DE2202393A1

DE2202393A1 - Prosapogenine,Verfahren zu deren Herstellung sowie Arzneimittel,die diese Prosapogenine enthalten

Info

Publication number: DE2202393A1
Application number: DE19722202393
Authority: DE
Inventors: Ezio Bombardelli; Attilio Bonati; Bruno Gabetta
Original assignee: Dott Inverni & Della Beffa S P
Current assignee: Dott Inverni & Della Beffa S P
Priority date: 1971-01-21
Filing date: 1972-01-19
Publication date: 1972-09-28
Also published as: GB1380253A

Description

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Unsere Nr. 17 627

dott. Inverni & Delia Beffa S.p.A. Mailand / Italien

Prosapogenine» Verfahren zu deren Herstellung sowie Arzneimittel, die diese Prosapogenine enthalten.

Die Erfindung betrifft neue Prosapogenine, Verfahren zu deren Herstellung sowie Arzneimittel, die eines oder mehrere der neuen Prosagenine enthalten.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Produkt der partiellen Hydrolyse eines oder mehrerer Saponine von Ruscus aculeatus L. (lileacea) bereitgestellt, sowie auch Verbindungen, die aus diesen Hydrolyseprodukten isoliert werden können und die hier als "Prosapogenine" bezeichnet werden. Es werden vor allem solche Prosapogenine bereitgestellt, die einen Ruscogenin- oder Neoruscogeninkern enthalten, an dem insbesondere in der 1-ß-Stellung ein mono- oder polyglycosidischer Rest, insbesondere ein mono-, di oder triglycosidischer Rest gebunden ist.

Die Erfindung betrifft insbesondere Verbindungen einer der folgenden Strukturen:

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in denen die freie Valenz in 1-ß-Stellung durch einen mono- oder polyglycosidischen Rest, insbesondere durch einen mono-, di- oder triglycosidischen Rest abgesättigt

Es werden insbesondere Verbindungen der folgenden Formeln

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und

tie Komponenten bestimmter Prosapogenine der Erfindung darstellen, wobei R in diesen Formeln eine der Gruppen

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bedeutet, bereitgestellt.

Die Erfindung umfaßt ebenso Gemische, die eines oder mehrere der neuen erfindungsgemäßen Prosapogenine oder eine oder mehrere ihrer Komponenten allein oder in Verbindung mit beispielsweise dem entsprechenden Saponin oder den entsprechenden Saponinen, oder Ruscogenin oder Ruscogeninen enthalten.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen eine wertvolle pharmakologische Wirksamkeit und eignen sich zur Vorbeugung und Behandlung von Kreislaufstörungen. Die erfindungsgemäßen Prosapogenine sowie Gemische und Komponenten davon können auf oralem, rectalem oder parenteralem, z.B. subkutanem Wege entweder allein oder in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Excipientien verabreicht werden. Die Erfindung umfaßt auch- pharmazeutische Präparate, die eine oder mehrere erfindungsgemäße Verbindungen in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Streckmittel oder Trägerstoff enthalten.

Beispiele für geeignete Excipienten sind Wasser, Stärke, Magnesiumstearat, Laktose, Saccharose, oberflächenaktive Mittel wie Tween 20, Polißlycol 4000, Migliol 812, Witepol H 15, und hydroalkoholische Lösungsmittel. Die pharmazeutischen Präparate können zusätzlich nichtantipathetische, pharmazeutisch verträgliche wirksame Bestandteile außer den Prosapogeninen enthalten. Beispiele für derartige Bestandteile sind Rutin, Aescin und Vitamin C.

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Die erfindungsgemäßen Prosapogenine können durch partielle Hydrolyse der geeigneten Saponine (wobei die Saponine aus einem Extrakt von Ruscus aculeatus L. (liliacea^: gewonnen werden) hergestellt werden. Die vollständige Hydrolyse des Saponins führt zur Bildung des entsprechenden Sapogenins (Ruscogenins) und die einzelnen Prosapogenine, die vorstehend beschrieben wurden, sind Zwischenprodukte, die noch einen mono-, di- oder triglycosidischen Rest enthalten.

Es wurde nun gefunden, daß die Hydrolyse der aus Ruscus aculeatus gewonnenen Saponine unter geeigneten Bedingungen in der Prosapogenin-Stufe zum Stillstand gebrach"¹; werden kann, wobei praktisch keine Ruscogenine gebildet werden. Diese kontrollierte Hydrolyse wird vorzugsweise in enzymatischen Verfahren durchgeführt; eine chemische Hydrolyse ist zwar möglich, jedoch liefert sie aufgrund der Bildung von beträchtlichen Mengen an Ruscogeninen nicht so gute Ergebnisse. Zur Durchführung der enzymatischen Hydrolyse werden die Saponine vorzugsweise in Wasser oder einem Gemisch aus Wasser und einem Lösungsmittel wie Alkohol, Aceton oder Dioxan gelöst oder suspendiert. Es wurde auch gefunden, daß die Hydrolyse in Gegenwart eines oder mehrerer der vorgenannten Lösungsmittel und eines nicht mischbaren Lösungsmittels wie Äthylacetat, das die sich bildenden Prosapogenine löst, durchgeführt werden kann.

