DE2424118A1

DE2424118A1 - Verfahren zur herstellung von hochreinem kallikrein

Info

Publication number: DE2424118A1
Application number: DE2424118A
Authority: DE
Inventors: Kazuo Kato; Michinori Koyama; Hiroshi Miyazaki
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1973-05-17
Filing date: 1974-05-17
Publication date: 1974-12-05
Also published as: DE2424118B2; JPS505515A; US3929757A; FR2229707B1; GB1419929A; FR2229707A1; JPS5544726B2; CA1030088A

Description

"Verfahren zur Herstellung von hochreinem Kallikrein"

Priorität: 17. Mai 1975, Japan, Nr. 54- 136/1973

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von hochreinem Kallikrein.

Kallikrein, ein Protein mit telangiektatischer Wirkung, wird aus dem Pankreas der Submaxillarisdrüse, dem Urin oder Blut von Säugetieren gewonnen. Es wird zur Behandlung von Kreislaufstörungen verwendet. Im allgemeinen wird es dabei injiziert oder oral verabreicht.

Bei Arzneipräparaten, die direkt durch Injektion verabfolgt werden, kommt es stark auf die Reinheit an. Deshalb sollen diese Präparate keine Beimischungen von Verunreinigungen enthalten.

Da Kallikrein jedoch aus Tierorganen gewonnen itfird, ist es sohwie·

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^™ a ™*

rig, das aktive Protein von anderen unerwünschten Proteinen, die

vollständig dem Kallikrein in verschiedenen Eigenschaften ähnlich sind ,/zu trennen. Bei Inn'ektionspräparaten, die zu therapeutischen Zwecken längere Zeit verabfolgt werden, führen diese Fremdproteine zu ernsthaften Nebenwirkungen, beispielsweise zu Antigen-Antikörper-Reaktionen. Demgemäß wurden verschiedene Verfahren zur Reinigung von Kallikrein vorgeschlagen.

Im Verlauf der Untersuchungen, die zur vorliegenden Erfindung

führten, wurde versucht, rohe Kallikreinpräparate, die nach begemäß
kannten Verfahren, beispielsweise/den JA-PSn I30 506 und 4-04- 256 hergestellt worden waren, von ihren Verunreinigungen zu trennen. Insbesondere wurden von rohem Kallikrein elektrophoretisch unter. Verwendung von Cellulosegel-Folien, die aus reinem Celluloseacetat mit feiner Porenstruktur bestehen, verschiedene Komponenten abgetrennt. Diese Komponenten wurden auf ihre pharmakologische Wirksamkeit untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß bei der-Elektrophorese an Cellulosegel-Folien eine wirksame Komponente (im folgenden mit "A" bezeichnet) am weitesten zur Anode wandert.

Diese wirksame Komponente hat einen ähnlichen R -Wert, wie

menschliches Serumalbumin. Weitere drei Komponenten, im folgenden mit "B", "C" und "D" bezeichnet, befinden sich zwischen der Komponente "A" und der Auf setz stelle. Eine Komponente "E^If bleibt

stelle ^zu** Kathode v/ändernde

an der Auf setz/. Schließlich gibt es eine/Komponente "F" mit

einem R -Wert ähnlich dem von Trypsin. Die letztgenannten Komponenten sind Fremdproteine, die nicht die pharmakologische Wirkung von Kallikrein aufweisen.

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-Ferner wurde festgestellt, daß bei der Anfärbung mit dem Dinati^msalz von 1-Pseudocumylazo-2-naphthol-3,6-disulfonsäure (Rot Nr., 502, Ponceau 3R) zur Bestimmung der Proteinmengen unter Verwendung eines Densitometers die Gesamtmenge der Fremdproteine B, C, D, E und F ein Mehrfaches des Proteins A beträgt; vgl. Fig.1.

Es ist also nach den herkömmlichen Verfahren unmöglich, die wirksame Komponente von Kallikrein abzutrennen und zu: reinigen. Bai Anwendung des vorgenannten analytischen Verfahrens auf handelsübliche Präparate, die eine Kallikreinwirkung oder eine ähnliche Wirkung aufweisen, wurde festgestellt, daß sämtliche Präparate die Proteine B, C, D und E und gelegentlich auch den Bestandteil F als Verunreinigung enthalten. Dies zeigt, wie schwierig es ist., im großtechnischen Maßstab die pharmakologisch unwirksamen Fremdproteine aus den Kallikreinpräparaten zu entfernen. .

