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DE2418460C2 - Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Lincomycin - Google Patents

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Lincomycin

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Publication number
DE2418460C2
DE2418460C2 DE2418460A DE2418460A DE2418460C2 DE 2418460 C2 DE2418460 C2 DE 2418460C2 DE 2418460 A DE2418460 A DE 2418460A DE 2418460 A DE2418460 A DE 2418460A DE 2418460 C2 DE2418460 C2 DE 2418460C2
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DE
Germany
Prior art keywords
gray
green
nrrl
yellow
lincomycin
Prior art date
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Expired
Application number
DE2418460A
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English (en)
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DE2418460A1 (de
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Alexander Demetrios Portage Mich. Argoudelis
Fritz Reusser
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Pharmacia and Upjohn Co
Original Assignee
Upjohn Co
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Filing date
Publication date
Application filed by Upjohn Co filed Critical Upjohn Co
Publication of DE2418460A1 publication Critical patent/DE2418460A1/de
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Publication of DE2418460C2 publication Critical patent/DE2418460C2/de
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/14—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to a sulfur, selenium or tellurium atom of a saccharide radical
    • C07H15/16—Lincomycin; Derivatives thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces

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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Tabelle A Lincomycin-Produktion durch S. espinosus-Stämme
(thermodur)
55
Biotyp Temp. Tag pH Licomycin 60
22,149 a 280C 1 7,7 0
= NRRL 5731 2 8,7 7 65
3 9,0 9
4 9,0 23
5 9,0 38
22,149 a
= NRRL 5731
45° C
10 21,987 a
= NRRL 5729
15
20
Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch 1 beschriebene Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Lincomycin. Der Patentanspruch 2 nennt eine Ausgestaltung dieses Verfahrens.
Wie aus der US-PS 30 86 912 bekannt, kann das Antibiotikum Lincolnensin (Lincomycin) mit Hilfe des Mikroorganismus S. lincolnensis van Iincolnensis, NRRL 2936, bei einer Inkubationstemperatur von 18 bis 400C, und vorzugsweise von 26 bis 300C, produziert werden. Aus der US-PS 36 97 380 ist die fermentative Herstellung von Lincomycin unter Verwendung des Mikroorganismus S. espinosus Dietz, sp. n., NRRL 3890 bekannt Hier beträgt die offenbarte Inkubationstempera ;ur von 18 bis 55° C, wobei das Wachstum bei 18° C, 45°C und 55°C leidlich, bei 24°C gut und bei 28 bis 37°C besonders stark sein soll.
Bei Durchführung der obigen Fermentationen bei den bevorzugten Temperaturen muß man große Mengen Kühlwasser verwenden, um die gewünschte Fermentationstemperatur aufrecht zu erhalten. Die Aufrechter- haltung einer Temperatur zwischen 26 und 36"1C, die nach den vorsiehenden Verfahren für die Antibiotika-Produktion bevorzugt wird, führt zur Entwicklung und Prolifikation verunreinigender Mikroorganismen im Fermentationsgefäß.
Es wurde nun gefunden, daß die Mikroorganismen S. espinosus NRRL5729,5730 und 5731 bei Inkubationstemperaturen von 44 bis 48° C, und vorzugsweise bei 45°C, wesentlich höhere Lincomycinmengen als bei 28° C produzieren. Ein Vergleich der Fermentationsaus· beuten bei 45 und 28° C für die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen ist aus Tabelle A ersichtlich:
28° C
45° C
22,061 a
= NRRL 5730
28° C
45° C
1 2 3 4 5
1 2 3' 4 5
1 2 3
4 5
1
2
3
4
1 2 3 4 5
8,6 9,2 9,0 8,8 8,8
8,1 8,6 9,0 9,0 9,1
8,3 9,1 8,9 8,7 8,7
7,9 8,7 9,0 9,0 9,0
8,8 9,1 8,9 8,9 8,8
17 24 60 60 110
2 6 2 8 13
10 12 30 36 48
Spuren
5 14 19
Spuren 30 33 54 76
*) Standardtest auf Lincomycin (S. Iutea = Testorganismus, Verd.-PufTer = 0,1 M PO4, pH 7,0, ATCC 9341, UC 130). Bemerkung:
Sämtliche Fermentationen verwendeten identische Inipfund Fermentationsmedien. Die Medien und sämtliche weitere Fermentationsbedingungen sind aus Beispiel 1 ersichtlich.