Die Lösung oder Suspension kann also mit einer reinen ß-Glycosidase (beispielsweise ß-Glucosidase) oder mit einem Enzymkomplex mit ß-glycosidasischer (beispielsweise ß-glucosidasischer) Wirksamkeit wie Cellulase,

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Taka-Diastase oder Ciarase behandelt werden. Die Hydro lyse wird vorzugsweise bei einem pH-Wert zwischen k und 8 und ei
geführt.

8 und einer Temperatur im Bereich von 20 bis 60 C durchEs wurde gefunden, daß im allgemeinen weniger als 2k Stunden ausreichen, um die Hydrolyse der Saponine zu Prosapogeninen vollständig durchzuführen, und daß mit Enzymgemischen bessere Ergebnisse erzielt werden als mit einer reinen ß-Glycosidase (beispielsweise einer reinen ß-Glucosidase). Der Verlauf der Hydrolyse kann durch Chromatographieren von Proben der Lösung der Saponine, die periodisch entnommen werden, verfolgt werden und die Reaktion wird zweckmäßigerweise dann abgebrochen wenn die den Saponinen entsprechenden Flecke verschwunden sind.

Die zu verwendende Menge an Enzymen hängt von deren enzymatischer Wirkung ab, die unter anderem von der Art des verwendeten Enzyms oder Enzymgemischs abhängt. Aufgrund der schlechten Löslichkeit in Wasser können die gebildeten Prosapogenine im Laufe der Hydrolyse ausgefällt werden (insbesondere dann, wenn die Hydrolyse in Wasser stattfindet).

Die Prosapogenine können entweder durch Filtration oder durch Extraktion mit einem Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch, das mit Wasser nicht oder nur teilweise mischbar ist, wie beispielsweise Äthylacetat, Butyl- und Amylalkohole oder ein Gemisch aus Chloroform und Alkohol, abgetrennt werden. Im Falle der Filtration können die rohen Prosapoginene nach dem Filtrieren ge-

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waschen und getrocknet werden, während im Falle der Lösungsmittelextraktion das die rohen Prosapogenine enthaltende Lösungsmittel mit einer alkalischen Lösung gewaschen, anschließend entweder zur Trockne oder auf ein kleines Volumen eingedampft und mit einem geeigneten Lösungsmittel (beispielsweise Ä'thyläther, Isopropyläther oder Aceton) verdünnt werden kann.

Die rohen Prosapogenine werden gewöhnlich als ein braunes amorphes Pulver isoliert.

Die Zusammensetzung dieser rohen Prosapogenine ist ziemlich komplex: neben einem Hauptprodukt sind gewöhnlich einige weitere ProsaDogenine in beträchtlicher Menge und darüber hinaus weitere in nur sehr kleinen Mensen vorhanden.

Pi,«?,. 1 der Zeichnungen zeigt Kopien von Chromatogrammen von Proben roher Prosapogeningemische, worin die Trennung von Prosapogenin-Bestandteilen, die mit den Abkürzungen R3, R¹I, P5, R6, R7, R8 und R9 bezeichnet sind, dargestellt ist.

Dts angewendete chromatographische Verfahren wurde wie folgt durchgeführt:

Absorptionsmittel: Silicagel

Eluierungsmittel : Äthylacetat-Äthanol-Wasser im

Verhältnis 100 : 13,5 : 10

Entwicklungsmittel: Sehwefelsäure-Essipsäure-Anisaldehyd

im Volumenverhältnis 1 : 100 : 1

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Da das Prosapogenin R6 (hier auch als Desglucoruscin bezeichnet) im allgemeinen das am reichlichsten auftretende Produkt der partiellen Hydrolyse zu sein scheint, kann es als Bezugssubstanz für analytische Kontrolluntersuchungen verwendet werden: ein rohes Prosapogeningemisch kann also 10 bis 25 % Prosapogenin R6 enthalten. Die rohen Prosapogenine können als Rohmaterial für die Gewinnung von teilweise reinen Prosapogeninen (Prosapogenin R6 > 50 %) zur Herstellung einer Reihe von reinen Prosapogeninen und auch eines Rohmaterials, aus dem die Komponenten der einzelnen Prosapogenine isoliert werden können, verwendet werden. Zur Gewinnung von teilweise reinen Prosapogeninen wird das Gemisch von rohen Prosapogeninen zur Reinigung bei einer Temperatur von 30 bis 50 C in Wasser gelöst, und diese Lösung wird mit einem Gemisch aus 2 oder 3 Volumen Chloroform und 1 bis 1,5 Volumen Alkohol ebenfalls bei einer Temneratur von 30 bis 50 C extrahiert. Nach partieller Eindampfung des Extraktionslösungsmittels und anschließender Verdünnung mit einem geeigneten Lösungsmittel wie beispielsweise Äthyläther, Isopropylather oder Acetor wird ein gelb-braunee amorphes Pulver erhalten, das in Wasser schlecht löslich ist, in Alkoholen, Dimethylsulf-

oxid und Dimethylformamid löslich ist und in Äthern, Chloroform, Aceton und Äthylacetat praktisch unlöslich ist. Das Pulver enthält mindestens 50 % Prosapogenin R6.

