DE1965431B2

DE1965431B2 - Inosin-Komplexverbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE1965431B2
Application number: DE1965431A
Authority: DE
Inventors: Paul Chicago Ill. Gordon (V.St.A.)
Original assignee: Newport Pharmaceuticals Inc Newport Beach Calif (vsta)
Current assignee: Newport Pharmaceuticals International Inc
Priority date: 1969-08-28
Filing date: 1969-12-30
Publication date: 1978-05-18
Also published as: SE384866B; DE1965431C3; PH9221A; AT299457B; DK137801C; NL140735B; JPS493999B1; SU381216A3; BE755361A; YU36188B; DE1967073A1; HU162297B; YU214570A; ES375387A1; CS183616B2; PL80960B1; PH10011A; IL35135A0; DE1965431A1; IL35135A

Description

N · (HX)_n
CH₂

HC-OH

CH,

HO OH

in der n=0 oder 1 und X das Anion einer pharmakologisch annehmbaren Säure ist 2u

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß HX die p- Acetamidobenzoesäure ist.

3. Verfahren zur Hersteilung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Dimethylaminoisopropanol oder ein Salz dieses Aminoalkohol mit einer pharmakologisch annehmbaren Säure mit Inosin im Molverhältnis 3 :1 mischt, die Mischung in Wasser löst und durch Einengen der Lösung die Komplexverbindung gewinnt

4. Therapeutische Zubereitung mit einem Gehalt jo der Verbindungen nach Anspruch 1 sowie üblichen Träger- und Hilfsstoffen.

j5

Gegenstand der Erfindung sind Inosin-Komplexverbindungen der allgemeinen Formel

HN

HO H₂C

CH₃ CH₃-N · (HX)_n
CH₂

HC-OH
CH,

4>

HO OH

in der n=0 oder 1 und X das Anton einer pharmakologisch annehmbaren Säure ist.

Diese Verbindungen sind gegen Virus-Erkrankungen wirksam. Sie steigern auch das Lernvermögen und unterdrücken bzw. verringern Senilitätserscheinungen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen besteht darin, daß man Dimethylaminoisopropanol bzw. ein Salz dieses Aminoalkohols mit einer pharmakologisch annehmbaren Säure und Inosin im Molverhältnis 3 :1 vermischt, dann in Wasser löst und durch Einengen der Lörung die gewünschte Komplexverbindung gewinnt.

Es ist auch möglich, das Hydrochlorid von Dimethylaminoisopropanol im Molverhäitnis 3 :1 mit Inosin zusammenzuschmelzen.

Das IR-Absorptionsspektrum der erfindungsgemäßen Verbindungen zeigt an, daß es sich um echte Komplexverbindungen und nicht nur um eine Mischung der Einzelbestandteile handelt, denn die erhaltene Absorptionskurve weicht von derjenigen ab, die aufgrund einer Überlagerung der Kurven der Einzelkomponenten zu erwarten wäre. Es fehlen die Banden oberhalb 11,45 μ, bei 8 μ, bei 8,1 μ und bei 8,55 μ, die sich im IR-Spektrum des Inosins bzw. des Dimethylaminoisopropanols finden. Dies wird auch dadurch bestätigt, daß Inosin selbst um etwa 80% schneller in Wasser diffundiert als aus der erfindungsgemäßen Komplexverbindung mit Dimethylaminoisopropanol. Ebenso diffundiert Inosin schneller in eine wäßrige Dimethylaminoisopropanol-Lösung als in Wasser.

Überraschend ist auch, daß eine Komplexbildung selbst dann eintritt, wenn die Einzelbestandteile des Komplexes getrennt verabreicht werden, jedoch die Möglichkeit haben, sich in der Körperflüssigkeit zu einem Komplex zu vereinigen.

Man hat auch festgestellt, daß beim Vermischen von überschüssigem Inosin mit Dimethylaminoisopropanol in wäßriger Lösung und nachfolgendem Eindampfen zur Trockne zunächst reines Inosin ausfällt und als Rückstand der Komplex aus dem Aminoalkohol und Inosin im Molverhältnis 3 :1 verbleibt.

Geeignete Säuren für die Salzbildung mit dem Dimethylaminoisopropanol sind zum Beispiel Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Acetylsalizylsäure, d-Weinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, trans-Zimtsäure, Salicylsäure, Adipinsäure, Methansulfonsäure, Essigsäure, p-Aminobenzoesäure und Propionsäure. Die meisten dieser Salze sind hygroskopisch und damit zerlließlich. Der Komplex aus Inosin und dem p-Acetamidobenzoat des Dimethylaminoisopropanols bleibt jedoch fest und stellt daher ein bevorzugtes Salz dar.

