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DE2841361A1 - Antibiotikum cc-1065, verfahren zu seiner herstellung und gewinnung und dabei verwendeter mikroorganismus - Google Patents

Antibiotikum cc-1065, verfahren zu seiner herstellung und gewinnung und dabei verwendeter mikroorganismus

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Publication number
DE2841361A1
DE2841361A1 DE19782841361 DE2841361A DE2841361A1 DE 2841361 A1 DE2841361 A1 DE 2841361A1 DE 19782841361 DE19782841361 DE 19782841361 DE 2841361 A DE2841361 A DE 2841361A DE 2841361 A1 DE2841361 A1 DE 2841361A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
antibiotic
green
gray
nutrient medium
yellow
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19782841361
Other languages
English (en)
Inventor
Ladislav James Hanka
David Glenn Martin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pharmacia and Upjohn Co
Original Assignee
Upjohn Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Upjohn Co filed Critical Upjohn Co
Publication of DE2841361A1 publication Critical patent/DE2841361A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces

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Description

Das Antibiotikum CC-1065 erhält man bei einer Fermentation unter gesteuerten Bedingungen mit Hilfe einer biologisch reinen Kultur des neuen Mikroorganismus Streptomyces zelensis DSM 1341.
Das Antibiotikum CC-106 5 ist gegen die verschiedensten grampositiven und gramnegativen Bakterien, z.B. gegen Proteus vulgaris, aktiv. Somit eignet es sich als ölkonservierungsmittel zur Inhibierung dieses Bakteriums, das bekanntlich eine ölverunreinigung hervorruft. Ferner eignet es sich als Bestandteil von Waschlösungen für sanitäre Zwecke. Da das Antibiotikum CC-1065 ferner gegen Bacillus subtilis wirksam ist, eignet es sich auch zur Behandlung der Brutplätze von Seidenraupen zur weitestgehenden Unterdrückung oder Verhinderung einer durch dieses Bakterium hervorgerufenen Infektion.
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Chemische und physikalische Eigenschaften von Antibiotikum CC-1065:
Molekulargewicht: etwa 700 Elementaranalyse:
gefunden: C 61,06 %; H 4,92 %; N 13,17 % UV-Absorptionsspektrum:
Eine Lösung des Antibiotikums CC-1065 in Dioxan zeigt eine starke Endabsorption mit Schultern bei 230 nm (Absorptionsfähigkeit a=68.00) und 258 nm (a=51.10) sowie ein Maximum bei 364 nm (a=66.10).
IR-Absorptionsspektrum:
Das Antibiotikum CC-1065 zeigt in Form einer Mineralölaufschwemmung ein charakteristisches IR-Absorptionsspektrum im Wellenzahlbereich von 3800-600 (cm" ) (vergleiche Figur 1). Das Spektrum wurde unter Verwendung eines Digilab Mo.del 14 D Fourier transform Spektralphotometer aufgenommen.
Peaks treten bei folgenden Wellenlängen (ausgedrückt in reziproken Zentimetern) auf:
2960, 2920, 2850, 1465 und 1377 cm"1. Diese sind teilweise auf die aliphatischen C-H-Schwingungen des Mineralöls zurückzuführen.
Erläuterung: S = stark; M = mittel; W = schwach; sh = Schulter
Bandenfrequenz Intensität
(Wellenzahl)
3460 S
3350 S
3230 S, sh
2960 S
2920 S
2850 S
2610 M
909816/0691
2041361
Bandenfrequenz (Wellenzahl) Intensität
1635 S
1610 S, sh
1570 S
1520 S
1480 S, sh
1465 S
1445 S
1420 S
1403 S
1377 S
1354 S
1333 S
1304 S
1268 S
1243 M, sh
1187 M
1175 M
1156 M
1125 M
1100 M, sh
1078 M
1047 M
1023 M
1005 M
962 W
948 W
918 W
888 W
856 M
805 M
779 W
760 W
737 M
678 W
Löslichkeitsverhalten:
Das Antibiotikum CC-1065 ist in Lösungsmitteln , wie Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Aceton, Methylenchlorid, Äthylacetat, Dioxan und Chloroform löslich.
C-Kernresonanzspektrum:
Das C-Kernresonanzspektrum des Antibiotikums CC-1065 bei 20 MHZ ist in Figur 2 dargestellt. Es ist mittels eines Varian CFT-20 Spektrometers unter Verwendung einer Lösung (etwa 1,0 ml; etwa 75 mg/ml) einer Probe des Antibiotikums CC-1065 in deutero Dimethylsulfoxid (d Dimethylsulfoxid) aufgenommen. Das Spektrum ist gegen die Mittellinie von d 6 Dimethylsulfoxid (39,6 ppm) bezogen auf Tetramethylsilan (0 ppm) geeicht. Die Frequenzen werden in cps "downfield" von Tetramethylsilan aufgezeichnet.