Zur Herstellung von im wesentlichen reinen Prosapogeninen kann ein Gemisch entweder aus rohen Prosapogeninen oder aus teilweise gereinigten Prosapogeninen als Rohmaterial verwendet werden. Die reinen Produkte können durch SSulonchromatographie «-«der durch direkte Kristallisation

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erhalten werden.

Die besten Ergebnisse werden durch Chromatograph! Trennung an Silicagel oder Aluminiumoxid erhalten. Eine direkte Kristallisation kann in der Regel nur mit Prosapogeninen durchgeführt werden, die einen hohen Gehalt an Prosapogenin R6 aufweisen, so daß in der Praxis nur reines Prosapogenin R6 mit diesem Verfahren erhalten werden kann. Dagegen können mit der Säulenchromatographie auch die anderen Prosapogenine erhalter werden.

Gemische wie Äthylacetat/Wasser/Methanol; Äthylacetat/ Alkohol/Wasser oder Chloroform/Methanol/Wasser 65:35:3.0 können als Lösungsmittel für die chromatographische Trennung verwendet werden. Die Menge an Silicagel oder Aluminiumoxid entspricht vorzugsweise dem 10- bis 40-fachen Gewicht der chromatographisch zu trennenden rohen oder gereinigten Prosapogeninen.

Die Prosapogenine R6, R9, R^ und R3 sind in reinem Zustand erhalten worden, und alle diese Produkte besitzen die gemeinsame Eigenschaft, daß sie nicht homogen sindj sondern aus einem Gemisch aus zwei Glycosiden, nämlich dem des Ruscogenins und dem des Neoruscogenins, bestehen. Diese Tatsache bestätigt die Entdeckungen von Sannie und Lapin (Bull. Soc Chim. France 1237, 1957) im Falle des "Ruscogenin", das durch vollständige Hydrolyse der Saponine von Ruscus erhalten wurde, und das auch kein homogenes Produkt ist, sondern ein Gemisch aus Ruscogenin und Neoruscogenin, deren prozentuale

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- ίο -

Anteile je nach der Art der zur Herstellung verwendeten Ruscus-Rhizome verschieden sind.

Prosapogenin R6 (Desglucoruscin)

Desglucoruscin kann als weißes Pulver erhalten werden, das in Wasser, Äthern, chlorierten Lösungsmitteln, Aceton und Äthylacetat unlöslich und in Alkoholen, Pyridin, Dimcthylsulphoxid und Dimethylformamid löslich ist.

Die Untersuchung des I.R.Spektrums zeigt eine intensive Bande bei 919 cm und eine schwächere bei 898 cm ; da die Bande bei 919 cm für Neoruscogenin und die bei 898 cm für Ruscogenin charakteristisch ist, ergibt sich, daß Desglucoruscin aus einem Gemisch aus zwei Glycosiden besteht, wobei als Aglycone in dem einen Fall Meoruscogenin und in dem anderen Fall Ruscogenin vorliegen.

Der glycosidische Teil von Desglucoruacin besteht aus einem Rhamnoserest und einem Arabinoserest.

Desglucoruscin ist daher ein Gemisch aus

a) l-O-CL-Rhamnopyranosyl-d^i-L-arabinopyranosyl (1)]-spirosta-5(6), 25(27)-dien-lß,3ß-diol (I)

b) l-0-[L-Rhamnopyranosyl-(l->2)-L-ar>ahinopyranosyl (1)}-spirost-5(6)-en-lß, 3ß-diol (II)

Die reine Komponente I wurde durch Verseifung, ihres Acetylderivates hergestellt, das wiederum durch Acetylicrung von Desglucoruscin und anschließende Trennung

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- li -

der Acetylderivate der Komponenten I und II durch wiederholte Kristallisation aus Isopropyläther und durch Chromatographie an 20 % Silbernitrat enthaltenem SiIicagel erhalten wurde. Die Komponente I kristallisiert aus Methanol, schmilzt bei 25¹J⁰C und besitzt ein spezifisches Drehvermögen von -7^,5° (c = 1,92, Methanol).

Pmsapogenin RQ (auch "Desglucodesrhamnoruscin" genannt)

Die Eigenschaften dieses Prosapogenins sind praktisch identisch mit denen des Desglucoruscins, was die physikalischen Eirenschaften und die Löslichkeit anbetrifft.

Desglucodesrhamnoruscin enthält einen einzigen glycosidischen Rest, nämlich ein Arabinosemolekül; es kann daher als mit Desglucoruscin identisch angesehen werden, wobei jedoch der Rhamnoserest fehlt.