Die Ergebnisse von Tabelle A sind im Hinblick auf die bisherigen Kenntnisse über die Produktion von Lincomycin durch S. espinosus überraschend. Es wurde auch gefunden, daß S. lincolnensis var. lincolnensis, NRRL 2936 bei einer Inkubationstemperatur von etwa 45° C kein Lincomycin produziert. Die Fähigkeit der erfindungsgemäß verwendeten Stämme von S. espinosus zur Lincomycin-Produktion bei •'iner Inkubationstemperatur von 44 bis 48° C ist daher völlig unerwartet.
^in Vorteil bei Verwendung dieser Mikroorganismen zur Herstellung von Lincomycin besteht, neben den höheren Fermentationsausbeuten, wie aus Tabelle A ersichtlich, darin, daß weniger Kühlwasser für das Fermentationsgefäß benötigt wird. Der Bedarf an weniger Kühlwasser ist besonders günstig in warmen Klimazonen und in Gebieten mit begrenztem Wasservorrat, da zum Kühlen und Aufrechterhalten der Fermentationstetnperaturen im allgemeinen Wasser verwendet wird.
Die erfindungsgemäß zur Produktion von Lincomycin verwendeten neuen Actinomyceion sind Streptomyces espinosus NRRL 5729, NRRL 5730 und NRRL5731. Ein Stammescharakteristikum dieser Mikroorganismen ist die Produktion von Lincomycin bei einer Inkubationstemperatur von 44 bis 48° C. Eine Subkultur des lebenden Mikroorganismus kann von der permanenten
Sammlung der Northern Regional Research Laboratories, Agricultural Research Services, US, Landwirtschaftsministerium, Peoria, Illinois, USA, bezogen werden,
Farbeigenschaften:
Luftwachstum grau-grün; Melanin-negativ, Aussehen auf Ektachrome (Dietz, A, (1954), »Ektachrome transparencies as aids in actinomycete classification«, Ann.N.Y.Acad.ScL60: 152-554) ist aus Tabelle 1 ersichtlich. Die Tabellen 2 und 3 geben die Referenz-Farbeigenschaften wieder. Die Kulturen können in der grünen (GN) Farbserie gemäß Tresner und Backus (Tresner, H. D. und E. J. Backus (1963) »System of color wheels for streptomyces taxonomy«, Applied MicrobioL 11: 335—338) untergebracht werden.
Mikroskopische Eigenschaften:
Sporophoren kurz, gerade bis gebogen, bis offenspiralig bis spiralig (RF, RA, S) im Sinn von Pridham et aL(Pridham, T. G, C W. Hesseltine und R. G. Benedict (1958). »A guide for the classification of streptomyces according to selected groups. Placement of strains in morphological sections«, Applied Microbiol.6: 52-79). Die Sporen sind hauptsächlich kugelförmig, zahlreiche zeigen eine deutliche Bindung. Die Sporenoberfläche ist dornig bis stachelig im Sinne von Dietz und Mathews (Dietz, A. und J. Mathews (1971). »Classification of Streptomyces spore surfaces into five groups«, Applied MicrobioL 21: 527-533). Einige Dorne zeigen einen Übergang zu haariger Form. Die Dorne sind reichlich und zeige.-. Markierungen, wenn sie an Sporen beobachtet werden, die mittels der Kohlenstoff-Replikamethode -pn Dietz und Mathews (Dietz, D. und J. Mathews (1962). »Taxonomy by carbon replication. I. An examination of Streptomyces hygroscopicus«, Applied MicrobioL 10:258-263) behandelt wurden.
Kultur- und biochemische Eigenschaften:
Siehe Tabelle 4.
Kohlenstoff-Verwertung:
Das Wachstum der Kulturen auf Kohlenstoffverbindungen wurde im synthetischen Medium von Pridham und Gottlieb (Pridham T. G. und D. Gottlieb (1948) »The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination«, J. Bacterial. 56: 52—79, Tabelle 5) und im synthetischen Medium von Shirling und Gottlieb (Shirling, E. B. und D. Gottlieb (1966), »Methods for characterization of Streptomyces species«, Int. J. Syst Bacteriol. 16:313-340, Tabelle 6) ermittelt.
Temperatur;
Wachstum mäßig bei 18 und 55" C, gut bei 240C, schwer bei 28 bis 37° C Bei 45° C mäßiges (vegetatives) Wachstum in 24 Stunden und schwere (gute) Sporenbildung in 72 Stunden. Es wurden Bennett-, Czapek's Saccharose-, Maltose-Trypton- und Hickey-Tresner-(modifiziert)Medien verwendet
Quelle:
Erde aus Südost-Texas.
Kulturtyp:
Streptomyces espinosus Dietz sp. n, NRRL 3890.
Typenvarietät:
Streptomyces espinosus var. espinosus Dietz NRRL 3890.
