DE2321174A1 - Nonapeptidamidderivate und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
Nonapeptidamidderivate und verfahren zu ihrer herstellungInfo
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Description
PATENTANWÄLTE
DR.-iNG. VON KREISLER DR.-ING. S CHCKVVA^D
DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL.-CHEM. ALEK VON KREISLER
DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH DIPL.-ING. SELTING
5KOLNI7DEICHMANNHAUs
Köln, den 25. April I973
Kl/Ax
27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan).
Die Erfindung "betrifft neue Nonapeptidamidderivate mit
starker ovulationsfordernder Wirkung, Die neuen Nonapeptidamidderivate
haben die allgemeine Formel
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A1-Gly-A2-Arg-Pro-Y (I)
in der A1 für Tyr oder Phe, A2 für Leu, lie, NLe, VaI,
NVaI, Met oder Phe, Y für NHR, worin R ein gegebenenfalls
mit einer Hydroxylgruppe substituierter geradkettiger oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 3 C-Atomen
ist, oder für eine Pyrrolidinogruppe steht.
Die Erfindung umfaßt ferner die pharmazeutisch unbedenklichen Salze der Nonapeptidamidderivate sowie ein
Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen.
In dieser Beschreibung stehen (Pyr)G-lu, His, Trp, Ser,
Tyr, Phe, GIy, Leu, ILe, NLe, VaI, NVaI, Met, Arg und
Pro für "Reste" von L-Pyroglutaminsäure, L-Histidin,
L-Iryptophan, L-Serin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, Glycin,
L-Leucin, L-Isoleucin, L-Norleucin, L-Valin, L-Norvalin,
L-Methionin, L-Arginin bzw. L-Prolin. Unter dem "Rest"
ist ein Radikal z-u verstehen, das von der entsprechenden α-Aminosäure durch Eliminierung des OH-Teils der Carboxylgruppe
und des Η-Teils der a-Aminogruppe abgeleitet
3 Q98 Λ 5/1153
— ρ — "
ist. Beispielsweise stellt im Falle von L-Arginin
■ ■ HHV " ■■■ ■ ■
^O-NHOH2Oh2CH2CHOOQH
^ NH
das durch die Formel NH2-A-COOH dargestellt werden kann
(worin NH2 der a-Aminorest ist), das Radikal (-NH-A-CO-)
einen "Rest" von L-Arginin dar und wird als "-Arg-" abgekürzt. Die Abkürzungen für die anderen vorstehend genannten
α-Aminosäuren haben die entsprechende Bedeutung,
wie sie vorstehend für L-Arginin dargelegt wurde»
Der vorstehend genannte Substituent R, d.h. der geradkettige oder- verzweigte Alkylrest, der 1 bis 3 C-Atome
enthält und mit einer Hydroxylgruppe substituiert sein kann, kann beispielsweise ein Methylrest, Äthylrest,
n-Propylrest, Isopropylrest, Hydroxymethylrest, 1-Hydroxyä/fchylrest,
2-Hydroxyäthylrest, 2-Hydroxy-n-propylrest, 5—Hydroxy-n-propylrest oder 2,2-Dihydroxyisopropylrest
sein.
Es ist seit vielen Jahren bekannt, daß der Hypothalamus Faktoren enthält, die bei höherer Konzentration die
Sekretion der tropen Hormone aus der Hypophyse steuern« Kürzlich wurde anschließend an die Isolierung eines
Ehyrotropin freigebenden Hormons (TRH = Ihyrotropinreleasing
hormone) ein Hormon, das die Sekretion des luteinisierenden Hormons fördert, in reiner Form aus
Schweinen und Schafen extrahiert und als Decapeptid der
Struktur H-iPyriGlu-His-Irp-Ser-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NHg
identifiziert (A0V.Schally und Mitarbeiter,! Biochem.
Biophys.Res. Commun. ,43., 1334 (1971), R.Gniilemin und
Mitarbeiter, Proc.NatoAcad.Sci., USA., 69, 278(1972)).
Dieser Feststellung folgte die Synthese einer Anzahl ähnlicher Peptide. Außerdem wurden biologische Tests mit
diesen analogen Peptiden durchgeführt. Jedoch verringert selbst eine geringfügige Modifikation der vorstehend
30 98 4 57 1 1 53
genannten Aminosäurezusammensetzung stark die physiologische
Aktivität des Peptids, und die vorstehende chemische Struktur wird als wesentlich für die Genese maximaler
physiologischer Aktivität angesehen (A.V.Schally und Mitarbeiter, Biochem.Biophys.Res.Gommun., 4, 366(1972)).
Der Anmelderin gelang die Synthetisierung der Nonapeptidamidderivate
(i) sowie ihrer pharmazeutisch unbedenklichen Salze. Überraschenderweise wurde gefunden, daß diese Verbindungen
eine stärkere ovulationsauslösende Wirkung haben als das natürlich vorkommende Decapeptid. Ferner
■wurde gefunden, daß diese Verbindungen auf die Hypophyse einwirken und die Sekretion sowohl des luteinisier§nden
Hormons als auch des follikelstimulierenden Hormons fördern.
Ferner wurde von der Anmelderin gefunden, daß diese Verbindungen nicht nur wertvoll als Medikamente für den
Menschen, z.B. als Medikamente für die Diagnose der Hypophysenfunktion oder des Gonadotropinmangels und für
die Therapie der Amenorrhoe, sondern auch als Veterinärmedikamente insbesondere für die Zwecke der Viehzucht
sind. Der Erfindung liegen die vorstehenden überraschenden
Peststellungen zu Grunde.
Hauptgegenstand der Erfindung sind demgemäß die neuen Nonapeptidamidderivate und ihre pharmazeutisch unbedenklichen
Salze mit starker ovulationsinduzierender Wirkung sowie ein Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen.
Die Nonapeptidamidderivate der allgemeinen Formel (i)
und ihre pharmazeutisch unbedenklichen Salze werden nach einem Verfahren hergestellt, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man ein Reagens (A), nämlich !-Pyroglutaminsäure oder ein Peptidfragment, das eine L-Pyroglutaminsäureeinheit
(d.h. H-(Pyr)Glu-) an seinem N-endständigen Teil und gleich anschließend daran die vorstehend genannte
Aminosäuresequenz enthält, mit einem Reagens (B), nämlich
dem
einer Aminkomponente, die/restlichen Teil des vorstehend
einer Aminkomponente, die/restlichen Teil des vorstehend
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genannten, als Produkt gewünschten Nonapeptidamidderivats
(I) entspricht, kondensiert, wobei die beiden Reagentien (A) und (B) wahlweise durch eine oder mehrere Schutzgruppen
geschützt sind, und dann die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen entfernt»
Das Reagens (A) ist somit !-Pyroglutaminsäure oder ein
Peptidfragment, das eine 1-Pyroglutaminsäureeinheit an
seinem N-endständigen Teil und gleichzeitig anschließend daran die Aminosäuresequenz der allgemeinen Formel (l)
enthält, und das mit dem Reagens (A) zu kondensierende Reagens (B) ist eine Aminkomponente, die dem restlichen
Teil des vorstehend genannten, als Produkt gewünschten Nonapeptidamidderivats (i) entspricht. Die Reagentien (A)
und (B) sind wahlweise geschützt.
Das Reagens (A) hat somit die folgende Beziehung zum Reagens (B)s
| Methode Nr. |
Reagens (A) | Reagens (B) |
| 1 | H-(Pyr)GIu-OH | H-His-Trp-Ser-A-j^-Gly- A2-Arg-Pro-Y |
| 2 | H-(Pyr)Glu-His-0H | H-Trp-S Gr-A1-GIy-A2- Arg-Pro-Y · |
| 3 | H-(Pyr)Glu-His-Trp-OH | H-SeP-A1-GIy-A2-ATg- Pro-Y |
| 4 | H-(Pyr)Glu-His-Trp- Ser-OH |
H-A^Gly-A^Arg-Pro-Y |
| 5 | H-(Pyr)Glu-His-Trp- Ser-Aj-OH |
H-Gly-A2-Arg-Pro-Y |
| 6 | H-(Pyr)Glu-His-Trp- SOr-A1-GIy-OH |
H-A2-Arg-Pro-Y |
309845/1 153
Methode Nr.
Reagens (A)
Reagens (B)
| 7 | H-(Pyr)Glu-His-Trp- | H-Arg-Pro-Y |
| Ser-A1-Gly-A2-0H | ||
| 8 | H-(Pyr)Glu-His-Trp- | H-Pro-Y |
| SeIvA1-GIy-A2-ATg-OH | ||
| 9 | H-(Pyr)Glu-His-Trp- | H-Y |
| S er-A^Gly-A2-Arg-Pr o- | ||
| OH |
Wenn eine Verbindung aus der linken Spalte als Reagens (A) verwendet wird, wird die Verbindung in der rechten
Spalte in der gleichen Zeile als Reagens (B), d.h. als entsprechende Gegenverbindung des Reagens (A) "bei der
Kondensationsreaktion verwendet. Die Reagentien (A) und/ oder (B) können vor der Kondensationsreaktion geschützt
oder während der Kondensationsreaktion, genauer gesagt, vor der Bildungsreaktion der Peptidbindung, aktiviert
werden. Hierauf wird nachstehend ausführlicher eingegangen. Wie dem Fachmann auf dem Gebiet der Peptidsynthese
bekannt ist, können alle Arten von Peptiden durch Kondensation einer Aminosäure oder eines Peptidfragments
(d.h. eines Peptids mit weniger Einheiten) mit einer Aminosäure oder einem Peptidfragment (d.h. Peptid mit
weniger Einheiten) hergestellt werden. Eine Anzahl ausgereifter Verfahren zur Durchführung der Kondensationsreaktion
ist bereits entwickelt worden.