Die erfindungsgemäßen Komplexverbindungen stellen nichtspezifische Mittel mit breitem Wirkungsspektrum gegenüber den verschiedensten DNS- und RNS-Viren dar. Ihre Untersuchung bei einer Vielzahl von Viruserkrankungen ergab, daß sie die Immunreaktion der Wirtszellen erhöhen und damit zu einer selektiven Hemmung der Reproduktion der Virusproteine führen. Die größte Wirkung stellte man fest, wenn die Infektion bereits eingetreten war und die ersten Krankheitssymptome beobachtet wurden. Die erfindungsgemäßen Komplexverbindungen besitzen also weniger eine prophylaktische als eine echte therapeutische Wirkung.

Sie sind oral anwendbar und führen bei Erkrankungen, die durch Influenza-, Herpes-, Hepatitis-, Polio- und Echo-Viren hervorgerufen werden, zu einer raschen Behebung der Krankheitssymptome und zu einer Verkürzung der Krankheitsdauer.

Für die Behandlung von Infektionen, die durch pathogene Mikroorganismen hervorgerufen werden, steht eine große Zahl therapeutisch wirksamer Antibiotika zur Verfügung. Dies trifft jedoch für Viruserkrankungen nicht zu. Es besteht daher echter Bedarf nach weiteren antiviral wirksamen Mitteln, insbesondere nach einem Mittel mit breitem Wirkungsspektrum gegenüber den verschiedenartigsten Viren, das auch Mehrfachinfektionen wirksam zu bekämpfen vermag. Im Hinblick darauf, daß Antivirusmittel mit vergleichbarer Struktur bisher nicht bekannt sind, könnte die Therapie von Viruserkrankungen mit der Erfindung durch einen neuen Wirkungsmechanismus bereichert werden.

Die folgenden Versuche zeigen die antivirale Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Komplexverbindungen in vitro und in vivo.

Im folgenden wird für Dimethylaminoisopropanol die Abkürzung DIP verwendet. Das p-Acetamidobenzoesäuresalz von 1 Mol Inosin ■ 3 Mol Dimethylaminoisopropanol wird als Isoprinosin bezeichnet

Hemmwirkung der Komplexverbindung aus

1 Mol Inosin und 3 MoI DIP und des Isoprinosin

auf den Influenza A Schweinevirus 31/76

Die antivirale Wirkung der Komplexverbindung aus 1 Mol Inosin und 3 Mol DIP und des isoprinosins unter Anwendung einer Modifizierung der Hämagglutination-Adsorptionstechnik von Vogel und Shelokov (Science, Bd. 126 [1957], S. 358/359) bei Vero-Zellen (Nierenzellen von Arikan. Grünen Affen) untersucht Diese Methode wurde entwickelt, um in rascher und reproduzierbarer V/eise die antivirale Wirkung von Substanzen untersuchen zu können.

Nach den frühen Stadien der Influenzavirus-Vermehrung in Monoschichten dieser Kulturen zeigen infizierte Zellen die Neigung, an ihrer Oberfläche Erythrccyten von Meerschweinchen zu adsorbieren. Es kann daher innerhalb von 18 Stunden nach Zugabe des Virus zu den Kulturen der Grad der Infektion der Monoschichten durch Auszählen der Zellen mit adsorbierten Erythrocyteatirauben festgestellt werden.
Die Verringerung der Anzahl der Erythrocytentrauben in Gegenwart von Hemmsubstanzen stellt ein Maß für die Hemmwirkung dieser Substanzen dar.

Das Isoprinosin wurde in einer Konzentration von 15(^g/ml Kulturmedium angewandt. Die übrigen Substanzen wurden in äquimolaren Mengen eingesetzt.

Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, führte Isoprinosin im Vergleich zu den infizierten Kontrollproben zu einer Hemmung von 60%, die Komplexverbindung aus Inosin und freiem DIP zu einer Hemmung von 43%. Die Hemmwirkung der Einzelkomponenten war dagegen nur gering. Sie betrug für Inosin 13% und für das freie Dimethylaminoisopropanol 18%.

Tabelle 1

Hemmung der Vermehrung des Influenza-Schweinevirus 31/76 in Vero-Zellen

Isoprinosin

Inosin

DIP

Inosin · DIP
(1:3)

Infizierte
Kontrolle

Zahl dej^hämadsorbierten 598 ± 33
Zellen X

Hemmung, % 60

± 62,2 1221 ± 52,8 841 ± 44,5
18 43

1474 ± 56

Die In-vivo-Untersuchungen wurden wie folgt durchgeführt: Gruppen von jeweils 80 Mäusen mit einem Körpergewicht von 12 bis 14 g wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen an Influenza Virus, Stamm A2, infiziert. Die Infizierung erfolgte intranasal mit 0,1 ml unverdünnter Viruslösung und 4 zehnfachen Reihenverdünnungen dieser Lösung, so daß das Virus in fünf verschiedenen Verdünnungen zur Anwendung kam. Nach der Infizierung wurden die Mäuse der verschiedenen Verdünnungsgruppen willkürlich in eine Kontrollgruppe und drei Behandlungsgruppen von jeweils 20 Mäusen eingeteilt Die behandelten Gruppen erhielten intraperitoneal 500 mg/kg Isoprinosin je Tag, wobei mit der Behandlung am Tage Null (3 Stunden nach der Virusinfektion), am Tage 1 und am Tage 2 begonnen wurde. Die Mortalität wurde statistisch am 16. Tage festgestellt.