Protonenmagnetresonanzspektrum:
Das Protonenmagnetresonanzspektrum des Antibiotikums CC-1065 bei 100 MHZ ist in Figur 3 dargestellt. Dieses Spektrum ist mittels eines Varian XL-100-15 Spektrometers unter Verwendung einer Lösung (etwa 0,5 ml; etwa 150 mg/ ml) einer Probe des Antibiotikums CC-1065 in deutero Dimethylsulfoxid (d 6 Dimethylsulfoxid) aufgenommen. Das Spektrum ist gegen internes Tetramethylsilan geeicht. Die Frequenzen werden in ppm "downfield" von Tetramethylsilan aufgezeichnet.
Antibakterielles Spektrum des Antibiotikums CC-1065: Das Antibiotikum CC-1065 ist gegen die verschiedensten grampositiven und gramnegativ Bakterien und Pilze aktiv (vergl. die folgende Tabelle). Zu Testzwecken wurden folgende Testprozeduren durchgeführt:
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Die geringste inhibierende Konzentration wird nach üblichen bakteriziden Verfahren unter Verwendung zweifacher Verdünnungen des Antibiotikums in Gehirn/Herz-Infusionsbrühe ermittelt. Die Inokulate bestehen aus über Nacht stehengelassenen Kulturen der Testorganismen, die so weit verdünnt sind, daß die Endpopulation etwa 10 Zellen /ml beträgt. Die Röhrchen werden 42 h lang bei einer Temperatur von 28° bis 370C inkubiert. Die geringste inhibierende Konzentration wird bestimmt, indem 0,1 ml der kein Wachstum zeigenden Brühe aus den 42 h lang inkubierten Röhrchen in 10 ml Antibiotikum-freie Brühe übertragen werden. Röhrchen ohne Wachstum innerhalb von 24 h werden als solche mit bakterizider Konzentration angesehen. Eine für Pilze gut geeignete Brühe enthält 0,5 % KH2PO4, 3,0 % Dextrose und 0,7 % Hefeextrakt.
Mikroorganismus
Grampositive Bakterien: Staphylococcus aureus UC 76 Staphylococcus aureus UC 552 Staphylococcus aureus UC 70 Staphylococcus aureus UC 3665 Bacillus subtilis UC 564 Streptococcus pyogenes UC 6055 Sarcina lutea UC 130 Streptococcus faecalis UC Streptococcus faecalis UC 3235
Gramnegative Bakterien: Escherichia coli UC 51 Proteus vulgaris UC 93 Pseudomonas aeruginosa UC 95 Pseudomonas mildenbergii UC 3029 Salmonella gallinarum UC 265 Klebsieila pneumoniae UC 57
geringste inhibierende Konzentration (mcg/ml)
0,0015
0,003
0,0015
0,003
0,025
0,0008
0,012
0,012
0,003
0,32
0,08
0,08
0,3
2,5
0,08
Mikroorganismus geringste inhibierende Konzentration (meg/ml)
Salmonella schottmuelleri UC 126 0,3
Salmonella pullorum UC 267 0,08
Pilze:
Candida albicans UC 1392 0,3
Saccharomyces cerevisiaeUC 1337 0,04
Saccharomyces pastorianus UC 1342 0,3
Penicillium oxalicum UC 1268 0,02
"UC" steht für The Upjohn Company Culture Collection. Die aaO zahlenmäßig definierten Kulturen sind auf Anfrage von The Upjohn Company, Kalamazoo, Michigan, erhältlich.
Das Antibiotikum CC-1065 ist ferner gegen in einer Kultur gezüchtete L 1210-Tumorzellen wirksam (in vitro). Ferner inhibiert das Antibiotikum CC-1065 in vivo bei Laboratoriumsmausen L 1210 Leukämie, P 388 Leukämie und B 16 Melanome.
Der bei der Gewinnung von Antibiotikum CC-1065 verwendete Mikroorganismus ist Streptomyces zelensis DSM 1341.
Eine Subkultur dieses Mikroorganismus ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen der Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung mbH München, Grisebachstraße 8, 3400 Göttingen unter der Hinterlegungsnummer DSM 1341 hinterlegt.