Die herkömmlichen Verfahren weisen außer den vorgenannten Nachteilen noch weitere Schwierigkeiten auf. So hat das Verfahren der JA-PS I30 506, bei dem das Kallikrein mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel gefällt wird, das Ziel, Proteine von Lipiden zu trennen. Dieses Verfahren ist jedoch nicht in der Lage, die' wirksamen Proteinbestandteile von Fremdproteinen zu trennen. Demgemäß spielt dieses Verfahren lediglich eine Rolle bei der Vorbehandlung. Dabei besteht jedoch die Gefahr der Denaturierung von Proteinen durch das organische Lösungsmittel, wodurch die pharmakologische Aktivität von Kallikrein verringert wird..

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Die JA-PS 404 256 "beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von Kailikrein unter Verwendung von Cellulose mit basischen Substituen-Autolysate von Tierorganen und/oder menschlichem Urin, die große Mengen an Verunreinigungen enthalten, direkt auf das Celluloseharz aufbringen. Deshalb ist es erforderlich, das Autolysat und den Urin einer Vorbehandlung zu unterziehen. Ferner läßt das Celluloseharz in Bezug auf seine physikalischen Eigenschaften (.Zähigkeit) zu wünschen übrig, so daß es nicht mehrmals verwendet werden kann. Außerdem bildet das Celluloseharz leicht Zusammenballungen mit festen Bestandteilen des Autolysats oder des menschlichen Urins, die in Extrakten.aufgrund ihrer geringen Teilchengröße auftreten. Durch diese Zusammenballungen wird die Elution stark erschwert und es kommt zu Verstopfungen. Aus diesem Grunde läßt sich das vorgenannte Verfahren nicht zur großtechnischen Kallikreinherstellung anwenden.

Es wurden also umfangreiche Untersuchungen durchgeführt, um ein Verfahren zur Herstellung von hochreinem Kallikrein zur Verfügung zu stellen, bei dem die vorgenannten Schwierigkeiten vermieden werden und bei dem sich hochreines Kallikrein in großtechnischem Maßstab unter geringen Kosten herstellen läßt. Dabei ■ wurden verschiedene Ionenaustauscherharze, die sich durch gute Beständigkeit, geringen Preis und leichte Handhabbarkeit auszeichnen, auf ihre Eignung zur selektiven Adsorption und Elution von Kallikrein und dementsprechend zur Abtrennung der vorgenannten Verunreinigungen untersucht. Beispielsweise wurde bei Verwen-. dung eines Autolysats von Schweinepankreas als Ausgangsmaterial L _l

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— ρ —

und Amberlite IR 45 (basisches Harz auf Polystyrolgrundlage vom Poly.amintyp) als Ionenaustauscherharz ein Verlust von 13 Prozent der Gesamtmenge der wirksamen Komponente während der Adsorption und während des Waschens festgestellt. Ferner konnte die adsorbierte Substanz nach Elution mit einem Elutionsmittel in einer Menge von nur 55 Prozent der eingesetzten Gesamtmenge erhalten werden. Dabei waren die Komponenten B, C, D, E und F als Verunreinigungen enthalten.

Bei der Verwendung von Dowex 44 (poröses Harz mit tertiären Amingruppen als Ionenaustauschergruppen) wurden 73 Prozent der Gesamtmenge der wirksamen Komponente während der Adsorption und während des Waschens verloren. Bei Verwendung von Diaion WA 21, einem makroporösen Harz mit primären und sekundären Amingruppen,. betrug der Verlust bei der Adsorption und beim Waschen lediglich 2 Prozent der Gesamtmenge. Jedoch konnten mit verschiedenartigen Elutionsmitteln bei verschiedenen Konzentrationen nur 50 Prozent der ursprünglichen Aktivität erhalten werden, Ferner enthielt das Eluat die Komponenten B und G als Verunreinigungen.