Es wurden die in der Tabelle 2 aufgeführten Ergebnisse erhalten.

Tabelle 2

Verhältnis tote Tiere/infizierte Tiere

35

40

45

50

55

Virus	Kontrolle	Isoprinosin,	am Tage	2	60
verdünnung		verabreicht	1	8/20
		0	9/20	8/20
10°	20/20	20/20	7/20	6/20	b5
10"'	20/20	20/20	5/20	3/20
ΙΟ"²	15/20	8/20	3/20	1/20
ΙΟ"¹	3/20	3/20	1/20
ΙΟ"⁴	1/20	1/20

Der Titer der 10°-Verdünnung betrug 2 · 10⁶ HA-Einheiten/ml. Die erhaltenen Werte zeigen, daß die antivirale Wirkung von Isoprinosin bei starker Virusinfektion signifikant und vom Behandlungsbeginn abhängig ist. Insbesondere stellte man in ähnlichen Versuchen fest, daß die antivirale Wirkung besonders gut ist, wenn mit der Behandlung am 1. bis 4. Tage nach der Infektion begonnen wird.

Ferner wurde die Wirkung von Isoprinosin auf mit Herpes-Viren, Stamm LU, infizierte neugeborene Mäuse in folgender Weise untersucht:

An einen Tag alte Mäuse wurden intraperitoneal 0,5 ml einer Virussuspension verabfolgt, die nach einem vorausgegangenen Versuch 90 bis 100% der Mäuse tötete. Die infizierten Mäuse wurden willkürlich in eine unbehandelte Kontrollgruppe, eine mit Kochsalzlösung behandelte Gruppe und eine mit Isoprinosin behandelte Gruppe von jeweils 30 Mäusen eingeteilt. Das Isoprinosin wurde in einer Dosis von 400 mg/kg je Tag intraperitoneal verabfolgt. Mit der Injektion der Kochsalzlösung und des Isoprinosins wurde am Tage 1 begonnen. Sie wurde 20 Tage fortgesetzt. Nach Ablauf dieser Zeit betrug das Verhältnis tote Tiere/infizierte Tiere bei der nicht behandelten Kontrollgruppe 29/30, bei der mit Kochsalzinjektionen behandelten Gruppe 29/30 und bei der mit Isoprinosin behandelten Gruppe 13/30.

Die LD50 der erfindungsgemäßen Komplexverbindung beträgt bei intraperitonealer und oraler Verabreichung an Mäuse, Ratten und Katzen 4000 bis 6500 mg/kg.

Außer der Schutzwirkung gegenüber Viren vermögen die erfindungsgemäßen Inosin-Komplexverbindungen ein geschädigtes Lernvermögen wiederherzustellen

und Senilitäts- sowie Alterserscheinungen zu verringern.

Bei Anwendung der erfindungsgemäßen Komplexverbindungen ließ sich das Lern- und Erinnerungsvermögen junger Ratten nicht mehr von dem alter Ratten unterscheiden, obgleich bei letzteren das Lern- und Erinnerungsvermögen vor der Behandlung geschädigt war. Die erzielten Ergebnisse waren wesentlich besser als bei Anwendung von Diphenylhydantoin. Methoden zur Ermittlung des Lernvermögens junger und alter Ratten sind Do ty in Journal of Gerontology, Bd. 21 (1966), S. 287 - 290, beschrieben.