Ein neues Bodenisolat, das das Antibiotikum CC-1065 produziert, wird aufgrund seiner Übereinstimmung im Hinblick auf die allgemeinen Eigenschaften der Gattung als neue Art
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der Gattung Streptomyces charakterisiert und angesehen (vgl. T.G. Pridham und H. D. Tresner 1974, Teil 17 "Actinomycetes and related organisms", Family VII. Streptomycetaceae Waksman und Henrici 1943. Genus I. Streptomyces. P. 748. In: "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" 8. Ausgabe, Herausgeber Buchanan und Gibbons, Verlag The Williams and Wilkins Co., Baltimore). Dieses neue Isolat zeigt ein grau-grünes Luftwachstum, ist melaninnegativ, besitzt kurze, gestreckte bis offen-spiralige bis spiralige Sporenketten runder Sporen mit stacheliger oder dorniger Oberfläche.
Die neue Kultur läßt sich von den meisten Angehörigen der begrenzten "grünen" Gruppe (Kulturen der grünen Gruppe sind diejenigen in der Viridis-Reihe nach Waksman (vgl. S.A. Waksman 1961 "The actinomycetes" Band 2, Classification, identification and descriptions of genera and species. Verlag The Williams and Wilkins Co. Baltimore und nach Baldacci (vgl. E. Baldacci 1958 "Development in the classification of actinomycetes". Giornale di Microbiologia Band 6,Seiten 10-27); der prasinus-Farbgruppe nach Ettlinger und Mitarbeitern (vgl. L. Ettlinger, R. Corbaz und R. Hütter 1958 "Zur Systematik der Actinomyceten", 4. "Eine Arteinteilung der Gattung Streptomyces Waksman und Henrici "Archiv für Mikrobiologie", Band 31, Seiten 326 - 358); der prasinus-Geruch-azureus-glaucus-Gruppe nach Hütter (R. Hütter 1967 "Systematik der Streptomyceten unter besonderer Berücksichtigung der von ihnen gebildeten Antibiotika", Verlag S. Karger, Basel); der malachiticus-Gruppe nach Küster (E. Küster 1970 "Note on the taxonomy and ecology of Streptomyces malachiticus and related species", International Journal of Systematic Bacteriology, Band 20, Seiten 25 - 29); der Grünsporenfarbgruppe X nach Kutzner (vgl. H.J. Kutzner 1956 "Beitrag zur Systematik und Ökologie der Gattung Streptomyces Waksm.
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et Henrici, Dissertation an der Landwirtschaftlichen Hochschule Hohenheim); den prasinomycin-Lieferanten nach Myers und Mitarbeitern (vgl. E. Myers, G. J. Miraglia, D.A. Smith, H.I. Basch, F.E. Pansy, W.H. Trejo und R. Donovick 1968 "Biological characterization of prasinomycin, a phosphorus-containing antibiotic", Appl. Microbiol. Band 16, Seiten 603-608); (E. Myers, R. Donovick, F.L. Weisenborn und F.E. Pansy, 1970, US - PS 3 493 653); denen in Tabellen 11 und 12 nach Küster (vgl. E. Küster 1972 "Simple Working Key for the classification and identification of named taxa included in the International Streptomyces Project". Int. J. Syst. Bacteriol., Band 22, Seiten 139 - 148) und denjenigen der grünen Reihe nach Pridham und Tresner (vgl. T.G. Pridham und H.D. Tresner 1974. Teil 17. "Actinomycetes and related organisms". Familie VII. Streptomycetaceae Waksman und Henrici 1943. Genus I. Streptomyces. Tabelle 17.46 a-d grüne Reihen. Seite 825. In: "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8.Ausgabe, Herausgeber: Buchanan und Gibbons,
* Verlag The Williams and Wilkins Co., Baltimore). Die
unterscheidenden Merkmale liegen in der Bildung des Antibiotikums CC-1065, ihrem Wachstum bei 4° bis 450C und in unterschiedlichen Sporenketten und Sporen. Sie unterscheidet sich auch von einer in jüngster Zeit charakterisierten Kultur, nämlich Streptomyces espinosus (vgl. US-PS 3 697 380 und 3 833 475) durch ihr Farbmuster auf Ektachrom-Filmen, ihr Kohlenstoffausnutzungsmuster, ihr Wachstum bei 4° bis 45°C und ihre Fähigkeit zur Bildung von Antibiotikum CC-1065.
Es wird vorgeschlagen, das neue Bodenisolat als "Streptomyces zelensis" (von zeleny = tschechisch'grün") Dietz und Li sp. n. und diese Typusart als Typus subspecies Streptomyces zelensis subsp. zelensis zu bezeichnen (dies steht in Übereinstimmung mit den im International Code of Nomenclature of Bacterial gegebenen Vorschriften.
* unterscheiden
(vgl. S.P. Lapage und Mitarbeiter (Herausgeber) Ausgabe 1976 "International Code of Nomenclature of Bacteria" Amer. Soc. for Microbiol., Washington D.C. 180 Seiten).
