DE2164664C3

DE2164664C3 - Verfahren zur Herstellung von Lincomycin

Info

Publication number: DE2164664C3
Application number: DE2164664A
Authority: DE
Inventors: Alexander Demetrios Portage Argoudelis; John Henry Kalamazoo Coats; Thomas Richard Portage Pyke
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1970-12-28
Filing date: 1971-12-24
Publication date: 1980-07-31
Also published as: US3697380A; JPS557238B1; NL7117563A; FR2120924A5; SE387364B; DK126340B; NL156441B; DE2164664B2; DE2164664A1

Description

Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Lincomycin ohne gleichzeitige Erzeugung von Lincomycin B (4'-Despropyl-4'-äthyl-iincomycin). Die Abwesenheit von Lincomycin B in der Gärbrühe ermöglicht eine verbesserte und wirksamere Lincomycingewinnung hieraus.

Lincomycin ist ein nützliches Antibiotikum, das durch Gärverfahren unter Verwendung des Mikroorganismus Streptomyces lincolnensis van lincolnensis gewonnen wird. In der US-Patentschrift 30 86 912 wird ein solches Gär- und Gewinnungsverfahren für Lincomycin, früher als Lincolnensin bekannt, beschrieben. Bei der Gärung gemäß dieser Patentschrift fällt gleichzeitig Lincomycin B, eine stickstoffhaltige Base der Molekularformel C17H32N2O6S an. Zwar sind Lincomycin und Lincomycin B gegen praktisch das gleiche Spektrum von Mikroorganismen wirksam, doch liegt bekanntlich die Wirksamkeit des Lincomycin B gegen diese Mikroorganismen erheblich unter jener des Lincomycins. Lincomycin ist infolgedessen das bevorzugte Antibiotikum.

Zum mikrobiologischen Verfahren dieser Erfindung wird ein neuartiger Mikroorganismus zur Herstellung von Lincomycin herangezogen, wobei die gleichzeitige Erzeugung von Lincomycin Bunterbleibt.

Der im vorligenden für die Lincomycinherstellung herangezogene, neuartige Actinomycet ist Streptomyces espinosus Dietz, sp. nov. Eine seiner Stammeseigenschaften liegt in der Bildung von Lincomycin ohne gleichzeitige Bildung von Lincomycin B. Eine Subkultur dieses lebenden Organismus kann auf Anfrage von der hierfür vorgesehenen Hinterlegungsstelle der Northern -ti Utilization and Research Division, Agricultural Research Services, U. S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U.S.A., bezogen werden. Die Eintragungsnummer bei dieser Hinterlegungsstelle lautet NRRL 3890.

Des weiteren erfolgte eine Hinterlegung bei der ίο Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Göttingen mit der Eintragungsnummer DSM 920.

Der erfindungsgemäO verwendete Mikroorganismus Streptomyces espinosus Dietz, sp. nov. wurde von Alma Dietz vom Upjohn-Forschungslaboraiorium untersucht « und wird nachfolgend beschrieben:

Farbeigenschaften:grau-grünes Luftwachstum. Melanin negativ. Sein Erscheinungsbild auf Ek t ach rom (2) beschreibt Tabelle I. Die ßezugsfafbeigenschäften sind in Tabelle Il zusammengestellt. Die Kultur kann in der Grün(GN) und Grau-(GY)farbreihe nach Tresner und Backus (Applied Microbiol. Bd. II₁S. 353-338[1962]) untergebracht werden.

