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DE2601398A1 - Neues antibiotikum - Google Patents

Neues antibiotikum

Info

Publication number
DE2601398A1
DE2601398A1 DE19762601398 DE2601398A DE2601398A1 DE 2601398 A1 DE2601398 A1 DE 2601398A1 DE 19762601398 DE19762601398 DE 19762601398 DE 2601398 A DE2601398 A DE 2601398A DE 2601398 A1 DE2601398 A1 DE 2601398A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
antibiotic
acid
medium
yellow
growth
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19762601398
Other languages
English (en)
Inventor
Alexander Demetrios Argoudelis
Fritz Reusser
Howard Arnold Whaley
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pharmacia and Upjohn Co
Original Assignee
Upjohn Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Upjohn Co filed Critical Upjohn Co
Publication of DE2601398A1 publication Critical patent/DE2601398A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07GCOMPOUNDS OF UNKNOWN CONSTITUTION
    • C07G11/00Antibiotics
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/803Physical recovery methods, e.g. chromatography, grinding
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215Microorganisms
    • Y10S435/822Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)

Description

ALFRED HOEPPENER
DR. JUR. Dl·-L-CHiEM. H.-J. WOLFP H, J^ 197g
DR. JUR. HAfJS Ci-!si. BEIL
61% FRAH X i ι; is T A M MAl N - HOCHSl
Unsere Nr. 20 511
The Upjohn Company Kalamazoo, Mich., V.St.A.
Heues Antibiotikum
Das erfindungsgemäße neue Antibiotikum U-47 929 wird erhalten, indem man Streptomyces ficellus Dietz, sp. n., KREL 8067 in wässrigem Fährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet· Das Antibiotikum U~47 929 und dessen Säureadditionssalze besitzen die Eigenschaft, das Wachstum gram-positiver Bakterien wie zum Beispiel Staphylococcus aureus, Sarcina lutea, Streptococcus hemolyticus, Diplacoccus pneumoniae negativ zu beeinflussen. Das Antibiotikum U-47 929 ist besonders gegen S.aureus in vitro und in vivo bei Mäusen wirksam.
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U-47 929 und dessen Säureadditionssalze könne9"aher allein oder in Kombination mit anderen antibiotisehen Mitteln eingesetzt werden zur Verhütung des Wachstums oder Verminderung der Anzahl von Bakterien in verschiedenen Milieus.
Chemische und physikalische Eigenschaften von U-47 929
Summenformelί C«-zHo .N^-CU (durch hochauflösende Massen-
13 24 6;
spektrometrie bestimmt) Elementaranalyse;
Ber. C: 50,00; H: 7,69; N: 26,92; 0: 15,38.
gef. C: 46,27; H: 7,59; N: 25,05. Molekulargewicht: 312,1929 (durch Maesenspektrometrie) Schmelzpunkt: zersetzt sich innerhalb eines breiten
Temperaturbereichs.
Spezifische Drehung: #$7 £ = +39° (c = 1, Wasser) Löslichkeiten: Das Antibiotikum U-47 929 ist löslich
in Wasser und niederen. Alkoholen wie zum Beispiel Methanol und Äthanol, relativ unlöslich in Ketonen, halogenierten oder gesättigten Kohlenwasserstofflösungsmitteln, Äthylacetat oder anderen esterartigen Lösungsmitteln.
Ultraviolettabsorptionsspektrenι Kein Maximum zwischen 220 und 400 mn.
Titrationswerte: Das Antibiotikum U-47 929 verhält sich wie eine sehr starke Base. Die Titration mit wässriger KOH zeigt keine titrierbare Gruppe. Die Titration mit wässriger HCl ergibt ein Ag1Uivalentgewicht von 288. Die Titration einer Lösung des Antibiotikums U-47929 in Essigsäure mit Perchlorsäure ergibt ein Äquivalentgewieht von 292· Infrarotabsorptionsspektren: U-47929 besitzt ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum in Mineralöl, siehe Figur 1. Peaks werden bei folgenden Y/ellenlängen. (in cm" ) beobachtet:
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Bandenfrequenz (Wellegzahl).
3350 3170 3070 2960 2920 2850 1640 1592 1518 1467 1377 1312
1265 1242
1195 1170 1150 1104 1083 1040 1020
968
932
890
832
802
745
720
U-47929 besitzt auch ein charakteristisches Infrarotspektrtim in einer KBr-Scheibe. Peaks werden bei folgenden Wellenlängen beobachtet:
Intensität (Schulter)
2601398 S Öl
S Öl
s, Öl
s,
s,
s,
S Öl
S Öl
S
s,
s,
HL
m
m Sch
W Sch
m Sch
w,
w, Sch
w,
W
W,
W Sch
W
W Sch
m, Öl
m
m,
m,
609830/089 4
Ba η. de nf r e qu e η (Wellenzahl)
3370 3180 2960 2870 2210
1645
1600 '
1518
1469
1390
1312
1265
1242
1195
1171
1150
1102
1040 1020
968 932 832 800 748 712 655
Die Intensitäten der Infrarotbanden werden in vorliegender Beschreibung mit "s", "i" und "w" angegeben, wobei die Angaben sich auf den Hintergrund in der Umgebung der Banden bez-iehen. Eine "s"-Bande ist von gleicher Größenordnung der Intensität wie die stärkste Bande im Spektrum. "m"-Banden
Sch
2601398
Intensität
S
S
S Sch
m Sch
W
S Sch
S
S
m Sch
S
m,
m
m
m
m
m,
w,
W
W
w,
m
W
m,
m
zn
m
m
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"5" 260 Ί 398
sind 1/3 bis 2/3 so intensiv wie die stärksten Banden, und "w"-j3anden sind weniger als 1/3 so intensiv wie die stärkste Bande. Diese Schätzungen erfolgen auf der Basis einer prozentualen Transmissionsskaia.