Taxonomie:
Streptomyces zelensis Dietz und Li sp.n.
Farbeigenschaften:
Luftwachstum: grün-grau oder grau-grün. Melaninnegativ. Das Aussehen der Kultur auf Ektrachrom-Film findet sich in der folgenden Tabelle I. Referenzfarbeigenschaften sind in Tabelle II angegeben. Die Kultur kann in die gelbe und grüne Farbreihe nach Tresner und Backus (H. D. Tresner und E. J. Backus 1963 "System of color wheels for streptomycete taxonomy" Applied Microbiol. Band 11, Seiten 335 bis 338) eingeordnet werden.
Mikroskopische Eigenschaften:
Sporenketten zunächst gestreckt, dann offen-spiralig bis spiralig (RF, RA, S) im Sinne von Pridham und Mitarbeitern (vgl. T. G. Pridham CW. Hesseltine und R. G. Benedict 1958 "A guide for the classification of streptomycetes according to selected groups". Placement of strains in morphological sections. Applied Microbiol. Band 6, Seiten 52 - 79). Sporenoberfläche: stachelig oder dornig.
Kultureigenschaften und biochemische Eigenschaften: Die Kultureigenschaften und biochemischen Eigenschaften finden sich in der später folgenden Tabelle III.
Kohlenstoffausnutzung:
Das Wachstum auf Kohlenstoffverbindungen wird nach dem von Pridham und Gottlieb entwickelten Verfahren bestimmt (vgl. T. G. Pridham und D. Gottlieb 1948 "The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination". J. Bacteriol. Band 56, Seiten
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bis 114) und nach den von Shirling und Gottlieb entwickelten Verfahren (vgl. E. B. Shirling und D. Gottlieb 1966 "Methods for characterization of Streptomyces species". International Journal of Systematic Bacteriology Band 16, Seiten 313 - 340) . Bei ersterem Verfahren wuchs die Kultur gut auf D-Xylose, D-Pructose, D-Galactose, D-Glucose, D-Mannose, Maltose, Cellobiose, Dextrin, löslicher Stärke, Glyzerin, D-Mannit und Inosit, mäßig auf L-Arabinose, Natriumoxalat, Natriumacetat und Natriumsuccinat und schlecht auf Rhamnose, Saccharose, Lactose, Raffinose, Inulin, Dulcit, D-Sorbit, Salicin, Phenol, Natriumformiat, Natriumtartrat, Natriumsalicylat, Natriumcitrat und dem Vergleichsmedium ohne zugesetzte Kohlenstoffverbindung. Die Kultur wuchs nicht auf Kresol. Bei letzterem Verfahren wuchs die Kultur gut auf dem positiven Vergleichsmedium (D-Glucose), D-Xylose, Inosit, D-Mannit und D-Fructose, mäßig auf L-Arabinose und schlecht auf dem negativen Vergleichsmedium (Grundmedium).Sie wuchs nicht auf Saccharose, Rhamnose, Raffinose oder Cellulose.
Temperatur:
Die Kultur wuchs langsam bei 4°C, mäßig bei 18°, 24° und 45°C und gut bei 28°, 32° und 37°C. Bei 55°C war kein Wachstum festzustellen. Für die Temperaturuntersuchungen wurden als Medien Bennett's-, Czapek's-Saccharose-, Maltose-Trypton- und Hickey-Tresner-Agars verwendet.
Antibiotikum produzierende Eigenschaften:
Die Kultur produziert das Antibiotikum CC-1065.
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Tabelle I Aussehen von Streptomyces zelensis auf Ektachrom-Film
Agar-Medium Oberfläche Rückseite
Bennett's Spuren grau gelb-lohfarben
Czapek's Saccharose fahlgrau farblos
Maltose-Trypton graugrün lohfarben
Pepton-Eisen grauweiß lohfarben
0,1 % Tyrosin Spuren grau fahlgelb-lohfarben
Kasein/Stärke fahl graugrün fahl-lohfarben
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Tabelle II
Agarmedium
Referenzfarbeigenschaften von Streptomyces zelensis
ISCC-NBS Centroid-Farbkarten Standardprobe Nr. 2106
Bennett's
Czapek1s Saccharose
Maltose-Trypton
Hickey-Tresner
Hefeextrakt / Malzextrakt (ISP-2)
Bestimmung (NacJr P-
1 .
1 .		 YG
Y
yBr		 . YG
gy. Y
yBr
ltre p.YG
y. weiß		 . YG
. Y
S
R
P		 ig zu N. gy·
d.
1 .		 yBr
S
R
P		 Farbplättchen gy
gy		 . YG
gy. Y
yBr
S
R
P		 121
86
76		 1 .
S
R		 121
92		 gy
d.
m.