Beispielsweise kann man die funktionelle Gruppe oder die funktioneilen Gruppen (z.B. die Aminogruppe, Carboxylgruppe,
Hydroxylgruppe, Guanidingruppe), die an der Bildungsreaktion der Peptidbindung (d.h. -CONH-) über
die Kondensationsreaktion nicht beteiligt sind, vor der Kondensationsreaktion durch die Schutzgruppe oder Schutzgruppen
schützen. Beim Verfahren gemäß der Erfindung kann
309845/1 153
■-. 6 - ' ■ ■■ ; :
man die nicht an der Kondensationsreaktion teilnehmenden
funktioneilen Gruppen von Reagens (A) oder (B) ebenfalls nach an sich bekannten Methoden schützen0
Bekanntlich wird vor der Bildungsreaktion der Peptidbindung
die C-endständige Carboxylgruppe oder die N-end—
ständige Aminogruppe einer Aminosäure oder eines Peptidfragments, die an der Bildungsreaktion der Peptidbindung
beteiligt ist, aktiviert, damit sie die Bildung der Peptidbindung zustande bringt, und, wenn die Aktivierung
nicht erfolgt, die Bildungsreaktion der Peptidbin-
wird
dung/in Gegenwart eines Dehydratisierüngsmittels durchgeftöirt. Verfahren zur Aktivierung der C-endständigen Carboxylgruppe sowier der ^-endständigen Aminogruppe sind allgemein bekannt. Das Verfahren gemäß der Erfindung kann in an sich bekannter Weise durchgeführt werden. Die Kondensation gemäß der- Erfindung kann somit vorgenpmmen werden, indem man in einer ersten Stufe die C-endständige Carboxylgruppe des Reagens (A) oder die N-endständige Aminogruppe des Reagens (B) aktiviert und in der zweiten Stufe die Bildungsreaktion der Peptidbindung zwischen dem aktivierten Reagens (A) und dem Reagens (B) oder zwischen dem Reagens (a) und dem aktivierten Reagens (B) durchführt oder als Alternative die Bildungsreaktion der Peptidbindung zwischen dem Reagens (A) und dem Reagens (B) in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels durchführt, wobei die Reagentien (A) und (B) wahlweise geschützt sind.
dung/in Gegenwart eines Dehydratisierüngsmittels durchgeftöirt. Verfahren zur Aktivierung der C-endständigen Carboxylgruppe sowier der ^-endständigen Aminogruppe sind allgemein bekannt. Das Verfahren gemäß der Erfindung kann in an sich bekannter Weise durchgeführt werden. Die Kondensation gemäß der- Erfindung kann somit vorgenpmmen werden, indem man in einer ersten Stufe die C-endständige Carboxylgruppe des Reagens (A) oder die N-endständige Aminogruppe des Reagens (B) aktiviert und in der zweiten Stufe die Bildungsreaktion der Peptidbindung zwischen dem aktivierten Reagens (A) und dem Reagens (B) oder zwischen dem Reagens (a) und dem aktivierten Reagens (B) durchführt oder als Alternative die Bildungsreaktion der Peptidbindung zwischen dem Reagens (A) und dem Reagens (B) in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels durchführt, wobei die Reagentien (A) und (B) wahlweise geschützt sind.
Es ist ferner bekannt, daß in Fällen, in denen die vorstehend genannten funktioneilen Gruppen durch eine oder
mehrere Schutzgruppen vor der Kondensationsreaktion geschützt werden, die schützende Gruppe oder schützenden
Gruppen nach der Kondensationsreaktion entfernt werden. Beim Verfahren gemäß der Erfindung kann die Entfernung
der Schutzgruppen ebenfalls in bekannter Weise vorgenommen werden.
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Es ist in diesem Zusammenhang ebenfalls bekannt, daß eine geschützte L-Glutamylgruppe d^r allgemeinen Formel
RCo-CH2CH2CH(WH2)CO- (II)
in der R ein Alkoxyrest (z.B. ein Methoxyrest, Äthoxyrest,
n-Propoxyrest, Isopropoxyrest oder n-Butoxyrest), ein
Aralkyloxyrest (z.B. ein Benzyloxyrest) oder eine Aminogruppe ist, sich durch Umsetzung mit einer Base (z.B.
Ammoniak) oder einer Säure (z.B. Essigsäure) leicht.in die L-Pyroglutamylgruppe selbst
umwandeln läßt, und daß die Gruppe .(II) hierbei der L-Pyroglutamylgruppe selbst äquivalent ist. Beim Verfahren
gemäß der Erfindung ist vorauszusetzen, daß das L-Pyroglutamyl
(d.h. H-(Pyr)Glu-) des Reagens (A) nicht nur die L-Pyroglutamylgruppe selbst, sondern auch die geschützte
L-Glutamylgruppe der Formel (II) einschließt. Wenn H-(Pyr)Glu- des Reagens (A) die Gruppe (II) ist, läßt
sich diese in an sich bekannter Weise leicht in die L-Pyroglutamylgruppe selbst umwandeln. :
Nachstehend werden einige Verfahren aufgeführt, die vorteilhaft zur Durchführung der Bildungsreaktion der Peptidbindung
gemäß der Erfindung angewandt werden können»
I) Das geschützte oder ungeschützte Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe eine freie Carboxylgruppe
ist, wird mit dem geschützten oder ungeschützten Reagens (B), dessen N-endständige Aminogruppe
eine freie Aminogruppe ist, in Gegenwart eines Kondensationsmittels umgesetzte ;
II) Das geschützte oder ungeschützte Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe aktiviert worden
ist, wird mit dem Reagens (B) Umgesetzt, dessen
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N-endständige Amlnogruppe eine freie Aminogruppe ist.
Ill) Das geschützte oder ungeschützte Reagens A, dessen
C-endständige Carboxylgruppe frei ist, wird mit dem geschützten oder ungeschützten Reagens (B)
umgesetzt, dessen N-endständige Aminogruppe aktiviert worden ist.
Als Schutzgruppe für die innermolekulare Acylaminogruppe
der !-Pyroglutaminsäure kommen somit beispielsweise die
Benzyloxycarbonylgruppe, tert.-Butoxycarbonylgruppe und
Isobornyloxycarbonylgruppe, als Schutzgruppe für die Iminogruppe von L-Histidin beispielsweise die Benzylgruppe,
Tosylgruppe, 2,4-Dinitrophenylgruppe, tert<Butoxycarbonylgruppe
und Carbobenzoxygruppe, als Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe von 1-Serin beispielsweise
ätherbildende Gruppen, z.B. die Benzylgruppe und tert,-Butylgruppe,
als Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe von Tyrosin beispielsweise ätherbildende Gruppen, z.B.
die Benzylgruppe und tert.-Butylgruppe, und als Schutzgruppe
für die Guanidinogruppe von L-Arginin beispielsweise die Nitrogruppe, Tosylgruppe, Carbobenzoxygruppe,
Isobornyloxycarbonylgruppe und Adamantyloxycarbonylgruppe in Frage. Ferner kann die Guanidinogruppe von L-Arginin
durch Salzbildung mit einem Proton, das von einer Säure (z.B. Salzsäure und Bromwasserstoffsäure) abgeleitet ist,
geschützt werden. Natürlich ist das Proton im Rahmen dieser Beschreibung als zu den Schutzgruppen gehörend
anzusehen.
Als Beispiele der aktivierten Form der C-endständigen
Carboxylgruppe des Reagens (A) sind die entsprechenden Säureanhydride, z.B. die gemischten Anhydride mit einem
Kohlensäuremonoalkylester, Azide und aktiven Ester (z.B. die entsprechenden Ester mit Alkoholen wie Pentachlorphenol,
2,4,5-Trichlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanmethylalkohol,
p-Kitrophenol, N-Hydroxysuecinimid,
N-Hydroxy-S-norbornen^^-dicarboximid, N-Hydroxyphthal-
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imid und N-Hydroxybenztriazol) zu nennen. Von diesen
Estern wird der N-Hydroxy-S-norbornen^jS-dicarboximidester
bevorzugt. Die N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester
von Aminosäuren oder Peptiden sind zwar neu, können jedoch in der gleichen Weise wie die N-Hydroxysuccinimidester
von Aminosäuren oder Peptiden hergestellt werden.
Das entsprechende Amid der phosphorigen Säure ist ein Beispiel einer aktivierten Form der N-endständigen Aminogruppe
des geschützten oder ungeschützten Reagens (B).
Als Dehydratisierungsmittel können alle Verbindungen der Art, die für die Peptidsynthese geeignet sind, verwendet
werden. Besonders bevorzugt werden beispielsweise die sog. Carbodiimidreagentien, z.B. Dicyclohexylcarbodiimid.
Zur Durchführung der Kondensationsreaktion gemäß der Erfindung können natürlich in einen einzelnen Reaktor
1) das geschützte oder ungeschützte Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe frei ist, 2) das geschützte
oder ungeschützte Reagens (B), dessen N-endständige Aminogruppe frei ist, 3) der vorstehend genannte Alkohol
(z.B. N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximiä oder
N-Hydroxysuccinimid) und 4) das Dehydratisierungsmittel
gegeben werden. In diesem Fall reagiert zuers.t das geschützte oder ungeschützte Reagens (A), dessen C-endständige
Carboxylgruppe frei ist, mit dem Alkohol mit Hilfe des Dehydratisierungsmittels unter Bildung des geschützten
oder ungeschützten Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe aktiviert ist, worauf das letztere
mit dem geschützten oder ungeschützten Reagens (B), dessen N-endständige Aminogruppe frei ist, reagiert. Bei diesem
Prozess werden die Aktivierung der C-endständigen Carboxylgruppe und die Bildungsreaktion der Peptidbindung in
einem Einstufenverfahren durchgeführt.
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Für die Herstellung der vorstehend beschriebenen, als Produkte gewünschten Peptide stehen somit die verschiedensten
Kombinationen von Verfahren zur Auswahl. Eine "bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung
ist nachstehend schematisch dargestellt:
(I) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A-^Gly-OH . (Reagens (A)) :
+ DCC +HOEBI
Aktivierung "L· -
H-(Pyr)&lu-His-Trp-Ser-A1-Gly-OHBI + H-A^Arg-Pro-Y
(Aktiit R ())
1 (Aktiviertes Reagens (A))
.(Geschütztes ; Reagens (B))
Bildung der • Peptidbindung
H-(Pyr
Entfernung der Schutzgruppen
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A-L-Gly-A2-Arg-Pro-Y
(II) H-(Pyr)Glu»His-Trp-Ser-A -GIy-OH + H-A?-Arg-Pro-Y
(Reagens (A)) (Geschütztes Reagens
+ DCC + HOEBI
X) Aktivierung
D Bildung der Peptidbindung
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A1-GIy-A2-Arg-Pro-Y
Entfernung der Schutzgruppen H-(Pyr) Glur-His-Trp-Ser-A1-Gly-A2-Arg-Pro-Y
309845/1 153
Im vorstehenden Schema bedeuten DCC das N,N*-Dicyclohexylcarbodiimid,
HOSBI das N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid und Z eine Schutzgruppe der Guanidinogruppe
des L-Argininrestes.
Die Bildungsreaktion der Peptidbindung, z.B. nach den
vorstehend genannten Verfahren (I), (II) oder (III), wird im allgemeinen in einem Lösungsmittel durchgeführt. Als
Lösungsmittel eignen sich beispielsweise trockenes .oder wässriges Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd, Pyridin,
Chloroform, Dioxan, Dichlormethan, Tetrahydrofuran und Gemische dieser Lösungsmittel.
Die Reaktionstemperatur liegt gewöhnlich im Bereich von etwa -20° bis 300C, jedoch kann die Reaktion auch bei
niedrigeren Temperaturen oder unter Erhitzen durchgeführt werden.
Die beiden Ausgangsmaterialien, die eine Peptidbindung bilden sollen, werden gewöhnlich in äquimolaren Mengen
verwendet, jedoch sind gegebenenfalls auch andere Mengenverhältnisse geeignet. Im allgemeinen werden für jedes
molare Äquivalent eines Ausgangsmaterials gewöhnlich etwa 1 bis 2 molare Äquivalente, vorzugsweise etwa 1 bis
1,4 molare Äquivalente der zugehörigen Verbindung (d.h. der Gegenverbindung) verwendet. Der Anteil des Dehydratisierungsmittels
beträgt im allgemeinen etwa 1 bis 2 molare Äquivalente, bezogen auf das Wasser, das bei der
Bildungsreaktion der Peptidbindung gebildet wird.
Gute Ergebnisse werden in vielen Fällen erhalten, wenn die Reaktion etwa 6 bis 10 Stunden durchgeführt wird.