Es wurde gefunden, daß das Desglucnruscin durch Erhitzen

des mit Essigsäure fast vollständig in DesglucfTrhamnoruscin umgewandelt wird. Das Desglucodesrhamnoruscin besteht daher aus einem Gemisch aus zwei Glycosiden mit den folgenden Formeln:

a) l-0-[L-Arnbinopyranosyl-(l)]-spirosta-5(6),25(27)-dien-lß, 3ß-diol (III)

b) l-0-[L-Arabinopyranosyl-(l)3-spirost-5(6)-en-lß, 3ß-diol (IV)

Die reine Komponente III wurde durch Verseifung ihres Acetylderivites hergestellt, das wiederum durch Acety-

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lierung von Desglucodesrhamnoruscin und anschließende Trennung der Acetylderivate der Komponente III und IV durch wiederholte Kristallisation aus Isopropyläther und durch Chromatographie an 20 % Silbernitrat enthaltendem Silicagel erhalten wurde. Die Komponente III kristallisiert aus Methanol, schmilzt bei 236 - 240 C und besitzt ein spezifisches Drehvermögen von -79»0 (c = 0,5,Äthanol).

Prosapogenin R^ (auch "Ruscin" genannt)

Ruscin kann als weißes Pulver erhalten werden, das die gleichen Lösungseigenschaften hat wie Desglucoruscin und Desglucodesrhamnoruscin.

Ruscogenin und Neoruscogenin, Glucose, Rhamnose und Arabinose werden durch Säurehydrolyse aus Ruscin erhalten. Es besteht aus einem Gemisch aus:

a) l-0-[D-Glucopyranosyl-(l->3)-L-rhamnopyranosyl-(l-^>2)-L-arabinopyranosyl(l)]-spirosta-5(6), 25(27)-ddenlß, 3ß-diol (V)

b) l-O-CD-Glucopyranosyi-il-^-L-rhamnopyranosyl-d-^)-L-arabinopyranosyl(l)]-spirost-5(6)-en-lß, 3ß-diol (VI)

Die reine Komponente V wurde durch Verseifung ihres Acetylderivates hergestellt, das wiederum durch Acetylierung von Desglucodesrhamnoruscin und anschließende Trennung der Acetylderivate der Komponenten V und VI durch wiederholte Kristallisation aus Isopropyläther und durch Chromatographie an 20 % Silbernitrat enthaltendem Silicagel erhalten wurde. Die Komponente V

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kristallisiert aus Methanol, schmilzt bei 215 C und besitzt ein spezifischen Drehvermögen von -72,1 (c = O,5,Äthanol).

Prosapogenin R5

Die Eigenschaften ('es Prosapogenin R5 entsprechen denen der vorstehend beschriebenen Prosapogenine.

Durch Säurehydrolyse werden daraus Ruscogenin und Neoruscogenin erhalten.

Prosapogenin R5

Prosapogenin R3 kann als weißes Pulver erhalten werden, das in Alkohol und Wasser löslich und in Sther und Chloroform unlöslich ist. Es wird durch Kristallisation aus Isonropanoi gereinigt; Schmelzpunkt = 200 C (Zers-), Ca]₁,-70,115° (c = !,Methanol).

Ruscogenin und Meoruscogenin können durch Säurehydrolyse erhalten werden.

Die Strukturformeln der Verbindungen I, III und V lassen sich folgendermaßen darstellen:

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Produkt Γ

R =

OH

HO -0

ι I

ι ι

HO OH

Produkt III R = o—

OH

o—

Produkt V

R = KOH ^N

VL/

	CH,	,OHi	I
	y		οΉ
(	OH	)
P	vL	-/
4		I
HO	I
	OH

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Die Strukturformeln der vorstehend genannten Verbindung-II, IV und VI können wie folgt dargestellt werden:

Produkt II

R =

Produkt IV

R =

o—

0 0

ι ι HG O

HO

'OH

OH

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Produkt VI

R =

OH

ΗΡ,Γ-0

	CjH₂	I	ι
ι	h	OH '	ι OH
J	OH	-ol
(		)
I >		/
I		-ί
I		ι
HO	L..

OH

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Die nachstehenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

30 kg zerriebene Rhizome von Ruscus aculeatus wurden mit 300 1 70 %igem Äthanol bei seinem Siedepunkt extrahiert.

Die vereinigten alkoholischen Extrakte wurden solange eingedampft, bis der Alkohol völlig entfernt war; die die Saponine enthaltende wäßrige Lösung wurde zur Entfernung der Harz- und Fettsubstanzen mit 100 1 Chloroform extrahiert.