P 122
91
76
S
R
P		 122
90
76
122
91
77
Farbbezeichnung
fahlgelb-grün hellgelb
hell-gelblich braun
fahlgelb-grün gelblich weiß
graues Gelbgrün dunkelgraues Gelb hellgelbes Braun
graues Gelbgrün graues Gelb
hellgelbes Braun
graues Gelbgrün dunkelgraues Gelb schwach-gelbes Braun
GO CD CD
Tabelle II Fortsetzung;
Agarmedium
Hafermehl (ISP-3)
anorganische Salze-Stärke (ISP-4)
Glyzerin / Asparagin (ISP-5)
S = Oberfläche
Bestimmung
ISCC-NBS Centroid-Farbkarten Standardprobe Nr. 2106
(Nachtrag zu NBS Circular 553*)
S R P
S R
S R
R = Rückseite
Farbplättchen
p. YG
p. gy. Y
gy. YG
gy. gY
1. yBr
p. YG
gy. Y
P = Pigment
Farbbezeichnung
fahlgelbes Grün fahlgraues Gelb
graues Gelbgrün graugrünes Gelb hellgelbes Braun
fahlgelbes Grün graues Gelb
*) K. L. Kelly und D. B. Judd. 1955 "The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names" U.S. Dept. Comm. Circ. 553.
Tabelle III
Kultureigenschaften und biochemische Eigenschaften von Streptomyces zelensis
Medium Oberflache
Agarmedien
Pepton-Eisen fahl graugrün
Calciummalat fahl graugrün
to
O 		Glucose-
Asparagin		 fahl graugrün
CO
CO		 Magermilch Spuren fahl gr
—A
/0691 Tyrosin
Xanthin		 grün-grau
grün-grau
Nährstärke grün-grau
Hefeextrakt/
Malzextrakt
Pepton/Hefeextrakt-
Eisen (ISP-6)
Tyrosin (ISP-7)		 grün
fahl grau-weiß
grau-grün
Rückseite
sonstige Eigenschaften
lohfarben
oliv
fahl hellgrün
lohfarbenes Pigment
melaninnegativ
ohne Pigment
Malat geht nicht in
Lösung
kein Pigment
orange-lohfarben orange-lohfarbenes
Pigment
Kasein geht in Lösung
braun
hell-lohfarben
gelb-grün-lohfarben
lohfarben
lohfarben
grau
hellbraunes Pigment Tyrosin geht in Lösung
hell-lohfarbenes Pigment
Xanthin geht nicht in Lösung
hell-lohfarben die Stärke wird hydrolysiert
lohfarbenes Pigment
lohfarbenes Pigment
melaninnegativ f
kein Pigment (
melaninnegativ
Fortsetzung Tabelle III
Medium
Oberfläche Rückseite
sonstige Eigenschaften
O CD OO
CD CD (O
Gelatinemedien blanke Gelatine
Nährgelatine
Brühemedien
synthetische Brühe
Nährbrühe
Lakmusmilch
weißes Luftwachstum auf einem Oberflächenhäutchen
weißes Luftwachstum auf einem Oberflächenhäutchen
grün-weißes Luftwachstum
auf einem Oberflächenhäutchen
grau-grün-weißes Luftwachstum auf einem Oberflächenhäutchen gelb-lohfarbenes Pigment vollständige Verflüssigung
gelb-lohfarbenes Pigment vollständige Verflüssigung
sehr schwaches Bodenwachstum
Nitrat wird zu Nitrit reduziert
gelb bis gelb-lohfarbenes Pigment
sehr schwaches Bodenwachstum
Nitrat wird zu Nitrit reduziert
blaues Oberflächenpigment in zwei bis drei Röhrchen lohfarbenes Pigment Peptonisierung
pH-Wert 7,9
Die erfindungsgemäße Verbindung bildet sich, wenn der sich ausbreitende Organismus in einem wäßrigen Nährmedium untersubmersen, aeroben Bedingungen wächst. Selbstverständlich können zur Herstellung begrenzter Mengen (an der erfindungsgemäßen Verbindung) auch Oberflächenkulturen und Flaschenkulturen zum Einsatz gelangen. Der Organismus wird in einem Nährmedium mit einer Kohlenstoffquelle, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat und einer Stickstoffquelle, beispielsweise einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweißartigen Material, wachsen gelassen. Bevorzugte Kohlenstoffquellen oder -lieferanten sind Glucose, brauner Zucker, Saccharose, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Kasein, Fischmehl, in Destillationsanlagen anfallende Feststoffe, Tierpeptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle und dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten zum Einsatz gelangen. Spurenmetalle, beispielsweise Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, brauchen dem Fermentationsmedium nicht zugesetzt zu werden, da als Bestandteile des Mediums vor seiner Sterilisation Leitungswasser und ungereinigte Komponenten zum Einsatz gelangen.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung kann bei jeder Temperatur, die das Mikroorganismus-Wachstum fördert, beispielsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 18° und 40°, vorzugsweise zwischen etwa 20° und 28°C ablaufen gelassen werden. In der Regel dauert eine optimale Gewinnung der betreffenden Verbindung etwa 3 bis 15
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Tage. Das Fermentationsmedium bleibt während der Züchtung in der Regel alkalisch. Der End-pH-Wert hängt teilweise (sofern mitverwendet) von den vorhandenen Puffern und teilweise vom Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums ab.