Mikroskopische Eigenschaften: Sporenträger sind kurz, gerade bis zickzackförmig bis offenspiralig (RF, RA) im Sinne von Pridham und Mitarbeitern (Applied Microbiol. Bd. 6, S. 52-79[1958]). Sporen

M) sind meistens kugelförmig, viele davon mit ausgesprochener Verkettung (linkage). Die Sporenoberfläche ist dornig bis stachelig und scheint bei manchen Stacheln ins Haarförmige überzugehen, D?e Stacheln erscheinen reichlich und gemustert, wenn sie auf Sporen beobachtet werden, die nach der Kohlenstoff-Vermehrungsmethode von Dietz und Mathews (Applied MicorbioL Bd, 10, S. 258-263 und Bd. 16, S. 935—941 [1968]) behandelt worden sind

Biochemische und Kultureigenschaften: siehe Tabelle III

Verwendung von Kohlenstoff: Das Wachstum der Kultur auf Kohlenstoffverbindungen wurde in dem synthetischen Medium nach Pridham un<J Gottlieb (J. Bacteriol. Bd. 56, S. 107-114[1948J und in deren modifiziertem Medium (International Journal of Systematic Bacteriology Bd. 16, S. 313—340 [1966]) ermittelt Im erstgenannten Medium erfolgte ein geringes Wachstum der Kultur auf der Kontrolle, Inulin, Dulcit, D-Sorbit, Phenol, Natriumoxalat, Natriumtartrat und Natriumsuccinat; ein mäßiges Wachstum auf Sucrose, Raffinose, Saücin und Natriumacetat; ein gutes Wachstum auf D-Xylose, L-Arabinose, Rhamnose, D-Fructose, D-Galactose, D-GIucose, D-Mannose, Maltose, Lactose, Cellobiose, Dextrin, löslicher Stärke, Glycerin, D-Mannit und Inosit: kein Wachstum auf Kresol, Natriumformiat und Natriumsalicylat Im modifizierten Medium erfolgte eine geringe Entwicklung auf der negativen Kontrolle (kein Zusatz von Kohlenstoffverbindung) und gute Entwicklung auf der positiven Kontrolle (Glucose). Das Wachstum auf L-Arabinose, D-Xylose, Inosit, D-Mannit, D-Fructose, Rhamnose und Cellulose (eine von zwei Platten) war gleichartig oder besser als die Glucosekontrolle. Es zeigte sich kein Wachstum auf Saccharose oder Raffinose.

Temperatur: Auf Bennett's-Agar, Czapek's-Saccharose-Agar und Maltose-Trypton-Agar gedieh das Wachstum ziemlich gut bei 18°C, 45°C und 55°C; gut bei 24°C und reichlich bei 28—37°C.

S. espinosus ist leicht zu unterscheiden von dem Lincomycin-Erzeuger Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis (D.). Mason, A. Dietz und C. DeBoer, 1962, »Lincomycin, A New Antibiotic«; .'. Discovery and Biological Properties, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, S. 554—559). Die neue Kultur entfaltet grau-grünes Luftwachstum, ist melaninnegativ, hat kurze, gerade bis offenspiralige Sporenträger mit runden, dornigen bis stacheligen bis haarigen Sporen, solubilisiert Xanthin nicht und gedeiht bei 45—55°C sowie bei niedrigeren Temperaturen. S. lincolnensis zeigt dagegen blaß-rosafarbenes Luftwachstum, ist melanin-positiv, hat lange gerade bis zickzackförmijse Sporenträger mit rechtwinkligen glatten Sporen mit feinem Oberflächendetail, solubilisiert Xanthin und entfaltet bei 45—55°C kein bzw. nur spurenartiges Wachstum.

S. espinosus unterscheidet sich von anderen zur begrenzten »grünen« Gruppe von Streptomyces gehörenden Organismen durch seine Produktion von Antibiotikum Lincomycin, durch sein rasches Wachstum und die Bildung von grau-grünem Luftmycel, durch sein auffallendes weißes Luftwachstum auf Pepton-Eisen-Agar, sein Wachstum bei 18—55"C und seine ausge-

