wobei sich, wenn überhaupt, nur sehr geringe toxische Erscheinungen einstellen.

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Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne dass diese auf sie beschränkt ist.

Beispiel 1

292 g Diäthylaminoäthyl-Sephadex-A-50-Dextrangel (bezogen von der Akteibolaget Pharmacia, Uppsala, Schweden) wurden in 16 0,12m Phosphatpuffer (Katriumdihydrogenphosphat) bei pH 7>2 ins Gleichgewicht gebracht. Das Harz wurde in eine Säule von 15 cm Durchmesser aus hartem Geräteglas (Pyrex) übergeführt und gepackt und mit 0,12m Phosphatpuffer bei pH 7>2 gewaschen. Das von der Säule abströmende Gut erwies sich bei der Limuluslysatbewertung auf Endotoxine als von Endotoxin-Verunreinigung en frei. Das Volumen des gepackten Harzes betrug 4800 ml bei einem Verhältnis von Höhe zu Durchmesser von 1,8 : 1.

4000 ml wässrige L-Asparaginase-Beschickungslösung (10 930 Einheiten/ml; 271 Einheiten/mg Protein) wurden durch Zugabe konzentrierter Phosphat- (in Form von Natriumdihydrogenphosphat) und verdünnter Natriumhydroxidlösungen auf 0,12m an Phosphat und pH 7»2 eingestellt. Die gepufferte L-Asparaginase-Lösung wurde der Harzsäule zugeführt und mit 0,12m Puffer eluiert. Nach Sammlung eines Vorlaufs von 3900 ml war in dem von der Säule abströmenden Gut L-Asparaginase festzustellen. Hierauf wurden an L-Asparaginase reiche Fraktionen gesammelt und auf Asparaginase-Aktivität und Endotoxin-Verunreinigungen nach dem Limuluslysattest bewertet.

Die L-asparaginasereichen Fraktionen wurden zusammengegeben, mit verdünnter Essigsäure auf pH 5>1 eingestellt und mit Äthanol gefällt. Die Aufschlämmung wurde geschleudert und das Feststoffgut in 0,01m Natriumphosphat-Puffer gelöst und mit verdünnter Natronlauge auf pH 7»4 eingestellt. Die trübe L-Asparaginase-Lösung (9400 Einheiten/ml) enthielt 73 % der Beschickungsaktivität und hatte eine spezifische Aktivität von 285 Einheiten/mg Protein. Die Lösung wurde hierauf durch Filtration durch ein 0,22-Mkron-Filter geklärt und keimfrei gemacht .

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Die Säulenbeschickung und die geklärte L-Asparaginase-Lösung wurden dann nach dem Kaninchentest bei einer Dosis von 1000 Einheiten/kg bewertet, wobei sich bei den drei Kaninchen 'durchschnittliche Temperaturanstiege von 0,73 bzw. 0,13° C _f ergaben. Die geklärte L-Asparaginase-Lösung genügte somit den Spezifikationen des Kaninchentests mit Leichtigkeit. Darüberhinaus waren bei der Limuluslysatbewertung bei einer Konzentration von 2500 Einheiten/ml keinerlei Endotoxine festzustellen (keine Gelbildung in 60 Minuten), während die Beschickungslösung bei einer Konzentration von~100 Einheiten/ml positiv war (Gelbildung in 20 Minuten).