Kernmagnetische Resonanz
Das NMR-Spektrum des Antibiotikums U-47929 bei 60 MHz zeigt Figur 2. Das NMR-Spektrum wurde mit einem Varian A-60 Spektrometer an einer Lösung (ca. 0,5 ml, etwa 15?£ ige Konzentration) der Probe in Deuteriumoxid aufgenommen. Das Spektrum wurde gegen Tetramethylsilan als innerem Standard kalibriert und die Genauigkeit von Δ γ betrug* + 1c«p.s. Die !Frequenzen wurden in cps feldabwärts vom Tetramethylsilan aufgenommen.
Antibakterielle Wirkung von U-47929
Organismus Nr. des Inhibierung (ug/ml) Stammes ^
Staphylococcus aureus UC 76 62,5
Staphylococcus aureus UG 570 125
Staphylococcus aureus UC 746 62,5
Diplococcus pneumoniae UC 41 500
Bemerkung: UC betrifft die Kulturensammlung der Upjohn Com= pany.
Das obige antibakterielle Spektrum wurde mittels eines Mikro= platten-Brühenverdünnungstests erhalten, wobei als Medium BBL Streptomycin-Testbrühe und Agar (pH 7,9) verwendet wurde· Das Verdünnungsmittel war 0,05-molarer Phosphatpuffer vom pH 8,0.
Mit Staphylococcus aureus UC 96 infizierte Mäuse wurden durch
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26Q1398
subkutane Injektion mit einer CD™ von 6,2 (4,3 - 8,8) mg/kg des Antibiotikums U-47929 geschützt· Auch mit Staphylococcus aureus UC 3090 (resistent gegen Streptomycin) oder Staphylo= coccus aureus UC 571 (resistent gegen Erythromycin und Lincosaminide)infizierte Mäuse wurden mit CD1-Q1S 10 (7,4 - 14) und 11 (7,3 - 16) mg/kg des Antibiotikums bei subkutaner Verabreichung geschützt.
Die vorstehend erwähnten UC-Kulturen können auf Anfrage von der The Upjohn Company, Kalamazoo, Michigan bezogen werden.
Zur Produktion von U-47929 verwendet man den Mikroorganismus Streptomyces ficellus Dietz, sp. n., NBHL 8067· Eine .Subkultur dieses Mikroorganismus kann vom Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U.S.A. aus der permanenten Sammlung bezogen werden.
Der erfindungsgemäße Mikroorganismus ist ein Streptomyces, der in die "Lavendulae-Roseus-Reihe" von Gauze (Gauze, Go F.,T. P. Preobrazhenskaya, E. S. Kudrina, N. 0. Blinov, I. D. Ryabova und M. A. Iveshnikova (I957)i "Problems in the classification of antagonistic actinomyeetes", State Publishing House for Medical Literature, Moskau, Übersetzung d. engl. Ausgabe durch Fritz Danga; David Gottlieb (Herausg.) The American Institute of Biological Sciences, Washington, D.C))ZUm Streptomycetin mit cinnamomeus-Luftmyeel" von Hütter (Hütter, R. (1967), "Systematik der Streptomyceten", S. Karger, Basel, S. 382), oder die "Rote Reihe" (17.44C)" von Pridham und Tresner, s. Bergey's Manual, 8. Aufl. (Buchanan, R. E. und N. E. Gibbons (1974), "Fergey's Manual of Determinative Bacteriology;, 8. Aufl., The Williams & Wilkins Co., Baltimo:»^ eingeordnet werden kann. Die neue Kultur läßt sich leicht von den in obiger Literatur zitierten Species und von Kulturen der Upjohn-Sammlung unterscheiden.
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In tabelle 4 werden die Unterschiede gegenüber Streptomyces virginiae (Grundy, Y/. E., A. L. Whitman, E. J. Rdzok, M. E. Hanes und J. G. Sylvester (1952) "Aetithiazic Acid. 1 Microbiological Studies". Antibiotics & Chem. 2:399 408), der Kultur aus obigen Gruppen, der der Mikroorganismus am nächsten zu kommen scheint, aufgeführt.
Aufgrund der in Tabelle 4 angegebenen Unterschiede und der fehlenden Korrelation von Eigenschaften mit in obiger Literatur genannten Kulturen wird das neue Isolat als neue Strep= tomyces-Art betrachtet. Es wird mit Streptomyces ficellus Dietz sp· n. benannt. Der Name leitet sich vom Wort "ficelle", der französischen Bezeichnung für das Wort Faden, ab. Die Sporen der Kultur erscheinen fadenförmig. Es versteht sich, daß diese Kultur die Typenspeeies ist und, falls Kulturen mit ähnlichen Eigenschaften isoliert werden, als Typenvarie betrachtet wird.
Farbeigenschaftens Luftwachstum weiß bis blaßcremefarben oder blaß pfirsichfarben bis blaßrosa bis blaßgrau. Melaninpositiv. Das Aussehen auf Ektachrome zeigt Tabelle 1· Vergleichende Farbeigenschaften liefert Tabelle 2. Die Kultur kann in die rote (R) oder graue (GY) Farbgruppe von Tresner und Backus (Tresner, H. D., und E. J. Backus (1963), "System of color wheels for streptomyeete taxonomy", Appl. Microbiol. 11:335-338) eingeordnet werden.
Mikroskopische Eigenschaften: Sporenketten lang, gerade (RF) bis offenspiralig (RA) bis spiralig (S) im Sinne von Pridham et al. (Pridham, T. G., C. W. Hesseltine, und R. G. Benedict (1958) "A guide for the· classification of streptomycetes according to selected groups. Placement of strains in morphological sections", Appl. Microbiol. 6:52-79)· Die Spo-
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ren erscheinen unter dem Transmissionselektronenmikroskop lang (rechtwinklig mit dreiseitigen Enden) und besitzen eine glatte Silhoutte bei direkter Untersuchung. Bei der Untersuchung von Kohlenstoffreplika-Präparaten ergibt die Sporenoberfläche den Effekt einer Leinwandbindung» Die elektronenmikroskopische Untersuchung erfolgte nach Dietz und Mathews (Dietz, Ao, und J. Mathews (1962) "Taxonomy by carbon replication. Io An examination of Streptomyces hygroscopicus. Appl. Microbiol.- 10:258-263), (Dietz, A., und J. Mathews.C197O> Classification of Streptomyces spore surfaces into five groups. Appl. Microbiol. 21:527-533).