prägten runden Sporen mit dorniger bis stacheliger Ws haariger Oberfläche (vgl Cultures in the Viridis Series of Waksman [s, A, Waksmann, 1961, The Aotinomycetes, Band 2, Classification, Identification, and Descriptions of Genera and Species, The Williams and Wilkins Co_n Baltimore] und Baldacci, Giornale di Microbiologja, Bd. 6, S. 10—27 [1958]); die prasinus-Farbgruppe von Ettlinger et al, (Archiv, für Mikrobiologie, Bd. 31, S. 326—358 [1958J, die prasinus-farbene azureus-glaucus-Gruppe von Hütter (R. Hütter, »Systematik der Streptomyceten unter besonderer Berücksichtigung der von ihnen gebildeten Antibiotika«, S. Karger, Basel [1967]), die malachiticus-Gruppe von Küster (International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 20, S. 25—29 [1970]), die grünsporige Fafbgruppe X von Kutzner (H. J. Kutzner, »Beitrag zur Systematik und Ökologie der Gattung Streptomyces Waksman et Henrici«, Diss. Landw. Hochschule Hockenheim [1956]) und die Prasinomycin-Er.tjuger von Myers et al. (Appl. Microbio!., Bd. 16, S. 603-608[!95S]).

Von den aufgeführten Arten der Upjohn-Kulturensammlung und von den in der Literatur beschriebenen Arten ist der Streptomyces espinosus durch die Art seiner auffallende Farbmuster tragenden Sporenträger und Sporen sowie durch sein Vermögen, Lincomycin zu produzieren, unterscheidbar. Es wird vorgeschlagen, das neue Bodenisolierungsprodukt mit Streptomyces espinosus Dietz, sp. nov. und diese Typenart als Variante Streptomyces espinosus var. espinosus gemäß Bestimmung 9d(2) des In'ifirnationalen Code der Bakterienno- Jo menklatur (Intern. J. System. BacterioU Bd. 16, S. 459—490 [1966J zu bezeichnen.

Tabelle II

Bezugsfarbeigenschaften von Streptomyces espinosus Pie Eigenschaften des Streptomyces espinosus Pietz, sp, nov„ NRRL 3890 sind in nachstehenden Tabellen zusammengestellt;

Tabelle 1; Erscheinungsbild des Streptomyces espinosus auf Ektachrome,

Tabelle II; Bezugsfarbeigenschaften des Streptomyces espinosus.

Tabelle III: Biochemische und Kultureigenschaften des Streptomyces espinosus.

Tabelle I	Oberfläche	Unterseite
	grau-grün	blaßgelb- gelbbraun
	grau-grün	mattgrau
Erscheinungsbild des Streptomyces espinosus auf Ekta chrome*)	grau-grün	gelb-gelbbraun bis oliv
Agar-Medium	weiß	gelb
Bennett's	farblos	rot
Czapek's-Saccharose	grau-grün	mattgrau-grün
Maltose-Trypton
Pepton-Eisen
0,1% Tyrosin
Kaseinstärke

*) A. Dietz, »Ektachrome Transparencies as Acids in Actinomycete Classification«, Annals of the New York Academy of Seiendes, Bd. 60, S. 152-154 (1954).

Agar-Medium Nach »Color Harmony Manual«, 3. Auflage, 1948*)

Nach »ISCC-N'ßS-Methode zur Farbenbezeichnung und Wörterbuch der Farbbezeichnungen«**)

Bennett's
O

Czapek's-Saccharose
O

1 '/2ge helles Olivgrau
Ige Zitronat-zitronengrau

2ec Biskuit, hellbraun, Hafermehl, Sand

2ig schiefergraugelbbraun

2ig schiefergraugelbbraun 109gm helles Gräulicholiv
109gm helles Gräulicholiv

90gm gräulich-gelb

110g gräulich-oliv
II2m helles Olivgrau
110g gräulich-oliv
112m helles Olivgrau

Maltose*Trypton
Ö

1 'Age helles Olivgrau
Hh olivgrau

2gc Bambus, chamois
1 '/2ge helles Olivgrau

109gm helles Gräulicholiv
112m helles Olivgrau
113g olivgrau
127g gräulich-olivgrün