Nach Beendigung der Bildungsreaktion der Peptidbindung kann das Reaktionsprodukt beispielsweise durch Ausfällung
mit einem Lösungsmittel (in dem die gewünschte Verbindung schwer löslich ist) und anschließendes Abfiltrieren
der gebildeten Fällung isoliert werden.
3098Α5/Ί 1&3
• ; - 1-2 V
2 32117A
Wenn das Reagens (A) und/oder das Reagens (B) durch die Schutzgruppe oder Schutzgruppen geschützt sind, enthält
das Kondensationsprodukt im allgemeinen die Schutzgruppe oder Schutzgruppen in seinem Molekül. Wie bereits erwähnt,
werden jedoch die Schutzgruppe oder Schutzgruppen nach üblichen Methoden entfernt, die die Aminosäuresequenz
des gewünschten Nonapeptidamidderivats nicht beeinträchtigen. Nach der Entfernung der Schutzgruppen bleibt das
von Schutzgruppen freie Nonapeptidamidderivat (I) zurück.
Als Beispiele solcher üblichen Verfahren sind die katalytische Reduktion mit einem Katalysator wie Palladiumschwarz, Palladiumkohle oder Platin, die Säurehydrolyse
beispielsweise mit.Fluorwasserstoff oder Irifluoressigsäure
und die chemische Reduktion beispielsweise mit Natriummetall in flüssigem Ammoniak zu nennen. Bei jedem
dieser Verfahren kann die gewünschte Verbindung nach üblichen Methoden, z.B. durch die oben beschriebene Ausfällung,
isoliert werden.
Das in dieser Weise isolierte Endprodukt kann nach üblichen
Methoden, z.B. durch Säulenchromatographie beispielsweise an Carboxymethylcellulose und handelsüblichen
Polymerisaten für die Reinigung, z.B. an den Ionenaustauscherharzen "Sephadex" oder "Amberlite XAD-2", gereinigt
werden.
In Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen wird die gewünschte Verbindung in Form einer Base oder als Salz
einschließlich der pharmazeutisch unbedenklichen Salze erhalten. Aus dem Salz kann die Base nach üblichen Verfahren
hergestellt werden, und die Base kann durch Umsetzung mit Säuren,die für die Herstellung pharmazeutisch
unbedenklicher Salze geeignet sind, in Salze umgewandelt werden. Als Säuren eignen sich für diesen Zweck
verschiedene anorganische. Säuren, z.B. Halogenwasserstoff
säur en wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure,
Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure
3 0 9 8 Λ 5 / 1153
und Phosphorsäure, und verschiedene organische Säuren, z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure,
Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Anthranylsäure,
Zimtsäure, Naphthalinsulfonsäure und Sulfanylsäure.
Die in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Endprodukte können nach üblichen Methoden in Metallkomplexsalzverbindungen
umgewandelt werden. Beispielsweise kann eine wässrige lösung des in der oben beschriebenen
Weise hergestellten Nonapeptidamidderivats mit einem oder
mehreren Salzen, Hydroxyden oder Oxyden von Zink, Nickel, Kobalt, Kupfer und Eisen umgesetzt und das Reaktionsgemisch
dann auf einen pH-Wert von etwa 6 bis 8 eingestellt werden, wobei eine wenig lösliche Adsorptionskomplexsalzverbindung
zwischen der als Träger dienenden Metallverbindung und dem jeweiligen Nonapeptidamidderivat erhalten
wird.
Es hat sich gezeigt, daß von den in dieser Weise herstellbaren verschiedenen Metallkomplexsalzverbindungen die
Zinkkomplexsalzverbindungen vom Standpunkt ihrer lang anhaltenden Aktivität nach der Verabreichung am vorteilhaftesten
sind.
Auf Grund ihrer äußerst geringen Toxizität können die
in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellten Nonapeptidamidderivate
oder ihre pharmazeutisch unbedenklichen Salze unbedenklich verabreicht werden. Diese Verbindungen
zeigen eine starke ovulationsinduzierende Wirkung.
Wenn Ratten eine winzige Menge (ζ»Β. 50 bis 500 ng/100 g)
des Konapeptidamidderivats (I) oder dessen pharmazeutisch
unbedenklichen Salzes intravenös, intramuskulär oder subkutan erhalten, ist ein steiler Anstieg der
Konzentration des luteinisierenden Hormons und des follikelstimulierenden Hormons im-Blut festzustellen.
3 0 9 8 4 5/1153
-■. ■ - .1.4 ~
Wenn Ratten eine Infusion von 10 "bis 200 ng/100 g der
Verbindung intravenös oder intramuskulär erhalten, wird
die Ovulation "bei etwa 50$ der Ratten ausgelöst. Wenn die
Ratten eine Infusion von 0,1 bis 5 yug/1 00 g der Verbindung
intravenös oder intramuskulär erhalten, wird die Ovulation bei 100$ der als Versuchstiere verwendeten
Ratten ausgelöst, auch wenn die Ratten sich im Diöstrus befinden. ,Bei--unveränderter Dosis ist die intravenöse
Infusion Im allgemeinen doppelt so wirksam wie die subkutane Infusion.
Die vorstehenden Werte zeigen, daß die Peptide gemäß der
Erfindung stärkere Hormonwirkungen haben als das natürlieh
vorkommende, die Sekretion des luteinisierenden Hormons auslösende Hormon.
Injektionslösungen können durch Auflösen der Verbindungen gemäß der Erfindung in physiologischer Kochsalzlösung
hergestellt werden.
Da diese Verbindungen auch bei Verwendung in sehr winzigen Mengen eine genügende physiologische Wirkung aufweisen,
ist es zweckmäßig, sie als gefriergetrocknete Ampullenpräparate, die Mannit als Hilfsstoff enthalten,
zu verwenden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter
erläutert. In diesen Beispielen werden die folgenden Abkürzungen mit den nachstehend genannten Bedeutungen
verwendet:
Z-: Benzyloxycarbonyl; IBOC-: Isobornyloxycarbonyl; BOC-: tert.-Butyloxycarbonyl; -OEt:Äthylester;
-OSU: N-Hydroxysuccinimidester; -OtBu: tert.-Butylester;
-ONDP: 2,4-Dinitrophenolester; -ONBI: N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarbonsäureimidester;
HONBI: N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarbonsäureimid;
DCC: NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid; DI1IF:N, N-Dimethylformamid;
DSC: Dünnschichtchromatographie; DCHA: Dicyclohexyl-
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ami n.
Für die Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Entwicklerlösungsmittelsysteme verwendet:
Rf 1 = Chloroform-Methanol-Essigsäure (9:1:0,5)
Rf 2 = Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser (60:20:6:11)
Rf 3 = n-Butanol-Äthylacetat-Essigsäure-Wasser (1:1:1:1)
Rf 4 = n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:1)
Rf 5 = n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (30:20:6:24).
In den Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter. Die Prozentsätze
sind auf das Gewicht "bezogen, falls nicht anders angegeben.
Die folgenden Ionenaustauscherharze werden verwendet:
"Amberlite CG-400" (Copolymerisat von tertiärem Amin,
Styrol und Diviny!benzol, Hersteller Rohm & Haas Co.,USA);
"Sephadex LH 20" (verestertes Dextrangel, Hersteller Pharmacia line Chemicals, Sweden); "Amberlite XAD-2"
(makroretikuläres Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat) und
"Amberlite IRA-400" (Copolymerisat von tertiärem Amin, Styrol und Divinylbenzol, Hersteller Rohm & Haas Co., USA),
Herstellung von H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-PrO-NHC2H5
a) Herstellung von Z-Arg(NO2)-PrO-NHC2H5
In 10 Raumteilen DMF werden 0,901 GeWo-Teile Z-Arg(N02)-Pro-0H
und 0,181 Gew„-Teile Äthylaminhydrochlorid gelöst.
Während bei 00C gehalten wird, werden 0,38 Raumteile Triäthylamin zugetropfto Nach Zusatz von 0,43 Gew.-Teilen
HONBI und 0,495 Gew.-Teilen DCC wird das Gemisch 5 Stunden bei O0G und dann 10 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert und das DMF abdestilliert. Der Rückstand wird
mit Chloroform extrahiert, mit Wasser gewaschen und über
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| C | 6, | H | 20 | N | |
| 52 | ,82 | 6, | 54 | 19 | ,53 |
| 52 | ,95 | 77 | ,65 | ||
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Chloroform
wird abdestilliert und der Rückstand mit Äther behandelt und aus Methanol-Äther erneut ausgefällt. Ausbeute
0,692 Gew.-Teile; Rf 1 = 0,50; Schmelzpunkt 141°-145°C (Zers.); ß.'J^= 44,6° (c=1, Methanol).
Berechnet für C21H31°6N7!
Gefunden:
Gefunden:
b) Herstellung von Z-Leu-Arg(NO2)-PrO-5
In 5 Raumteilen 25$ HBr-Essigsäure werden 0,572 Gew.-Teile
Z-Arg(-NO2)-PrO-NHC2H5 gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten
bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wird trockener Äther zum Reaktionsgemisch gegeben und die gebildete
Fällung abfiltriert und getrocknet. Getrennt hiervon werden 0,291 Gew.-Teile Z-Leu-OH in 5 Raumteilen Dioxan
gelöst. Unter Kühlen werden 0,247 Gew.-Teile DCC und
0,215 Gew.-Teile HONBI zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden gerührt und der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff
abfiltriert. Zum Filtrat wird die in der oben beschriebenen Weise erhaltene Fällung gegeben, die durch Zusatz
von 3 Raumteilen DMF gelöst wird. Während gekühlt wird, werden 0,17 Raumteile Triäthylamin zugetropft, worauf
das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt wird,,
Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand mit Chloroform extrahiert und mit Wasser gewaschen. Die
Chloroforrnschicht wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Chloroform abdestilliert. Der Rückstand
wird mit Äther behandelt und aus Methanol-Äther erneut ausgefällt. Ausbeute 0,47 Gew.-Teile (72$);
Schmelzpunkt 144° bis 1460C (Zers.); Rf 1 = 0,40; /ä_7^4 - -58,0° (c=1, Methanol),,
c) In 25$ HBr-Essigsäure werden 0,165 Gewo-Teile"
Z-Leu-Arg(NO2)-PrO-NHC2H5 gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten
bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wird
3098k5/1153
trockener Äther dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die gebildete Fällung abfiltriert und gut getrocknet. Diese
Fällung wird in 3 Raumteilen DMF gelöst. Während gekühlt und gerührt wird, werden 0,05 Raumteile N-Äthylmorpholin
zugetropft. In dieser Lösung werden 0,19 Raumteile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr_Gly-OH-hydrochlorid gelöst„
Zur Lösung werden 0,054 Gew.-Teile HOUBI und 0,062 Gew„-DCC
gegeben.