Bei der Verwendung von Dowex 1, einem Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat mit quartären Amingruppen als Hauptaustauβehergruppen, wurdenGO Prozent der gesamten Aktivität bei der Adsorption und beim Waschen verloren.

Bei der Verwendung eines porösen Ionenaustauscherharzes mit quartären Amingruppen als austauschenden Gruppen, beispielsweise Amberlite IRA 904, einem stark vernetzten makrojjorösen lonen-Laustauscherharz mit quartären Ammoniumsalzen als austauschenden..!

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Gruppen, Amberlite IRA 938 und Amberlite IRA 900, die beide die gleichen Eigenschaften wie Amberlite IRA 904 aufweisen, wurden 100 Prozent der gesamten Aktivität adsorbiert. Jedoch betrugen die Aktivitätsausbeuten nach der Elution 23,4, 91,8 bzw. 98,0 Prozent, wobei sich keine reproduzierbaren Ergebnisse erhalten ließen. Außerdem war die Reinigungswirkung bei den letztgenannten Harzen nur gering. Setzt man die spezifische Aktivität des Ausgangskallikreins mit 1 an, so betragen die entsprechenden Aktivitäten 0,48, 1,04 bzw. 1,21. Es zeigt sich also, daß die vorgenannte Verfahrensweise gegenüber den herkömmlichen Verfahren keine deutlichen Vorteile bietet.

• Bei dieser Sachlage konnte man annehmen, daß sich Ionenaustauscherharze zur Reinigung von Kallikrein nicht eignen. Überraschenderweise wurde jedoch bei weiteren Untersuchungen festgestellt, daß Diaion VA30, ein Styrol-Divinylbenzol-Copolyiaerisat, das Ähnlichkeiten zu Diaion WA21 aufweist und aus einem stark vernetzten makroporösen Harz besteht, das tertiäre Amingruppen als Ionenaus- · tauschergruppen enthält, nur 1,28 Prozent der Gesamtaktivität wäh-

. rend der Adsorption und während des V/aschens verlorengehen und 95 Prozent der Aktivität sich nach Elution mit einem Elutionsmittel erhalten lassen. Setzt man die spezifische Aktivität des Ausgangskallikreins mit 1 an, so beträgt die des erhaltenen Kallikreins 2 bis 5· Bei Verwendung des vorgenannten Harzes läßt sich also der Rainheitsgrad von Kallikrein deutlich steigern« Ähnliche Ergebnisse werden bei Verwendung von Imac A 2OR, das eine ähnliehe Struktur wie Diaion VA 30 aufweist und ein stark vernetztes makroporöses Harz mit tertiären Amingruppen als Hauptaustauscher-"

L _l

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gruppen ist, erhalten. Das heißt, die Aktivität wird während der Absorption und während des Waschens nicht verloren und läßt sich zu 95 Prozent durch Elution mit einem Elutionsmittel gewinnen. Überraschenderweise · wurde festgestellt, daß das dabei erhaltene Kallikrein bei der Analyse mittels Elektrophorese an Cellulosegel-

als Folien sich als hochreines Kallikrein,d. h./ Komponente A, erweist,

bei dem die Verunreinigungen B und C lediglich in einer Menge von

das Präparat von Beispiel 6 in 4 Prozent vorhanden sind; vgl. Kurve für / Fig. 1. Die Reinheit bzw. die spezifische Aktivität der Komponente A erreicht Werte von 20,81 bis 45,072 ku/mg.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur*Herstellung von hochreinem Kallikrein, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Autolysate aus Säugetierorganen, menschlichem Urin oder Lösungen, die Kallikrein geringer Reinheit enthalten, zur Adsorption des Kallikreins mit einem stark vernetzten makroporösen Anionenaustauscherharz mit tertiären Amingruppen als Austauschergruppen in Kontakt bringt und das am Anionenaustauscherharz adsorbierte Kallikrein mit einem Elektrolyten behandelt.

Die Abtrennung von Kallikrein unter Verwendung der genannten Ionenaus.täuscherharze ist im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren, beispielsweise der Fällung mit Aceton, bei der eine spezifische Aktivität und Reinheit von 4,4-7 bis 13»59 ku/mg erzielt wurde, ein äußerst wirkungsvolles uid in großtechnischem Maßstab gut durchführbares Verfahren.