90gm gräulich-gelb
109gm helles Gräulicholiv

Fortsetzung

Agar-Medium

Nach »Color Harmony Manual«, 3. Auflage, 1948*) Nach »ISCC-NBS-Methoile zur Farbenbezeichnung und Wörterbuch tier Farbbezeichnungen«**)

Hefeextra kt-Malzextrakt (ISP-2)

2ih dunkles, gedecktes Grau lih olivgrau

2gc Bambus, chamois 2ie helles Senfgelbbraun 112m helles Olivgrau 113g olivgrau 112m helles Olivgrau 113g olivgrau 127g gräuliches Olivgrün 90gm gräulich-gelb 91gm dunkles gräuliches Gelb 94g helles Olivbraun 106g helles Oliv

Hafermehl (ISP-3) O

1 Vag olivgrau

2fe gedecktes Grau

1 'Age helles Olivgrau

2ec Biskuit, hellbraun, Hafermehl, Sand 94g helles Olivbraun 112gm helles Olivgrau 109gm helles gräuliches Oliv 90gm gräulich-gelb

Anorganische Salz-Stärke (ISP-4)

3ih beige-grau, Maus Hh olivgrau

2gc Bambus, chamois

2ec Biskuit, hellbraun, Hafermehl, Sand 113g olivgrau

265m mittelgrau 112m helles Olivgrau 113g olivgrau

127g gräuliches Olivgrün 90gm gräulich-gelb 90gm gräulich-gelb

Glycenn-Asparagin (ISP-5)

2ik dunkles, gedecktes Grau 2fe gedecktes Grau

2ge gedecktes Gelbbraun, gräulich-gelbbraun (griege)

2ge gedecktes Gelbbraun, gräulich-gelbbraun (griege) 112m helles Olivgrau 113g olivgrau 94g helles Olivbraun 112gm helles Olivgrau

90gm gräulich-gelb 90gm gräulich-gelb

O = Oberfläche. U = Unterseite. P = Pigment.

*) E. Jacobson, W. C. Granville und C. E. Foss, »Color Harmony Manual«, 3. Aufl., Container Corporation of America, Chicago, Illinois (1948).

**) K. S. Kelly and D. B. Judd, »The ISCC-NBS-Method οΓ Designating Colors and a Dictionary of Color-Names«, U.S. Department ofComm. Circular 553 (1955).

Tabelle 111

Kultur und Biochemie des Streptomyces espinosus

Medium	Eigenschaften	Unterseite	Weitere Eigenschaften
	Oberfläche (Luftwachstum)
Agar-Medien		gelb	Melanin-negativ
Pepton-Eisen	grau-weiß in der Mitte; grün
	am Rand	mattgrau	Malat wird nicht solubilisieri
Calciummalat	schwaches bis kräftiges
	Graugrün	hcllcreme
Glucose-Asparagin	grauweiß bis graugelb	bis creme
		tiefgelb bis	gelbes bis gelb-gelbbraunes
Magermilch	hellgrau-grün-gelb bis	gelb-gelb	Pigment
	grau-grün-rosa	braun	Kasein wird solubilisiert
		rotbraun	rotbraunes Pigment
Tyrosin	starkes Graugrün		Tyrosin wird solubilisiert
		blaßgelb bis	Xanthin wird nicht
Xanthin	kräftiges Graugrün bis nur	blaßgelb-	solubilisiert
	an der Peripherie	grün
	kräftiges Graugrün	blaßoliv	Stärke wird hydrolysiert
Nährstärke	kräftiges Graugrün	blaßgelb-	-
Hefeextrakt-Malzextrakt	starkes Graugrün	gelbbraun
		oliv	-
Bennett's	starkes Graugrün	graugrün	-
Czapek's-Saccharose	kräftiges Graugrün	oliv	-
Maltose-Trypton	kräftiges Graugrün mit weiß
	bis starkes Graugrün
Agar-Medien		gelb	Melanin-negativ
Pepton-Hefeextrakt-Eisen	blaßrosa	gelbbraun
(ISP-6)		blaßgelb-	Melanin-negativ
Tyrosin (ISP-7)	graugrün mit weiß bis	grün
	graugrün
Gelatine-Medien		-	farbloses vegetatives
Ungestreckt (piain)	-		Wachstum
			Verflüssigung ¹A-¹/:
		-	weißes Luftwachstum auf
Nährgelatine	-		Oberflächenhäutchen
			Verflüssigung '/>-'/:

