DE1957980A1

DE1957980A1 - Verfahren zur Herstellung von Daunorubicin durch Zuechtung eines Streptomyces

Info

Publication number: DE1957980A1
Application number: DE19691957980
Authority: DE
Inventors: Mancy Geb Courtillet; Jean Florent; Homme Jean Preud
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1968-11-18
Filing date: 1969-11-18
Publication date: 1970-08-13
Also published as: US3875010A; BR6914251D0; FI46079C; DK124138B; GB1241750A; ES373632A1; DE1957980C3; AT290729B; NO128618B; DE1957980B2; IL33371A0; JPS5218279B1; FR1593235A; SE351864B; CH508043A; IL33371A; IE33857L; FI46079B; IE33857B1; NL6916898A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Gewinnung des mit der Nummer 13 057 R.P. bezeichneten Antibioticums, das den Namen Daunorubicin(früher: Rubidomycin) erhalten hat.

In der französischen Patentschrift 1 533 151 sind das mit der Nummer 9 865 R.P. bezeichnete Antibioticum, seine drei Hauptbestandteile, die mit den Nummern 13 213 R.P., 13 057 R.P. (oder Daunorubicin) und 13 330 R.P. bezeichnet werden,

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die Herstellung des Antibioticums 9 8o5 R.P. durch Züchtung von Streptomyces 8 899 oder Streptomyces 31 723 in geeignetem Medium und die Fraktionierung des Antibioticums 9 8b5 R.P. in seine drei Bestandteile beschrieben.

In der französischen Patentschrift 1 551 195 ist ebenfalls die Herstellung des Antibioticums 13 057 R.P. oder Daunorubicins durch Züchtung eines neuen Streptomyces-Stamrr.es beschrieben, der mit Streptornyces griseus, Varietät Rubidofaciens, Stamm DS 32 O41 (NRRL 33-33) bezeichnet wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Daunorubicin durch Züchtung eines im folgenden näher identifizierten Mikroorganismus, der dem Genus Strep tomyces angehört und mit "streptomyces bifurcus, DS 23 219 bezeichnet wird, unter aeroben Bedingungen. Dieser neue Organismus wurde aus einer in Frankreich im Departement Val-de-Marne, entnommenen Erdprobe erhalten.

Die Isolierung dieses Stammes wurde unter Anwendung der folgenden üblichen Methode vorgenommen: Die Erdprobe wird in sterilem destilliertem Wasser suspendiert, die Suspension wird dann auf verschiedene Konzentrationen verdünnt, und kleine Volumina jeder Verdünnung werden auf die Oberfläche von Petrischalen verteilt, die ein geeignetes Agarnährmedium enthalten. Nach einer Inkubation von 15 Tagen bei 26°C werden die Kolonien von Mikroorganismen, die man isolieren will, auf Schrägagar versetzt, um reichlichere Kulturen zu erhalten. '

Aus den im folgenden dargelegten Gründen muss der Stamm Streptomyces DS 23 219 als Repräsentant einer neuen Species angesehen werden, die mit Streptomyces bifurcus aufgrund der Tatsache bezeichnet wird, dass man in seinen Kulturen sehr häufig eine recht besondere Form von Sporophoren antrifft, die am Ende

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eine Dichotomie aufweisen und dann zwei ländliche fts te aufweisen, die air. Snde eines Hauptfadens sitzen.

Streptomyces bifur^us, L'tamrn DS 2j5 219» bildet, zylindrische Sporen mit Abr.es.sunken von 0,k bis 0,5/1,0 bis 1,2 μ. P.oine geraden oder schwach gebogenen Sporenfäden sind auf Luft-ausgesetzten Fäden angeordnet, die sie isoliert oder als Trauben tragen, die eine beschränkte Anzahl von Elementen umfassen. Häufig bildet der Hauptfaden an seinem Ende nur zwei längliche Fäden, was den Sporophoren ein ganz besonderes gespaltenes Aussehen gibt.