In Fig. 1 ist die Auftrennung in den aktiven Bestandteil und die L j

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Verunreinigungen bei verschiedenen Proben auf folgende Weise graphisch dargestellt: Zwei gemäß den JA-PSn I3O 506 und 404- 256 erhaltene Kallikreinpräparate, ein erfindungsgemäß verwendetes Autolysat von Tierorganen und zwei gemäß den nachfolgenden Beispielen 6 und 7 erhaltene Kallikreinpräparate werden jeweils in destilliertem V/asser gelöst. Die Lösungen werden auf eine Cellulosegel-Folie der Abmessungen 12 χ 12'cm aufgesetzt. Anschließend werden die Präparate elektrophoretisch unter Verwendung von 0,0'7 m Veronalpuffer vom pH-Wert 8,6 2 1/2 Stunden bei 0,63 mA/cm aufgetrennt. Nach Beendigung der Elektrophorese wird die Folie mit Ponceau JR angefärbt und anschließend entfärbt, um die Folie teilweise durchsichtig zu machen. Anschließend werden die mit dem Farbstoff gefärbten Proteinfraktionen densitometrisch unter Verwendung eines 500 nm-Filters bei einem Schlitz von 0,5 x 5 mm analysiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 zusammengestellt.

Aus Fig. 1 geht hervor, daß die gemäß den Beispielen 6 und 7 erhaltenen Kallikreinpräparate keinen Gehalt an den Fremdproteinen B, C, D, E und F aufweisen, während die nach den herkömmlichen Verfahren erhaltenen Kallikreinpräparate Fremdproteine enthalten.

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand von bevorzugten Ausführungsformen näher erläutert.

Ein Autolysat, das durch Behandlung von Tierorganen auf übliche Weise, beispielsweise durch Behandlung mit verdünnter Essigsäure, erhalten worden ist, wird zur Adsorption des Kallikreins mit einem stark vernetzten makroporösen Anionenaustauscherharz

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in Kontakt gebracht. Anschließend wird mehrmals mit einem Elektrolyt einer Konzentration von höchstens 0,25 m gewaschen, bis die Waschflüssigkeiten keine Extinktionsänderungen bei 280 maze igen. Bei dieser Behandlung werden Lipide und Fremdproteine abgetrennt. Anschließend wird eine Elektrolytlösung mit einer Konzentration von mindestens 0,6 m verwendet, um das hochreine Kallikrein in Lösung zu bringen.

Zur Adsorption des Kallikreins am Ionenaustauscherharz kann das Harz direkt in ein Autolysat von tierischen Organen gegeben werden, wobei die Adsorption absatzweise durchgeführt wird. Eine andere Möglichkeit besteht darin, das Autolysat über eine mit dem ,Harz beschickte Säule zu geben. Ferner können das absatzweise und . das säulenchromatographische Verfahren kombiniert werden.■

Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete, stark vernetzte makroporöse Ionenaustauscherharz, das tertiäre Amingruppen als Austauschergruppen enthält, kann durch Behandlung eines vorhände-.nen Ionenaustauscherharzes erhalten werden, indem man es auf physikalischem Wege makroporös macht und tertiäre Amingruppen als 'Austauschergruppen einführt. Beispiele für Ionenaustauscherharze, die sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eigne n_} sind Diaion WA 30, Imac A20R, Imac A20S und Imac A24.

Beispiele für Elektrolyte, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, sind wäßrige Lösungen-von Ammoniumsalzen oder Alkalimetallsalzen, wie Natrium- oder Kaliumsalzen, von organischen Säuren, wie Ameisensäure oder Essigsäure, oder von anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Fhosphor-

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säure. Der Elektrolyt kann je nach, seiner Molarität als Waschflüssigkeit oder als Elutionsmittel verwendet werden. Der pH-Wert der Elektrolytlösung liegt vorzugsweise im Bereich von 6,0 "bis 8,5» wobei das Kallikrein nicht beeinträchtigt wird.