Brühe-Medien		-	rosa-eremefarbenes Luft-
Synthetisches Nitrat	-

Nähr-Nitrat

wachstum auf Oberflächenhäutchen

flockiges Wachstum an der Basis

Wachstum im ganzen Medium Nitrat wird nicht zu Nitrit reduziert

Spur von grünem Luftwachstum auf gelbem vegetativem Wachstum des Oberflächenhäutchens flockiges Wachstum an der Basis

Gelbpigment weder Nitrat noch Nitrit vorhanden

Fortsetzung
M otl ι um

Hruii'j-Medien
Lackmus-Milch

hipcnsi lullen

Obcrll.ivho f Lullwachstum)

Unterseite Weitere l-igenschdTlen

cremefarben bis grün bis graugrün auf gelbem bis graugrünem vegetativen Ring

Lackmus reduziert Peptonisierung Vi pH 7,5-7,9

Der neue Mikroorganismus erzeugt Lincomycin, π wenn er in einem wäßrigen Nährmedium unter Mihmnrsen aeroben Bedingungen gezüchtet wird. Für die Herstellung begrenzter Mengen können natürlich Oberflächenkulturen und Flaschen benutzt werden. Man züchtet den Organismus in einem Nährmedium. _>o das eine Kohlenstoffquelle, z. B. ein assimilierbares Kohlenhydrat, und eine Stickstoffquelle wie eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder ein assimilierbares eiweißartiges Material enthält. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind u. a. Glucose, brauner Zucker. r> Saccharose. Glycerin, Stärke, Maisstärke, Lactose. Dextrin. Melasse. Als Stickstoffquelle verwendet man zweckmäßig Maisquellwasser. Hefe, autolysierte Brauere^:hefe mit Milchfeststoffen, Sojamehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, pankreatischen n> Kasein-Verdauungssaft, in Brennereien anfallende Feststoffe, tierische Pepton-Flüssigkeiten, Fleisch- und Knochenschnitzel. Mit Vorteil können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen eingesetzt werden. In der Regel ist es nicht nötig, Spurenmetalle r> wie Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen den Gärmedien zuzusetzen, da als Komponenten der Medien Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile verwendet werden.

Die Lincomycinherstellung nach dem vorliegenden ad Verfahren kann bei jeder Temperatur erfolgen, die zu einem befriedigenden Wachstum des neuen Mikroorganismus führt, so z. B. zwischen etwa 18 und 40, vorzugsweise zwischen etwa 20 und 32°C. Eine optimale Lincomycinerzeugung liegt gewöhnlich in etwa 2 bis 10 .»-> Tagen vor. Während der Gärung bleibt das Medium normalerweise basisch. Der pH-Endwert hängt teilweise von den vorhandenen Pufferstoffen, sofern solche überhaupt zugegen sind, und teilweise von dem anfänglichen pH-Wert des Kulturmediums ab.

Erfolgt die Züchtung in großen Gefäßen und Behältern, so inokuliert man vorzugsweise eher mit der vegetativen als mit der Sporenform des Mikroorganismus, um dadurch eine deutliche Verzögerung bei der Lincomycinerzeugung und den damit verbundenen unökonomischen Geräteeinsatz auszuschalten. Es ist daher ratsam, ein vegetatives Inokulum dadurch in einer Nährlösungskultur herzustellen, daß man letztere mit einem Bruchteil aus einer Boden- oder einer Schrägbodenkultur inokuliert. Nach derartiger Beschaffung eines to jungen aktiven vegetativen Inokulums wird dieses aseptisch auf große Gefäße oder Behälter übertragen. Das Medium, in dem das vegetative Inokulum erzeugt wird, kann dasselbe oder ein anderes sein als das, welches für die Lincomycinerzeugung herangezogen wird, so lange es so beschaffen ist, daß der Mikroorganismus gut gedeiht

Der beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismus kann auch unter Heranziehung der in der US-Patentschrift 30 86 912 geoffenbarten Medien und Bedingungen gezüchtet werden. Des weiteren kann die nach vorlegendem Verfahren erzeugte Lincomycin Verbindung nach den in obiger Palentschrift beschriebenen Methoden aufgearbeitet werden.