Das Gemisch wird 2 Stunden bei 0° und dann über lacht bei Raumtemperatur gerührte Der als Nebenprodukt gebildete
Harnstoff wird abfiltriert und das DMF abdestilliert. Der Rückstand wird mit Äthylacetat behandelt, wobei 0,32 Gew,-Teile
eines Pulvers erhalten werden. Dieses Produkt wird auf eine Säule von Amberlite XAD-2 aufgegeben und in
einem Elutionssystem mit' linearem Gradienten von 5$igem
wässrigem Äthanol bis Äthanol desorbiert. Die Hauptfraktion wird gefriergetrocknet, wobei 0,11 Raumteile reines
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Le u-Arg(NO2)-PrO-NHC2H5
erhalten werden. Dieses Produkt wird 1 Stunde mit 4 Raumteilen Fluorwasserstoff bei O0C in Gegenwart von 0,02
Raumteilen Anisol und 0,02 Raumteilen Mercaptoäthanol behandelt. Der Fluorwasserstoff wird abdestilliert und der
Rückstand nach der Trocknung in Wasser gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule von Amberlite IRA-400 (Acetatform)
geleitet und dann an einer Carboxymethylcelliilosesäule
adsorbiert. Die Säule wird in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von wässrigem 0,005N Ammoniumacetat
bis zu wässrigem 0,2N Ammoniumacetat eluiert. Die Hauptfraktion
wird gefriergetrocknet. Hierbei werden 0,087 Gew.-Teile reines H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-PrO-NHC2H5
erhalten. Rf 3 = 0,36; ß.J7^- -56,2°
(c=0,5> 5$ Essigsäure)ο
Aminosäureanalyse: His 0,95,(1)? Arg 0,98 (1);-Ser 0,95
(1); GIu 0,98 (1);, Pro 1,00 (1); GIy 1,00(1); Leu 1,00(1);
Tyr 1,00(1); NH2C2H5 1,10 (1).
Die Klammerzahlen sind die berechneten Werte»
Die Klammerzahlen sind die berechneten Werte»
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Beispiel 2 ' -.. ; -
Hers te llung von H- (Pyr) Gl u-His -Trp-Ser-Tyr_Gly-Le u-Arg.-Pro-■
NHC2H4OH -■: -...■■,
a) Herstellung von Z-Arg(NO2J-PrO-NHC2H4OH
In 5 Raumteilen DMF werden 0,9 Gew.-Teile Z-Arg(N02)-Pro-·
OH und 0,43 Gewo-Teile HONBI gelöst. Während bei OC gehalten
wird, werden 0,495 Gew.-Teile DCC zugesetzt. Das
Gemisch wird über Nacht gerührt. Die abgeschiedene Harnstoffverbindung wird abfiltriert. Zum Filtrat werden
0,1832 Gew.-Teile Äthanolamin gegeben. .Das. Gemisch wird
über Nacht gerührt. Das DMF wird unter-vermindertem Druck
abdestilliert.. Zum Rückstand wird Dioxan gegeben. Die
unlöslichen Bestandteile werden abf11triert. Das Dioxan
wird unter vermindertem Druck destilliert und der Rückstand mit n-Butanol extrahiert. Der Extrakt wird mit
Wasser, verdünnter Salzsäure, Wasser, einer wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge
gewaschen, worauf das n-Butanol unter vermindertem Druck abdestilliert wird. Der Rückstand wird mit Äther
behandelt und aus Methanol-Äther erneut ausgefällt. Ausbeute 0,625 Gew.-Teile (63,3$); Schmelzpunkt 124° bis
1280C (ZersJ; Rf 2 = 0,23; Zä_7£°=-36,6O (c=0,5, Äthanol).
b) Herstellung von Z-Leu-Arg(NO2)-PrO-NHC2H4OH
In 2 Raumteilen 25% HBr-Essigsäure werden 0,493 Gew.-Teile
Z-Arg(NO)2-PrO-NHC2H4OH gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten
bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wird trockener Äther zugesetzt und die erhaltene Fällung abfiltriert und
getrocknet, wobei ein pulverförmiges Produkt erhalten wird ο Getrennt hiervon werden 0,282 Gew.-Teile Z-Leu-OH
und 0,215 Gew.-Teile HONBI in 3 Raumteilen DMF gelöst. Während bei O0C gehalten wird, werden 0,248 Gew.-Teile
DCC zugesetzt, worauf 2 Stunden gerührt wird. Der Lösung wird das oben genannte pulverförmige Produkt zugesetzt,
worauf 0,15 Raumteile Triäthylamin zugetrppft. werden» Das
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Gemisch wird über Nacht gerührt. Der Harnstoff wird abfiltriert
und das DMF unter vermindertem Druck abdestilliert.
Der Rückstand wird auf eine Säule von 50 Gew.-Teilen Kieselgel aufgegeben und mit einem Lösungsmittelsystera
aus Chloroform-Methanol-Essigsäure (9:1:0,5) desorbierto
Die Lösungsmittel werden abdestilliert und der Rückstand mit Äther kristallisiert. Ausbeute 0,153 Gew„-Teile;
Schmelzpunkt 110° bis 113°C (Zers.); Rf 1 = 0,49; /α_7|° =-46,6° (c= 0,5, Äthanol).
c) 0,152 Gew.-Teile Z-Leu-Arg(UO2)-Pro-NHC2H/,OH werden
in Gegenwart von 0,1 Raumteil Anisol in 3 Räumteilen Fluorwasserstoff gelöst. Die Lösung wird 1 Stunde bei
O0C gerührt. Der Fluorwasserstoff wird abdestilliert und
der Rückstand gut getrocknet und in Wasser gelöst. Nach Zusatz einer geringen Menge konzentrierter Salzsäure wird
die Lösung mit Äther gewaschen und die wässrige Schicht gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver wird in 5 Raumteilen
DMF zusammen mit 0,19 Raumteilen H-(Pyr)Glu- . His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydrochlorid und 0,0493 Gew.-Teilen
HONBI gelöst. Die Lösung wird auf O0C gekühlt, worauf
0,0567 GeWp-Teile DCC und 0,07 Raumteile N-Äthylmorpholin
zugesetzt werden. Das Gemisch wird über Nacht gerührt» Das DMF wird unter vermindertem Druck abdestilliert und
der Rückstand in Wasser gelöst. Die unlöslichen Bestandteile werden abfiltriert und das Piltrat durch eine ;
Säule von Amberlite IRA-400 (Acetatform) geleitet. Der !
Ablauf wird aufgefangen und gefriergetrocknet. Das Produkt wird auf eine Säule von Amberlite XAD-2 aufgegeben und
in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von Wasser-Methanol
desorbiert. Die Hauptfraktion wird gefriergetrocknet, wobei 0,023 Gew.-Teile reines H-(Pyr)Glu-His- '.
Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pr0-NHC2H.OH erhalten werden. ;
Rf 3 = 0,28; /a_J^0= -54,4° (c= 0,5, 5^ige wässrige j
Essigsäurelösung). - j
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Aminosäureanalyse: His 1,00(1); Arg 1,05(1)} Ser 0,95(1 >;
GIu 1,00(1); Pro 1,05(1); GIy 1,00(1); Leu 0,95(1);
Tyr 0,76(1). Die Klammerzahlen sind die berechneten Werte«
Herstellung von H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg- :
PrO-NHCH5
a) Herstellung von Z-=-Arg (NO2)-PrO-NHCH5 !
In 5 Raumteilen DMF werden 0,675 Gew.-Teile Z-Arg(NO2)-Pro-OH
und 0,101 GeWo-Teile Methylaminhydrochlorid gelöst.
Während die Lösung "bei O0C gehalten wird, werden 0,21 Raumteile Triäthylamin zugetropft. Nach Zusatz von 0,322 Gew.-Teilen HONBI und 0,37 Gew.-Teilen DCC wird das Gemisch
5 Stunden "bei 00C und dann 10 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird
abfiltriert und das DMF abdestilliert. Der Rückstand wird ; mit Chloroform extrahiert, mit Wasser gewaschen und über : wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Chloroform
wird abdestilliert und der Rückstand mit Äthanol beban- [ delt und aus Methanol-Äther erneut ausgefällt. Ausbeute ' 0,612 Gew.-Teile (885ε); Rf 1 = 0,30; Schmelzpunkt 137° bis
Während die Lösung "bei O0C gehalten wird, werden 0,21 Raumteile Triäthylamin zugetropft. Nach Zusatz von 0,322 Gew.-Teilen HONBI und 0,37 Gew.-Teilen DCC wird das Gemisch
5 Stunden "bei 00C und dann 10 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird
abfiltriert und das DMF abdestilliert. Der Rückstand wird ; mit Chloroform extrahiert, mit Wasser gewaschen und über : wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Chloroform
wird abdestilliert und der Rückstand mit Äthanol beban- [ delt und aus Methanol-Äther erneut ausgefällt. Ausbeute ' 0,612 Gew.-Teile (885ε); Rf 1 = 0,30; Schmelzpunkt 137° bis
1430C (Zers.)j /a_7^4= -41,5° (c=1, Methanol). |
Elementaranalyse; £ H N !
Berechnet für C20H29O6N7: 51,82 6,31 21,15 ■
Gefunden: 51,84 6,54 21,57 ,
- 1
b) Herstellung von Z-Leu-Arg(NO2)-Prο-NHCH^ j
In 5 Gew.-Teilen 25$ HBr-Essigsäure werden 0,556 Gew.- ;
Teile Z-Arg(NO2)-PrO-NHCH5 gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten
bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wird
trockener Äther zugesetzt, worauf die gebildeten Kristalle abfiltriert und getrocknet werden. Getrennt hiervon werden 0,312 Gew.-Teile Z-Leu-OH in 5 Raumteilen Dioxan-Äthylacetat (1:1) gelöst. Während die Lösung gekühlt wird,
trockener Äther zugesetzt, worauf die gebildeten Kristalle abfiltriert und getrocknet werden. Getrennt hiervon werden 0,312 Gew.-Teile Z-Leu-OH in 5 Raumteilen Dioxan-Äthylacetat (1:1) gelöst. Während die Lösung gekühlt wird,
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| C | 7, | H | 19 | I | |
| 54 | ,15 | 6, | 02 | 19 | |
| 54 | ,37 | 98 | ,52 ! | ||
werden 0,268 Gew.-Teile DCC und 0,232 Gewe-Teile HONBI
zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert. Zum
Filtrat werden die in der oben beschriebenen Weise hergestellten Kristalle gegeben und durch Zusatz von 3 Raumteilen
Dp1 gelöst. Während gekühlt wird, werden 0,17 Raumteile
Triäthylamin zugesetzt. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert.
Der Rückstand wird mit Chloroform extrahiert und mit Wasser gewaschen. Die Chloroformschicht wird über
wasserfreiem Magnesiumsulfat dehydratisiert, worauf das Chloroform abdestilliert wird. Der Rückstand wird mit
Äther behandelt und aus Methanol-Äther erneut ausgefällt. Ausbeute 0,45 Gew.-Teiler (78$); Rf"1 = 0,25. j
Berechnet für C26H4007N8:
Gefunden:
Gefunden:
c) In 5 Raumteilen 25$ HBr-Essigsäure werden 0,144 Gew,-Teile
Z-Ieu-Arg(NOg)-PrO-MHCH, gelöst. Die lösung wird
30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, worauf trockener Äther zugesetzt wird. Die gebildete Fällung
wird abfiltriert und gut getrocknet. Sie wird dann in 3 Raumteilen DM51 gelöst. Während die Lösung gekühlt und
gerührt wird, werden 0,05 Raumteile N-Äthylmorpholin zugetropft.