Kultur- und biochemische Eigenschaften: Siehe Tabelle 3·
Kohlenstoffverwertung: Im synthetischen Medium von Pridham und Gottlieb (Pridham, T. G., und D. Gottlieb (1948) "!The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination", J. Baeteriol. 56:107—114) wächst S. ficellus schlecht auf dem Vergleichsmedium (Grundmedium ohne zugesetzte Kohlenstoffverbindung), auf L-Arabinose, Bhamnose, D-J?ructose, Sucrose, Lactose, Raffinose, Inulin, Dulcit, D-Mannit, D-Sorbit, Salicin und Na-tartrat; mäßiges Wachstum auf D-Glucose, Glycerin, Na-acetat, Na-citrat und Na-succinat und gutes Wachstum auf D-Xylose, D-Galactose, D-Mannose, Maltose, Cellobiose, Dextrin, löslicher Stärke und Inosit. Die Kulturen wachsen nicht auf Phenol, Cresol, Na= triumformiat, Natriumoxalat oder Natriumsalicylat. Im synthetischen Medium von Shirling und Gottlieb (Shirling, E. B. und D. Gottlieb (1966), "Methods for characterization of Strepto= myces species", Int. J. Syst. Bacteriol. 16:313-340) wächst S. ficellus auf dem negativen Vergleichsmedium (Grundmedium) und auf dem positiven Vergleichsmedium (Grundmedium plus D-Glucose). Das Wachstum auf D-Xylose und Inosit ist besser als
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auf dem positiven Vergleichsmedium. Das Wachstum auf L-Ara= binose ist gleich wie beim positiven Vergleichsmedium, auf Sucrose und D-tfructose schlechter. Kein Wachstum auf D-Man= nit, Rhamnose, Raffinose oder Cellulose.
Temperatur: S. ficellus besitzt ein gutes vegetatives und Luftwachsturn bei 18 bis 370O auf Czapek's Sucrose, Maltose-Trypton und Hickey-Tresner-Agars und bei 18 bis 320C auf Bennett-Agar. Die Kultur zeigt gutes vegetatives Wachstum auf diesen Medien bei 450C nach 24 bis 48 Stunden· Sie wächst nicht bei 40C, zeigt jedoch ein vegetatives Wachstum nach Stunden bei Reinkubation bei 24°C. Bei 5-5°C wird keine Spur eines vegetativen Wachstums nach 24 bis 48 Stunden beobachtet.
Tabelle 1 auf Ektachrome
Aussehen von Streptomyces ficellus Unterseite
Agar—Medium Oberfläche . gelb
Bennett 's blaßrosa farblos
Czapek's Sucrose sehr blaßrosa lederf.
Maltose-Trypton rosa braun
Pepton-Eisen - rot-lederf.
0,1$ Tyrosin rosa gelb-lederf
Casein/Stärke rosa
Dietz, A. (1954) "Ektachrome transparencies as aids in actinomycete classification", Ann. N.Y. Acad. Sei. 60:152*154.
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Tabelle 2 Vergleich d. Farbeigensehaften von Streptomycea fioellua
Agar-Medium
Beat· Color Harmony Manual 3.Aufl. 1948+ NBS Circular 553, 1955"
Bennett 's
ο Czapek 's
co Sucrose
oo
Maltose
ζ Trypton
CX) CO
4> Hickey-Tresner
S R P S
R P
3cb(g) sand
21e(m) senf, altgold
2ic(m) honiggold, dellgold,
(m) biskuit, ecru, sandf.
2ec
5δ 3dc(gm) natur
3ca(gm) perlrosa, muschelf. 3pe(g) bernsteinf. topas
2ec(g) biskuit, ecru, hafermehlf.
sandft
3ca(g) perlrosa, muschelf* 3ec(g) biskuit, hellbeige
3ic(g) hell bernsteinf. 3dc(m) natur 88 gm dunkelgelb 94g hell oliv-braun 87gm mittelgelb 90gm gräulich-gelb
73gm blaß orange-gelb -ϊ
72m mittel gelblich-braun C{
74gm stark gelblich-braun 90gm gräulich-gelb
73gm blaß orange-gelb
^9gm hell gräulich-gelblich-braun 90 g gräulich-gelb 71m mittel orange-gelb 72g dunkel orange-gelb
ro
σ) ο
CD QO
Tabelle 2 (.Fortsetzung)
Agar-Medium
Best.
Color-Harmony Manual 3.Aufl. 1948+
NBS Circular 553, 1955'
CD O CO OO OJ O
O OO CD
Hefeextrakt- S Malzextrakt R (ISP-2) P
Hafermehl S (ISP-3)
R P
anorganische Salze/ S Stärke " H
■ (ISP-4)
5 do(g) weidenkätζchenf.-grau 31c(g)-&ernsteinf., ■ karamellf.
21e(m) senf, altgolä
4ec(m) biskuit, hell rosa-beige
2gc(g) bambus, chamois
5cb(g) -
3ec(g) biskuit, hell beige
5ge(g) pfirsich/lederf.
Glycerin P
S
3dc(g) natur
Asparagin R 3dc(g) natur
(ISP-5) P -
10gm rosa- grau
71m mittelorange-gelb
88gm dunkelgelb
94g hell oliv-braun
32m gräulich-gelblich-rosa 33gm bräunlich-rosa
90gm gräulich-gelb
79gm hell gräulich-gelblich braun
29m mittel gelblich-rosa
39g gräulich-rötlich-orange
S = Oberfläche R = Unterseite P = Pigment
(g) - glänzend (m) = matt, (gm)- glänzende oder matte Oberfläche des Chips
+Jacobson, B., W. C. Granville, und C. E. Poes (1948) "Color harmony manual", 3. Aufl. Container Corporation of America, Chicago
++Kelly, K. L·., und D. B. Judd. (1955) "The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names", U.S. Dept. of Comm. Core. 553, Washington, D.C.