Allgemein entwickelt streptoniyces bifurcus, Stamm DS 2j5 219, auf synthetische.'^ iJährnsedipr. ein gell-Hohes bis hellrora, bräun lichrosa oder· r'H Ii oh braunes vegetatives Mycel ur; i pr .-hj:;inrt lösliche Pigmente von orangerosa bis'violettrocn Färbung. Auf den organischen Medien ist sein vegetatives Mycel gelbbraun bis orangebraun, und die löslichen Pigmente, die er erzeugt, färben den Agar orangebraun bis rötlichbraun. Er erzeugt kein Melaninpigment auf organischen Medien und kein HpS. Er bildet aus Nitraten sowohl auf organischen Keulen als auch auf synthetischen Medien Nitrite, verflüssigt Gelatine, peptonisiert Milch langsam und verwertet Cellulose.

In der nachfolgenden Tabelle I sind die Züchtungscharakteristiken und die "biochemischen Eigenschaften, die Streptorr.yces bifurcus, Stamm DS 2j5 219, auf einer gewissen Anzahl von üblicherweise zur Prüfung des Aussehens von Streptoniyces-Stämmen verwendeten Nähragarmadien und Nährbouillons aufweist, angegeben. Ohne genauere Angaben sind diese Eigenschaften diejenigen, die Kulturen von etwa 2 bis 3 V.'ochen bei 25^CC, die ein gutes Entwicklungsstadium erreicht haben, aufweisen. Eine gewisse Anzahl der verwendeten Züchtungsmedien wurde nach den Rezepturen hergestellt, die in "The Actinorr.ycetes" (S.A. WAKS-KAN, "Chroniea ßotanica Company, Waltharri, Mass., USA, 1950,

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Seite 193-197) angegeben sind. In diesem Falle sind die Medien durch den Buchstaben W, dem die Nummer folgt, die ihnen in
"The Actinornycetes" gegeben wurde, bezeichnet.

Die Literaturstellen für die anderen ZUchtungsmedien oder die Zusammensetzungen derselben sind die folgenden:

Anm. A: "Hickey and Tresner's Agar", T.G. PRIDHAM u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950

Anm. B: K.L. JONES, Journal of Bacteriology, 57, 142, 1949 Anm. C: Rezeptur W-2J5, versetzt mit 2 % Agar

Anm. D: "Yeast Extract Agar", T.G. PRIDHAM u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950

Anm. E: "Tomato.Paste Oatmeal Agar", T.G. PRIDHAM u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950

Anm. F: W.E. GRUNDY u. Mitarb., Antibiotics and Chem., 2, 4O1, 1952

Anm. G: "inorganic Salts - Starch Agar", T.G. PRIDHAM u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 951

Anm. H: entspricht der Rezeptur W-1, wobei JO g Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt sind

Anm. I: entspricht der Rezeptur W-1, wobei 30 g Saccharose durch 15g Glycerin ersetzt sind

Anm. J: "Plain gelatin", hergestellt nach den Angaben des

"Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of American Bacteriologists, Geneva,
N.Y., H_50-18

Anrr.. K: "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y.,

Anm. L: "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y.,

^I:C5O-19

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Anm. M: entspricht der Rezeptur W-18, wobei 30 g Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt sind

Anm. N: entspricht der Rezeptur W-18, wobei die Saccharose weggelassen und durch kleine Filterpapiers^reifen ersetzt ist, die teilweise in die Flüssigkeit eintauchen

Anrn. 0: Handelsübliches Magermilchpulver, nach den Angaben des Herstellers zubereitet

Anm. P: The Actinomycetes, Band 2, Seite 333, Nr. 42, S.A. WAKSMAN, The Williams and-Wilkins Company, Baltimore, 1961

Anm. Q: H.D. TRESNER und F. DANGA, Journal of Bacteriology, 76, 239-24'i, 1958

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Tabelle I

CO 00 CO CO

U)

INJ

U)

0 Z

Έ.

"Ο

,m

Kulturmedium	Entwicklungs-	gut	Vegetatives	Luft-ausgesetzter	Lösliches	! Beobachtungen i	"ren mit Abmes	CXD
	grad		Mycel oder	Teil (umfasst Ge	Pigment	und biochemische	sungen von 0,4	er
			Unterseite	samtheit von Luft-		Eigenschaften	bis 0,5/1»0 bis
			der Kultur	ausgesetztem My			1,2 μ; gerade
(D	(2)		(5)	cel und SpornIa- tion) _(i})	(5)	(6) . .	oder schwach ge	α
Agar nach		hellgelb	hellgrau; sehr	I I sehr schwach!zylindrische Spo-	bogene Sporenfä
Hickey und		braunes ve	massig entwickelt	rosa bräun	den; häufig 3po-
Tresner		getatives		lich	rophoren von
(Anm. A)		Mycel; gut			zweigeteilter
		entwickelt			Form

	ziemlich
	gut



Agar nach	ziemlich	gelbliches	keiner·	keines
Bennett	gut	bis hellgelb-
(Anm. B)		lichbraunes
		vegetatives
		Mycel
Agar nach		gelbliches	keiner	schwach
Emerson	bis hellgelb-		rosabraun
(Anm. C)	lichbraunes
	vegetatives
	Mycel

σ·.