In dieser Lösung werden 0,19 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydrochlorid
gelöst. Zur Lösung werden 0,054 Gew.-Teile HONBI und 0,062 Gew.-Teile DCC gegeben.
Das Gemisch wird 2 Stunden bei O0C und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete
Harnstoff wird abfiltriert und das DMF abdestilliert. Der Rückstand wird auf eine Säule von Amberlite
XAD-2 aufgegeben und in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 5$igem wässrigem Äthanol bis Äthanol desorbiert.
Die Hauptfraktion wird gefriergetrocknet, wobei
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0,137 Gew.-Teile reines H-(Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg(NO2)-Pr0-NHCH5
erhalten werden. 0,09 Gew.-Teile dieses Produkts werden mit 4- Gew.-Teilen Fluorwasserstoff
in Gegenwart von 0,02 Raumteilen Anisol und 0,02 Raumteilen Mercaptoäthanol 1 Stunde "bei O0C behandelt. Der
Fluorwasserstoff wird abdestilliert und der Rückstand nach dem Trocknen in Wasser gelöst. Die Lösung wird durch
Amberlite IRA-400 (Acetatform) geleitet und dann an einer
Säule von Carboxymethylcellulose adsorbiert. Die Säule wird in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von
wässrigem 0,005N Ammoniumacetat bis zu wässrigem 0,2N-Ammoniumacetat
eluiert. Die Hauptfraktion wird gefriergetrocknet. Hierbei werden 0,06 Gew.-Teile reines ' !
H-(Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pr0-NHCH5 erhaltei.
Rf3= 0,37, /ä_JvA= -55,6° (c=0,5 in 5$iger wässriger \
Essigsäurelösung). S
Atoinosäureanalyse: His 0,96(1); Arg 0,98(1); Ser 0,96(1); '
GIu 1,00(1); Pro 1,00(1); GIy 1,00(1); Leu 0,98(1); |
Tyr 0,98(1); NH2CH5 1,12(1). Die Klammerzahlen sind die
berechneten Werte.
Herstellung von H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Pyrrolidln.
a) Herstellung von IBOC-Pro-Pyrrolidin
In 30 Raumteilen Acetonitril werden 11,7 Gew„-Teile IBOC-Pro-OSU
und 2,3 Raumteile Pyrrolidin gelöst. Die Lösung wird über Nacht gerührt. Das Acetonitril wird abdestilliert
und der Rückstand mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem
Natriumsulfat dehydratisiert. Das Äthylacetat wird abdestilliert. Die erhaltenen Kristalle.werden aus Äthylacetat-Eröölbenzin
umkristallisiert. Ausbeute 8,4 Raum— teile (80,2$). Schmelzpunkt 84° bis 84,50C;
o_7p3= -83,4° (c=1,0, Methanol)
30 984 5/1 1 B3
| C | • | 9 | 2321 | 174 | |
| ,93 | 9 | H | N | ||
| 68 | ,93 | ,26 | 8,04 | ||
| 68 | ,43 | 8,17 | |||
Elementaranalyse;
Berechnet für
G-efunden:
Berechnet für
G-efunden:
b) Herstellung von IB0C-Arg(N02)-Pro-Pyrrolidin
In 30 Raurateilen Trifluoressigsäure werden 6,96 Gew.-Teile
IBOO-Pro-Pyrrolidin gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten bei
Raumtemperatur stehen gelassen<>
Zur Lösung wird trockener Äther gegeben. Das erhaltene Öl wird durch Dekantieren
isoliert und in einem Exsiccator, der Natriumhydroxyd
enthält, getrocknet. Getrennt hiervon werden 7,98 Gew.-Teile IBOC-Arg(NOp)-OH in 40 Raumteilen Acetonitril gelöst.
Während die Lösung bei O0C gehalten wird, werden
4,0 Gew.-Teile Dinitrophenol und 4,6 Gew„-Teile DCC zugesetzt,
worauf 2 Stunden gerührt wird. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert und das in der
oben beschriebenen Weise erhaltene Öl dem Filtrat züge- setzt.
Das Gemisch wird auf O0C gekühlt, worauf 2,5 Raumteile N-Äthylmorpholin zugetropft werden. Das Gemisch \.
wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Acetoni- ;
tril wird abdestilliert und der Rückstand an 100 Gew.- ,
Teilen Kieselgel adsorbiert und mit 5$igem wässrigem ·
Methanol desorbiert. Nach dieser Reinigung wird das Lösungsmittel abdestilliert, wobei 6,0 Gew.-Teile eines
Pulvers erhalten werden. Ausbeute 54,5%. Schmelzpunkt
190° bis 1930C (Zers.); /ä_7^5= -59,7° (c=1, Methanol)
Elementaranalyse: (J S ü
Berechnet für C26H^5OgN7: 56,82 7,88 17,84
Gefunden: - 57,00 8,26 17,51
c) Herstellung von IBOC-Leu-Arg(NO2)-Pro-Pyrrolidin
In 30 Raumteilen Trifluoressigsäure werden 5,49 Gew„-Teile
IBOC-Arg(N02)-Pro-Pyrrolidin gelöst. Die Lösung wird
30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wird trockener Äther zugesetzt. Die gebildete Fällung wird
abfiltriert und gut getrocknet, wobei ein Pulver erhalten wird. Getrennt hiervon werden 3,95 Gew.-Teile IBOC-Leu-OH
30 98-45/1 153
.- 24■■-
23211-7 A.
in 20 Raumteilen Dioxan gelöst» Während die Lösung bei
O0C gehalten wird, werden 1,52 Gew.-Teile N-Hydroxysuccinimid
und 2,7 Gew.-Teile DCC zugesetzt, worauf das Gemisch 2 Stunden gerührt wird. Der als Nebenprodukt abgeschiedene
Harnstoff wird abfiltriert. Zum Filtrat wird das in der oben beschriebenen Weise erhaltene Pulver gegeben,
worauf 10 Raumteile Tetrahydrofuran zugesetzt werden. Das Gemisch wird auf O0C gekühlt, worauf 1,4 Raumteile
Triäthylamin zugetrqpft werden. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, das Lösungsmittel
abdestilliert und der Rückstand mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit einer 5$igen wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung
und einer 10bigen wässrigen Citranensäurelösung
gewaschen. Er wird dann mit V/asser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert. Das
Äthylacetat wird abdestilliert und der Rückstand mit Erdölbenzin gewaschene Der Rückstand wird dann aus Äthylacetat-Erdölbenzin
erneut ausgefällt. Ausbeute 5,8 Gew.- | Teile; Schmelzpunkt 185° bis 1860C (Zers.)j
7J35 = -53,6° (c=0,98, Methanol).
Elementaranalyse: Cl H N
Berechnet für C52H54O7N8CH2O: 56,45 8,29 16,46 |
Gefunden: 56,97 8,17 15,25 ;
I d) In 50 Raumteilen Methanol werden 0,22 Gew.-Teile j IBOC-Leu-Arg(NO2)-Pro-Pyrrolidin gelöst. Die Lösung wird
8 Stunden der Hydrierung in Gegenwart von Palladiumschwarz unterworfen. Das Methanol wird abdestilliert und
der Rückstand mit Äther behandelt. Das erhaltene Pulver '.
wird in einem Gemisch von 5 Raumteilen Trifluoressigsäure und 1 Raumteil 2N HCl-Essigsäure gelöst. Die Lösung wird
40 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Trifluoressigsäure wird abdestilliert, worauf trockener
Äther zugesetzt wird. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und gut getrocknet. Dieses Pulver (0,153 Gew.-Teile)
wird in 3 Raumteilen DMF zusammen mit 0,24 Gew.-Teilen
309845/1153
H-(PyrjGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydrochlorid gelöst.
Zur Lösung werden 0,0742 Gew.-Seile DCC, 0,0644 Gew.-Teile HONBI und 0,084 Raumteile N-Äthylmorpholin gegeben» Das
Gemisch wird 5 Stunden bei O0C und dann über Nacht bei
Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete
Harnstoff wird abfiltriert. Zum Piltrat wird Äthylacetat
gegeben. Die Fällung wird filtriert und in einer Menge
von 0,26 Gew.-Teilen gewonnen. Eine Menge von 0,2 Gew.-Teilen dieses Produkts wird an einer Säule von "Amberlite
XAD-2" adsorbiert und in einem Blutionssystem mit linearem Gradienten von 5$>igem wässrigem Äthanol (180 Raumteile) bis zu 50^igem wässrigem Äthanol eluiert. Die
Fraktionen, die scharf abgegrenzte Zonen bei der Dünn- : Schichtchromatographie (Kieselgel) bilden, werden aufgefangen und gefriergetrocknet. Die Ausbeute beträgt i 0,02 Gew.-Teile. ß.J^= -91,0° (c=0,5, 5$ Essigsäure); : Papierchromatographie: Rf=O,72 (n-Butanol-Pyridin-Essig- ; säure-Wasser = 30:20ί6ί24)» j
Zur Lösung werden 0,0742 Gew.-Seile DCC, 0,0644 Gew.-Teile HONBI und 0,084 Raumteile N-Äthylmorpholin gegeben» Das
Gemisch wird 5 Stunden bei O0C und dann über Nacht bei
Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete
Harnstoff wird abfiltriert. Zum Piltrat wird Äthylacetat
gegeben. Die Fällung wird filtriert und in einer Menge
von 0,26 Gew.-Teilen gewonnen. Eine Menge von 0,2 Gew.-Teilen dieses Produkts wird an einer Säule von "Amberlite
XAD-2" adsorbiert und in einem Blutionssystem mit linearem Gradienten von 5$>igem wässrigem Äthanol (180 Raumteile) bis zu 50^igem wässrigem Äthanol eluiert. Die
Fraktionen, die scharf abgegrenzte Zonen bei der Dünn- : Schichtchromatographie (Kieselgel) bilden, werden aufgefangen und gefriergetrocknet. Die Ausbeute beträgt i 0,02 Gew.-Teile. ß.J^= -91,0° (c=0,5, 5$ Essigsäure); : Papierchromatographie: Rf=O,72 (n-Butanol-Pyridin-Essig- ; säure-Wasser = 30:20ί6ί24)» j
Aminsäureanalyse: His 1,09(1); Arg 0,96(1); Ser 0,82(1). j
GIu 1,00(1); Pro 0,96(1); GIy 1,00(1); Leu 1,00(1); j
Tyr 0,96(1).