Nach Abtrennung des Chloroforms wurde die wäßrige Lösung unter Vakuum konzentriert, um das organische Lösungsmittel völlig zu entfernen; dann wurden 150 g eines Enzymge-. misches (z. B. Cellulase oder Taka-Diastase) bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 5,5 und einer Temperatur von 40 °C zugesetzt. Die enzymatische Hydrolyse war nach etwa 18 Stunden abgeschlossen. Während der Hydrolyse wurden die Prosapogenine ausgefällt. Der Niederschlag wurde filtriert und gründlich mit Wasser gewaschen; dabei wurden etwa 1,2 kg rohe Prosapogenine in Form eines amorphen braunen Pulvers erhalten.

Beispiel 2

30 kg zerriebene Rhizome von Ruscus aculeatus wurden mit 300 1 70 %igem Alkohol bei seinem Siedepunkt extrahiert.

Nachdem der Alkohol aus den vereinigten Extrakten unter Vakuum abgedampft worden war, wurde die wäßrige Lösung bei einer Temperatur von 45-50 C und einem pH-Wert von 4,5 bis 5,5 mit 200 g eines Gemisches von Enzymen mit ß-glykosidasischer Wirkung, wie z. B. Cellulase, versetzt. Nach etwa 20 Stunden wurde Alkali zugesetzt, um den pH-Wert auf 11 zu erhöhen, und die Extraktion wurde mit 300 1 Butanol durchgeführt. Der Butanolextrakt wurde mit einer ge-

sättigtem Natriumchloridlösung gewaschen, die ausgefällten Salze wurden abfiltriert, und das Filtrat wurde auf etwa 10 1 eingedampft. Dann wurde das Filtrat unter kräftigem Rühren in 50 1 Isopropyläther gegossen. Es wurden 1,5 kg rohe Prosapogenine mit einem Gehalt von etwa 20 % Prosapogenin R6 erhalten.

Beispiel 3

1 kg rohe Prosapogenine (mit einem Gehalt von 20 % Prosapogenin R6) wurden bei 40 C in 20 1 Wasser gelöst; die Lösung wurde dreimal mit gleichen Volumen eines Gemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis von 2,8 : 1 extrahiert. Die Chloroformlösung wurde auf 5 1 eingedampft und in 15 1 Isopropyläther gegossen; dabei wurden 500 g teilweise gereinigte Prosapogenine mit einem Gehalt von mindestens 50 % Prosapogenin R6 erhalten.

Beispiel 4

400 g rohe Prosapogenine (mit einem Gehalt von etwa 20 % Prosapogenin R6) wurden an 10 kg Silicagel chromatographiert, wobei als Elutionsmittel ein Gemisch aus mit Wasser gesättigtem Äthylacetat und Methanol im Volumenverhältnis von 99,5 : 0,5 verwandt wurde.

Dabei wurden nach Kristallisieren aus Alkohol neben geringeren Mengen an Prosapogenin R7 und Prosapogenin R8 16 g Prosapogenin R9, 55 g Prosapogenin R6, 6 g Prosapogenin R5 und 3,2 g Prosapogenin R 4 erhalten.

Beispiel 5
K> ^K

O 400 g teilweise gereinigte Prosapogenine (mit einem Gehalt

von etwa 50 % Prosapogenin R6) wurden an 6,5 kg SiHeagel chromatographiert, wobei als Elutionsmittel ο in G aus Äthylacetat, Äthanol und Wasser im Verhältnis von 100 13,5 : 10 oder ein Gemisch aus Chloroform, Methanol und Wasser im Verhältnis von 65 : 35 : 10 verwandt wurde.

Dabei wurden nach Kristallisieren aus Alkohol neben geringen Mengen an Prosapogenin R7 und Prosapogenin R8 19 g Prosapogenin R9 , 180 g Prosapogenin R6 , 18 g Prosapogenin R5 und 10 g Prosapogenin R4 erhalten.

Beispiel 6

100 mg Prosapogenin R6 wurden in 10 ml Eisessig gelöst. Mach etwa einstündigem Erhitzen auf 90 C war praktisch völlige Umwandlung zu Prosapogenin R9 erfolgt, das durch Verdünnen mit einem gleichen Volumen Wasser und Extrahieren mit ButanoJ isoliert wurde. Nachdem der Butanolextrakt mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen und zu einem kleinen Volumen konzentriert worden war, kristallisierten 50 mg reines Prosapogenin R9 aus.

Beispiel 7

100 g teilweise gereinigte Prosapogenine (mit einem Gehalt von 50 % Prosapogenin R6) wurden in 10 Volumenteilen eines Gemisches aus mit Wasser gesättigtem Äthylacetat und Methanol im Verhältnis von 99,5 : 0,5 gelöst. Nachdem die Lösung ■ibür Nacht stehengelassen worden war, wurden 40 g Prosapogenin R6 mit einer Reinheit von etwa 90 % erhalten; durch anschließendes Kristallisieren aus 5 Volumenteilen 40 %igem Alkohol wurden 30 g reines Prosapogenin R6 erhalten.

Beispiel 8

15 g Prosapogenin R6 wurden in 50 ml Pyridin gelöst. Dann wurden 15 ml Essigsäureanhydrid zugesetzt, und das Gemisch wui'de 24 Stunden lang bei Raumtemperatur stehengelassen.