CO CO U) U)

U) fsj

(1)	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)	T	195798
Agar m£t Kefoextrakt nach Pridham (Anm. D)	gut	hellorange- braunes ve getatives Mycel	hellblaugrau; massig entwik- kelt	hellrötlich- orangebraun
Ajrar mit Hafer und Tomate" nach Pridham (Anm. E)	gut	hellorange- braunes ve getatives Mycel	blaugrau; ziemlich gut entwickelt	orangebraun		gute Loslichma- chung von CaI- ciummalat
Glucose- Pcpton- Agar (W-6)	ziemlich gut	bräunlich oranges ve getatives Mycel	keiner	schwach rosa orange braun
Nähragar (W-^)	sehr massig	he11bräunlich- gelbes vege tatives Mycel	keiner	keines
Agar mit Calcium- malat nach Krainsky (Anm. P)	massig	farbloses bis hellbräunlich- rosa vegeta tives Mycel	keiner	hellgräulich- rosa
A^ar mit Ovalbumin (W-1i?)	schlecht	farbloses bis hellrosa vegetatives Mycel	keiner	keines

(1)	(2)	(3)	(²O	I	(5)	•	(6)	!	Hydrolyse von
Glucose-	ziemlich	hellorangebraunes	blaugrau;	hellrötlich-			Stärke: posi
Asparagin-	gut	bis hellrotbrau	sehr massig	orange			tiv
Agar		nes vegetatives	entwickelt				zylindrische
(W-2)		Mycel					Sporen mit o*j
Glycerin-	ziemlich	rosabraungelb	rosagrau bis	orangerosa bis			Abmessungen ^i
Asparagin-	gut	bis rot	blaugrau; ziem	rot			von 0,4 bis
Agar			lich spärlich				0,5/1,0 bis
(w-3)			entwickelt			1,2 μ; gerade
Stärke-	massig	rötlichrosa bis	hellgräulich;	hellviolettrosa-		oder schwach
Nitrat-		hellrosabraunes	spärlich ent	braun		gebogene Spo
Agar (W-10)		vegetatives Mycel	wickelt			renfäden ;
Agar mit	ziemlich	rötlichorangebrau-	hellbläulich-	hellrötlich-	häufig Sporo-
Stärke	gut	ne Unterseite	grau Dis hell-	braun	phoren von
nach			rosagrau; mas		zweigeteilter
Pridham			sig entwickelt	Formj Hydroly
(Anm. G)				se von Stärke:
				positiv

(D	(2)	(3)	(4) ■	(5) (6)	I	intensiv
Synthe	gut	hellgelbliches	keiner	violettrosa	purpurviolett;
tischer		bis rötlichrosa			reichlich
Agar nach		vegetatives
Czapek		Mycel
mit
Saccharose
(w-1)
Synthe	gut	hellgelbliches	keiner
tischer		bis hellrosabrau-	•
Agar nach		nes vegetatives
Czapek		Mycel		blassrosa
mit				bis blass
Glucose				orange
(Anm. H)
Synthe	gut	violettrotes	rosagrau
tischer		vegetatives	bis violett
Agar nach		Mycel	grau; massig
Czapek			entwickelt
mit
Glycerin
(Anm. I)

CD OD O.