Herstellung von H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-NLe-Arg- ;
PrO-NH-CH2CH3 j
a) Herstellung von Z-NLe-Arg (NO2)-Pr0-NH-CH2CH5 j
l ■! !■■ ■■I—.. HIIIi1III 1 Ii ■ ■■■
I !■ Il ■ I I I ■■ Il ■ I — —...Ι ■ ■■■ '
\
In 4 Raumteilen 25?6 Bromwasserstoff-Essigsäure werden ;
0,4775 Gew.-Teile Z-Arg (NO^-PrO-NH-CH2CH5 gelöst. Die Lösung
wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann werden 50 Raumteile trockener Äther zum Reaktionsgemisch gegeben«, Die abgeschiedene Fällung wird abfiltriert,
mit Äther gut gewaschen und über Natriumhydroxyd
unter vermindertem Druck getrocknet. Getrennt hiervon
werden 0,2653 Gewo-Teile Z-NLe-OH in einem Gemisch von
2 Raumteilen Äthylacetat und 12 Raumteilen Dioxan gelöst.
Während die Lösung bei O0C gehalten wird, werden 0,197
unter vermindertem Druck getrocknet. Getrennt hiervon
werden 0,2653 Gewo-Teile Z-NLe-OH in einem Gemisch von
2 Raumteilen Äthylacetat und 12 Raumteilen Dioxan gelöst.
Während die Lösung bei O0C gehalten wird, werden 0,197
309845/1153
Gew.-Teile· HONBI und 0,226 Gew.-Teile DCC zugesetzt. Das
Gemisch wird 3 Stunden gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert und das Filtrat zu
einer Lösung der in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Fällung in 1 Raumteil DMF gegeben, worauf 0,28
Raumteile Triäthylamin zugetropft werden. Das Gemisch v/ird
über Nacht gerührt, das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand mit 100 Raumteilen Chloroform extrahiert.
Der Extrakt wird mit 5$iger wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung,
Wasser, Ö,5N Salzsäure und Wasser gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat dehydratisiert.
Das Chloroform wird abdestilliert und der Rückstand mit Äther behandelt und aus Äthanol-Äther erneut
ausgefällt. Die Ausbeute beträgt 0,41 Gew.-Teile.
0C (Zers); /aj^2 504°
Schmelzpunkt- 109° bis 1110C (Zers.); /aj^2= -50,4
c=0,5, Äthanol.
Elementaranalyse: C H E
Berechnet für C27H42O7N8-O^H2Oi 54,07 7,22 18,68
Gefunden; 53,79 7,09 18,24
In 2 Raumteilen 25$ Bromwasserstoff-Essigsäure werden
0,155 Gew„-Teile Z-NLe-Arg(NO2)-PrO-NH-CH2CH3 gelöst» Die
Lösung.wird 50 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Dann werden 50 Raumteile trockener Äther zum Reaktionsgemisch gegeben. Die abgeschiedene Fällung wird abfiltriert,
mit Äther gut gewaschen und über Natriumhydroxyd unter vermindertem Druck getrocknete
Die Fällung wird in 2 Raumteilen DMF gelöst. Während die Lösung bei O0C gehalten wird, werden 0,19 GeWo-Teile
H-CPyrJ-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-bydrochlorid, 0,09 '
Gew.-Teile HONBI, 0,103 Gew.-Teile DCC und 0,1 Raumteil N-Äthylmorpholin in dieser Reihenfolge zugegeben. Das Gemisch wird 5 Stunden bei O0C und 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt abgeschiedene
Harnstoff wird abfiltriert und das DMF unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird in 4 Raumteilen
309845/1153
5$igem -wässrigem Äthanol zusammen mit 0,2 "Gewe-Teilen
Harnstoff gelöste Die Lösung wird an einer Säule von Amberlite XAD-2 adsorbiert und in einem Elutionssystem
mit linearem Gradienten von dfolgem wässrigem Äthanol bis
80$igem wässrigem Äthanol desorbiert. Die Hauptfraktion wird gefriergetrocknet, wobei 0,067 Gew„-Teile H-(Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-NLe-Arg(N02)-Pro-NH-CH2CH3
erhalten werden. Eine Menge von 0,060 Gew.-Teilen dieses Produkts wird in 4 Raumteilen Fluorwasserstoff bei -50-C in
Gegenwart von 0,05 Raumteilen Anisol und 0,02 Raumteilen 2-Mercaptoäthanol gelöste Die Lösung wird 1 Stunde bei
O0C gerührt. Der Fluorwasserstoff wird unter vermindertem
Druck abdestilliert und der Rückstand in einem •Natr'iumhydroxyd
enthaltenden Exsiccator getrocknet. Der Rückstand wird in 20 Raumteilen Wasser gelöst und die Lösung
durch Amberlite CG-400 (Acetatform) geleitet. Der Ablauf wird gefriergetrocknet und auf eine Säule von Carboxymethylcellulose
aufgegebene Er wird in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 0,005N Ammoniumacetat
bis 0,2N Ammoniumacetat desorbiert. Die Hauptfraktion wird gefriergetrocknet, wobei 0,035 Gew.-Teile des gewünschten
Produkts erhalten werden. Dieses Produkt wird auf eine Säule von "Sephadex LH-20" aufgegeben und mit
0,1N Essigsäure desorbiert. Die homogene Fraktion wird
gefriergetrocknet, wobei 0,028 Gewe-Teile reines H-(Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-NLe-Arg-Pro-NH-CH2CH5
erhalten werden.
/ö_7^5= -52,2° (c=0,5, 5#ige Essigsäure)
Aminosäureanalyse: His 1,00(1); Arg 1,02(1); Trp 1,00(1);
Ser 0,91(1); GIu 1,00(1); Pro 1,05(1); GIy 0,98(1); Tyr 1,00(1); KLe 1,02(1).
309845/1 153
Herstellung von H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg-PrO-NH-CH2CH5
a) Herstellung von Z-Ser-Phe-GIy-OEt
2,5 Gew.-Teile Z-Phe-Gly-OEt werden in 50 Raumteilen
Methanol gelöst. Die Lösung wird 4 Stunden der katalytischen Reduktion mit 5$iger Palladiumkohle unterworfen.
Der Katalysator wird abfiltriert und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wird in 20 Raumteilen Dimethylformamid
gelöst. Zur Lösung werden 2,6 Gewe-Teile Z-Ser-ODNP gegebene Das Gemisch wird 8 Stunden gerührt.
Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand in Äthylacetat gelöst. Das Lösungsmittel wird mit 5$iger
wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung, 1N Salzsäure und Wasser gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet.
Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der feste Rückstand aus Äthylacetat-Erdölbenzin kristallisiert.
Die Ausbeute beträgt 1,75 Gew„-Teile (74,2$).
Schmelzpunkt 128° bis 129°C JuJ^ = -26,6° (c=0,6,
Äthanol)ο
Elementaranalyse: G H N
Berechnet für C2^H29O7N5: 61,13 6,20 8,91
Gefunden: 60,47 6,00 8,88
b) Herstellung von Z-Ser-Phe-Gly-NHNHO
1,65 Gew.-Teile Z-Ser-Phe-GIy-OEt werden in 20 Raumteilen
Methanol gelöst. Zur Lösung werden 0,71 Raumteile Hydrazinhydrat gegeben. Das Gemisch wird 8 Stunden stehen gelassen.
Die gebildeten Kristalle werden abfiltriert und mit Methanol-Äther (1s1) gewaschen. Die Ausbeute beträgt
1,6 Gew.-Teile (IOO7O0 Schmelzpunkt 191° bis 1930C.
/ä_7^2 = -23,0° (c=2, DMF)0
Eleme nt aranalys et
Eleme nt aranalys et
Berechnet für ο22Η27ίΓ5Ο6ί
Gefunden:
309845/1153
| C | 5 | H ... | 1 | 5 | N | |
| 57 | ,76 | 6 | ,95 | 1 | 5 | »31 |
| 57 | ,32 | ,21 | ,53 | |||
c) Herstellung von Z-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2CH3
0,8 Gew.-Teile Z-Ser-Phe-Gly~NHNH2 werden in 10 Raumteilen
DMF gelöst. Die lösung wird gekühlt. Dann werden 3,5 Raumteile 2N Salzsäure zugesetzt» Während "bei -60C gerührt
wird, wird eine wässrige 2N Natriumnitritlösung zugesetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten der Reaktion überlassen»
Die Fällung, -wird durch Zugabe von 10 Raumteilen DMF gelöst. Zum Reaktionsgemisch wird eine gesättigte
wässrige Natriumchloridlösung gegeben, worauf mit Äthylacetat extrahiert wird. Der Extrakt wird mit der Waschflüssigkeit
zusammengegossen. Die Lösung wird mit 5$iger wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter
wässriger Natriumchloridlösung gewaschen. Die Äthylacetatschicht (80 Raumteile) wird über Natriumsulfat getrocknet
und dann zu 20 Raumteilen einer Lösung von 1,04 Gew.- i Teilen H-Leu-Arg(NO2)-PrO-NH-CH2CH5 in DMF gegeben. Das \
Äthylacetat wird in ein Eisbad abdestilliert. Die erhaltene homogene Lösung wird 2 Tage bei 3°C gerührt. Das :
Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand durch \ Chromatographie an Kieselgel gereinigt. Das Chromato- !
gramm wird mit einem Lösungsmittelsystem aus Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser
(60:20ί6ί10) entwickelt. Die
aktiven Fraktionen werden zusammengegossen uqd zur Entfernung
der Lösungsmittel destilliert. Zum Rückstand wird Wasser gegeben. Der gebildete Feststoff wird abfiltriert.
Die Ausbeute beträgt 0,87 Gew.-Teile (61,25ε). Schmelz- !
0C /ä7^2= 591°
punkt 1080C. /ä__7^2= -59,1° (c=0,7, Äthanol).
| Elernentaranalyse: | J1N11.H2O: | 54 | C | H | 83 | 17 | N |
| Berechnet für C^Ht-oO. | 54 | ,72 | 6, | 84 | 16 | ,12 | |
| Gefunden: | ,95 | 6, | ,74 | ||||
309845/1153
232117 A
d) 0,836 Gew.-Teile Z-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg(M)2)-Pro-NH-
- CHpCH, werden in Methanol gelöst. Zur Lösung wird
•1 Raumteil 1F Salzsäure gegeben» Die Lösung wird der
katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz unterworfen.
Der Katalysator wird abfiltriert und das Lösungsmittel
abdestilliert. Der Rückstand wird in 10 Raumteilen DMF
gelöst. In der Lösung werden 0,83 Gew.-Teile H-(Pyr)-Glu-His-Trp-OH und 0,36 Gew.-Teile HOMBI gelöst. Das Gemisch
wird auf -5°C gekühlt, worauf 0,4-12 Gew.-Teile DCC zugesetzt werdenο Das Gemisch wird 2 Tage der Reaktion überlassen, worauf die Fällung abfiltriert und das DMF abdestilliert wird. Der Rückstand wird durch Chromatographie au einer Säule von Amberlite XAD-2 in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 5/£igem wässrigem Äthanol bis
80$igem wässrigem Äthanol gereinigt. Die aktiven Fraktionen werden zusammengegossen und zur Entfernung des ; Äthanols destilliert. Die als Rückstand verbleibende J wässrige Lösung wird gefriergetrocknet. Das erhaltene : Pulver wird durch Ionenaustauschchromatographie an Carb- j oxymethylcellulose in einem Elutionssystem mit linearem , Gradienten von 0,005N bis 0,1N wässrigem Ammoniumacetat : weiter gereinigt. Die aktive Fraktion wird gefriergetrocknet, wobei ein rein weißes Pulver erhalten wird. Die Ausbeute beträgt 0,424 Gew.-Teile»{μJ^ = -55° (c=0,5, ; 5$ Essigsäure). ■
•1 Raumteil 1F Salzsäure gegeben» Die Lösung wird der
katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz unterworfen.