Beispiel 2

300 g Diäthylaminoäthyl-Sephadex-A-50-Harz wurden in 17 1 O,12m Phosphatpuffer mit einem Gehalt von etwa 0,5 % ao. Formaldehyd (zur Aufrechterhaltung der Harz-Keimfreiheit) bei pH 7»4 ins Gleichgewicht gebracht. Die Harz aufschlämmung wurde 20 Stunden bewegt und dann mit 0,12m Phosphatpuffer in eine Säule von 15 cm Durchmesser gepackt und eingewaschen. Alle Arbeiten wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Harzbett hatte ein Volumen von 6800 ml bei einem Verhältnis von Höhe zu Durchmesser von 2,2 : 1. 5500 ml L-Asparaginase-Beschickungslösung (12 3OO Einheiten/ml; 385 Einheiten/mg) wurden auf 0,11m an Phosphat und mit Kalilauge (0,1 n) auf einen pH-Wert von 7>4 eingestellt. Die L-Asparaginase wurde von der Säule mit 0,12m Phosphatpuffer bei pH 71^· verdrängt. Nach einem Vorlauf von 6000 ml, der verworfen wurde, wurden L-asparaginreiche Fraktionen von jeweils etwa 1 1 (insgesamt 8 Fraktionen) gesammelt, die zusammengegeben, auf pH 5»1 eingestellt und mit Äthanol kristallisiert wurden. Die enzymreichen Fraktionen zeigten bei der Limuluslysatbewertung keine Endotoxine (keine Gelbildung in 60 Minuten). Die Aufschlämmung wurde geschleudert, um die Feststoffe zu sammeln, von denen 54-8 g in 0,01m Phosphatpuffer gelöst und mit 0,1 η Natronlauge auf pH 7v3 eingestellt wurden. Die Entfernung ungelöster Feststoffe durch

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Schleudern ergab eine Lösung (10 600 Einheiten/ml; 409 Einheiten/mg Protein), die 92 % der ursprünglichen L-Asparaginase-Aktivität aufwies. Diese Lösung zeigte bei der Limuluslysatbewertung bei 10 000 Einheiten/ml nach 60 Minuten keine GeI-bildung. Die Lösung wurde durch Filtrieren durch ein 0,22-Mikron-Filter weiter geklärt und sterilisiert.

Die Säulenbeschickung, die zusammengegebenen Fraktionen und die geklärten Lösungen wurden im Eaninchentest bei einer Dosierung von 1000 Einheiten/kg auf Pyrogene bewertet, wobei sich bei drei Kaninchen ein durchschnittlicher Temperaturanstieg von 1,07, 0,20 bzw. 0,10° C ergab. Die geklärte L-Asparaginase-Lösung wurde auch bei 8000 Einheiten/kg geprüft, wobei sich bei drei Kaninchen ein durchschnittlicher Temperaturanstieg von 0,5° C ergab. Bei der Limuluslysatbewertung war bei der geklärten Lösung bei einer Konzentration von 2500 Einheiten/ml keinerlei Endotoxin-Aktivität festzustellen (keine Gelbildung in 60 Minuten).

Beispiel $

Pyrogenhaltiges Leitungswasser (durchschnittlicher Temperaturanstieg je Kaninchen 1,5° C), das auf die Limululysatbewertung stark positiv ansprach (Gelbildung bei Verdünnung 1 : 100 in 10 Minuten), wurde auf 0,12m an Kaliumphosphat und mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt. Aliquote Anteile der Lösung wurden über verschiedene, in dem gleichen Puffer bei pH 8,0 ins Gleichgewicht gebrachte anionische Harze (Dowex 1x2, Amberlite lRA-938, Sephadex DEAE-A 25) geleitet. Durch jede Säule wurde Wasser in einer 20 Bett-Volumina entsprechenden Menge geleitet; die Säuleneffluate wurden getrennt zusammengegeben.Die zusammengegebenen Säuleneffluate wie auch nach Beschickung mit 20 Bett-Volumina gesammelte Säuleneffluat-Proben waren bei der Limuluslysatbewertung negativ (keine Gelbildung in 60 Minuten). Bei Prüfung der zusammengegebenen Effluate auf Pyrogene im Kaninchentest genügten diese den Test-Spezifikationen mit durchschnittlichen Temperaturanstiegen-

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von 0,3» 0,1 und 0,2° C/Kaninchen im Falle des Amberlite IRa-938, Sephadex DEAE-A25 und. Dowex 1x2.

Beispiel 4 .