O O CD OO

co ω

co

Λ Q Z

co

(1)	(2)	■	(3)	(M .	(5)	(6)	i
Kultur	gut	sehr gut ent	keiner	rotlichbraun
auf Kar		wickeltes,
toffeln		sehr dickes
(W-27)		und stark ge
		faltetes vege
		tatives Mycelj
		hellbräunIich
		bis hellrötlich-
		braun
reine	massig	weissliches	keiner	keines	Verflüssigung:
Gelatine		vegetatives My-			positiv
mit 12 % ■		cel
(Anm. J)
Nitrat-	ziemlich	gelblicher Ring	keiner	keines	Reduktion von
Nähragar	gut				Nitraten zu Ni
(Anm. K)					triten: stark
					positiv
Glucose-	massig	kleine gräuliche	keiner·	keines	Reduktion von
Nitrat-		Kolonien, die			Nitraten zu Ni
Bouillon		sich an der Ober			triten: positiv
nach		fläche agglome
Dimmick		rieren
(Anm. L)

CD cn

CO CX) O

σο u> co

(1)	(2)	O)	(*)	(5) ·.	(6) i
Bouillon nach Czapek mit Saccharose (W-18)	mittel	rosa Schleier, dick, gut ent wickelt	keiner	keines ■	Reduktion von Nitraten zu Nitriten: positiv
Bouillon nach Czapek mit Glucose (Anm. M)	mittel	rosaviolett	keiner	keines	Reduktion von Nitraten zu Nitriten: positiv
Bouillon nach Czapek mit Cellulose (Anm. N)	mittel	kleine rosaweisse Kolonien auf dem aus der Bouillon herausragenden Papier	•rosa-weiss '	keines	Reduktion von Nitraten zu Nitriten: positiv; Verwertung von Cellu lose: positiv
Magermilch (Anm. O)	gut	gelblicher Ring	keiner		Keine Koagulation; langsame Peptonisatlon, erst nach 1 Monat Züch tung beginnend; pH un verändert in 1 Monat

O O CD OO

(1)	(2)	O)	(4)	(5)	(6)
Tyrosin-	massig	hellbräunlich-	rosa-weiss	he11bräun-	Bildung von Melanin:
Hefeextrakt-		rosa	bis rosa	lichrosa	negativ
Agar zur			grau j massig
Bildung			entwickelt
von
Melanin
(Anm. P)
Agar nach	gut	hellbräunlich-	keiner	hellbräun-	Produktion von HpS:
Tresner		gelb		lichgelb	negativ
und üanga
(Anm. Q) ■

co IS) OJ

Γ"

CD cn

CD OO CD

Die Fähigkeit von Streptomyoes bifurcus, Stamm DS 2> 219* verschiedene Kohlenstoff que Ilen und Stickstoffquellen zur Gewährleistung seiner Entwicklung zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode von Pridham und Gottlieb (J. of Bact. 56, 107-114, 1948) bestimmt. Der Entwicklungsgrad wurde auf dem von diesen Autoren angegebenen Grundmedium beobachtet, wobei die Glucose durch die verschiedenen jeweilig untersuchten Kohlenst off que Ilen oder das (NHh)₂SOj, durch die verschiedenen jeweils untersuchten Stickstoffquellen ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle II angegeben.

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Tabelle II

Geprüfte Kohlen stoffquellen	Ver wertung	-	+	-	+	Geprüfte Stick stoffquellen	Ver wertung	-
D-Xylose	+	+	-	+	NaNO₃	+	-
L-Arabinose	+	+	-	+	NaNO₂	+	+ aber langsam
L-Rhamnose	+	+ aber langsam +	+	(NH^)₂SO₄	+	+ .
D-Glucose	+	+	(NH₄J₂HPO₄ ·	+	+
D-Galactose	+	+	Adenin	+	+
D-Fructose	+	+	Adenosin	+	+
D-Mannose	+	+	Uracil	+
L-Sorbose	+	Harnstoff	+
Lactose	+	L-Asparagin	+
Kaitose	Glykokoll	+
Saccharose	Sarcosin	+
Trehalose Cellobiose	DL-Alanin DL-VaIin	+
Raffinose	DL-Asparaginsäure	+
Dextrin	L-Glutaminsäure	+
Inulin	L-Arginin	+
Stärke	L-Lysin	+
Glykogen	DL-Serin	+
Glycerin	DL-Threonin	+
Erythrit	DL-Methionin
Adonit	Taurin
Dulcit	DL-Phenylalanin
D-Mannit	L-Tyrosin
D-Sorbit	DL-Prolin
Inosit	L-Hyd roxypro1in
Salicin	Betain

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Die Gesamtheit der Charakteristiken, die Streptomyces bifurcus, Stamm J)G 23 219, aufweist, hat nicht ermöglicht, ihn als eine der bereits beschriebenen Species zu identifizieren. Er muss daher als Repräsentant einer neuen Species angesehen werden.