Das auf diese Weise nach entsprechender Aufarbeitung erhaltene Kaliikreinpulver kann direkt für Injektionszwecke verwendet werden. Gegebenenfalls kann jedoch das erfindungsgemäße Verfahren wiederholt werden, um die Reinheit des Kallikreins zu steigern.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet große Vorteile bei der großtechnischen Herstellung von hochreinem Kallikrein. In Tabelle I wird das erfindungsgemäße Verfahren mit dem Verfahren der Jl-PS 404 256 verglichen. In letzterem Verfahren wird ein gemäß JA-PS 130 506 erhaltenes Kallikreinpräparat mit einer spezifischen Aktivität von 7,77 ku/mg eingesetzt.

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Tabelle I

Ausgangsmaterial Autolysebedingungen

Abtrennung von Fremdproteinen

σ co oo

Isolation der aktiven Komponente

Erfindungsgemäßes Verfahren

Verfahren der JA-PS I3O 506

AutoIysat

Nach 5stündiger Autolyse bei 15⁰C mit 0,05n Essigsäure wird abfiltriert.

Verschiedene Proteine werden" an Diaion WA 30 adsorbiert
und anschließend unter Verwendung einer 0,1 bis 0,25 m Ammoniumchloridlösung vom
pH-Wert 6,0 bis 8,5 eluiert. Es sind 8 bis 12 Stunden erforderlich.

Das Kallikrein wird mit einer
0,6 bis 1,0 m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,5
eluiert. Es sind S bis 12
Stunden erforderlich.

AutoIysat .

Nach 48; bis 72stündiger Autolyse bei 37⁰C mit 0,02n Essigsäure wird abfiltriert.

Es wird dialysiert und anschließend mit der gleichen Volumenmenge Aceton versetzt. Die erhaltene Lösung wird zur Ausfällung des Kallikreins 8 bis 12 •Stunden stehengelassen.

Das Kallikrein wird unter Verwendung einer 1/3n Na- ' triumhydrogencarbonatlösung extrahiert. Das unlösliche Material wird entfernt. Dieses Verfahren wird dreimal wiederholt. Insgesamt sind dazu 8 bis 12 Stunden erforderlich.

Tabelle I (Fortsetzung)

Dialyse

Spezifische Aktivität Elektr ophore se Ausbeute Bemerkungen

Arbeitsweise

Erfindungsgemäßes Verfahren Verfahren der JA-PS I30 506

Entsalzen und Dialyse. Zeitbedarf : 4-8 Stunden.

20,81 bis 35,26 ku/mg

Siehe Pig. 1

bis 94 Prozent

Das Anionenaustauscherharz
kann leicht regeneriert und
wiederholt eingesetzt werden.

einfach

Entsalzen und Dialyse. Zeitbedarf :48 Stunden.

4,4-7 bis 13,59 ku/mg

Siehe Fig. 1

65 bis 75 Prozent

Es sind große Acetonmengen erforderlich, deren Rückgewinnung schwierig ist.

kompliziert

Tabelle I (Fortsetzung)

Ausgangsmaterial

. Abtrennung von Fremdproteinen

Erfindungsgemäßes Verfahren Verfahren gemäß JA-PS 404 256

JS-CO

Isolation der aktiven Komponente

Dialyse

Spezifische Aktivität Elektrophorese Ausbeute Kallikrein (bzw. eine Kallikreinlösung), das nach dein
erfinäungsgemaßen Verfahren
erhalten wurde.

Das vorgenannte Produkt wird
in einer verdünnten Salzlösung
vom pH-Wert 7,0 gelöst und an
Diaion WA JO adsorbiert. Anschließend wird.zur Entfernung
von Fremdproteinen mit einer
verdünnten Salzlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,5 gewaschen.

Die aktive Komponente wird
mit einer 0·,6 bis 1,0 m
Salzlösung vom pH-Wert 6,0
bis 8,5 eluiert. " :

Entsalzen und Dialyse
•103,78 bis 146,82 ku/mg
Siehe Pig. 1
bis 96 Prozent

Kallikrein, das gemäß JA-PS 130 5O6 erhalten wurde.