CO CD CX)
Tabelle
Kultur- und biochemische Eigenschaften von Sftreptomyces ficellus
Medium
Oberfläche
Unterseite
weitere Eigenschaften
Agar Pepton-Eisen
Calciummalat
Glueöse-Asparagin cn Magermilch ο
0^ Tyrosin ■^. Xanthin
«> Nährstärke
Etefeextrakt-Malzextrakt Pepton-Hefeextrakt-Eisen
(ISP-6) Tyrosin (ISP-7)
blaß grau-roaa Luft Spur blaßrosa
blaß grau-roaa Spur weiß
weiß blaßrosa
blaßrosa-pf.iraich
schwer blaß lachsf.-
rosa
blaß grau
creme-grau blaß lederf.-braun
creme-grau
blaßgelb
lederf.
gelb-lederf.
gelb
gelb-lederf.
gelb-lederf.
blaß lederf.-braunes Pigment
Melanin-positiv
kein Pigment
Malat wird solubilisiert
kein Pigment
lederf. Pigment
Casein wird nicht bis schwach
solubilisiert
lederf. Pigment
Tyrosin wird solubilisiert
blaßgelbes Pigment
Xanthin wird solubilisiert
bei Wachstum
gelbes Pigment
Stärke wird hydrolysiert
gelb-lederf.
hellbraunes Pigment Melanin +
gelb-braunes Pigment Melanin - negativ
—s, CaJ CD QO
Tabelle 3 (Fortsetzung)
Medium
Oberfläche
Unterseite
weitere Eigenschaften
Gelatine
O CO OO
einfach
Nährgelatine
Brühe Synthet.-Nitrat
Nährnitrat
Lackmusmilch
farbloses vegetatives Wachstum bis Spur weisses Luftwachsturn am Oberflächenring
farbloses vegetatives Wachstum bis Spur weißes Luftwachstum am Oberflächenring
Spur bis gutes vegetatives Oberflächenwachstum
weißes Luftwachstum auf Oberfl.-haut
Vegetatives Wachstum auf Oberfl.-haut oder -ring Dunkel lederf. Pigment 1/5 lederf. Pigment 4/5 vollständ. Verflüssigung
dunkel lederf. Pigment 1/5 lederf. Pigment 4/5 vollständ. Verflüssigung
blaß gelbes bis gut gelbes Pigment, Wachstum durch und durch, kompaktes Wachstum a« Grund,
Nitrat wird nicht zu Nitrit reduziert
kein Pigment
flockiges Bodenwachstum Nitrat wird nicht zu Nitrit reduziert
Lackmus wird reduziert Peptonisierung
pH 8,4
CO CD CO
Tabelle
Vergleich zwischen Streptomyces ficellus und Streptomyces virginiae
T estbedingungen
Streptomyces ficellus Streptomyces virginiae
Stamm·'NA 255-B8, Uü 2002
O CO CO
ISP-Agars 2-5 Pepton-Eisen-Agar ISP-Agars 2-5
Calciummalat-Agar Tyrosin-Agar Nitrat-Brühe
Xanthin-Agar Magermilch-Agar Gelatine Lackmusmilch
Agars - Bennett's Czapek's Sucrose Maltose-Trypton Wachstum bei Hickey-Tresner
Ähnlichkeiten
Vergleichsfarbe rot oder grau Melanin-pdsitiv Sporenketten lang, gerade bis offen spiralig bis spiralig, Sporen lang, glatt mit Oberflächenmuster
Malat wird solubilisiert, Tyrosin wird solubilisiert, Nitrat wird nicht zu Nitrit reduziert
Unterschiede
Xanthin wird schwach solubilisiert Casein wird schwach solubilisiert vollst. Gelatineverflüssigung Lackmus wird reduziert Peptonisierung pH 8,4 Vergleichsfarbe rot
Melanin-positiv
Sporenketten lang, gerade bis offen,
spiral ig bis spiral ig
Malat wird solubilisiert
Tyrosin wird solubilisiert
Nitrat wird nicht zu Nitrit
reduziert
Xanthin wird nicht solubilisiert
Casein wird nicht solubilisiert
teilw. Gela.tineverflüssigung
Lackmus wird nicht reduziert
Keine Peptonisierung
pH 7,7
Kein Y/achstum bei 450C
CO CD OO
est bed ingungen
Tabelle 4 (Fortsetzung) Streptomyces ficellus
Streptomyces virginiae Strain NA 255-B8, UG 2002
Unterschiede
CD
CD
CD
CX)
CO
O
O
OO
CO
Wachstum auf C-Verbindungen in synthetischem Medium
L-Arabinose schlecht
Hhamnose schlecht
D-^ructose schlecht
Eohrzucker schlecht
Lactose schlecht
Haffinose · schlecht
•Inulin schlecht
Dulcit schlecht
D-Mannit schlecht
D-Sorbit schlecht
Salicin schlecht
Na-tartrat schlecht
Inosit sehr gut
D-Xylose sehr gut
produz- Antibiotika U-47929
mittel mittel mittel mittel mittel mittel mittel mittel mittel mittel mittel mittel schlecht mittel
Actithiazinsäure nicht identif. Antipilzmi.ttel
CO CD OO
pq Die erfindungsgemäße neue Verbindung wird erzeugt, wenn man den Mikroorganismus in einem wässrigen Nährmedium unter sub= mer;s en aeroben Bedingungen züchtet. Für die Herstellung begrenzter Mengen können jedoch auch Oberflächenkulturen und Flaschen verwendet werden. Der. Organismus wird in einem Nährmedium gezüchtet, welches eine Kohlenstoffquelle, zum Beispiel ein assimilierbares Kohlehydrat, und eine Stickstoffquelle, zum Beispiel eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder proteinartiges Material enthält. Zu bevorzugten Kohlenstoff quellen gehören Glucose, Rohzucker, Rohrzucker, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melassen und dergleichen. Zu den bevorzugten Stickstoffquellen gehören Cornste.ep Liquor, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, pankreatisch verdautes Casein, Fischmehl, Destillenrückstände, tierische Peptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenschnitzel und dergleichen. Mit Vorteil werden Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verwendet. Spurenmetalle wie zum Beispiel Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt', Eisen und dergleichen müssen den Fermentationsmedien nicht zugefügt werden, da man vor der Sterilisierung des Mediums Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile verwendet.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung kann bei jeder Temperatur, die zu einem befriedigenden Wachstum des Mi= kroorganismus führt, ausgeführt werden, beispielsweise zwischen etwa 18 und 40 . _ und vorzugsweise zwischen etwa 20 und 280C. Gewöhnlich erzielt man eine optimale Produktion der Verbindung innerhalb etwa 5 bis 15 Tagen. Das Medium bleibt während der Fermentation gewöhnlich neutral. Der am Ende vorhandene pH-Wert hängt teilweise von gegebenenfalls anwesenden Puffern und teilweise vom Anfangs-pH des Kulturmediums ab.