Nach der in Sergey's Manual of Determinative Bacteriology (7· Auflage, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957) angegebenen Klassifikation von Streptomyces machen ihn seine Eigenschaften, auf organischen Medien kein Melaninpigment zu bilden, auf Kartoffeln ein lösliches rötlichbraunes Pigment zu entwickeln und auch auf Kartoffeln ein hellrötlichbraunes vegetatives Mycel zu entwickeln, dem Streptomyces hoursei ähnlich. Er steht jedoch mit diesem letzteren in keinem Verhältnis, der spiralige Sporophoren bildet und dessen sporuliertes Luft-ausgesetztes Mycel eine rosa Farbe annimmt, während er nur nichtspiralige Sporenfäden bildet und ein hellblaugraues sporuliertes Luft-ausgesetztes Mycel aufweist.

In The Actinomycetes (Band 2, S.A. WAKSMAN, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, Seite 158) befindet sich eine Beschreibung von drei anderen Species, die mit Streptomyces noursei die Eigenschaft teilen, auf organischen Medien kein Melaninpigment zu bilden, auf Kartoffeln ein rötliches lösliches Pigment freizusetzen und auf Kartoffeln ein rosa bis rötliches vegetatives Mycel zu bilden, nämlich Streptomyces albogriseolus, Streptomyces spiralis und Streptomyces fragilis. Diese drei Species weisen jedoch gegenüber dem Stamm Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, wesentliche Unterschiede auf, die zeigen, dass sie unbestreitbar Species sind, die ihm nicht entsprechen können: Streptomyces albogriseolus und Streptomyces spiralis bilden spiralige Sporophoren und gehören daher in die Sektion Spira der Klassifikation von Pridharn, während Sti'eptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, der nur gerade ode" schwach gebogene Sporenfäden bildet, in die Sektion Rectus-Flexibilis

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dieser gleichen Klassifikation gehört. Was Streptomyces fragilis anbetrifft, so zeigt die rosa Farbe, die sein Luffcausgesetztes Mycel bei Erreichung der Sporulation annimmt, dass er in keiner Beziehung zu Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23> 219_f steht, dessen Luft-ausgesetztes Mycel, wie bereits ausgeführt wurde, sich hellblaugrau färbt, wenn er sporuliert ist. -

Streptomyces bifurcus, Stamm DS 2J 219* kann daher nicht als einer der als nächsten kommenden Stämme identifiziert werden.

Das neue Verfahren zur Gewinnung von Daunorubicin besteht im wesentlichen darin, Streptomyces bifurcus, Stamm DS 25 219> oder seine Mutanten in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und das im Verlaufe der Züchtung gebildete Antibioticum abzutrennen.

Die Züchtung durch Fermentation von Streptomyces bifurcus, Stamm DS 25 219» ergibt im wesentlichen Daunorubicin, jedoch auch die anderen Bestandteile des Antibioticums 9 865 R.P., die von dem Daunorubicin im Verlaufe von Extrakt-Ons- und Reinigungsarbeitsgängen abgetrennt werden und gegebenenfalls isoliert v/erden können. Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist jedoch die Herstellung von Daunorubicin.

Die Züchtung von Streptomyces bifurcus, Stamm DS 2^ 219» kann nach jeder beliebigen aeroben Oberflächenzüchtungsmethode oder Submerszüchtungsmethode erfolgen, doch ist diese letztere aus Gründen der Bequemlichkeit zu bevorzugen. Man verwendet zu diesem Zweck die verschiedenen Apparaturtypen, die jetzt üblicherweise in der Fermentationsindustrie verwendet werden.

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Man kann insbesondere den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen:

Stamm DS 23 219 - Stammansatz

Kultur auf Agar

Kultur im Kolben unter Bewegung

Impfkultur im Fermenter

Produktionskultur im Fermenter

Das Fermentationsmedium soll im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Bestandteile in Form von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Maltose, Dextrine, Stärke, oder andere Kohlehydratsubstanzen, wie beispielsweise Zuckeralkohole, z.B. Mannit und dgl., oder gewisse organische Säuren, wie beispielsweise Milchsäure oder Citronensäure, verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können diese verschiedenen Kohlehydratquellen mit Vorteil ersetzen oder ihnen beigefügt werden.

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind ausserordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise Nitrate, anorganische oder organische Ammoniumsalze, Harnstoff oder Aminosäuren, sein.