Das Kallikrein ,wird an DEAE-Cellulose, die mit 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7»0 äquilibriert ist, adsorbiert. Anschließend wird zur Entfernung von Fremdproteinen mit einem Gemisch aus 0,01 m Phosphatpuffer und 0,4prozentiger wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen.

Die aktive Komponente wird .λ

mit einem Gemisch aus 0,05 m ^ Phosphatpuffer und einer ' 5prozentigen wäßrigen Natriumchloridlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert.

Entsalzen und Dialyse 38,87 bis 92,88 ku/mg Siehe Fig. 1
85 bis 87 Prozent

Die gemäß den folgenden Beispielen 6 und 7 erhaltenen Kallikreinpräparate werden auf ihre steigernde Wirkung der Blutflußgeschwindigkeit bei Hunden untersucht und mit den Produkten der JA-PS 404 256 und 13Ο 506 verglichen. Von den Kallikreinproben wird jeweils eine vorbestimmte Menge in physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Die erhaltene Lösung wird erwachsenen Hunden injiziert, und die Steigerung der Blutflußgesehwindigkeit wird an einem Hinterfuß "bestimmt. Die Versuchsergebnisse sind in Fig. 2 zusammengestellt, wobei auf der Abszisse die Kallikreindosis und auf der Ordinate die Blutflußgeschwindigkeit aufgetragen ist. Wie aus Fig. 2 hervorgeht, ist die steigernde Wirkung auf die Blutflußgeschwindigkeit des gemäß Beispiel 6 erhaltenen Kall.ikreinpräparats 201 mal größer als die entsprechende Wirkung des gemäß. JA-PS 130 5Ο6 erhaltenen Präparats.. Ferner ist festzustellen, daß das Präparat von Beispiel 6 in seiner Wirkung den gemäß JA-PS 404 256 erhaltenen Präparat entspricht. Schließlich ist nach Verabreichung des Kallikreinpräparats von Beispiel 7 die Blutflußmenge 3,8 rral größer als nach Verabreichung des Präparats von Beispiel 6 und 3,13 mal größer als nach Verabreichung des gemäß JA-PS 404 256 erhaltenen Präparats.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispieli

6 kg Schweinepankreas werden in Streifen geschnitten und 5 Stunden unter Rühren bei 15⁰C in 20 Liter einer 0,05 m Essigsäurelösung autolysiert. Anschließend werden die Pankreasstreifen und das Fett aus der Lösung abfiltriert. Der pH-Wert des Filtrats

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wird auf 6,5 eingestellt. Sodann wird die erhaltene Lösung auf eine mit "1,4- Liter Diaion VA 50 "beschickte Säule der Abmessungen 6 χ 70 cm aufgesetzt. Die Säule wird mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,5 "bis 2,0 Liter/Stunde betrieben. Anschließend wird die Säule mit einer 0,25 m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert δ,5 solange gewaschen, bis die Extinktion des Waschwassers bei 280 mn den Wert 1,0 erreicht. Sodann wird die aktive Komponente mit 0,8 m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,5 eluiert. Das Eluat · wird mittels eines Ultrafilters entsalzt. Die erhaltene Lösung, die das Kallikrein enthält, wird zu 8,99 g Kallikrein gefriergetrocknet. Die spezifische Aktivität bzw. Reinheit beträgt 20,76 ku/mg und. die Ge samt aktivität 186 632,4 ku. Die Ausbeute, bezogen auf die ursprüngliche Aktivität des Autolysats, beträgt 85 Prozent. In Bezug auf das Autolysat wird eine 1207fache Reinigung erzielt.

Beispiel2

1>58 g gemäß Beispiel 1 erhaltenes,/Kallikreinpulver· mit einer spezifischen Aktivität von 20,76 ku/mg werden in 50 ml einer 0,2 m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,5 gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf eine mit 240 ml Diaion V/A 30 beschickte Säule der Abmessungen 3 x 40 cm aufgesetzt. Während der Adsorptionsphase wird die Säule mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 200 bis 3OO ml/Stunde-betrieben. Anschließend wird mit 0,2 m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,5 und schließlich mit einer 0,3 m. Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,5 gewaschen, bis die Extinktion der Waschflüssigkeit einen Wert von 0, 8 erreicht. Sodann wird mit 0,6 m Ammoniumchloridlösung vom pH-V/ert 6,5 eluiert.