Es wird allgemein angenommen, daß ein optimales Funktionieren des Gehirns und anderer Nervengewebe, insbesondere bei Lern- und Anpassungsvorgängen sowie anderen Vorgängen, die hohe Aktivität erfordern, die Synthese von neuer RNS und von Protein notwendig macht. Das ältere Gehirn synthetisiert weniger RNS und Protein mit dem höchsten Molekulargewicht. Es ergeben sich daher Mangelzustände, die zu einer Beeinträchtigung der Funktionen des Nervensystems führen. Die Anwendung eines Therapeutikums, das die Synthese von RNS und von Protein hohen Molekulargewichts beschleunigt, ist daher sehr wertvoll. In Polyribosom-Untersuchungen am Saccharose-Dichtegradienten wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Komplexverbindungen die Geschwindigkeit der RNS-Synthese stärker erhöhten als Inosin. Der Komplex stellt einen Inhibitor für die RNS abbauende Ribonuclease dar, während Inosin dieser Enzym stimuliert und seine Wirkung auf die Bildungsgeschwindigkeit für RNS wesentlich geringer ist als die der erfindungsgemäßen Komplexverbindungen. Darüber hinaus bewirken die Komplexverbindungen, jedoch nicht Inosin allein, ein vermehrtes Auftreten einer kürzlich im Gehirn entdeckten und als Informosom bezeichneten Substanz. Ihre Absetzgeschwindigkeit im Zentrifugentest beträgt 20 bis 60 S (Svedberg-Einheiten). Sie ist damit merklich leichter als Ribosom-Monomere. Man nimmt an, daß diese Substanz bei der Übertragung biochemischer Information durch die informationsübertragende RNS vom Kern zum Cytoplasma mitwirkt, wo die Vereinigung der Informations-RNS mit den Ribosomen stattfindet, und die Informations-RNS gegen eine vorzeitige Zerstörung durch Ribonuclease schützt. Man hat festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Komplexverbindungen den Informosomgehalt, insbesondere im Gehirn älterer Tiere, merklich erhöhen.

Ein weiteres Anwendungsgebiet für die erfindungsgemäßen Komplexverbindungen besteht in ihrer Anwendung als Härter für Melaminformaldehyd- oder Harnstofformaldehydharze.

Das folgende Beispiel erläutert die Herstellung der erfindungsgemäßen Komplexverbindungen.

Beispiel

Das p-Acetamidobenzoat der erfindungsgemäBen Komplexverbindung erhält man in einfacher Weise dadurch, daß man das aus Dimethylaminoisopropanol

ίο und p-Acetamidobenzoesäure gebildete Salz mit Inosin im Molverhältnis Salz zu Inosin von 3 :1 vermischt und anschließend in Wasser löst; z. B. löst man 846 mg Dimeihylaminoisopropanol-p-Acetamidobenzoat und 268 mg Inosin in 2,8 ml Wasser von 23°C, einer Menge Wasser, die gerade zur Lösung ausreicht. Die wäßrige Lösung kann zur Trockne eingeengt werden, um die Komplexverbindung als weißes kristallines Pulver zu erhalten. MG = 1115,25; F.= 147- 150°C; λ,™= 258; ε™, = 50 · 10^J. Es löst sich in Wasser von 20⁰C (28% Gewicht/Volumen) und ist m neutraler Lösung beständig.

Bei der Herstellung der Komplexverbindung aas freiem Dimethylaminoisopropanol und Inosin im Molverhältnis 3 :1 beträgt die zum Lösen von 309 mg Dimethylaminoisopropano! und 268 mg Inosin erforderliche Menge Wasser 0,4 ml bei 23° C.

Zur Herstellung des Dimethylaminoisopropano!-p-Acetamidobenzoats werden 44,75 g (0,25 Mol) p-Acetamidobenzoesäure in 125 ml wasserfreiem Methanol bei Zimmertemperatur suspendiert, worauf 36 ml (0,29 Mol) Dimethylaminoisopropanol unter Rühren zugesetzt werden.

Die Umsetzung ist exotherm. Nachdem die Säure gelöst ist, wird abgekühlt und unter Anlegung eines

j3 Vakuums durch ein Papierfilter filtriert und in 400 ml wasserfreien Äther eingegossen. Es tritt sofort Kristallisation ein. Das weiße kristalline Produkt wird abgesaugt, dreimal mit wasserfreiem Äther gewaschen, bei Zimmertemperatur getrocknet und aus 100 ml absolutem Methanol/Ethylacetat (25 :75 Volumteile) umkristallisiert. Das Produkt wird bei 50⁰C unter Vakuum getrocknet. Ausbeute 56,6 g (80% der Theorie) · Fp. — 147 —148° C, empirische Summenformel C₁₄H₂₂O₄N₂; Analyse: C 59,54% (Theorie 59,50%), H 7,83% (Theorie 7,80%), N 10,04% (Theorie 9,92%).

Das Salz ist in Wasser leicht löslich und innerhalb eines weiten Bereiches normaler Bedingungen sehr beständig. Es zersetzt sich etwa 25 bis 30° C oberhalb des Schmelzpunktes unter quantitativer Freisetzung der freien Säure. Beim Erhitzen auf 50⁰C unter Normaldruck beträgt der Gewichtsverlust nach 66 Stunden 0,22%, nach 90 Stunden 0,28% und ncch 172 Stunden 0,44%.

Claims

Patentansprüche:

1. Inosinkomplexverbindungen der allgemeinen Formel

HO-H₁C

CH₁

CH₃