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Sie können auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in protidischer Form enthalten, zugeführt werden, wie beispielsweise in Form von Casein, Lactalbumin, Gluten oder deren Hydrolysaten, Sojamehl, Arachismehl, Fischmehl, Fleicchcxtrakten, Hefeextrakten, Distillers¹ Solubles und Maisquellwasser.

Unter den zugefügten mineralischen Stoffen können gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder Calcium- und Magnesiumcarbonat.

Andere führen zu dem zur Entwicklung des Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219» und zur Erzeugung des Antibioticums erforderlichen Ionengleichgewicht, wie beispielsweise die Alkali- und Erdalkalichloride und -sulfate. Schliesslich wirken gewisse in speziellerer Weise als Aktivatoren der Stoffwechselreaktionen des Streptomyces DS 23 219. Es sind dies die Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- und Mangansalze.

Der pH-Wert des Fermentationsmediums soll zu Beginn der Züchtung zwischen 6,0 und 7>8, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5, liegen. Die zur Fermentation optimale Temperatur beträgt 25 bis 50°C, doch wird auch bei Temperaturen zwischen 23 und 33°C eine zufriedenstellende Produktion erhalten. Die Belüftung der Züchtung kann in ziemlich weiten Grenzen variieren. Es wurde jedoch gefunden, dass Belüftungen von 0,3 bis 3 Luft je 1 Bouillon und je Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an Antibioticum wird nach 2- bis 8-tägiger Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt.

Aus den vorstehenden Ausführungen ist ersichtlich, dass die zur Produktion von Daunorubicin angewendeten allgemeinen Bedin-

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gungen der Züchtung von Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219* in ziemlich weitem Masse variieren und jedem besonderen Erfordernis angepasst werden können.

Das Daunorubicin kann aus den Fermentationsmaischen nach verschiedenen Methoden isoliert werden.

Man kann die Kulturmaische bei einem pH-Wert zwischen 1,5 und 9 filtrieren. Unter diesen Bedingungen geht der Hauptteil der Aktivität in das Filtrat. Nach Waschen mit V/asser enthält der Filterkuchen praktisch keine Aktivität mehr. Es ist vorteilhaft, diesen Arbeitsgang in saurem Medium und insbesondere unter Ansäuern mit Oxalsäure auf einen pH-Wert zwischen 1,5 und 2 durchzuführen. Es ist auch möglich, die Filtration bei einem pH-Wert zwischen 2 und 7» vorzugsweise bei einem pH-Wert in der Nähe von 2, in Anwesenheit eines aliphatischen Alkohols mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen vorzunehmen.

Bei den oben genannten Extraktionsarbeitsgängen wird das Daunorubicin in wässriger oder wässrig-alkoholischer Lösung erhalten, und man führt es anschliessend durch Extraktion mit einem mit Wasser nichtmischbaren organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Butanol, Methylisobutylketon, Ä'thylacetat oder Chloroform, bei einem pH-Wert zwischen 5*5 und 9» vorzugsweise bei einem pH-Wert in der Nähe von 7,5* in eine organische Lösung über. Gegebenenfalls nimmt man vor dieser Extraktion eine Behandlung mit einem lonenaustauscher- harz vor. In diesem Falle wird die wässrige Lösung auf einen pH-Wert in der Nähe von 4 eingestellt und das Antibioticum dann an ein Kationenaustauscherharz gebunden. Das Daunorubicin wird vorzugsweise mit Methanol, das 10 % Wasser und 1 £ Natriumchlorid enthält, eluiert. Das Eluat wird dann eingeengt, um den Alkohol zu entfernen, und dann wie oben angegeben, extrahiert.

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Man kann die.. Fermentationsinaische auch einer Extraktion mit einem mit Wasser nichtmischbaren organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Butanol, A'thylacetat oder Chloroform, bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 9,vorzugsweise bei einem pH-Wert in der Nähe von 7*5, unterziehen. In diesem Falle geht die gesamte Aktivität in die organische Phase, die von der wässrigen Phase nach üblichen Verfahren abgetrennt wird. .