Nach einem bevorzugten Aufarbeitungsverfahren erhält man das Lincomycin aus seinem Kulturmedium durch herkömmlich durchgeführte Abtrennung der Mycele und ungelösten Feststoffe, z. B. durch Filtrieren und Zentrifugieren. Dann wird das Lincomycin dadurch vom Filter oder aus der zentrifugierten Brühe gewonnen, daß man mit einem mit Wasser niehl mischbaren organischen Lösungsmittel, in dem Lincomycin löslich ist. z. B. mit I-Butanol, Methylethylketon Benzol oder vorzugsweise Methylenchlorid extrahiert Vorzugsweise wird die Extraktion nach Einstellung der filtrierten Gärbrühe auf einen pH-Wert von etwa 8,5 bis 10,0 mit einer Base wie Natriumhydroxid durchgeführt Der lincomycinhaltige Lösungsmittelextrakt läßt sich zu einem öligen Stoff einengen, der anschließend mit Äther und angesäuertem Methanol unter Gewinnung eine: farblosen, amorphen Lincomycinpräparates extrahieri werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht infolge des NichtVorhandenseins von Lincomycin B eine leichtere Lincomycinaufarbeitung.

Wenn auch das vorliegende Verfahren unter besonderer Berücksichtigung des neuen Mikroorganismus Streptomyces espinosus Dietz, sp. nov., NRRL 3890 ausführlich beschrieben wird, so beschränkt es sich dennoch nicht auf diesen speziellen Mikroorganismus oder auf Mikroorganismen, die durch die hierir geoffenbarten Kultureigenschaften genau definierl wurden. In die vorliegende Erfindung sind auch andere Stämme oder Mutanten dieses Mikroorganismu« einzubeziehen, die durch bekannte Techniken, ζ. Β durch Einwirkung von Röntgenstrahlen oder Ultravio lettbestrahlung auf den neuen Mikroorganismus, durch Einwirkung von Stickstofflost, von Phagen gebildei werden können.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläute rung der Erfindung. Sofern nicht anders vermerkt beziehen sich alle Prozentsätze auf das Gewicht unc sämtliche für Lösungsmittelgemische angegebener Mengen auf das Volumen.

Beispiel
A) Fermentation

Mit einer Schrägbodenkultur von Streptomyce espinosus Dietz, sp. nov, NRRL 3890 wurde eine Reih«

von 500 ml Erlenmeyer-Kolben inokuliert, die jeweils 100 ml Keimungsmedium folgender Zusammensetzung enthielten:

Glucosemonohydrat 25 g/l

Baumwollsaatmehl, techn. rein'· 25 g/l

Rest Leitungswasser zur Auffüllung

*) Handelsprodukt »Pharmamedia« der Firma Traders Oil Mill Comp.. Fort Worth,Texas.

Die Kolben wurden auf einer Rotationsschüttelmaschine drei Tage bei 28°C kultiviert.

Mit 5% des obigen Keimungsinokulums wurde ein 500-ml-Erlenmeyer-Gärkolben inokuliert, der 100 ml steriles Medium folgender Zusammensetzung enthielt:

Feinvermahlenes, aus Sojamehl	35 g/l
extrahiertes Fett *)	10 g/l
Magermilch	10 g/l
Czapek Dox Broth**)	3 g/l
CaCO₁
Antischaummittel, bestehend aus
Polyalkylenglykolen und deren	2 ml/100 I
Derivaten***)
Rest Leitungswasser zur Auffüllung

*) Handelsprodukt »kay-soy«.