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A /> Λ ^ O ^ O
Erfolgt die Züchtung in großen Gefäßen und Tanlcs, verwendet man vorzugsweise die vegetative Form anstelle der Sporenform des Mikroorganismus zur Inokulierung, um einen spürbaren Zeitrückstand bis zur Erzeugung der neuen Verbindung und eine, entsprechend ungünstige Ausnutzung der Anlage zu vermeiden. Man erzeugt daher zweckmäßig ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühenkultur, indem man die Brühe mit einer Bodenkultur, einer flüssigen Np-Agar-Kultur oder einer Schrägnährbodenkultur inokuliert. Sobald ein junges aktives vegetatives Inokulum siehergestellt ist, wird dieses aseptisch in große Behälter oder Tanks überführt. Das Medium, injdem das vegetative In= okulum erzeugt wird, kann gleich oder verschieden von dem zur Produktion der neuen Verbindung verwendeten Medium sein, solange man nur ein gutes Wachstum des Mikroorganismus darin erzielt.
Zur Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindung können zahlreiche Verfahren angewandt werden, zum Beispiel Lösungsmittelextraktion, Verteilungschromatographie, Silikagel= Chromatographie, Flüssig/Flüssig-Verteilung in einer Craig-Vorrichtung, Adsorption an Harzen und Kristallisation aus Lösungsmitteln.
Gemäß einer bevorzugten Methode zur Aufarbeitung wird die erfindungsgemäße Verbindung aus dem Medium zur Züchtung gewonnen, indem man das Mycel und ungelöste Feststoffe in konventioneller Weise absondert, zum Beispiel durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Das Antibiotikum wird aus der filtrierten oder zentrifugieren Brühe isoliert, indem man diese über ein Adsorbens leitet, zweckmäßig ein hochselektives Magnesia/ Silikagel-Adsorbens wie zum Beispiel Florisil (Vertrieb durch The Floridin Company, Pittsburg, Pennsylvania). Das Adsorbens wird mit einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise einem niederen Alkanon und zweckmäßig Aceton, eluiert. Gemäß -uünn-
ORIGINAL INSPECTED 609830/0894
Schichtenchromatographie und antibakteriellen-Tests das Antibiotikum enthaltende Fraktionen werden eingeengt und gefriergetrocknet, wobei man ein Rohpräparat des Antibiotikums U-47929 erhält. Ein solches Rohpräparat kann dort verwendet
werden, wo die Reinheit nicht kritisch ist, wie zum Beispiel bei Tierfutterzusätzen.
Das.erfindungsgemäße Antibiotikum kann auch aus der Fermentationsbrühe isoliert werden, indem man filtriert und das FiItrat an Tonerde (neutral oder mit Säure gewaschen) adsorbiert und mit Wasaer/Aceton-G-emischen eluiert. Ferner kann U-47929 durch Harzsorption aus der Fermentationsbriihe gewonnen werden, wobei man ein Harz aus einem nicht-ionischen makroporösen C'opo= lymer aus mit Divinylbenzol vernetzten! Styrol verwendet· Geeignete Harze sind "Amberlite XAD-2" und "XAD-4" gemäß dem
Verfahren der US-PS 3 515 717 (Vertrieb von Amberlite-Harzen durch Rohm and Haas, Philadelphia, Pennsylvania). Das Antibiotikum kann aus den Harzen durch ein Gemisch aus Wasser
und niederem Alkohol (vorzugsweise Methanol) oder aus Wasser und Aceton eluiert werden.
Im v/es en ti ic hen reines Antibiotikum U-47929 kann aus den auf obige Weise erhaltenen Hohpräparaten durch ehromatographische · Verfahren gewonnen werden. Gemäß einem bevorzugten Verfahren werden Rohpräparate des Antibiotikums U-47929 zunächst chromatographischen Verfahren an einem nicht-ionischen makroporösen Copolymer aus mit Divinylbenzol vernetzten! Styrol, zum Beispiel "Amberlite XAD-4", unterworfen. Die Säule wird mit
Wasser gewaschen und dann mit einem Gemisch aus niederem Alkohol/Viiasser (Volumenverhältnis 20:80) eluiert, wobei Metha= nol/Wasser bevorzugt wird. Die Fraktionen werden dünnschichtenchromatographisch und durch Biotests analysiert. Bioaktive
Fraktionen werden eingeengt und gefriergetrocknet und dann
weiteren chromatographischen Verfahren an einer Säule mit
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einem stark basischen Anionenaustauscherharz, zum Beispiel "Dowex-1 (X-4)", unterworfen. Andere hier brauchbare Harze sind "Dowex-11" und "Dowex-21K". Die Yernetzung des Harzes kann 4 bis 8$ betragen und die genannten Harze werden von der Dow Chemical Company, Midland, Michigan vertrieben.