Gleichgültig, welche Extraktionsweise gewählt wird, wird das Daunorubicin schliesslich in organischer Lösung erhalten. Es kann zu diesem Zeitpunkt vorteilhaft sein, eine Reinigung durch aufeinanderfolgende Überführung des Antibio-.ticums in wässrige Lösung und dann in organische Lösung durch Änderung des pH-Werts vorzunehmen. Das rohe Antibioticum kann anschliessend -aus der zuletzt erhaltenen organischen Lösung durch Einengen oder durch Ausfällen mit einem schlechten Lösungsmittel, wie beispielsweise Hexan, isoliert werden.

Zur Herstellung von reinerem Daunorubicin kann man die üblicherweise angewendeten Methoden, wie beispielsweise Chromatographie an verschiedene Adsorbentien, Gegenstromverteilung oder Verteilung zwischen verschiedenen Lösungsmitteln, anwenden .

Das Daunorubicin kann auch in Additionssalze mit Säuren, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, übergeführt werden. Diese Salze können durch Anwendung üblicher Methoden gereinigt werden.

Das nach den· erfindungsgemässen Verfahren erhaltene Daunorubicin und dessen Salze weisen Eigenschaften auf, die mit denjenigen des Antibioticums 13 057 R.P. und seiner Salze, die in der französischen Patentschrift 1 533 15I beschrieben sind, identisch sind.

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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

In einen 170 1-Fermenter bringt man die folgenden Bestandteile ein:

Pepton	1200 g
Fleischextrakt	600 g
Hydratisierte Glucose	1200 g
Agar	240 g
Leitungswasser	ad 110 1

Der pH-Wert wird mit 120 cnr 10n-Natronlauge auf 7*20 eingestellt. Man sterilisiert das Medium durch 40-minütiges Durchleiten von Dampf von 122°C. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 120 1 und der pH-Wert 6,65. Man beimpft dann mit 200 cnr einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur von Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219. Die Kultur wird bei 27⁰C während 30 Stunden unter Bewegen und unter Belüftung mit steriler Luft entwickelt. Sie ist dann zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet.

Die Produktionskultur wird in einem 800 1-Fermenter durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen beschickt ist:

Distillers' Solubles gekörnte Bohnen Sojaöl

Natriumchlorid

Kobaltchlorid-Hexahydrat Leitungswasser

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4	kg	1
12	kg
8	1
2	kg
8	g
ad 330

Nach Einstellen des pH-Werts mit -iOO crcr I0n-Natronlauge auf 7,70 wird das Medium bei 12P°C während 40 Kinuten sterilisiert. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der 3ouillon 3Ö0 1. Es wird durch Zugabe von ²K) 1 einer sterilen wässri-

.- hydratisierte
gen Lösung, die ö kg/Glucose enthält, auf 400 1 aufgefüllt.

Der pH-Wert beträgt dann 6,80.

Man beimpft mit 4o 1 der Impfkultur aus dem oben beschriebenen 170 1-Fermenter. Die Züchtung wird bei 27°C I70 Stunden unter Bewegen mittels eines Turbinenrührers, der mit* 260 U/min betrieben wird und unter Belüftung mit steriler Luft in einer Menge von 30 nr/Stunde durchgeführt. Der pH-Wert des Züchtungsmediums beträgt dann 7,30 und das Volumen der Maische 305 1. Die vorhandene Menge an Daunorubicin (13 057 R.P.) beträgt 22,5 μg/^/cnr⁵ ₀

Beispiel 2

200 1 der während der in Beispiel 1 beschriebenen Fermentation erhaltenen Züchtungsmaische werden in einen mit einem Rührer und einer Heizschlange mit Dampf ausgestatteten Bottich eingebracht. Man setzt 6 kg Oxalsäure zu und erhitzt die Masse auf 50⁰C. Man rührt bei dieser Temperatur 1 1/2 Stunden weiter. Nach dieser Zeitspanne wird die Suspension auf einer Filterpresse nach Zugabe von 30 kg Filterhilfe filtriert. Der Filterkuchen wird auf dem Filter mit 100 1 Wasser gewaschen. Das Filtrat, dessen Volumen 2oO 1 beträgt, wird auf ' +15⁰C abgekühlt, und der pH-Wert wird mit 10 ^iger Natronlauge auf 4,5 eingestellt.