Wenn die Züchtung in großen Gefäßen und Tanks vonstattengeht, bedient man sich zur Beimpfung vorzugsweise der vegetativen Form und nicht der Sporenform des Mikroorganismus, um eine deutliche Verzögerung bei der Bildung der erfindungsgemäß erhältlichen Verbindung und die damit einhergehende unzureichende Ausnutzung der Anlage zu vermeiden. Folglich ist es zweckmäßig, (zunächst) in einer Nährbrühekultur, in einer über flüssigem N2 aufbewahrten Agarscheibe oder in einer geneigten Kultur einen vegetativen Impfstoff herzustellen, indem man die betreffende Nährbrühe und dergleichen mit einem aliquoten Teil aus einem Erdevorrat beimpft. Wenn auf diese Weise ein junger, aktiver, vegetativer Impfstoff erhalten wurde, wird dieser auf aseptischem Wege in große Gefäße oder Tanks übertragen. Das Medium, in dem der vegetative Impfstoff erzeugt wird, kann aus demselben oder einem anderen Medium, als es bei der Herstellung der erfindungsgemäß erhältlichen Verbindung verwendet wird, bestehen, solange der Mikroorganismus in dem betreffenden Medium nur gut wächst.
Zur Isolierung der erfindungsgemäß erhältlichen Verbindung aus der Fermentationsbrühe und zur Reinigung der abgetrennten Verbindung kann man sich der verschiedensten Maßnahmen bedienen. Die Isolierung erfolgt beispielsweise durch Extraktion mit Lösungsmitteln, z.B. Methylenchlorid, Aceton, Butanol, Äthylacetat und dergleichen. Zur Reinigung roher Chargen des Antibiotikums kann man sich einer Silikagelchromatographie bedienen.
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Bei der bevorzugten Reindarstellung der erfindungsgemäß erhältlichen Verbindung wird diese aus dem Kulturmedium durch Abtrennen des Mycels und ungelöster Feststoffe nach üblichen bekannten Verfahren, z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, und Lösungsmittelextraktion sowohl des Mycelkuchens als auch der geklärten Brühe gewonnen. Der Mycelkuchen wird mit Aceton extrahiert, worauf der Extrakt unter vermindertem Druck zu einem wäßrigen Konzentrat eingedampft wird. Das wäßrige Konzentrat wird der filtrierten Brühe zugesetzt, worauf das Ganze dann dreimal mit dem halben Volumen Methylenchlorid extrahiert wird. Die vereinigten Extrakte werden unter vermindertem Druck eingedampft, worauf das erhaltene öl mit handelsüblichen isomeren Hexanen verdünnt wird. Die hierbei erhaltene Suspension wird über Nacht gekühlt, worauf die hierbei gebildeten Feststoffe gesammelt, mit den handelsüblichen isomeren Hexanen gewaschen und schließlich getrocknet werden. Hierbei erhält man relativ rohes Antibiotikum CC-1065 in Form eines gelbbraunen Feststoffs.
Das in der geschilderten Weise erhaltene rohe Antibiotikum wird dann zu einem praktisch reinen kristallinen Antibiotikum CC-1065 gereinigt. Zu diesem Zweck wird zunächst das rohe Antibiotikum CC-1065 mit Aceton extrahiert. Nach dem Verdampfen des Acetons wird der angefallene Verdampfungsrückstand mit Methanol verrieben, wobei kristallines Antibiotikum CC-1065 gebildet wird. Dieses wird zur Erhöhung der Reinheit mit kaltem Methanol gewaschen. Eine weitere Reinigung des Antibiotikums CC-1065 erreicht man durch Chromatographieren auf Silikagel und Kristallisieren der aktiven Fraktionen. Praktisch reines Antibiotikum CC-1065 erhält man schließlich durch Umkristallisieren des (chromatographierten) Antibiotikums CC-1065 aus Aceton/ Methanol.