Die genannte Säule wird mit V/asser eluiert, wobei die Fraktionen auf ihre biologische Y/irkung gegen S. aureus und Penicillium oxalicum getestet werden. Die Fraktionen werden ferner dünnschichtenchromatographisch an Silikagel mit 95$ wässrigem Äthanol/Wasser (Yolumenverhältnis 75:25) analysiert. Das Antibiotikum U-47929 wird durch Besprühen der Silikagel= platten mit einer Ninhydrinlösung festgestellt. Aktive Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet, wobei man im wesentlichen reine Präparate von U-47929 erhält.
Da das Antibiotikum U-47929 eine stark basische Verbindung ist, kann man Rohpräparate auch durch Adsorption an Kationenaustauschharzen und Bluierung mit organischen Basen oder Ammoniak reinigen. Rohpräparate können auch durch Umwandlung mit anorganischen oder organischen Säuren in ein Salz gereinigt werden. Die Basenform des Antibiotikums wird beim Neutralisieren des Säureanions mit Ammoniak oder anderen anorganischen oder organischen Basen zurückgewonnen.
Bei der Herstellung von Salzen des Antibiotikums U-47929 mit anorganischen oder organischen Säuren muß man die Säure wegen der Instabilität des Antibiotikums bei sauren pH-Werten vorsichtig zu einer wässrigen Lösung des Antibiotikums zugeben. Beispiele für verwendbare anorganische und organische Säuren sind Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Pamoesäure, Cholsäure, Palmitinsäure, Schleimsäure, Camphersäure, Glutarsäure, Glycolsäure, Phthal;=
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säure, Weinsäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure,. 3-Bhenylsalicylsäure, 5-Phenylsalicylsäure, 3-Methylglutarsäure, o-Sulfobenzoesäure, Cyclohexansulfamsäure, Gyclo= pentanpropionsäure, 1,2-Cyclohexandicarbonsäure, 4-Cyclohexen= carbonsäure, Octadecenylbernsteinsäure, üctenylbernsteinsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Helianthsäure, Reinecke-Säure, Dirnethyldithiocarbaminsäure, Sorbinsäure, Monochlor= essigsäure, Undecylensäure, 4!-Hydroxyazobenzol-4~sulfonsäure, Octadecylschwefelsäure, Pikrinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure und dergleichen.
Das Antibiotikum U-47929 und seine Salze sind wirksam gegen S. aureus und können verwendet werden zur Desinfektion gespülter und gestapelter Lebensmittelbehälter, die mit diesen Bakterien verunreinigt sind. Ferner können sie verwendet werden als Desinfektionsmittel für mit S. aureus verunreinigte medizinische und zahlmedizinische Vorrichtungen. Weiterhin können das Antibiotikum U-47929 und seine Salze verwendet werden zur Behandlung von mit S. aureus infizierten Labormäusen.
Das vorstehend beschriebene mikrobiologische Verfahren wird zwar im einzelnen unter Bezug auf Streptomyces ficellus Dietz, sp. n., NRRL 8067 beschrieben, ist jedoch nicht auf diesen speziellen hinterlegten Mikroorganismus beschränkt. Vielmehr betrifft das Verfahren auch die Verwendung jedes Mikroorganismus, der obige Kultureigenschaften besitzt oder einem solchen im wesentlichen äquivalent ist, wo immer dieser auch hinterlegt sei. Die Erfindung umfaßt ferner die Verwendung von Stämmen oder Mutanten dieses Mikroorganismus, die nach bekannten Methoden hergestellt werden können, zum Beispiel indem man den neuen Mikroorganismus einer Röntgen/ oder Ultraviolettbestrahlung aussetzt, mit Senföl, Phagen oder dergleichen behandelt.
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In den folgenden Beispielen beziehen sich sämtliche Prozentangaben auf das Gewicht und Mengenverhältnisse von Lösungsgemischen auf das Volumen, falls nichts anderes gesagt wird.
Beispiel 1 Teil A: Fermentation
Eine Bodenprobe von Streptomyces ficellus Dietz, sp. n. NRKL 8067 wird zur Inokulierung einer Reihe von 500 ml-Erlenmyerkolben verwendet, von denen jeder 100 ml eines sterilen Mediums folgender Zusammensetzung enthält:
Glucosemonohydrat 25 g/l
Pharmamedia 25 g/l
Leitungswasser auf 1 Liter
+Pharmamedia ist ein Baumwollsamenmehl technischer Reinheit, Hersteller Traders Oil Mill Company, Fort Worth, Texas.
Der pH-Wert dieses Mediums vor der Sterilisierung beträgt 7,2. Das Vorzüchtungs-Inokulum wird 3 Tage bei 280C auf einer Gump-Schüttelmasehine mit 250 Bewegungen/Minute bei einer Sewegungsstrecke von 6,35 cm gezüchtet.
300 ml dieses Inokulums werden zur Inokulierung eines Behälters mit 20 1 sterilem Medium folgender Zusammensetzung verwendet:
Glucosemonohydrat 10 g/l
Corn Steep Liquor 10 g/l
Pharmamedia 2 g/l
Wilson's Peptone Liquor No. 159 10 g/l Leitungswasser Rest
+Wilson's Pepton Liquor No. 159 besteht aus hydrolysierten Proteinen tierischen Ursprungs.
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Das inokulierte Medium wird bei 280G 2 Tage inkubiert, wobei es mit 400 Umdrehungen pro Minute bewegt und mit 1Q Standardlitern pro Minute bei einem Gegendruck von 1,73 kg/cm belüftet wird.
Nach 2-tägiger Inkubation wird das so erhaltene Impfmedium zur Inokulierung (5 1 Impfinokulum pro 100 1 Fermentationsmedium) einer 250 1-Fementation verwendet, wobei das sterile Fermentationsmedium folgende Bestandteile enthält:
Glucosemonohydrat 15 g/l
Black Strap Molasses 20 g/l
Stärke 40 g/l
Pharmamedia 25 g/l
CaCO5 8 g/l
Leitungswasser Rest
pH - 7,2 (presterilization).
