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DE2035814A1 - Neue Pleuromutihn Derivate und Ver fahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Neue Pleuromutihn Derivate und Ver fahren zu ihrer Herstellung

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DE2035814A1
DE2035814A1 DE19702035814 DE2035814A DE2035814A1 DE 2035814 A1 DE2035814 A1 DE 2035814A1 DE 19702035814 DE19702035814 DE 19702035814 DE 2035814 A DE2035814 A DE 2035814A DE 2035814 A1 DE2035814 A1 DE 2035814A1
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DE
Germany
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nrrl
clitopilus
formula
species
new
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Application number
DE19702035814
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DE2035814C3 (de
DE2035814B2 (de
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Franz Worgl Brand! Ernst Dr Kundl Tirol Knauseder (Osterreich) C07c 69 02
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Sandoz GmbH
Original Assignee
Biochemie GmbH
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Publication of DE2035814B2 publication Critical patent/DE2035814B2/de
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/02—Esters of acyclic saturated monocarboxylic acids having the carboxyl group bound to an acyclic carbon atom or to hydrogen
    • C07C69/12—Acetic acid esters
    • C07C69/16—Acetic acid esters of dihydroxylic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P15/00—Preparation of compounds containing at least three condensed carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2603/00—Systems containing at least three condensed rings
    • C07C2603/56—Ring systems containing bridged rings
    • C07C2603/58—Ring systems containing bridged rings containing three rings
    • C07C2603/76—Ring systems containing bridged rings containing three rings containing at least one ring with more than six ring members
    • C07C2603/80—Ring systems containing bridged rings containing three rings containing at least one ring with more than six ring members containing eight-membered rings
    • C07C2603/82—Ring systems containing bridged rings containing three rings containing at least one ring with more than six ring members containing eight-membered rings having three condensed rings with in total fourteen carbon atoms and having a having a [5.4.3.0(1,8)] ring structure, e.g. pleuromutiline
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description

Biochemie Ges.m.b.H. Wien / Österreich
Patentanwälte Dr, W. Schalk, Dipl.-lng. P. Wir* Dipl.-tng. G. Dannenberg Dr. V. Scnmied-Kowarzilc Dr. P. WeinhoW, Dr. D. Gudel Frankfurt/M., Gr. Eschenheimer Str.
Case 970-9609
Neue Pleuromutilin-Derivate und Verfahren zu ihrer Herstellung
Die Erfindung betrifft neue Pleuromutilin-Derivate der Formel I,
OH
worin R für eine
^ 2 )7-CIi=CH-(CH2)7-COO-i CH-(CH2)^-CH-CH-Ch2-CH=CH-(CH2)7-C00-ClU-(CH2I-CH=CH-(CH2 J7-COO- Gruppe
oder für Wasserstoff steht*
sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.
Das erfindungsgemasse Verfahren ist dadurch gekennzeichnetγ dass man
a) zur Herstellung von Verbindungen der Formel ί, worin R obige Bedeutung besitzt, einen Organismus der Spezies Clitopilus passeckerianus (Pil.) Sing. (NRRL JJIOO) bzw. dessen Variante (NRRL 3279), der Spezies
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O*
Clitopilus prunulus (Soop. ex Fr.) , ....
Kummer (NRRL 3473) sowie der Spezies Clitopilus pinsitus (Fr.) ss. Romagn. Joss. (NRRL 3W) bzw. deren Varianten oder Mutanten in einer wässrigen* eine Stickstoff und eine KohlenstoffqueHe enthaltenden Nährlösung züchtet oder
b) zur Herstellung von l4-Desoxy-l4-acetoxymutilin der Formel Ia
Ia
Mutilin mit Hilfe eines Organismus der Spezies Clitopilus passeckerianus (Pil.) Sing» (NKRL 3100) bzw, dessen Variante (NRRL 3279)» der Spezies Clitopilus prunulus (Scop, ex Fr.) Kummer (NRRL 3*173) sowie der Spezies Clitopilus pinsitus (Fr.) ss. Romagn., Joss«, (NRRL 3474) bzw„-deren. Varianten oder Mutanten oder mit Enzymextrakten bzw. Trofckenmycelen dieser Mikroorganismen in einer wässrigen, eine Stickstoff- und eine Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährlösung enzymatisch acetyliert«
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Die erfindungsgemäss verwendeten Mikroorganismen gehören zur Familie Tricholomataceae, der Ordnung Agricales und Klasse Basidlomycetes. Kulturen dieser Organismen sind bei der Fermentations Division of the Horthern Regional Research Laboratories (NRRL), Peoria, Illinois, unter den oben angegebenen Nummern hinterlegt. · .