_o Dann wurde das Gemisch in Eiswasser gegossen und mit Äther *° extrahiert. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der oo

*■» Rückstand sechsmal aus Isopropyläther kristallisiert. Das •n^ Acetylderivat von I, das auf diese Weise in reinem Zustan 1 ^ erhalten wurde, wurde mit Pottasche in Methanol verseift und ■*■* 1 Stunde lang unter Rückfluß erhitzt. Nachdem das erhaltene Produkt mit Essigsäure neutralisiert worden war, wurde os

auf ein geringes Volumen eingedampft. Nachdem es über Nacht stehengelassen worden war, wurde das reine Produkt I abfiltriert.

Beispiel 9

5 g Acetylderivate des Prosapogenins R6 wurden an 200 Teilen Silicagel, das 20 % Silbernitrat enthielt, chromatopraphiort.

Dur^ch Elution mit Benzol/Äthylacctat im Verhältnis von 8 : wir es möglich, Fraktionen zu erhalten, die einen besonders hohoη Gehalt an Produkt (I) aufwiesen. Aus diesen Fraktionen wurden nach Abdampfen des Lösungsmittels und zweimaligem Kristallisieren aus Isopropyläther 2 g des reinen Produkts I erhalten.

Beispiel 10

10 kg zerriebene Rhizome von Ruscus aculeatus wurden mit 100 1 70 %igem wäßrigen Äthanol bei seinem Siedepunkt extrahiert .

Die vereinigten alkoholischen Extrakte wurden unter Vakuum auf 20 1 eingedampft. Das Konzentrat wurde, mit 4 0 1 Hexan "entfettet". Dann wurden 5 1 Äthylacetat und anschließend 5OgCeIIuIuSe zugesetzt. Die enzymatische Hydrolyse wurde bei 37 C bei einen pH-Wert zwischen 6 und 7 durchgeführt.

Nach 24 Stunden waren die Saponine völlig zu..Prosapogeninen

in Äthylacetat umgewandelt worden. Auf Grund ihrer Löslichkeit-s'lag der größte Teil der Prosapogenine in der organischen Phase vor.

K> Die organische Lösung wurde abgetrennt, und die wäßrige

_<o Lösung wurde weitere 4 Mal mit jeweils 1 1 Äthylacetat

extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte-wurden

O mit einer 5 %igen Natriumcarbonatlösung gewaschen und dann

_* auf 0,b i einredrimpft. Das auf diese V/eise erhaltene Kcn-

zentrat wurde in 3 1 Isopr^opylather gegossen. Es wurden

*** 300 / rohu Pros .ipogenine mit einem Gehalt von etwa 30 %

? r c ^r, = ρ opi-. η i η P (-.· e rh alten.

BAD ORIGINAL

Pharmakologische Daten

Die pharmakologischen Eigenschaften der teilweise gereinigten Prosapogenine (mit einem Gehalt an 50 % Desglucoruscin) werden mit den nachstehenden Versuchen gezeigt:

der teilweise gereinigten Prosapogenine

Die teilweise gereinigten Prosapogenine wurden Mäusen und Ratten oral und intraperitoneal verabreicht. Die LD₅₀ (diejenige Dosis in mg/kg Körpergewicht, die erforderlich ist, um die Hälfte der Versuchstiere zu töten) wird in der nachstehenden Tabelle wiedergegeben.

Versuchstier

Verabreichungsart

in mg/kg

Maus	oral	> 3000	- 202)
Maus	intraperitoneal	245 (296
Ratte	oral	> 3000	- 189)
Ratte	intraperitoneal	210 (233

Hemmung von durch Carrageenin induzierten Ödemen

Dosis Anzahl Ödeme ödemin mg/kg der Ver- ml ± S.E. hemmung (1) suchs- (2) in % tiere

Kontrollversuche	25	10	0	,30	ί 0	,007	33
Teilweise gerei nigte Prosapoge nine	50	10	0	,20	ί 0	,oio^x	66
	10	0	,10	± 0	,005^X

unterscheidet sich merklich (p<0,05) von den mittleren Werten, die bei den Kontrollversuchen (nach dem Student ¹S-"t"-Test)erhalten wurden.

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(1) zweimal intraperitoneal verabreichte Dosen: 30 Minuten vor und 1 Stunde nach subplantarer.Carrageenin-Injektion (0,1 ml einer 1 %igen Suspension). 2202393

(2) Mittlerer Umfang der Ödeme, gemessen 3 Stunden nach der Carrageenin-Injektion, d. h. zu der Zeit, als der Umfang der Ödeme bei den KontrOlltieren am größten war.

Hemmung von durch Bierhefe induzierten Ödemen

Dosen • in mg/kg (1)

Anzahl
der Versuchstiere

Ödeme

ml ± S.E.