Eine im Untersuchungslaboratorium der Anmelderin aus einer Bodenprobe aus Südost-Texas isolierte Actinomyceten-Kultur wurde in der US-PS 36 97 380 als Streptomyces espinosus sp. n. charakterisiert Drei weitere Isolate aus Bodenproben aus Südost-Texas besaßen auf Ektachrome das gleiche Farbverhalten wie die obige Kultur. In vertieften Untersuchungen wurde festgestellt daß die Isolate die gleichen Sporophoren und Sporentypen und die allgemeinen Kultureigenschaften des obigen Kulturtyps besitzen. Besondere Eigenschaften dieser Kulturen sind ihr grau-grünes Luftwachstum, die kurzen Sporophoren mit runden dornigen Sporen, und das wärmeharte (thermodur) Wachstum. Die Kulturen werden nicht als thermophil betrachtet da sie bei Temperaturen von etwa 18° C wachsen, während thermophile gewöhnlich unterhalb 400C nicht wachsen. Die neuen Isolate und der Kulturtyp produzieren Lincomycin bei 45°C. Unterschiede in den Kultureigenschaften (siehe Tabellen) und antagonistischen Eigenschaften beeinflussen nicht die oben erwähnten signifikanten Kriterien und sind nicht ausreichend, um eine Varietätsbezeichnung dieser neuen Isolate zu gewährleisten. Sie werden daher in
Übereinstimmung mit Regel 8, Empfehlung 8a(3) Typ des internationalen Codes der Nomenklatur von Bakterien (International Code of Nomenclature of Bacteria (1966), Herausg. Editorial Board of the Judical Commission of the International Committee on Nomenclature of Bacteria, Intern. J. System. Bacteriol. 16: 459—490) als Biotypen bezeichnet (es wird empfohlen, daß die Bezeichnung Biotyp oder physiologischer Typ für infrasubspezifische Formen verwendet wird, basierend auf Unterschieden in physiologischen oder biochemischen Eigenschaften). Die Isolate werden als Streptomyces espinosus Biotyp 21 987a, Streptomyces espinosus Biotyp 22 061a und Streptomyces espincsus Biotyp 22 149a bezeichnet.
Tabelle 1
Aussehen von Streptomyces espinosus-Kulturen auf Ektachrome
Agar-Mediuma)
NRRL 5729
NRRL 5730
NRRL 5731
Bennett
S
R
Czapek's Saccharose
S
R
grau-grün
blaßgelb-braun
grau-grün
blaß grau
weiß bis graugrün
blaßgelb
grau-grün
blaß grau
grau-grün
blaßgelb-braun
grau-grün
blaß grau
5
Fortsetzung		 24 18 460 6
Agar-Medium*) NRRL 5729 NRRL 5730 NRRL 5731
Maltose-Trypton
S
R		 grau-grün
gelb-braun bis oliv		 grau-grün
gelb		 grau-grün
gelb-braun
iPepton-Eisen
S
R		 weiß
gelb		 weiß
gelb		 weiß
gelb-Iederfarben
0,1% Tyrosin
S
R		 farblos
rot		 farblos
rot		 grau-grün
rot
Casein-Stärke
S
R		 grau-grün
blaß grau-grün		 grau-grün
blaß grau-grün		 grau-grün
blaß ^ au-grün
a) S = Oberfläche, R = Unterseite.
Tabelle 2 von S. espinosus-KuIturen NRRL Aufl. 1948(1)") NBS-Circular 553, 1955 (2)c) NRRL
Referenz-Farbeigenschaften Color Harmony Manual, 3 5730 NRRL NRRL NRRL 5731
J Agar-MediunV) NRRL 5731 5729 5730
5729 a 122 gm
24Vi ih 24 Vi fe 263 gm 263 gm
Bennett a 122 m 122 m
': S 24'Λ ih 127 g 127 g
i- Ige l'/2gC 109 gm 90 gm
.' 2ec 89 gm 102 g 90 gm
Vh ca Vhcc 87 g 105 gm 93 m
R 2fb 89 m
2ec - 90 gm
-
- 2 ig 110 g
P 2 ig llOgm HOg 112m
Czapek's-Saccharose 1 Ii 2fe 112m 112m 121 m
S 2 ig £ CC 112m 94 g 122 g
lec 121 m 112gm
R 2 ig 122 g
- HOg
- 112m
- 3ba 122 gm
P 24Vi ih 241A fe 122 gm -
Maltose-Trypton 24'Λ fe 112m 122 m
S 1 ih 2 ic 113g 127 g 106 gm
l'/iie 90 gm 87 gm
2 gc 109 gm