Die in Verfahrensvariante a) beschriebene Fermentation erfolgt üblicherweise nach dem Submersverfahen, wenn gleich auch die Anwendung des Oberfliichenverfahrens möglich ist. Als Kohlenstoffquellen sind Zucker, insbesondere Glucose, Lactose oder Stärke, und aln Stickstoffquellen anorganische oder organische Stickstoffverbindungen, wie Natriumnitrat, AmmoniumGulfat, Hefeautolysat oder Cornsteepliquor, brauchbar. Diese decken in ihren unreinen Formen gleichzeitig den üblichen Mineralstoffbedarf. Der Fermentationsverlauf ist bezüglich pll-Aenderung, Sauerstoffaufnähme, NährstoffUmsatz und Bildung der gewünschten Produkte mit einer Penicillinfermentation vergleichbar. Gärtemperaturen zwischen 25 und 280C führen unter gutem Wachstum zu hohen Ausbeuten. Zusätze von Maisöl, Sonnenblumenöl, Olivenöl, Spermöl und anderen Oelen tierischer und pflanzlicher Herkunft in Mengen zwischen 0,05 % und 5 % stimulieren die Bildung der erfindungsgemässen Pleuromutilinderivate. Die Fermentationsdauer hängt entscheidend von den angewendeten Bedingungen ab. Normalerweise liegt sie bei 3-5 Tagen', sie kann jedoch auch darunter oder darüber liegen. Die gewünschten Produkte werden teils in das umgebende Medium abgeschieden, teils auch in den Zellen akkumuliert. Ihre Isolierung kann daher aus dem Kulturfiltrat und/oder aus dem abgetrennten, gegebenenfalls getrockneten, Mycel erfolgen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der in Verfahrensvariante a) beschriebenen Fermentation besteht darin, dass man den Mikroorganismus der Spezies Clitopilus passeckerianus (Pil.) Sing.
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(NRRL 3100) zuerst in einer Vorkultur, die als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, Malzextrakt und ferner Bohnenmehl, Hefeextrakt j, Agar, Pepton sowie Mineralsalze enthält, züchtet und den dabei erhaltenen Fermentationsbrei anschliessend zur weiteren Züchtung in eine Fermentationslösung einträgt, die als Kohlehydratquelle. Glucose und als Stickstoffquelle Bierhefeautolysat sowie Mineralsalze enthält. Der dabei erhaltene Fermentationsbrei wird gegebenenfalls erneut in eine Fermentationslösung der letztgenannten Art zur weiteren Züchtung eingetragen. Nach beendeter Züchtung werden die so erhaltenen Pleuromutilinderivate in bekannter Weise isoliert. Gegebenenfalls erfolgt eine Auftrennung des Substanzgemisches in ein PlauromutiHnfettsäureestergernisch und das 14-Desoxyl^-acetoxymutilin.
Eine weitere Ausführungsform der obigen VerfahrensVariante a) kann jedoch auch darin bestehen, dass man eine analog zu oben gezüchtete Vorkultur in eine Fermentationslösung einbringt, die als Kohlenstoffquelle Glucose und als Stickstoffquelle Presshefeautolysat sowie Mineralsalze enthält. Der dabei erhaltene Mycelbrei wird erneut in eine Fermentationslösung obiger Art überführt. Nach Beendigung dieser Züchtung bringt man den so gewonnenen Fermentationsbrei schliesslich in eine v/eitere Fermentationslösung, die als Kohlenstoffquelle Glucose und als Stickstoffquelle Sojabohnen-Stickstoff sowie Mineralsalze enthält. Nach Beendigung dieser letzten Züchtung wird das dabei erhaltene Substänzgeraisch in bekannter Weise isoliert, wobei eine zu dem erstgenannten Verfahren analoge Aufarbeitung erfolgen kann.
Bei der enzymatischen Acetylierung von Mutilin zu l^-Desoxyl4-acetoxymutilin gemäss VerfahrensVariante b) kann als Enzymträger das durch Submers- oder Oberflächenverfahren gewonnene Mycel der Mikroorganismen dienen. Trockenmycel oder Enzymextrak-
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te der beschriebenen Fungi können jedoch ebenfalls verwendet · werden. Die Umwandlungsrate ist von der angebotenen Belüftung abhängig. Für grosse Umwandlungsraten*liegt die Substratkonzentration beispielsweise zwischen 0,5 und 5,0 g Mutilin pro Liter. Die Acetylierung erfolgt mit Vorteil in einem gepufferten Medium bei pH-Werten zwischen 4/5 und 8,0 unter Zusatz einer Kohlstoffquelle und guter Belüftung. Als Kohlenstoffquelle kommen Zucker, wie Glucose oder Lactose, in Frage. Es lassen sich jedoch auch Maisöl, Spermöl, Sonnenblumenöl, Oelsäuremethyl* ester, Palniitinsäure, Glycerin, Aethanol oder Aminosäuren verwenden. Die Konzentrationen hierfür liegen beispielsweise zwischen 0,5 und 5 $· Durch Zusatz von Cu-Ionen in geringer Konzentration, vorzugsweise 10 ppm, wird die Acetylierung stimuliert. - .. ■;■■■■.. , V / -
Eine bevorzugte Ausführungsform der obigen enzymatischem Acetylierung von Mutilin zu l^-Desoxy-lty-acetoxymutilin besteht darin, dass man die gemäss der Verfahrensvarianten a) erhaltene Vorkultur des Mikroorganismus NRRL 5IOO von Clitopilus passekkerianus in eine Fermentationslösung bringt, die als Kohlenstoffquelle Glucose und als Stickstoffquelle Presshefeautolysat sowie-Mineralsalze enthält. Der dabei erhaltene Mycelbrei wird in einer Fermentationslösung, die unter anderem Cornsteepliquor. und Spermöl enthält, gezüchtet und die so gev;onnene Züchtung endlich in einem Replacementmedium suspendiert, das mit Phosphat gepuffert ist und Maisöl als KohlenstoffquelIe enthält. Die Substratkonzentration beträgt hierbei J5 g Mutilin pro Liter Kultur. Die Aufarbeitung der Ansätze zu dem gewünschten ΐΛ-pesoxy-14-acetoxymutilin, welches nach 48-stündiger Belüftung in hoher Ausbeute erhalten wird, erfolgt in bekannter Weise.