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Das erhaltene Eluat wird mit Hilfe eines Ultrafilters entsalzt. Nach dem Gefriertrocknen des Filtrats erhält man 0,216 g Kalli- · krein mit einer spezifischen Aktivität von 146,82 ku/mg und einer Gesamtaktivität von 31 708,8 ku. Die Ausbeute beträgt 96 Prozent und der Reinigungsgrad, bezogen auf das ursprünglich eingesetzte Kai1ikreinpulver, 7,07.

Beispiel 3

Aus 120 g Schweinepankreas wird gemäß Beispiel 1 ein Autolysat hergestellt. Daraus werden gemäß Beispiel 1 unter Verwendung von Imac A20R 55 mg Kallikrein mit einer spezifischen Aktivität von 35?19 ku/mg und einer Gesamtaktivität von 1936 ku hergestellt. Die Ausbeute beträgt 96 Prozent. In Bezug auf das Autolysat wird eine 2046fache Reinigung erzielt.

Beispiel 4

Als Ausgangsmaterial v/erden 1,6 Liter Urin von erwachsenen, männlichen Personen verwendet. Der pH-Wert des Urins wird auf 7?0 eingestellt. Sodann wird er auf eine mit Diaion WA 30 beschickte Säule der Abmessungen 25 x 25 cm aufgesetzt. Während der Adsorptionsphase wird die Säule mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 Liter/Stunde betrieben. Nach beendeter Adsorption wird zur Entfernung der Fremdproteine solange mit 0,3m Ammoniumchloridlösung gewaschen, bis die Extinktion der Waschflüssigkeit einen Wert von 0,7 erreicht. Anschließend wird mit 0,8m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,5 eine Kallikrein enthaltende Lösung eluiert. Diese Lösung wird entsalzt und gefriergetrocknet. Man erhält 242 mg Kallikrein von einer spezifischen Aktivität von 0,91 ku/mg

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und einer Gesamtaktivität von 220 ku. In Bezug auf den ursprünglich eingesetzten Urin wird eine 198fache Reinigung erzielt.

Beispiel 5

Aus 1,5 kg Schweinepankreas wird gemäß Beispiel 1 ein Autolysat hergestellt, das 2 Stunden bei 3 bis 5⁰O unter Rühren mit 300 ml Imac A20S behandelt 'wird. Anschließend wird das Harz abfiltriert und mit 0,3m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,5 gewaschen, bis eine Extinktion des Waschwassers von 1,0 erreicht wird. Sodann wird mit einer 0,8m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,5 eine kallikreinhaltige Lösung eluiert. Diese Lösung wird entsalzt und gefriergetrocknet. Man erhält 800 ml Kallikrein mit einer spezifischen Aktivität von 17*70 ku/mg und einer Gesamtak-. tivität von 14 160,0 ku. Die Ausbeute betragt 94 Prozent. In Bezug auf das Autolysat wird eine 1072,7fache Reinigung erzielt.

Beispiel 6

7,2 kg Schweinepankreas werden 5 »Stunden bei 15⁰C in 25 Litern einer 0,05n Essigsäurelösung autolysiert. Anschließend wird das erhaltene Autolysat mit einer Geschwindigkeit von 1 Liter/Stunde auf eine mit 900 ml Diaion WA 30 beschickte und vorher mit 0,25m Ainmoniumchloridlosung vom pH-Wert 6,0 äquilibrierte Säule auf getropft. Anschließend wird zur Entfernung von verschiedenen Premdproteinen mit einer 0,25m Ainmoniumchloridlosung vom pH-Wert 6,0 gewaschen. Der Waschvorgang wird abgebrochen, wenn die Extinktion der Waschflüssigkeit unter 3 sinkt. Anschließend wird das Kallikrein unter Verwendung- oiner 0,8m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 eluiert. Die erhaltene Lösung wird entsalzt und durch

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Durchfluß-Elektrodialyse oder Filtration mit einem/irJembranfilter teilweise eingeengt. Nach dem Gefriertrocknen erhält man 7,39 g Kallikrein mit einer spezifischen Aktivität von 27,33 ku/mg und einer Gesamtaktivität von 201 968,7 ku. In Bezug auf das Autolysat wird eine 3178fache Reinigung erzielt.