R 1 '/2 ge
Fortsetzung
Agar-MediumJ)
Color Harmony Manual. 3. Aufl. 1948 (l)b)
NRRL NRRL NRRL
5729 5730 5731
NBS-Circular 553, 1955 (2)c) NRRL 5729
NRRL
5730
NRRL
5731
Hickey-Tresner
(modifiziert)		 lig
S 2ee
R -
P
Hefe-Extrakt-Malz-Extrakt
(ISP-2)		 24 '/> ih
S 2 ih
2gc
R 2 ie
3ba
24'/2 ih 2 gc
24V2 ih
21 e
24V2 ih
2 gc
247: ih
2gc
109 gm — 122 m
HOg 127 g 127 g
90 gm 90 gm 90 gm
122 m 12/ g 122 m 113g
90 gm
91 gm 94 g
122 m 12/g
88 gm 94 g
122 m U/g
90 gm
Hafermehl (ISP-2)
S
2 ig 2fe
1 ec 2ec
24'/2fe
2ec
24'/2 ih
2ec 109 gm HOg 94 g 112gm 121 m 90 gm
122 gm
90 gm
122 gm
90 gm
Anorg. Salze-Starke (ISP^l)
S
Glycerin-AsDaragin
(ISP-5)
24'/2 ih 1 ih
2gc 2ec
a
2fe
2gc 2 ge
24'/2 ih
2gc 2ec
3ba 241A fe
2 ge
24'Λ ih
2ec 2 ig
2 ge
122 m 122 m 122 m
112m
H3g
90 gm 90 gm 90 gm
90 gm 90 gm HOg
112m
2,63 gm - -
94 g 122 gm
112gm
90 gm 94 m 94 m
94 m 109 gm 109 gm
109 gm
a) S = Oberfläche, R = Unterseite, P = Pigment.
b) Chips von glänzender Oberfläche abgel.
c) Chip-Oberfläche: m (matt), g (glänzend), gm (glänzend oder matt).
(1) Jacobson, E., W. C. Granviile und C. E. Foss. (1948). Color harmony manual, 3. Aufl. Container Corporation of Amerika, Chicago, liiinois.
(2) Kelly, K. L. und D. B. Judd (1955). »The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names«. US-Dept Comm. Circ 553.
ίο
Tabelle 3 Tabelle 2 (1) NBS Circular 553,(1955)(2)
Farbcode für Color Harmony Manual Farbname
3. Aufl. (1958) Farbe Farbname
Farbe weiß Chip
Chip hell zitronen-grau. 263 gm weiß
a gelblich hellgrau 121 m blaß gelb-grün
1 ec
zitronen-grau 122 g glclUlllfl gCIU-glUM
oliv-grau 109 gm hell gräulich-oliv
Ige 109 gm hell gräulich-oliv
Hg oliv-grau 110g gräulich oliv
112m hell oliv-grau
I ih 113 g oliv-grau
hell oliv graubraun 127 g gräulich olivgrün
creme llOgm gräulich oliv
11 i biscuit, ecru, hafermehlf., 89 gm blaß gelb
1 '/2 ca sandf. 90 gm gräulich gelb
1 '/2 ec staubig gelb 93 m gelblich grau
102 g mäßig grünlich-gelb
1 '/2 gc hell oliv-grau 105 gm gräulich/grünlich-gelb
hell oliv 109 gm hell gräulich-oliv
Vh ge olivgrau 196 gm hell oliv
1 '/2 ie hell elfenbeinf.-eierschaler.·". - -
Γ/2 ig hell weizen/maisf. 89 gm blaß gelb
2 ca biscuit, ecru, hafermehlf., 86 gm hellgelb
2ea sandf. 90 gm gräulich-gelb
2ec bambus, lederf., strohf.,
weizenf. 87 g mäßig gelb
2fb gedeckt grau 89 m blaßgeib
94 g hell oliv-braun
2fe bambus, chamois 122 gm hell oliv-grau
gedeckt braun, griege 90 gm gräulich gelb
2gc 94 m hell oliv-braun
2 ge honiggold, hell gold 109 gm hell gräulich-oliv
hell senf-braun 87 gm mäßig gelb
2 ic 91 gm dunkel gräulich-gelb
2 ie 94 g hell oliv-braun
schieferbraun 106 g hell oliv
HOg gräulich-oliv
2 ig 112m hell oliv-grau
24 it - (I) 18 460 12
Farbname
Fortsetzung Color Harmony Manual 553,(1955)(2)
3. AuH. (1958) dunkel gedeckt grau NBS Circular
Farbe Farbname
['; Chip senf, altgold Farbe
: ·;. 2 ih Chip hell oliv-grau
perlenf., muschelf. 112m oliv-grau
H 2 le beige-grau, mausf. 113g dunkelgelb
88 gm hell oliv-braun
3ba hell misielgrau 94 g -
3 ih mistelgrau - oliv-grau
113g mittelgrau
24'Λ fe 265 m gräulich gelbgrün
24'Λ ih 122 gm gräulich gelbgrün
122 m gräüiiCn OiiV-grUn
127 g
(1) Jacobson, E., W. C. Granville und C. E. Foss (1948), Color harmony manual, 3. Aufl.. Container Corporation of Amerika, Chicago, Illinois.