(2)

Ödemhemmung in %

Kontroll- VCrsuche	-	10	0	,35	± 0	,01	22
Teilweise ge reinigte Pro- s ipogenine	25	10	0	,27	ί 0	,01^X	31
	50	10	0	,24	t 0	_}008^X

unterscheidet sich merklich (p<0,05) von den mittleren Werten, die bei den Kontrollversuchen nach dem Student ¹S- ^!It"-Test erhalten wurden.

(1) Dosen, die 30 Minuten vor der subplantaren Injektion mit Bierhefe (0,1 ml einer 2 %igen Suspension) ir.traperitoneal verabreicht wurden.

(2) Mittlerer Umfang der Ödeme, gemessen 1 Stunde nach der Injektion mit Bierhefe, d. h. zu der Zeit, als der Umfang der Ödeme bei den Kontrolltieren am größten war.

Die vorstehend genannten Werte zeigen, daß teilweise gereinigte Prosapogenine eine niedrige Toxizität und eine gute entzündungshemmende Wirksamkeit aufweisen.

Die hier beschriebenen Prosapogenine lassen sich klinisch zur Verhinderung und Behandlung von Kreislaufstörungen verwenden. Wie vorstehend erwähnt, lassen sie sich allein oder in Kombination mit einem oder mehreren geeigneten pharmazeutisch verträglichen Produkten oral, rektal oder lokal, d.h. örtlich, verabreichen. Sie lassen sich auch injizieren. Gewöhnlich beträgt die mittlere tägliche orale Dosis 20 ~ 100 mg reines Prosapogenin oder die doppelte Menge an teilweise gereinigten Prosapogeninen (mit einem Gehalt von 50 % Desglucoruscin).

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Eine zu oraler Verabreichung geeignete Dosierungseinheit kann zweckmäßigerwoise 5 bis 100 mg reines Prosapogenin enthalten und kann bis viermal täglich verabreicht werden.

Eine geeignete Dosierung zur Verabreichung durch Injektion beträft 20-50 mg ein- oder zweimal täglich; bei
Verabreichung auf rektalem We«? beträgt eine geeignete Tagesdosis 1-3 Suppositorien, die ,ie 50-100 mg reine
Prosapogenine enthalten; im Falle von teilweise gereinigten Prosanogeninen (mit einem Gehalt von 50 « Desglucoruscin) kann die doppelte Dosis verwendet werden. Zur lokalen Behandlung werden im allgemeinen Salben
und Gele verwendet, die 1-3 % reine Prosapogenine oder die doppelte Konzentration an bis zu 50 % teilweise
gereinigten Prosapogeninen enthalten.

Die nachstehenden Formulierungen zeigen Beispiele von Präparaten, die als Wirkstoff nur die erfindungsgemäßen Prosapogenine enthalten un^ Beispiele für PrSp ar-ate, die darüber hinaus andere Wirkstoffe enthalten:

Tabletten

- Desglucoruscin 40 mg

- Streckmittel (Stärke, Magnesiumstearat, Laktose)

q. s. bis 250 mg

Tabletten

- teilweise gereinigte Prnsapngenine 'LOO r.g

- Rutin 25 mg

- Streckmittel (Stärke, Laktose, ilagnesiumsbearat,
Zucker) a.s. bis... 350 mg

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- teilweise ~ereinip;te Prosaponenine 3 r;

- Escin 1 [T

- Streckmittel (Polyrlycol 4000, Tween 20) und Wasser

q. s. bis 100 g

Suppositorien

- Desf'luco^esrhamnoruscin 75 mg

- Streckmittel (Mißli^l 812, Witenol H 15)

α. s. bis 1,4 (^

Tropfen

- Rusc in 1 ρ,

- Vftanin C 1 ρ

- Hydroalkoholisches Lösunnsmitte]

q. s. his 100 ml

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BAO ORIGINAL

Claims

Patentansprüche:

Prosapogenine als Produkt der partiellen Hydrolyse eines Sapnnins oder eines Gemischs aus Saponinen von Ruscus aculeatus.

2. Prosapofmnine nach Anspruch 1 als Produkt der

enzymatischen
partiellenVHydrolyse eines Saponins oder eines Gemischs aus Saponinen von Ruscus aculeatus.

3. Prosapogenin R3 nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch das Chromatogramm gemäß Figur 1 der Zeichnung.

k. Prosapogenin RiJ (Ruscin) nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch das Chromaton;ramm gemäß Figur 1 der Zeichnung.

5. Prosapogenin R5 nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch das nhromatogramm gemäß Figur 1 der Zeichnung.

6. Prosapogenin R6 (Desglucoruscin) nach Anspruch oder 2, gekennzeichnet durch das Ohromatogramm gemäß Figur 1 der Zeichnung.

7. Prosapogenin R7 nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch das Chromatogramm gemäß Figur 1 der Zeichnung.

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8. Prosapogenin R8 nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch das Chromatogramm gemäß Figur 1 der Zeichnung.

9. Prosanogenin R9 (Desglucodesrhamnoruscin nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch das Chrornatorramm gemäß Figur 1 der Zeichnung.