Beispiel 7

Das gemäß Beispiel 1 erhaltene Kallikreinpulver wird auf eine

WA 30
mit 500 ml Diaion/beschickte Säule der Abmessungen 4,2 χ 3?6 cm mit einer Geschwindigkeit von 1 Liter/Stunde aufgetropft. Anschließend wird das Harz mit 0,25m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 gewaschen. Sodann wird das Kallikrein mit einer 0,8 m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 eluiert. Das Eluat wird entsalzt und durch Dialyse oder unter Verwendung eines

filters
Durchflußmembran/, eingeengt. Nach dem Gefriertrocknen erhält man 1,0 g Kallikrein mit einer .spezifischen Aktivität von 103,78 ku/mg und einer Gesamtaktivität von 103 7SO,0 ku. In Bezug auf das ursprünglich eingesetzte Pulver wird eine 3>§0fache Reinigung erzielt.

Beispiel 8

1 g Kallikreinpulver mit einer spezifischen Aktivität von 7i ku/mg, das gemäß JA-PS 130 506 durch Acetonfällung aus einem Schweinepankreasautolysat erhalten worden ist, wird in 50 ml 0,25 ui Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf eine mit 212 ml Diaion WA 30 beschickte Säule der Abmessungen 3 x 30 cm aufgetropft. Die Säule wird mit einer Durehflußgeschwindigkeit von 200 bis 250 ml /Stunde betrie-

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ben. Anschließend wird mit einer 0,25 m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 gewaschen. Sodann wird das Kallikrein mit einer 0,6 m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 eluiert. Das Eluat wird entsalzt und gefriergetrocknet. Man erhält 168,5 mg Kallikreinpulver mit einer spezifischen Aktivität von 4-3,07 ku/mg. Die Ausbeute in Bezug auf das ursprüngliche Pulver beträgt 93,M-Prozent.' .

Beispiel 9

Das gemäß Beispiel 8 erhaltene Kailikreinpulver mit einer spezifischen Aktivität von 4-3,072· ku/mg wird in 20 ml einer 0,2 m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 gelöst. Die -erhaltene Lösung •wird auf eine mit 188 ml Diaion WA 30 beschickte Säule der Abmessungen 2 χ 60 cm aufgesetzt. Die Säule wird.mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 150 bis 180 ml/Stunde betrieben. Anschließend wird mit einer 0,25 m Ammoniumchloridlösüng vom pH-Wert 6,0 gewaschen. Das Kallikrein wird sodann mit einer 0,6 m Ammoniumchloridlösung vom pH-Wert 6,0 eluiert. Das erhaltene Eluat wird entsalzt und gefriergetrocknet. Man erhält 56,8 mg Kallikreinpulver mit einer spezifischen Aktivität von 121,7 5 ku/mg. Die Ausbeute in Bezug auf das ursprüngliche Pulver beträgt 95»28 Prozent.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von hochreinem Kallikrein, dadurch gekennzeichnet ; daß man Autolysate aus Säugetierorganen, menschlichern Urin oder Lösungen, die Kallikrein geringer Reinheit enthalten, zur Adsorption des Kallikreins mit einem stark vernetzten makroporösen Anionenaustauscherharz mit tertiären Amingruppen als Austauschergruppen in Kontakt "bringt und das am Anionenaustauscherharz adsorbierte Kallikrein mit einem Elektrolyten behandelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Austauscherharz ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat, das Amingruppen enthält, verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Elektrolyt Ammonium oder Alkalimetallsalze von Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das am Anionenaustauscherharz adsorbierte Kallikrein mit einer höchstens 0,3 m Elektrolytlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,5 wäscht und mit einer mindestens 0,6m Elektrolytlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,5 eluiert.

5. Verfahren nach Anspruch 3? dadurch gekennzeichnet, daß man als Elektrolyt eine Ammoniumchloridlösung verwendet.

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