*) Handelsprodukt der Difco Laboratories, Detroit, Michigan, folgender Zusammensetzung:

NaNOi

K2HPO-1

MgSOi · 7 H2O

KCl

FeSO4 · 7 H2O

Sucrose

pH

2 g/l I g/l 0,5 g/l 0,5 g/l Spuren 30.0 g/l 6.6.

***) Ucon LB-625. Handelsprodukt der Union Carbide Corp.. Chemicals Division, Detroit, Michigan.

Eine Reihe vorstehend beschriebener 500-ml-Kolben wurde zur Beschaffung von weiterem Fermentationsmaterial benutzt. Vor der Inokulierung wurden diese Kolben 30 Minuten bei 130°C sterilisiert. Die inokulierten Gärkolben wurden auf einer Rotationsschüttelmaschine (250 U/min, 6 cm Hub) vier Tage bei 28° C inkubiert.

Nach Ermittlung durch mikrobiologische Standardscheiben-Plattenanalyse wies ein typischer Gärkolben folgendes antibakterielles Spektrum auf:

Organismus	Zone (mm)	96 Stunden
	72 Stunden	30
B.sublilis	26	32
S. aureus	34	44
S. lutea	43	20
K. pneumoniae	21	0
E.coli	0	0
S. schottmuelleri	0	0
P. vulgaris	0	36
M. avium	34
	B) Extraktion

π Die ganze, nach obiger Beschreibung hergestellte Gärbrühe (etwa 9 Liter) wurde unter Verwendung von Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert. Der Filterkuchen wurde mit 1 Liter Wasser gewaschen, das Waschwasser mit der klaren Brühe ve^rrinigt und dieses

.'Ii klare Gemisch (7,2 1) auf pH 8,8 eingestellt und dreimal mit Methylenchlorid extrahiert, wobei jedesmal ein Drittel des Volumens der klaren Brühe verwendet wurde. Die Methylenchlorid-Extrakte wurden vereinigt und dann unter Gewinnung eines öligen Stoffes zur

2) Trockne eingeengt. Man löste diesen Stoff in 500 ml Äther und vermischte die Lösung mit 5 ml In methanolischem Chlorwasserstoff, aus dem Lincomycin als farbloses amorphes Material in einer Ausbeute von 450 mg ausfiel. Dieses Präparat wurde durch Dünn-Schichtchromatographie unter Verwendung von Silicagel G als Trägerstoff und mittels Methyläthylketon-Aceton-Wasser (186:52:20 V/V) als Lösungsmittel untersucht. Des weiteren wurde das Präparat durch Infrarot- und NMR-Spektroskopie untersucht. All diese Untersuchungen wiesen das Präparat als Lincomycin aus und ergaben, daß darin kein nachweisbares Lincomycin B enthalten war.

Die Menge an Lincomycin B bei normaler Fermentation von Streptomyces lincolmensis var. lircolnensis ändert sich je nach der Zusammensetzung der Medien, der Inkubationszeit, der Temperatur, Belüftung. Unter normalen Arbeitsbedingungen betragen die Mengen an Lincomycin B bei einer derartigen Gärung 5 bis 10% des gesamten vorhandenen Lincomycins. Das Lincomy-4) ein B wird durch wiederholte Umkristallisierung des Lincomycinproduktes in geeigneten Lösungsmitteln wie Wasser/Aceton-Gemischen oder Gemischen aus Wasser und niederem Alkohol entfernt. Da nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kein Lincomycin B entin steht, erübrigen sich derartige Umkristallisierungen.

Claims

2t 64

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Lincomycin, dadurch gekennzeichnet, daß man Strep- s tomyces espinosus Dietz NRRL 3890 oder daraus durch bekannte Techniken erhältliche Mutanten in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen zwischen etwa 18 und 40⁰C kultiviert und das Lincomycin aus der Gärbrühe isoliert