Der Katalysator wird abfiltriert und das Lösungsmittel
abdestilliert. Der Rückstand wird in 10 Raumteilen DMF
gelöst. In der Lösung werden 0,83 Gew.-Teile H-(Pyr)-Glu-His-Trp-OH und 0,36 Gew.-Teile HOMBI gelöst. Das Gemisch
wird auf -5°C gekühlt, worauf 0,4-12 Gew.-Teile DCC zugesetzt werdenο Das Gemisch wird 2 Tage der Reaktion überlassen, worauf die Fällung abfiltriert und das DMF abdestilliert wird. Der Rückstand wird durch Chromatographie au einer Säule von Amberlite XAD-2 in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 5/£igem wässrigem Äthanol bis
80$igem wässrigem Äthanol gereinigt. Die aktiven Fraktionen werden zusammengegossen und zur Entfernung des ; Äthanols destilliert. Die als Rückstand verbleibende J wässrige Lösung wird gefriergetrocknet. Das erhaltene : Pulver wird durch Ionenaustauschchromatographie an Carb- j oxymethylcellulose in einem Elutionssystem mit linearem , Gradienten von 0,005N bis 0,1N wässrigem Ammoniumacetat : weiter gereinigt. Die aktive Fraktion wird gefriergetrocknet, wobei ein rein weißes Pulver erhalten wird. Die Ausbeute beträgt 0,424 Gew.-Teile»{μJ^ = -55° (c=0,5, ; 5$ Essigsäure). ■
Aminosäureanalyse j His 1,02(1); Arg 1,01(1); Trp 0,91(1);
Ser 0,90(1); GIu 1,00(1); Pro 1,00(1); GIy 0,98(1); \ Leu 1,00(1); Phe 1,00(1); Äthylamin 1,06(1). |
Ser 0,90(1); GIu 1,00(1); Pro 1,00(1); GIy 0,98(1); \ Leu 1,00(1); Phe 1,00(1); Äthylamin 1,06(1). |
Um die Ausbeute an Trp zu ermitteln, werden alle Aminosäureanalysen
durch Säurehydrolyse mit 5,7N HCl in Gegenwart von Thioglykolsäure durchgeführt. \
30 98 45/1153
Herstellung von H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-ILe-Arg-PrO-NHC2H5
a) Herstellung von H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-&iy-OtBu
1,57 Gew.-Teile H-GIy-OtBu und 4,0 Gewe-Teile Z-Phe-OSU
werden in 20 Raumteilen Äthylacetat gelöst. Das Gemisch wird über Nacht "bei Raumtemperatur gerührt. Das Reajctionsgeinisch
wird mit 5?6iger wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung,
1N Salzsäure und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat dehydratisiert und unter vermindertem
Druck eingeengt. Zum Rückstand wird Petroläther gegeben. Die Fällung wird abfiltriert, wobei 3,5 Gew.-Teile
(85%) Z-Phe-Gly-OtBu vom Schmelzpunkt 78 bis 79°C er- ;
halten werden. /ä_7^5= -16,7° (c=1,O, Äthanol). \
Eleme ntaranalyse; C H ^i
Berechnet für C25H28O5N2: 66,97 6,87 <
6,79 \ Gefunden: 67,14 6,64 6,88
7,0 Gew.-Teile Z-Phe-Gly-OtBu werden in 50 Raumteilen !
Methanol gelöst. Die Lösung wird unter Verwendung von !
Palladiumschwarz als Katalysator 5 Stunden reduziert. :
Das Reaktionsgemisch wird filtriert und das Filtrat durch Abdampfen des Lösungsmittels eingeengt. Der Rückstand
wird in 10 Raumteilen Acetonitril gelöst. Zur Lösung werden 1,62 Gew.-Teile Z-Ser-ODNP gegeben. Das erhaltene
Gemisch wird 1 Tag bei Raumtemperatur gerührt, worauf das Acetonitril abgedampft wird. Der Rückstand wird in
Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 10bigem wässrigem
Ammoniak, 1N Salzsäure und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat dehydratisiert und durch Abdampfen
des Lösungsmittels eingeengt„ Der Rückstand wird in
Petroläther aufgenommen und aus Äthylacetat-Petroläther
umkristallisiert, wobei 1,41 Gew.-Teile (70?δ) Z-Ser-Phe-GIy-OtEu
vom Schmelzpunkt 105° bis 1060C erhalten werden.
309845/1153
1 1 7 A
7ψ = -26,6° (c=0,74, Äthanol).
Elementaranalyse: C H E
Berechnet für C26H55O7N5: 62,50 6,66 8,41
Gefunden: 62,91 6,38 8,12
1,34 Gew.-Teile Z-Ser-Phe-Gly-OtBu werden in 50 Raumteilen
Methanol gelöst. Die Lösung wird 5 Stunden der katalytischen Reduktion unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator unterworfen. Das Gemisch wird
filtriert und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand sowie 1,27 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-OH und 0,83 Gew.-Teile
HONBI werden in 20 Raumteilen DMF gelöst. Die Lösung wird mit Eis gekühlt. Nach Zugabe von 0,95 Gew.-Teilen DCC
wird das Gemisch über Nacht der Reaktion überlassen. Die
Fällung wird abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Nach Zugabe von Acetonitril zum Rückstand wird das Gemisch
erhitzt. Das abgeschiedene Pulver wird vom Gemisch abfiltriert und aus 50$igem wässrigem Äthanol erneut ausgefällt, wobei 1,8 Gew.-Teile (87$) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-OtBu
erhalten werden. /ö_7^ = -20,6° j
(c=1,0, DMF).
Elementaranalyse: C H E
Berechnet für C40H49O9N902H2O: 58,59 6,52 15,38
Gefunden: 59,02 6,62 15,23
b) Herstellung von Z-ILe-Arg(NO2)-PrO-NHC2H5
1,43 Gew.-Teile Z-Arg(N02)-Pro-NHC2H5 werden in 10 Raumteilen 25$ HBr-Essigsäure gelöst. Das Gemisch wird
40 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann werden 80 Raumteile trockener Äther zugesetzt. Die gebildete
Fällung wird abfiltriert und getrocknet, wobei ein Pulver erhalten wird.
0,795 Gew.-Teile Z-ILe-OH werden in 10 Raumteilen Dioxan gelöst. Die Lösung wird auf O0C gekühlt. Nach Zugabe von
0,59 Gew.-Teilen HONBI und' 0,68 Gew.-Teilen DCC zur Lösung wird das Gemisch 2 Stunden gerührt. Das Gemisch
wird zur Entfernung der Fällung filtriert. Zum Filtrat
309845/1153
wird das in der oben "beschriebenen Weise hergestellte
Pulver gegeben. Nach Zusatz von 0,84 Raumteilen Triäthylamin wird das Gemisch 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Das als Lösungsmittel verwendete Dioxan wird abgedampft. Der Rückstand wird in 100 Raumteilen Chloroform
gelöst und die Lösung mit 0,1N Salzsäure, 5$iger wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung und V/asser gewaschen,
über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und durch
Abdampfen des Chloroforms eingeengte Der Rückstand wird mit Äther verrieben, wobei eine Fällung gebildet wird,
die aus Äthanol-Äther erneut ausgefällt wird, wobei 1,1 Gew.-Teile Z-ILe-Arg(UO2)-Prο-NHC2H5 vom Schmelzpunkt
103° bis 105°C (Zers.) erhalten werden. /ö_7p3= -58,1°
(c=1, Methanol). :
Elementaranalyse t C_ H N !
Berechnet für C27H42O7Ng0O^H2O: 54,08 7,23 18,68
Gefunden: 53,80 7,15 18,84
c) 0,177 Gew.-Teile Z-ILe-Arg(NO2)-PrO-NHC2H5 werden in
5 Raumteilen 25$ HBr-Essigsäure gelöst. Die Lösung wird
30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann j mit 50 Raumteilen trockenem Äther versetzt. Die Fällung =
wird abfiltriert, mit Äther gut gewaschen und getrocknet, wobei eine Aminkomponente erhalten wird. !
0,221 Gew.-Teile H-(Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-OtBu
werden in 5 Raumteilen Trifluoressigsäure gelöst. Die :
Lösung wird 40 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen
und dann mit 0,05 Raumteilen 5,7N Salzsäure und anschliessend mit 50 Raumteilen Äther versetzt. Die Fällung wird
abfiltriert, getrocknet und in 3 Raumteilen DMF gelöst. Die Lösung wird auf O0C gekühlt und dann mit der in der
oben beschriebenen Weise hergestellten Aminkomponente, 0,097 Gew.-Teilen HONBI, 0,111 Gew.-Teilen DCC und 0,126
Raumteilen Triäthylamin versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 5 Stunden bei O0C und dann 10 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Das Gemisch wird zur Entfernung des hierbei
309845/1153
gebildeten Dicyclohexylharnstoffs filtriert. Das Filtrat
wird unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand
wird in 10 Raumteilen 10bigem wässrigem Äthanol gelöst.
Die Lösung wird oben auf eine Säule von Amberlite XAD-2 aufgegeben.
Die Desorbtion wird in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 10$igem "bis 80?Sigem wässrigem
Äthanol durchgeführt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden aufgefangen, durch Abdampfen des als Lösungsmittel
verwendeten Äthanols eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 0,085 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-GIy-ILe-Arg(NO0)-Pro.KHCoHc
erhalten werden. " ' :
0,07 Gew.-Teile des Produkts werden in einem Gemisch von
0,02 Raumteilen Anisol, 0,02 Raumteilen 2-Mercaptoätha- '
nol und 4 Raümteilen wasserfreiem Fluorwasserstoff gelöst.