Der Fermentationstank wird bei 280C unter Bewegung mit 240 Umdrehungen pro Minute und einer Belüftung von 80 1 pro Mi-
nute bei einem Gegendruck von 1,73 kg/cm inkubiert. Gegebenenfalls verwendet man das Antischaummittel "Ucon" (synthetischer Entschäumer der Union Carbide, N.Y., N.Y.). Geerntet wird gewöhnlich nach 3- bis 12-tägiger Fermentation. Eine typische 3-tägige Fermentation ergibt folgende Antibiotikum-Titer in der Fermentationsbrühe;
Balg BU/ml
1 Spur
2 18
3 14
Getestet wird nach dem Agar-Scheibentest unter Verwendung des Mikroorganismus S. aureus. Das Agar-Medium wird mit 0,1-mo-
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larem Phosphatpuffer auf pH 7,4 gepuffert. Eine Volumeneinheit (0,08 ml) Lösung, die die zu testende Bubstanz enthält, wird auf eine Papierscheibe von 12,7 m.m Durchmesser aufgebracht, die dann auf eine mit dein Testorganismus beimpfte Agarplatte gelegt wird. Die Agarplatte wird 16 bis 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Eine Bioeinheit (BU) ist definiert als die Konzentration des Antibiotikums, die unter obigen Testbedingungen zu einer Inhibierungszone von 20 m.m führt. Muß zum Beispiel eine Fermentationsbrühe oder eine andere, das Antibiotikum enthaltende Lösung 1/1OO verdünnt werden, um eine 20 mim-Inhibierungszone zu erreichen, so beträgt die Wirksamkeit dieser Lösung 100 BU/ml.
Teil B; Aufarbeitung
Das Antibiotikum U-47929 wird in den Fermentationsbrühen dünnschichtenchromatographisch aufgefunden und mittels der antibakteriellen Wirkung getestet. Die Dünnschiehtenchromatogramme werden mit Silikagelplatten unter Verwendung von 95$ wässrigem Äthanol/Wasser (Volumenverhältnis 75*25) als Lösungsmittelsystem ausgeführt. Die biologische Wirkung wird unter Verwendung von mit S. aureus beimpften Agarplatten wie in Beispiel 1, Teil A beschrieben^ getestet.
5000 1 von gemäß Teil A erhaltener Fermentationsbrühe werden über DiatomJherde als Filterhilfsmittel filtriert. Der Filterkuchen wird mit V/asser gewaschen und verworfen. Ein Teil der Fermentationsbrühe und Waschlösung (2000 1) gelangt mit einer Geschwindigkeit von 5 1 pro Minute über eine Florisil-Säule, welche mit etwa 80 kg mit Säure gewaschenem Florisil hergestellt wurde. Die verbrauchte Brühe wird verworfen· Die Säule wird mit 150 ml Wasser in einer Geschwindigkeit von 5 1 pro Minute gewaschen. Die .»wässrige Waschlösung wird im Vakuum auf etwa 40 1 eingeengt und dieses Konzentrat wird gefriergetrocknet, wobei man 1467 g Rohpräparat A, das Spu-
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ren des Antibiotikums U-47929 enthält, gewinnt.
Die Florisil-Säule wird dann mit 900 1 50$ igem wässrigem Aceton eluiert, wobei folgende Fraktionen erhalten werden:
Fraktion 1-60 Liter Fraktion II - 225 Liter Fraktion III - 225 Liter Fraktion IV - 420 Liter.
Die Fraktion I wird nicht zur Isolierung von Antibiotikum U-47929 herangezogen.
Die Fraktion II wird auf etwa 40 1 eingeengt und das Konzentrat wird gefriergetrocknet, wobei man 240 g eines Antibiotikumpräparats erhält, das als Präparat B bezeichnet wird.
Die Fraktion III wird eingeengt und das Konzentrat wird gefriergetrocknet, v/o bei man 105 g eines Präparats C erhält.
Die Fraktion IV wird ebenfalls eingeengt und das Konzentrat wird gefriergetrocknet und ergibt ein weiteres Präparat, das wenig Antibiotikum enthält.
Nach obigen Verfahren werden weitere I900 1 klare Brühe aus einer Fermentation gemäß Seil A über eine Florisil-Säule geleitet, die dann mit Wasser gewaschen und mit 50$ wässrigem Aceton eluiert wird, wobei man die Antibiotikum-Präparate D (374 g) und E (225 g) erhält.
Die obigen Präparate B, C, D und E werden vereinigt und dann einer weiteren Reinigung gemäß Teil C unterworfen.
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Teil G: Keinigung
1. Chromatographieren an "Amberlite XAD-4"
Das Ausgangsmaterial besteht aus 240 g Präparat B, 105 g Präparat G, 374 g Präparat D und 225 g Präparat E gemäß vorstehendem Teil B. Diese Präparate werden vereinigt und in 94»4 1 10?$ iger wässriger Natriumchloridlösung gelöst. Die Lösung wird auf pH 10,0 eingestellt und in einer Geschwindigkeit von 100 ml pro Minute über eine Säule von 23 cm Innendurchmesser geleitet, die 27 1 Amberlite XAD-4 enthält. Die verbrauchte Brühe wird in 3 Fraktionen aufgefangen (50 bezw. 25 bezw. 20 1). Alle 3 Fraktionen sind im Test mit S, aureus inaktiv und werden verworfen.
Die Säule wird dann mit 72 1 Wasser gewaschen, wobei 18 4-liter-Fraktionen 1 bis 18 aufgefangen werden.
Dann wird die Säule mit einem Methanol/Wasser-Gemisch (Volumenverhältnis 20:80) eluiert, wobei 17 4-Liter-Fraktionen 19 bis 35 aufgefangen werden.
Obige Fraktionen werden dann dünnschichtenchromatographisch und durch Biotest analysiert, worauf wie nachfolgend angegeben gepoolt wird. Jeder Pool wird auf ein kleines Volumen eingeengt und gefriergetrocknet und ergibt dann nachfolgende Präparate:
Pool I - Fraktionen 1-3 Präparat 127.1, (400 g)
Pool II - Fraktionen 4-8, Präparat 127.2, (258 g)
Pool III - Fraktionen 9-23, Präparat 127-3, (187,6 g)
Pool IV - Fraktionen 24-28, Präparat 127.4, (158,6 g).