(2) Kelly, K. L. und D. B. Judd. (1955). »The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names«. U. S. Dept. Coram. Circ. 553.
Tabelle 4
Kultur- und biochemische Eigenschaften von Streptomyces espinosus-Kulturen
Medium") NRRL 5729 NRRL 5730 NRRL 5731
Agar
Pepton-Eisen
S grau-weiß bis grau-grün Spur grau-grün-weiß grau-grün-weiß
■ R gelb gelb gelb
; O Melanin-negativ Melanin-negativ Melanin-negativ
., Calciummalat
Crt Spur grau-grün Spur grau-grün Spur grau-grün
13 R blaß grau blaß grau blaß grau
i ° Malat wird nicht solubilisiert Malat wird nicht solubilisiert Malat wird nicht solubilisiert
■ϊ Glucose-Asparagin
;- S grau-weiß bis Spur grün mäßig grau-weiß mäßig grau-weiß
% creme creme creme
I Magermilch
Crt weiß am Rand weiß am Rand weiß am Rand
bis grau-grün rosa
R gelb-lederf. gelb-lederf. gelb-lederf.
O gelb-lederf. Pigment gelb-lederf. Pigment gelb-lederf. Pigment
Casein wird während Casein wird während Casein wird während
Wachstum vollständig Wachstum solubilisiert Wachstum solubilisiert
solubilisiert 'j
Tyrosin
S gut bis schwer grau-grün gut grau-grün gut grau-grün
R rot-lederf. rotbraun rot-lederf. rot-lederf.
O rot-lederf. bis rotbraun roMederf- Pigment rot-lederf. Pigment
Pigment
Tyrosin wird solubilisiert Tyrosin wird solubilisiert Tyrosin wird solubilisiert
Fortsetzung 13 24 18 460 14
M cdi UTi'') NRRL 5729 NRRL 5730 NRRL 5731
Xanthin
S
R
0		 gut grau-grün
blaßgelb-grün bis creme
Xanthin wird nicht
solubilisiert 		gut grau-grün
creme
Xanthin wird nicht
solubilisiert		 gut grr.u-grün
creme
Xanthin wird nicht
solubilisiert
Nährstärke
S
R
O		 gut grau-grün
creme-oliv
Stärke wird hydrolysiert		 gut grau-giun
cienv-oliv
StäiKe wird hydrolysiert		 gut grau-grün
creme-oliv
Stärke wird hydrolysiert
Hefeextrakt-
Malzextrakt
S
R		 gut grau-grün
creme-gelb-lederf.		 gut grau-grün
creme-gelb-lederf.		 gut grau-grün
ei eme-gelb-lederf.
Bennett
S
R		 grau-grün-weiß bis
schwer-grau-grün
creme bis oliv		 Spur gpiu-creme
gelb		 creme
gelb
Czapek s-
Saccharose
S
R		 grau-grün
grau-grün		 grau-grün
grau-grün
Maltose-
Tiypton
S
R		 gut bis schwer grau-grün
oliv bis creme		 grau-grün-weiß
gelb
Hickey-Tresner
(modifiziert)
S
R		 schwer grau-grün
creme		 grau-grün-weiß
tief gelb-lederf.
Pepton-Hefe-
extrakt-Eisen
(ISP-6)
S		 blaßrosa bis grau-grün creme bis blaßrosa
O Melanin-negativ Melanin-negativ
Tyrosin (ISP-7)
S
R
O		 grau-grün-weiß bis
grau-grün
blaß gelb-grün bis
grau-creme
Melanin-negativ		 grau-grün
grau-creme
Melanin-negativ
Gelatine
einfach
O		 farblos veeetatives Wachst grau-weißes Luftw
bis grau-weißes Luftwachst, Verflüssigung vollständig
Verflüssigung 'h bis vollständig
grau-grün grau-grün
blaß grau-grün gelb-oliv
grau-grün gelb-oliv
creme mit Spur grau-grün bis blaßrosa Melanin-negativ
grau-grün
grau-creme
Melanin-negativ
grau-weißes Luftwachst, Verflüssigung vollständig
Fortsetzung 15 24 18 460
16
Medium3) NRRL 5729 NRRL 5730 NRRL 5731
Nähr-
Brühe
Synthetisches
Nitrat
Nähr-Nitrat
O
Lackmusmilch
O
weißes bis grau-weißes Luftw., Verflüssigung 1A bis vollständig
Spur weiß bis rosa-creme Luftwachst, a. Oberfl.haut, Wachst i. ganz:n Medium, Nitrat wird nicht z. Nitrit reduziert
grau-grün-weißes Luftw. a. Oberfl.haut, flockiges Bodenwachst., Nitrat w. nicht z. Nitrit reduziert
rosa-lederf. bis grau-grünes Luftwachst, auf Oberfl.ring; Lackmus wird reduziert; Peptonisierung; pH 7,3
grau-weißes Luftw.,
Verflüssigung vollständig
Spur weißes Luftw.