Die Lösung wird 1 Stunde bei O0C gerührt, worauf der ;
Fluorwasserstoff unter vermindertem Druck abgedampft wird. Der Rückstand wird im Exsiccator getrocknet, in 50 Raum- ;
teilen Wasser gelöst, und durch eine Säule von Amberlite | IRA-400 (Acetatform) geleitet« Die von der Säule ablaufende
Lösung wird gefriergetrocknet, wobei 0,075 Gew.- j Teile rohes Produkt erhalten werden. Dieses Produkt wird
an einer Säule von Carboxymethylcellulose adsorbiert und 4
in einem Elutionssystem mit linearen Gradienten von im& ]
0,005N Ammoniumacetat bis 0,2U Ammoniumaeetat desorb%erjt|fj
Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen gefriergetrocknet. Das hierbei erhaltene Produkt)^wijEdr i
wässriger 0, IN-Essigsäurelösung gelöst. Die durch eine Säule von Sephadex LH-20
Säule ablaufende Lösung wird
0,043 Gew.-Teile reines Produkt J^j^^4
Za_7j) = -59,4° (c=0,5, 5/B Essigsäare-Die- όίϊπ hnsieziQiJR inus ',
Aminosäureanalyse: His 1,1 (1) ;^J^msh^li^iü ifcps GbpS7<Qjtpta
Äthylamin 1,0(1 ) j Ser 0,81
GIy 1,0(1)* ILe 1,06(1); M
sind die theoretischen Werte»
GIy 1,0(1)* ILe 1,06(1); M
sind die theoretischen Werte»
3098A5/1153
Beispiel 8
Herstellung von H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Met-Arg
Herstellung von H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Met-Arg
a) Herstellung von BOC-Met-Arg-Pr0-25
1,91 Gew.-Teile Z-Arg(UO2)-PrO-HHC2H5 werden in 10 Raumteilen
253^ HBr-Essigsäure gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten
stehen gelassen und dann mit trockenem Äther versetzt. Die Fällung wird abfiltriert, mit Äther gut gewaschen
und getrocknet, wobei eine Aminkomponente erhalten
wird. --
1,75 Gew.-Teile BOC-Met-OH.DCHA werden in 100 Raumzellen
Äther gelöst. Die Lösung^wird zweimal mit 50 Raumteilen
einer wässrigen O92H Schwefelsäurelösung gewaschen und
über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Der Äther wird abgedampft und der Rückstand in 20 Raumteilen Dioxan
gelöst. .Die Lösung wird auf 00C gekühlt und mit 0,905
Gew.-Teilen DCC und 0,79 Gew.-Teilen HOHBI versetzt» Das Gemisch wird 2 Stunden gerührt. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff
wird abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Zum Rückstand werden 5 Raumteile DMP und die gesamte
Menge der in der oben beschriebenen Weise hergestellten Aminkomponente gegeben. Die erhaltene Lösung wird gekühlt
und dann mit 1,12 Raumteilen Triäthylamin versetzt. Das Gemisch wird i2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und
das DMF abgedampft, Der Rückstand wird in 100 Raumteilen
mxt
Chloroform gelöst,/0,1H Salzsäure, 5#iger wässriger Natriumbydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und durch Abdampfen des Chloroforms eingeengt. Durch Zugabe von Äther zum Rückstand wird ein Feststoff gebildet. Dieser Feststoff wird aus Äthylacetat-Äther erneut ausgefällt, wobei 1,4 Gew.-Teile BOC-Met-Arg-PrO-HHC2H5 vom Schmelzpunkt 101 bis 104°C (Zers.) erhalten werden, Zö_7|2= -64,4° (c=1,0, Methanol). !
Chloroform gelöst,/0,1H Salzsäure, 5#iger wässriger Natriumbydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und durch Abdampfen des Chloroforms eingeengt. Durch Zugabe von Äther zum Rückstand wird ein Feststoff gebildet. Dieser Feststoff wird aus Äthylacetat-Äther erneut ausgefällt, wobei 1,4 Gew.-Teile BOC-Met-Arg-PrO-HHC2H5 vom Schmelzpunkt 101 bis 104°C (Zers.) erhalten werden, Zö_7|2= -64,4° (c=1,0, Methanol). !
309845/1153
| 47, | 33 | 7, | 42 | 1 | 9, | 20 | 5, | 49 |
| 47, | 67 | 7, | 23 | 1 | 8, | 94 | VJl | 48 |
Elementaranalyse: £ S Σ
Berechnet für
023H4207N8S..0f5 H2O:
023H4207N8S..0f5 H2O:
Gefunden: ' * .
b) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Met-Arg-Pro-NHC2H5
0,275 Gew.-Teile BOC-Met-Arg(NO2)-PrO-NHC2H5 werden in
einem Gemisch von 0,1 Raumteilen 2-Mercaptoäthanol und 5 Raumteilen Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird
30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann mit 0,085 Raumteilen 5,7N Salzsäure versetzt. Das Gemisch
wird gekühlt und mit 50 Raumteilen Äther versetzt. Die Fällung wird abfiltriert, mit Äther gewaschen, getrocknet,
in DMF gelöst und auf O0C gekühlt. Zur Lösung werden
0,318 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydrochlorid,
0,107 Gew.-Teile HONBI, 0,124 Gew.-Teile DCC und 0,17 Raumteile N-Äthylmorpholin gegeben. Das Gemisch .
wird 12 Stunden gerührt. Der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat unter vermin- j
dertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird in 5 Raum- j teilen 5$igem wässrigem Äthanol gelöst. Die Lösung wird !
auf eine Säule von Amberlite XAD-2 aufgegeben und in !
einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 5/^igem ;
bis 80^igem wässrigem Äthanol desorbiert. Die Hauptfrak- '*■
tionen werden gefriergetrocknet und getrocknet, wobei j 0,135 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Met-Arg- '
(NO2)-PrO-NHC2H5 erhalten werden. 0,1 Gew.-Teile dieses
Produkts werden in einem Gemisch von 0,02 Raumteilen j Anisol, 0,02 Raumteilen Äthanol, 0,02 Raumteilen 2-Mercaptoäthanol
und 6 Raumteilen Fluorwasserstoff gelöst. ] Die Lösung wird 1 Stunde bei 0 C gerührt. Der Fluorwasserstoff
wird unter vermindertem Druck abgedampft und d er ; Rückstand im Exsiccator getrocknet. Der: Rückstand wird !
in 20 Raumteilen Wasser gelöst und durch eine Säule von Amberlite CG-4OO (Acetatform) geleitet. Die aus der Säule
ablaufende Lösung wird gefriergetrocknet. Der Rückstand
309845/1153
232117Λ
wird in 20 Raumteilen Wasser gelöst. Zur Lösung werden 0,4 Raumteile Thioglykolsäure gegeben» Das Gemisch wird
10 Stunden bei 60°G stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wird mit 50 Raumteilen Wasser verdünnt, an einer Säule
von Carboxymethylcellulose adsorbiert und in einem EIutionssystem
von 0,005N bis 0,2N Ammoniumacetat desorbiert. Die Hauptfraktionen werden gefriergetrocknet, wobei 0,02
Gew.-Teile des rohen gewünschten Produkts erhalten werden. Das Produkt wird an einer Säule von Sephadex LH-20 adsorbiert
und mit 0,1N Essigsäure eluiert. Die eluierte Lösung
wird gefriergetrocknet, wobei das gereinigte Produkt erhalten wird. Dünnschichtc'hromatographie: Rf = 0,31 (Kieselgel·;
n-ButanolEssigsäure:Äthylacetat:Wasser = ' ■
1:1:1:1). ; '
/ä 7i3= -43,2° (c=25,5/ 5# Essigsäure).
U ~ D Arg 0,9(1);
Aminosäureanalyse: His O,9(i);/Trp 0,8(1); Ser 0,7(1),
GIu 0,9(1); Pro 1,1(1); GIy 1,0(1); Met 0,9(1); Tyr 0,7
(1); Äthylamin 0,9(1). Die Klammerzahlen sind die theoretischen Werte.
Versuch
Die Nonapeptidamidderivate gemäß der Erfindung wurden Ratten im Diöstrus subkutan verabreicht und auf ihre
ovulationsinduzierende Wirkung untersuchte Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.
309845/1153
0vulatlon3induzierende Wirkung "bei Ratten im Diöstrus
A1 A2 Y -■- ED5O(ng/1OO g
Körpergewicht)
NH-CH5 165,0
NH-CH2-CH5 32,0
NH-CH2-CH2-CH5 56,0
NH-CH2-CH2-OH 170,0
NH-CH(CH5)2 76,0
NH-CH2-CH5 53,6
NH-CH2-CH5 35·, 0
NH-CH2-CH5 84,0 NH-CH0-CH, ... . 115,0
Tyr Ieu GIy-NH2 215 + 12 ng
Natürliches Decapeptid.
| Tyr | Leu |
| Tyr | Leu |
| Tyr | Leu |
| Tyr | Leu |
| Tyr | Leu |
| Tyr | Nie |
| Tyr | Met |
| Phe | Leu |
| Phe | ILe |
0 9845/1153
Claims (12)
1)^Nonapeptidamiäderivate der allgemeinen Formel
L-Pyroglutamyl-L-Histidyl-L-Tryptophyl-L-Seryl-A-j-GIycy1-A2-L-Arginy1-L-Prο1iη-Υ
in der A1 für L-Tyrosyl oder L-Phenylalanyl, A2 für
L-Leucyl, L-Isöleucyl, L-Norleucyi, L-Valyl, L-Norva-IyI,
L-Methionyl oder L-Phenylalanyl und Y für NHR steht, worin R ein gegebenenfalls mit einer Hydroxylgruppe
substituierter geradkettiger oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 3 C-Atomen oder eine Pyrrolidinogruppe
ist, und pharmazeutisch unbedenkliche Salze dieser Nonapeptidamidderivate. '
2) Nonapeptidamidderivat nach Anspruch 1 mit der dort genannte Formel, in der A1 für L-Tyrosyl, A2 für L-Leucyl und '
I' für NHCH2CH3 steht. j
3) Nonapeptidamidderivat nach Anspruch 1 mit der dort j
genannten Formel, in der A1 für L-Tyrosyl, A2 für
L-Leucyl und Y für NHCH2CH2OH steht.
4-) Nonapeptidamidderivat' nach Anspruch 1 mit der dort
genannten Formel, in der A1 für L-Tyrosyl, A2 für
L-Leucyl und Y für NHCH3 steht.
5) Nonapeptidamidderivat nach Anspruch 1 mit der dort genannten Formel, in der A1 für L-Phenylalanyl, A2 für
L-Isoleucyl und Y für NHCH2CH3 steht.
6) Nonapeptidamidderivat nach Anspruch 1 mit der dort
genannten Formel, in der A1 für L-Tyrosyl, A2 für
L-Leucyl und Y für eine Pyrrolidinogruppe steht.
7) Nonapeptidamidderivat nach Anspruch 1 mit der dort
genannten Formel, in der A1 für L-Tyrosyl, A2 für
L-Leucyl und Y für N(CH3)2 steht.
309845/ 1153
8) Nonapeptidamidderivat nach Anspruch 1 mit der dort genannten Formel, in der A1 für L-Tyrosyl, A2 für
L-Leucyl und Y für NHCH(CH5J2 steht,
9) Nonapeptidamidderivat nach Anspruch 1 mit der dort genannten Formel, in der A. für L-Tyrosyl, A2 für
• L-Norleucyl und Y für NHCH2CH5 steht.
10) Nonapeptidamidderivat nach Anspruch 1 mit der dort
genannten Formel, in der A1 für L-Tyrosyl, A2 für
L-Methionyl und Y für NHCH2CH5 steht.
11) Nonapeptidamidderivat nach Anspruch 1 mit der. dort genannten Formel, in der A1 für L-Phenylalanyl, •
A2 für L-Le ucyl und Y für IiHCH2CH5 steht.
12)· Verfahren zur Herstellung von Nonapeptidamidderivaten
nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet,
daß man ein Reagens (A), nämlich L-Pyroglutaminsäure
oder ein Peptidfragment, das eine L-Pyroglutaminsäureeinheit an seinem N-endständigen -Teil enthält und anschließend daran aus der oben genannten Aminosäuresequenz
besteht, mit einem Reagens (B), nämlich' einer Aminkomponente , " · die dem restlichen Teil des
oben genannten, als Produkt gewünschten Nonapeptid-
kondensiert,
amidderivats entspricht,/wobei die beiden Reagentien
amidderivats entspricht,/wobei die beiden Reagentien
(A) und (B) wahlweise durch eine oder mehrere Schutzgruppen geschützt sein können, und die gegebenenfalls
vorhandenen Schutzgruppen entfernt.
3 0 9 8 4 5/1153
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