Die Präparate 127·3 und 127*4 enthalten gemäß Dünnschichtenchromatogramm nur das Antibiotikum U-47929·
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2. Chromatparaphieren an "Dowex-1"
Die Säule wird mit 300 ml Dowex-1 (X-.4) ία Hydroxid an ion-Form hergestellt.
Ein Teil des Präparats 127.3 (20,0 g) wird in 200 ml Wasser gelöst (festgestellter pH-Wert 10,4)· Die Lösung wird mit einer Geschwindigkeit von 5 ml pro Minute über die Dowex-1 (X-4)-Säule geleitet, dann wird die Säule mit V/asser eluiert, wobei 20 ml-Fraktionen aufgefangen werden. Ausgewählte Fraktionen werden auf ihre biologische Wirkung gegen die Mikroorganismen S- aureus und P. oxalicum wie folgt getestet: Filterpapierscheiben von 12,7 mm Durchmesser werden in die Eluate (1 Scheibe pro Fraktion) eingetaucht und die Scheiben werden dann auf mit S. aureus bezw. Px oxalicum beimpfte Agarplatten gelegt. Die Platten werden 16 bis 18 Stunden bei S. aureus bei 37°C und bei P. oxalicum bei 280C inkubiert· Die resultierenden Inhibierungszonen (in mm Durchmesser) werden als roher Hinweis der biologischen Wirksamkeit der Fraktionen gewertet.
Man erzielt für die einzelnen Fraktionen folgende Ergebnisse:
Zone (mm)
Fraktion BTr.
8 10 12 14 16 18 20 22
S. aureus P. oxalicum
O O^
O 0
O 0
O 17
O 15
21
26
27
24
25 15 dünne Zo
25 27
26
19
20
22
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_ 27—
Fraktion Nr.
24 26 28 30 32
34 36 38 40 42 44 46 48 50 55 60 65 70
75
80
85
90
95 100 120 130 140 150
2601398 dünne Zo
S· aureus P. oxalicum nen
25 · 23 Spur
29 31 Spur
31 34 0
31 35 0
30 35 0
28 35 0
28 35
29 34
28 34
28 34
27 33
27 32
28 29
30 33
30 31
29 30
28 26
28 23
28 22
25 20s
25 17
23 16,
22
22
24
24
24
23
Die Fraktionen werden aufch. dünnschiehtenchromatographisch an ■ Silikagel unter Verwendung von 95$ igem wässrigem Äthanol/ Wasser (Volumenverhältnis 75:25) als Lösungsmittel analysiert.
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Das Antibiotikum U-47929 wird durch Besprühen mit Ninhydrinlösung lokalisiert. Es zeigt sich auf der Platte als purpurfarbener Fleck.
Die Fraktionen 26-50 werden vereinigt und gefriergetrocknet, wobei man 8,3 g eines im wesentlichen reinen Präparats des Antibiotikums U-47929 erhält.
Die Fraktionen 51 bis 75 werden ebenfalls vereinigt und gefriergetrocknet und geben 1,6 g eines im wesentlichen reinen Präparats des Antibiotikums U-47929. Dünnscnichtenchromatogramme zeigen, daß beide Präparate ausschließlich das Antibiotikum U-47929 enthalten.
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Antibiotikum U-47929» das gegen S. aureus wirksam ist, gekennzeichnet durch
(a) die Summenformel G-i^Hp.KgO,;
(b) folgende Elementaranalyse/
C: 50,00; H: 7,69; N: 26,92; 0: 15,38;
(c) die spezifische Drehung £CtJZ? - +39° (c=1, Wasser)
(d) Löslichkeit in Wasser und niederen Alkoholen wie zum Beispiel ^ethanol und Äthanol, relative Unlöslichkeit in Ketonen, halogenierten oder gesättigten Kohlenwasserstofflösungsmitteln, Äthylacetat und anderen esterartigen Lösungsmitteln;
(e) das Infrarotabsorptionsspektrum in Mineralöl gemäß Figur 1;
(f) das NMR-Spektrum gemäß Figur 2; und dessen Säureadditionssalze.
2· Terfahren zur Herstellung des Antibiotikums U-47929» dadurch gekennzeichnet,, daß man Streptomyces ficellus Dietz, sp· n. mit den identifizierenden Eigenschaften von NRRL 8067 oder dessen Mutanten in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, bis dem Medium eine wesentliche antibiotische Wirkung erteilt ist.
3· Verfahrennach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das wässrige Nährmedium assimilierbares Kohlehydrat und assimilierbaren Stickstoff enthält.
4. Verfahren zur Isolierung des Antibiotikums U-47929 aus dieses enthaltenden Fermentationsbrühen, dadurch gekennzeichnet, daß man
(1) eine das Antibiotikum U-47929 enthaltende Fermentationsbrühe filtriert, so daß man eine klare Brühe erhält,
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Claims (1)

  1. (2) die klare Brühe über ein Adsorbens leitet, wobei
    Rohpräparate des Antibiotikums erhalten werden,
    und
    (3) die Rohpräparate des Antibiotikums an (a) einem nichtionischen makroporösen Copolymer aus mit Divinylbenzol vernetztem Styrol und dann an (b) einem stark basischen Anionenaustauscherharz chromatographiert, wobei im wesentlichen reine Präparate des Antibiotikums U-47929 erhalten werden.
    5· Verfahren nach Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorbens hochselektives Magnesia/Sillikagel verwendet.
    6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Plorisil verwendet.
    7· Verfahren nach Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, daß man als nicht-ionisches makroporöses Copolymer aus mit Divinylbenzol vernetztem Styrol Amberlite XAD-4 verwendet·
    8. Verfahren nach Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, daß man als stark basisches Anionenaustauscherharz Döwex—T (X-4) verwendet.
    Für: The Upjohn Company
    Kalamazoo, Mich., V.St.A.
    Rechtsanwalt
    60983 0/0894
    Leerseite
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