a. Oberfl.haut, Wachst
i. ganzen Medium, Nitrat
wird nicht z. Nitrit reduziert
grau-grün-weißes Luftw.
p.. Oberfl.haut, flockiges
Bodenwachst., Nitrat w.
nicht z. Nitrit reduziert
lederf. Luftwachst, auf
Oberfl.ring; Lackmus
wird reduziert; Peptonisierung; pH 7,3
Spur grau-weißes Luftw., Verflüssigung vollständig
Spur weißes Luftw. a. OberfLhaut, Spur Wachst i. ganzen Medium, Nitrat wird nicht z. Nitrit reduziert
Spur weißes Luftw. a. Oberfl.haut, kompaktes b. flockiges Bodenwachst, Nitrat w. nicht z. Nitrit reduziert
grün-weißes Luftwachst, auf Oberfl.ring; partielle Reduktion; partielle Peptonisierung; pH 7,1
a) S = Oberfläche, R = Unterseite. P = Pigment, O = andere Eigenschaften.
Tabelle 5 in ^vnthptisrhpm 35 NRRL NRRL NRRL 107-114. NRRL NRRL Medium
ill oyi'Liiwwovii&iiJ
(D 		5729 5730 5731 5729 5730
Verwertung von Kohlenstoffverbindungen durch
Streptomyces espinosus-Kulturen
Medium von Pridham und Gottlieb		 NRRL NRRL 24. Na-Formiat (-) - (+) (+)
5730 5731 25. Na-Oxalat (-H), (-) (H-) (+) Vergleich
Negatives Grundmedium -,±" ±		 NRRL
NRRL 4 U 26. Na-Tartrat (-), - (H-) (+) Positives Grundmedium + + 5731
5729 27. Na-Salicylat - plus D-Glucose
(+) (+) 28. Na-Acetat (+) (H-) (+) Verwertung von Kohlenstoffverbindungen durch Strep
+ +
-|- -f. 		29. Na-Citrat (H-) + (+) tomyces espinosus-Kulturen in synthetischem +
Vergleich (-)" 4 5 30. Na-Succinat (-) (H-) (+) von Shirling und Gottlieb (1) +
1. D-Xylose +
T I _ArahinnQP -f" 		+ + (1) Pridham. T. G. und D. Gottlieb (1948). »The ι utilization
+ + of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid
J. IxIIaIUIIUbG >
4. D-Fructose (+) +
5. Galactose +		 + + 50 for species determination«, J. Bacteriol. 56:
+ = gute Verwertung,
(-) = zweifelhafte Verwertung,
6. D-Glucose + + H- ( + ) = schlechte Verwertung,
7. D-Mannose + -) (H-) (H-) = kein Wachstum,
8. Maltose + + + " = Ergebnisse verschiedener Untersuchungen.
9. Saccharose (-), (H + +
10. Lactose H- (+) (+) 55 Tübcllc 6
11. Cellobiose + + +
12. RafTinose (-) (+) (+)
13. Dextrin + + +
14. Insulin (-) + +
15. iösl. Stärke H- (+) (+) IjO
16. Glycerin + + +
17. Dulcit (-)
18. D-Mannit + (+) (+)
19. D-Sorbit (-)
20 Inosit (+)
21. Salicin (+)		 _
22. Phenol (-)
23. Krcsol
308 121/79
Fortsetzung
NRRL 5729
NRRL NRRL 5730 5731
Kohlenstoffverbindungen L-Arabinose ±, + ± ± Saccharose ±, — — —
D-Xylose ±,++ ++ ++
Inosit ±,+ ++ ++
D-Mannit ++ ++ ++
D-Fructose ±,+ ++ ++
Rhamnose ++ ++ ++
Rafünose — — —
Cellulose ±, - + +
(1) Shirling, E.B. und D. Gottlieb (1966), »Methods for characterization of Streptomyces species«. Int J. Syst. Bacteriol. 16: 313-340.