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Das FilLrat wird in eine Säule, die 6 1 Amberlike IRC-50 im Säure/.yklus enthält, so geleitet, dass das Harz bett von oben nach unten mit einer Hate von 1^Jj> 1/Stunde durchströmt wird. Die Säule wird anschliessend mit. 30 1 V/asser, das in der gleichen Richtung wie das Filtrat und mit der gleichen Rate durchgeleitet wird, und dann mit 30 1 Methanol mit einem Gehalt von 50 % Wasser in einer Rate von 15 l/Stunde von unten nach oben und dann weiterhin mit der gleichen Rate und von unten nach oben mit 50 1 Methanol mit einem Gehalt von 10 % Wasser gewaschen.

Der Abfluss und die Waschi'lüssigkeiten werden verworfen, und die Säule wird mit einer von oben nach unten durch das Harz geleiteten«Lösung der folgenden Zusammensetzung eluiert:

Natriumchlorid 10 g

Wasser 100 cirr

Methanol ad 1000 cm·'

Das Eluat wird ab dem Auftreten einer orange-roten Färbung und bis zum Verschwinden dieser Färbung gesammelt. Man erhält so ein Volumen von 50 1, die den Hauptteil des Antibioticums enthalten.

Das Eluat wird unter vermindertem Druck (2 mm Hg) bei 35°C auf ein Volumen von 10 1 eingeengt.

Das Konzentrat wird bei pH 8,5 nacheinander dreimal mit je 5 1 Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wird bei 30⁰C unter vermindertem Druck (5 mm Hg) auf ein Volumen von 50 cnr eingeengt. Das Antibioticum wird in Form der Base mit 500 cnr Hexan ausgefällt, abgesaugt, gewaschen und getrocknet

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Man erhält schliesslich 4,9 g rohe Base mit einem Gehalt von 64 % Daunorubicin.

Beispiel 3

6,8 g des wie in Beispiel 2 erhaltenen Produkts mit einem Gehalt von 64 % Daunorubicin werden in 4o cnr Wasser sus-

•7t.

pendiert und durch fortschreitende Zugabe von 7 cnr InSalzsäure gelöst. Die Lösung wird durch Filtrieren geklärt, und Daunorubicin-hydrochlorid wird durch langsame Zugabe von 1 1 Aceton kristallisiert. Die so erhaltenen Kristalle werden abfiltriert, mit 50 cnr Aceton gewaschen und bei 50⁰C unter vermindertem Druck (5 mm Hg) 15 Stunden getrocknet. Man erhält 3*3 g kristallisiertes Hydrochlorid mit einem Gehalt von 90 % Daunorubicin in einer Ausbeute von 68 %.

Beispiel 4

3 g des gemäss Beispiel 3 erhaltenen Produkts werden in 10 cnr Methanol gelöst. Dann werden 100 cnr Chloroform nach und nach zugegeben, was die Kristallisation von Daunorubicin-hydrochlorid bewirkt. Die so erhaltenen Kristalle werden abfiltriert, mit 20 cnr Chloroform gewaschen und unter vermindertem Druck (5 mm Hg) 15 Stunden bei 50⁰C getrocknet. Man erhält 1,Bg umkristallisiertes Hydrochlorid mit einem Gehalt von 90 % Daunorubicin. Die Ausfällung der Kristallisationsmutterlaugen mit 200 cnr Hexan ermöglicht, eine zweite Fraktion Daunorubicin zu erhalten. Nach Filtrieren, Waschen mit 50 cnr Hexan und Trocknen bei 50⁰C unter vermindertem Druck (5 mm Hg) erhält man 1 g Daunorubicin, das in den Arbeitsgang von Beispiel 3 zurückgeführt werden kann.

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Beispiel 5 .

2,4 g des wie in Beispiel 4 beschrieben erhaltenen Daunoru-

■7.

bicin-hydrochlorids werden in 40 cnr Butanol suspendiert.
Nach 1/2-stündigem Rühren werden die Kristalle abfiltriert, mit 10 crrr 3utanol gev/aschen und bei 6o°C unter vermindertem Druck (0,5 mm Hg) während 8 Stunden getrocknet. Man
erhält 2,1 g reines Daunorubicin-hydrochlorid mit einer Ausbeute von 88 '·%.

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Claims

Patentanspruch

Verfahren zur Herstellung des Daunorubicin genannten Antibioticums 1j5 057 R.P. durch Fermentation, dadurch gekennzeichnet, dass man einen neuen "Streptorcyces bifurcus, Stamm DS 23 219 / genannten Stamm verwendet. (NRRL 3539)"

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