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Die aktiven Fraktionen aus der Silikagel-Chromatographiersäule bestimmt man durch Dünnschicht-Chromatographie-Bioautographie. Bei diesem Verfahren wird eine 1 μg Antibiotikumprobe als Fleck auf flexibles Siliciumdioxidgel 1B-F (J. T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ) aufgetragen und nach der Entwicklung in einem Lösungsmittel aus 90 Teilen Chloroform, 10 Teilen Methanol und 0,5 Teil konzentriertem Ammoniumhydroxid auf Bacillus subtilis (synthetisches Medium) oder Sarcina lutea bioautographiert. Die Antibiotikum CC-1065-Dünnschichtchromatogrammzone (bei Verwendung von 1 μg oder schwereren Proben des kristallinen Antibiotikums) kann auch mit UV-Licht (254 nm) sichtbar gemacht werden. In normalem Licht ist sie als bernsteinfarbene Zone zu sehen.
Das synthetische Medium für Bacillus subtilis besitzt folgende Zusammensetzung:
Na2HPO4 1,7 g
KH2PO4 2,0 g
(NH4)2SO4 1,0 g
MgSO4 0,1 g
Glucose 2,0 g
Metallionen 1,0 ml
Agar 15,0 g
destilliertes H~0 1 Liter
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen. Soweit nicht anders angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben "Gew.-%". Die Angaben bei Lösungsmittelgemischen beziehen sich, soweit nicht anders angegeben, auf "Volumina".
Beispiel 1 Ai Fermentation
Eine biologisch reine Kultur von Streptomyces zelensis
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NRRL 11 183 dient zum Beimpfen einer Reihe von 500 ml fassenden Erlenmeyer-Saatkolben mit jeweils 100 ml eines sterilen Mediums aus folgenden Bestandteilen:
handelsüblicher Hefeextrakt 0,3 %
handelsübliches Bacto-Trypton 0,5 %
handelsübliches Dextrin 0,1 %
Das Saatinokulum wird 48 h lang bei einer Temperatur von 28°C auf einem handelsüblichen, mit 250 UpM umlaufenden Drehrüttler inkubiert.
Das in der geschilderten Weise bereitete Saatinokulum dient zum Beimpfen von 500 ml fassenden Erlenmeyer-Fermentationskolben mit jeweils 100 ml eines sterilen Fermentationsmediums mit folgenden Bestandteilen:
Black Strap Melasse 1 %
Dextrin 1 %
Bacto-Trypton 1 %
CaCO3 0,5 %
NaCl 0,2 %
Der pH-Wert vor der Sterilisation beträgt 7,2. Die Fermentationskolben werden mit jeweils 5 ml Saatinokulum pro 100 ml Fermentationsmedium beimpft. Danach werden die Fermentationskolben 120 h lang bei einer Temperatur von 280C auf einem handelsüblichen, mit einer Geschwindigkeit von 250 UpM umlaufenden Drehrüttler inkubiert.
Die Prüfung des Antibiotikums CC-1065 erfolgt durch Extrahieren der gesamten Brühe mit 2 Volumina Methylenchlorid. Wechselnde Mengen des Methylenchloridextrakts (20 μΐ, 10 μΐ, 5 μΐ, 2 μΐ, 1 μΐ) werden auf Polygram SIL-N-HR-Silikagelfolien (Macherey-Nagel und Co., Doren) aufgetragen und nach der Entwicklung in einem Lösungsmittel-
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system aus 10 ml Methanol, 90 ml Chloroform und 0,5 ml Ammoniumhydroxid auf Sarcina lutea bxoautographiert.
Herstellung von Agarschalen von Sarcina lutea UC 130 (ATCC 9341) zur Bioautographie:
125 ml gekühlten (48°C) Penassay Saatagar (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) werden mit einer aufgetauten Kulturbrühe von S. lutea (0,5 ml/1) beimpft, worauf das Ganze in 200 mm χ 500 mm Plastikschalen gegossen und verfestigen gelassen wird. Die Agarschalen werden 20 bis 24 h lang bei einer Temperatur von 320C inkubiert.
Das S. lutea Inokulum mit 10 Zellen/ml wird in aliquoten Teilen in der Gasphase von flüssigem Stickstoff gelagert.