++ starke Verwertung,
+ positive Verwertung,
± Verwertung zweifelhaft,
— negative Verwertung,
" Ergebnisse verschiedener Untersuchungen.
Lincomycin wird durch die erfindungsgemäß vorgesehenen neuen Mikroorganismen produziert, wenn diese in wäßrigem Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen gezüchtet werden. Für begrenzte Mengen können selbstverständlich auch Oberflächenkulturen und Flaschen verwendet werden. Die Organismen werden in einem eine Kohlenstoffquelle, z. B. ein assimilierbares Kohlehydrat, und eine Stickstoffquelle, z. B. eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder eiweißartiges Material enthaltenden Nährmedium gezüchtet. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind z. B. Glucose, Kochzucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melassen und dergl. Bevorzugte Stickstoffquellen sind z. B. Maisquellwasser, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, mit Pankreas verdautes Kasein, Rückstände der Alkoholdestillation, tierische Peptonflüssigkeiten, Fischmehl, Fleisch- und Knochenschnitzel und dergl. Auch Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können mit Verteil verwendet werden. Spurenmetalle, z. B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergl., müssen gewöhnlich nicht zugesetzt werden, da man mit Leitungswasser und ungereinigten Ausganpsmaterialien arbeitet.
Die Herstellung des Lincomycins wird im erfindungsgemäßen Verfahren bei einer Temperatur von 44 bis 48° C und vorzugsweise bei 45° C durchgeführt Gewöhnlich erhält man eine optimale Lincomycin-Produktion innerhalb etwa 2 bis 10 Tagen. Das Medium bleibt gewöhnlich während der Fermentation basisch. Der End-pH-Wert hängt teilweise von den gegebenenfalls vorhandenen Puffern und teilweise vom Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums ab.
Wird das Wachstum in großen Gefäßen und Tanks durchgeführt, so verwendet man vorzugsweise zur Inokulierung die vegetative und nicht die Sporenform des Mikroorganismus, um einen spürbaren Zeitverlust bei der Produktion des Lincomycins, mit gleichzeitiger unwirtschaftlicher Ausnützung der Anlage, zu vermeiden. Es empfiehlt sich daher, das vegetative Inokulum in einer Nährbrühenkultur zu erzeugen, indem man diese Brühenkultur mit einer Probe einer Boden- oder Schrägnährkultur inokuliert Sobald ein junges, aktives vegetatives Inokulum auf diese Weise sichergestellt ist, wird es aseptisch in große Gefäße oder Tanks überführt Das Medium, in dem das vegetative Inokulum produziert wird, kann dem Produktionsmedium gleich oder von diesem verschieden sein, solange nur ein gutes
ίο Wachstum der Mikroorganismen erreicht wird
Das erfindungsgemäß hergestellte Lincomycin kann nach dem Verfahren der US-PS 30 86 912 aufgearbeitet werden. Gemäß einem zweckmäßigen Aufarbeitungsverfah ren werden Mycel und ungelöste Feststoffe in konventioneller Weise abgesondert, z. B. durch Filtrieren und Zentrifugieren. Das Lincomycin wird dann aus der filtrierten oder zentrifugierten Brühe erhalten, indem man diese über ein Harz leitet, welches aus einem nichtionischen makroporösen Styrolcopolymer, das mit Dävinyibenzo! vernetzt ist, besteht Harze dieser Art sind aus der US-PS 35 15 717 bekannt Als Beispiel sei das Harz »Amberlite XAD-2« angegeben. Das Lincomycin wird aus dem Harz mit einem Lösungsmittelsystem aus Methanol/Wasser (Volumenverhältnis 95 :5) eluiert Bioaktive Eluatfraktionen werden durch einen Standardplattentest unter Verwendung des Mikroorganismus Sarcina lutea ermittelt Die biologisch aktiven Fraktionen werden dann vereinigt und zu einer wäßrigen Lösung eingeengt, die gefriergetrocknet wird. Das gefriergetrocknete Material wird mit Methylenchlorid verrieben, der Methylenchlorid-Extrakt wird zur Trockene eingeengt und der Rückstand wird mit Aceton verrieben. Das Filtrat wird mit Äther vermischt, wobei man einen Niederschlag erhält, der abgetrennt wird. Das restliche Filtrat wird mit 1 n-methanolischem Chlorwasserstoff vermischt, wobei das farblose Lincomycinhydrochlorid ausgefällt wird. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und aus Wasser/Aceton kristallisiert; dabei erhält man das kristalline Lincomycin-hydrochlorid.
Im folgenden Beispiel beziehen sich sämtliche Prozentangaben auf das Gewicht und sämtliche Lösungsmittelanteile auf Volumenanteile, falls nichts anderes gesagt wird.