IC. Prosapogenin R^ (Ruscin) enthaltend ein Gemisch aus l-0-[P-Glucnpyranos,yl)-(l-^3)-L-rhamnopyranosyl-(1*2)-L-arabinopyranosyl (1 )]-spirosta-5 (6) ,25(27 )-dienlß, 3ß-diol und l-O-fD-Glucopyranosyl- (l->3)-L-rhamnopyranosyl-(l-^2)-L-arabinopyrjanosyl(l)'J-spirost-5(6)-enlß, 3ß-diol.

11. Prosapogenin R6 (Desglucoruscin) enthaltend ein Gemisch aus 1-0-£L-Rhamnopyranosyl- (l->2 )-L-arabinopyranosyl(l)]-spirosta-5(6),25(27)-dien-lß, 3ß-diol und l-O-fL-Rhamnopyranosyl- (1r^>2 )-L-arabinopyranosyl( 1 )]-spirost-5(6)-en-lß, 3ß-diol.

12. Prosapogenin R9 (Desglucodesrhamnoruscin) enthaltend ein Gemisch aus I~0-[L-Arabinipyranosyl-(1)J-spirosta-^ci(6),25(27)-dien-lß, 3ß-diol und 1-0-[L-Arabinopyranosyl-(l)3-spirost-5(6)-en-lß, 3ß-diol.

13. Prosapogeninkomponente, bestehend aus einer Verbindung der Formel

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ocier

in R eine -Tor Γοΐ rennen Gruppen darstellt

0-

O¹H

HO

,CH₇

HO

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BAD ORfGINAL

lh. ProsapoKeningemisch, erhalten durch partielle Hydrolyse eines Saponins oder eines Gemisches aus Saponinen von Ruscus aculeatus und gegebenenfalls durch weitere Konzentration des erhaltenen Produkts.

15. Prosariogeningemisch nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens 50 Gew.-% Prosapogenin R6 enthält.

16. Verfahren zur Herstellung eines Prosapogenins oder einen Gemischs aus Prosapogeninen oder einer Komponente eines Prosapogenins dadurch gekennzeichnet, daß man ein oder mehrere Saponine von Ruscus aculeatus einer partiellen Hydrolyse unterwirft und ein Prosapogenin enthaltendes Gemisch erhält.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man eine enzymische Hydrolyse anwendet.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymische Hydrolyse in Gegenwart eines Enzyms oder eines Gemischs aus Enzymen oder einem Enzymkomplex mit ß-glycosidasischer Wirkung durchführt.

19. Verfahren nach Anspruch l8, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym, das Gemisch aus Enzymen oder der Enzymkomplex ß-glucosidasische Wirkung aufweisen.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man ein oder mehrere Prosapogenine durch fraktionierte Kristallisation oder durch chromatographische Trennung isoliert.

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21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die chromatographische Trennung an Silicagel oder Aluminiumoxid durchgeführt wird, wobei 10 bis 40 Gewichtsteile Silicagel oder Aluminiumoxid pro Gewichtsteil Prosapogenine, die chromatographisch getrennt werden, verwendet werden.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß ein Äthylacetat/Wasser/Methanol-Gemisch, ein Äthylacetat /Äthanol/Wasser-Gemisch oder ein Chloroform/Methanol/Wasser-Gemisch als chromatographisches Lösungsmittel verwendet wird.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Isolieren einer Komponente eines Gemische aus einem 1-Glycosid von Spirostn-5(6), 25(27)-dien-lß, 3ß-diol und einem 1-Glycosid von Spirosta-5(6)-en-lß, 3ß-diol das Gemisch acetyliert, die ncetylierten Glycoside durch fraktionierte Kristallisation oder durch Chromatographieren trennt und das Acetylderivat der gewünschten Komponente hydrolysiert.

2k. Pharmazeutisches Präparat enthaltend ein Prosapogenin oder ein Gemisch aus Prosapogeninen oder eine Komponente eines Prosapogenins nach einem der Ansprüche 1 bis 15 im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten.

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25. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 2¹J, in Einheitsdosierungsform zur oralen Verabreichung, enthaltend 5 bis 100 mg des Prosapogenins oder des Gemischs aus Prosapogeninen oder der Komponenten eines Prosapogenins.

26. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 2¹I, in Einheitsdosierungsform zur rektalen Verabreichung enthaltend 50 bis 100 mg des Prosapogenins, des Gemischs aus Prosapοgeninen oder der Komponenten des Prosapogenins.

27· Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 2¹I, in Form einer injizierbaren Lösung oder Suspension.

28. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 2¹I, in zur lokalen Anwendung geeigneter Form, enthaltend 1 bis 3 % des Prosapogenins, des Gemischs aus Prosapogeninen oder der Komponenten des Prosapogenins.

Für: dott. Inverni & Delia Beffa S.p.A. Mailand / Itaflien

(Dr.H.J.Wolff) Recht sanv/alt

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