B) Gewinnung
Die in der geschilderten Weise aus Fermentationen in 10 1 Tanks gewonnene Fermentationsbrühe wird durch einen Pfropfen aus Celatom FW 40 (Eagle Picher's Diatomeenerde) filtriert. Der hierbei angefallene Mycelkuchen wird mit Aceton extrahiert, worauf der Extrakt unter vermindertem Druck zu einem wäßrigen Konzentrat eingeengt wird. Das wäßrige Konzentrat wird danach der geklärten Brühe zugesetzt, worauf das Ganze dreimal mit dem halben Volumen Methylenchlorid extrahiert wird. Die hierbei erhaltenen Methylenchloridextrakte werden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zu einem öligen Rückstand eingedampft. Dieser wird mit 1,5 ml handelsüblicher isomerer Hexane verdünnt, worauf die erhaltene Suspension über Nacht gekühlt wird. Die hierbei ausgefallenen Feststoffe werden abgetrennt, mit handelsüblichen isomeren Hexanen gewaschen und
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getrocknet, wobei relativ rohes Antibiotikum CC-1065 in Form eines gelbbraunen Feststoffs erhalten wird. Dieses rohe Antibiotikum kann in der geschilderten Weise durch Bioautographie getestet werden.
C) Reinigung
Das in der geschilderten Weise erhaltene rohe Antibiotikum CC-1065 wird mit 400 - 800 ml Aceton extrahiert, um geringe Mengen acetonunlösliehen Materials zu entfernen. Danach wird das Aceton abgedampft und der Rückstand mit 10 ml/g Methanol verrieben, worauf die Suspension über Nacht gekühlt wird. Der hierbei ausgefallene kristalline Niederschlag wird abgetrennt, mit kaltem Methanol gewaschen und getrocknet, wobei 40 - 180 mg kristallines Antibiotikum CC-1065 erhalten werden. Dieses kristalline Antibiotikum läßt sich in der geschilderten Weise durch Bioautographie auf Silikagel testen.
Eine weitere Reinigung erreicht man durch Chromatographieren auf Silikagel und Kristallisieren der aktiven Fraktionen. So werden beispielsweise 470 mg kristalliner Feststoff in
940 ml Aceton gelöst, worauf das Ganze auf 10 ml Silikagel
TM
(Geduran SI60, E. M. Laboratories, Inc., Elmsford, N.Y.)
eingedampft wird. Das hierbei erhaltene Pulver wird auf 100 ml Silikagel chromatographiert, wobei als Eluiermittel ein Lösungsmittelgemisch aus 80 Teilen Chloroform, 20 Teilen Methanol und 4 Teilen Ammoniumhydroxid verwendet wird. 20 Fraktionen von jeweils 20 ml werden aufgefangen und zur Trockene eingedampft. Die einzelnen Fraktionen werden durch dünnschichtchromatographische Bioautographie getestet. Die Fraktionen 6-19 werden gesammelt und mit Methanol verrieben, wobei 218 mg qualitativ hochwertiges kristallines Antibiotikum CC-1065 erhalten werden. Die endgültige Reinheit
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erreicht man durch Umkristallisieren aus Aceton/Methanol, wobei 167 mg (77 % der theoretischen Ausbeute) praktisch reines kristallines Antibiotikum CC-1065 erhalten werden.
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Claims (6)

  1. Patentansprüche
    Gegen grampositive und gramnegative Bakterien sowie gegen L 1210-, P 388- und B 16-Zellen in vivo bei Mäusen aktives Antibiotikum CC-1065, das in im wesentlichen reiner Form folgende Eigensc1 iften aufweist:
    a) Molekulargewicht von etwa 700;
    b) folgende Elementaranalysenwerte: C 61,06 %; H 4,92 %; N 13,17 %;
    c) löslich in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Ac ation, Methylenchlorid, Äthylacetat und Dioxan;
    d) in Form einer Aufschwemmung in einem Mineralöl
    ein charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum gemäß Figur 1;
    e) ein charakteristisches Kernresonanzspektrum gemäß Figur 2 und
    f) ein charakteristisches Protonenspektrum gemäß Figur 3.
  2. 2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums CC-1065, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces zelensis
    909«16/0691
    j NACHtagRElCHT
    DSM 1341 so lange unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium züchtet, bis dieses eine merkliche Antibiotikum CC-1065-Aktivität erhält.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein wäßriges Nährmedium mit einem Lieferanten für assimilierbare Kohlenhydrate und assimilierbaren Stickstoff verwendet.
  4. 4. Verfahren zur Gewinnung von Antibiotikum CC-1065 aus einer Fermentationsbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man die filtrierte Fermentationsbrühe mit einem Lösungsmittel für das Antibiotikum CC-1065 extrahiert und danach das Antibiotikum CC-1065 aus den erhaltenen Extrakten gewinnt.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel für Antibiotikum CC-1065 Aceton, Methylenchlorid, Butanol oder Äthylacetat verwendet.
  6. 6. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Streptomyces zelensis DSM 1341 die bei der Fermentation in einem wäßrigen Nährmedium mit assimilierbaren Kohlenhydrat- und Stickstofflieferanten und anorganischen Substanzen zur Bildung einer gewinnbaren Menge des Antibiotikums CC-1065 fähig ist.
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