Beispiel
Ein Schrägnährboden von Streptomyces espinosus NRRL 5729 wird zur Inokulierung eine: 500 ml-Erlenmeyerkolbens verwendet, der 100 ml steriles Impfmedium folgender Zusammensetzung enthält:
Glucosemonohydrat 25 g/l
Baumwollsamenmehl 25 g/l
Leitungswasser Rest
Vorsterilisierung pH = U
Die Kolben werden 3 Tage auf einer Schüttelmaschine bei 28°C gehalten.
Das obige Impfinokulum wird zur Inokulierung einer Reihe von 500 ml Ei lenmeyerkolben verwendet, die jeweils 100 ml steriles Medium folgender Zusammensetzung enthalten:
Sojabohnenmehl*) 35 g/l
Magermilch 10 g/l
Czapek-Dox-Brühe 10 g/l
CaCO3 3 g/l
Folyalkylenglycr« als
flussiger Entschäumer
Vorsterilisiening
*) Feingemahlenes, einer
SojabohnenmehL
20mI/l
pH =7,2
Fettextraktion unterworfenes
10
15
Jeder Kolben wird mit 5 ml des Impfinokulums pro 100 ml Fermentationsmedium inokuliert Einige Kolben werden bei 28° C, andere bei 45° C auf einer rotierenden Schottelmaschine mit 250 Umdrehungen pro Minute und einer Exzentrizität von 6,3 cm inkubiert
Das am Beispiel von S. espinosus NRRL 5729 beschriebene Verfahren wird mit NRRL 5730 und 5731 wiederholt Die Ergebnisse dieser Fermentationen sind aus der vorstehenden Tabelle A ersichtlich.
Mögliche Aufarbeitung der Fermentationsbrühe
Die auf obige Weise erhaltene gesamte Fermentationsbrühe (etwa 41) wird unter Verwendung von Diatomeen-Erde a5s Filterhilfsmittel filtriert Der Filterkuchen wird mit 1 Liter Wasser gewaschen und die wäßrige Waschlösung wird mit dem Filtrat vereinigt Die resultierende Lösung wird als »klare Brühe« zur Seite gestellt Der Filterkuchen wird zweimal mit je 700 ml Methanol verrieben, der Methanolextrakt wird als »MEOH-Extrakt« zur Seite gestellt Die klare Brühe wird dann mit einer Fließgeschwindigkeit von 25 ml/ Min. durch eine Säule geleitet, die 250 ml Ionenaustauscher enthält Die austretende Brühe wird als eine Fraktion (verbraucht) zur Seite gestellt Dann wird die Säule mit 500 ml Wasser gewaschen, die wäßrige Waschlösung wird als eine Fraktion aufbewahrt Sodann wird die Säule mit 95%igem -väßrigem Methanol eluiert, wobei 20 ml-Fraktionen aurgefa/ ^en werden. Die Ergebnisse (Test gegen S. lutea) lauteten wie folgt:
Zone (mm)
klare Brühe 38
»Verbraucht« 19
Waschlösung 20
Fraktion Nr.
2 16
4 14
Fraktion Nr, 14,5
5 36
6 49
7 51
8 52
9 51
10 47
12 43
14 40
16 37
19 34
20 35
25 29
30 30
35 27
40 26
45 24
50 28
55 24
60 19
65 11
70 —
75 11,5
80 Spuren
85 Spuren
90 0
95 10
100
Die Fraktionen 6 bis 60 werden vereinigt, die Lösung wird zur Trockene eingeengt, wobei man 3,5 g eines Lincomycinpräparates mit 310 meg Lincomycin/mg erhält Dieses Material wird mit Methylenchlorid verrieben, der Methylenchloridextrakt wird zur Trockene eingeengt und der Rückstand wird mit Aceton verrieben. Das Filtrat wird mit Äther vermischt, wobei ein Niederschlag entsteht, der abgetrennt wird. Das restliche Filtrat wird mit 1 n-methanolisclvai Chlorwasserstoff vermischt, wobei farbloses Lincomycinhydrochlorid ausfällt Dieser Niederschlag wird abfiltriert und aus Wasser/Aceton kristallisiert, wobei kristallines Lincomycin-hydrochlorid erhalten wird.

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Lincomycin durch aerobes Züchten von Streptomyces espinosus bei einer Inkubationstemperatur von 44 bis 48° C in einem wäßrigen Nährmedium, bis das Medium durch Lincomycinproduktion eine wesentliche antibiotische Wirksamkeit erhalten hat, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stämme Streptomyces espinosus NRRL 5729, 5730 oder 5731 züchtet
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei 45° C durchführt Biolyp
Temp. Tag pH
Licomycin μg/ml♦)
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