Unter Verwendung pyrogenhaltigen Leitungswassers wurde 0,12m Katriumphosphat-Puffer von pH 7»4- angesetzt. Dieser pyrogenhaltige Puffer wurde über in dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebrachte Harze (Dowex 1x2, Whatman DE-52 und Sephadex DEAE-A 25) geleitet, wobei durch Jede Säule eine 10 Bett-Volumina an Puffer geschickt und die Säuleneffluate gesammelt wurden. Alle zusammengegebenen Effluate waren bei der Limuluslysatbewertung negativ (keine Gelbildung in 10 Minuten) und genügten den Kaninchentest-Spezifikationen mit einem durchschnittlichen Temperaturanstieg von 0,2, 0,2 und 0,1° C/Kaninchen bei den drei Harzen in der obengenannten Reihenfolge.

Beispiel 5

Zur Herstellung einer pyrogenhaltigen Lösung wurde eine E.-coli-Standardendotoxinpräparation (Mallinkrodt Chemical Works, St. Louis, Mo., V.St.A.) in pyrogenfreiem Wasser gelöst. Das E.-coli-Standardendotoxin wurde auf eine Konzentration von 10 mg/ml verdünnt. Die Lösung erwies sich im Kaninchentest als stark pyrogenhaltig (Temperaturanstieg Je Kaninchen bei einer Testverdünnung von 1 : 1000 1,2° C) und ergab bei dem Limuluslysattest eine starke Reaktion (Gelbildung bei Verdünnung 1 : 1000 in 10 Minuten). Die Lösung wurde auf 0,12m an Kaliumphosphat und mit Kaliumhydroxid auf einen pH-Wert von 7>2- eingestellt. Aliquote Anteile der Endotoxinlösung wurden durch Harzsäulen (Sephadex DEAE-A 50, Dowex 1x2 und Whatman DE-52) geleitet, die in 0,12m Kaliumphosphat-Puffer bei pH 7i2 ins Gleichgewicht gebracht worden waren. Die Säulenef fluate wurden mittels Limuluslysatbewertung auf Jegliches Durchbrechen von Endotoxinen überwacht, wobei sich die Säulenef fluate bei 12, 5 und 8 Bett-Volumina bei den drei Harzen

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in der obengenannten Reihenfolge als negativ erwiesen (keine Gelbildung in 10 Minuten). Auch Prüfungen nach dem Kaninchentest bei einer Verdünnung von 1 : 10 zur Herabsetzung der Puffer-Konzentration zeigten die Entfernung von pyrogenen Stoffen; die zusammengegebenen Effluate genügten den Test-Spezifikationen mit durchschnittlichem Temperaturanstieg von 0,2, 0,4 bzw. 0,3° C.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Entfernen pyrogenen Materials aus wässrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Ionen- « stärke der wässrigen Lösung auf etwa 0,1- bis 0,2m bei einem pH-Wert von 6 bis 10 einstellt und die eingestellte, wässrige Lösung durch eine Säule basischen lonenaustauschharzes leitet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die wässrige Lösung mit einem Phosphatpuffer auf eine Ionenstärke von 0,1- bis 0,2m einstellt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die wässrige Lösung mit Alkali- oder Erdalkaliphosphatpuffer auf einen Ionenstärke von 0,1 bis 0,2* einstellt.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, dass man die wässrige Lösung auf eine Ionenstärke von 0,11- bis 0,14m einstellt.

5· Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die wässrige Lösung auf eine Ionenstärke von etwa 0,12m einstellt.

6. Verfahren zum Abtrennen pyrogenen Materials von L-Asparaginase, dadurch gekennzeichnet, dass man das Enzym in einer Pufferlösung mit einer Icnenstärke von 0,1- bis 0,2m bei einem pH-Wert von 7>0 bis 7,5 löst, die Enzymlösung durch eine Säule Diäthylaminoäthyldextrangel, mit der Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht, leitet und die L-Asparaginase von der Säule mit der Pufferlösung eluiert.

7« Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass

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man als Pufferlösung hoher Ionenstärke eine 0,1- bis 0,2m Phosphatpufferlösung verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7> dadurch gekennzeichnet, dass man als Pufferlösung hoher Ionenstärke eine 0,11-bis 0,14m Phosphatpufferlösung verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man als Pufferlösung hoher Ionenstärke eine 0,12m Phosphatpufferlösung verwendet.

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