Die Struktur der erfindunsgemäss hergestellten Pleuromutll-In->: fettsäureester ist durch UV- und IR-Spektren,. Abbaureakt.ione.n,; Papier-, Dünnschicht- und Gaschromatographie gesichert. Die
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;··..: ,;: . l'i : 20358U
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Dünnschichtchromatographie der durch Umesterung der Pleurorautilinfettsäureester erhaltenen .Fettsäuremethylester ergibt auf ΑςΝΟ -imorägnierten Kieselgelplatten, auf denen eine Trennung der verschiedenen Isomeren möglich ist, den Hinweis auf Oelsäure, Linolsäure und Gadoleinsäure, Die Struktur des l4~Desoxy-l4-aeetoxymutilins ist durch IR-Spektren, Abbaureaktionen und Synthese von Pleuromutilin ausgehend gesichert,,
Die erfindungsgemäss erhaltenen Pleurcmtitilin-Derivate stellen wertvolle Antibiotika dar und bilden einen hervorragenden Zusatz zu Fertigfuttermischungen. Infolge der geringen Dosierung irn Fertigfutter und wegen ihrer schlechten Resorption im tierischen Organismus besteht beim Verzehr damit behandelter Tiere keine Gefahr einer Resistenzentwicklung von Krankheitserregern im Menschen. Ausserdem werden die erfindungsgemässen Pleuromutilin-Derivate nicht im Humanb.er.eich eingesetzt, so dass die dort üblichen Antibiotika.ihre volle Wirksamkeit behalten«
Die zu verabreichende Dosis an Pleuromutilin-Derivaten der Formel I beträgt für Geflügel zweckmässigerweise 2,5 bis 90 mg pro kg Fertigfuttermischung. Für Schweine liegt die entsprechende Dosis bei 10 bis I80 mg pro kg Fertigfuttermischung. Bei Kälbern und Mastrindern sollen die Verbin- ' düngen der Formel I in solchen Dosen verfüttert werden, dass vom Tier täglich etwa·25 bis 120 rag Wirkstoff aufgenommen werden.
Die erfindungsgemäss hergestellten Pleuromutilin-Derivate . zeigen ferner eine günstige Wirkung gegen tierpathogene Keime, so dass sie in der Tierheilkunde verwendet werden können.
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·· imi
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Beispiel 1: Fermeritatton ■ V .■■'."-
Zvrel Kulturen von Clltopilus paseeGkerianus (MRHL 3IOO) auf Agar-Nährböden werden mit steriler, physiologischer Kochsalz» lösung -abgesp.ült, worauf man mit je > ml der erhaltenen Suspension jeweils 60 ml steriler Fermentationsn&hrlösung beimpft, die sich in zwei 500 ml Erlenmeyer-HeithalefcQlben befinden.
Nährboden_fÜr_Schrägagar£
Bohnenmehl * 10,0 g
PO4 0,5 β
FeCl, (1 ^ige Lösung) 1,0 ml
Hefeextrakt 0*1 g
Malzextrakt 50,0 g
Pepton 1,0 g
Agar 15,0 g
mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen;, natürliches pH.
FermentationsnUhrlösung
Glucose 50,0 g/l
Bierhefeautolysat-Stickstoff 1,0 g/l
KH2PO4 1,0 g/l
MgSO4 . 7 H2O 0,5 g/l
Ca(H05)2 0,5 g/1
NaCl 0,1 g/l
f ■·;. FeSO4 . 7 H2O 0,05g/l
mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen; pH vor der.Sterilisation: 6,0
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: 2Q358H
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- 8 - 970-96Ό9
Nach 120 Stunden Fermentation bei 250C auf einer Rundschüttelmaehine mit ^O nun Hub und 250 U/min wird der Inhalt der zwei 500 ml-Erlenmeyer-WeithalSkolben dickt?r-eiig. Je 10 ml davon werden zur Beimpfung von zehn 2 Liter Erlenmeyer-Vfeithalskolben verwendet, die mit je 200 ml der obigen sterilen Fermentationsnährlösung gefüllt sind. Die Bebrütung erfolgt unter denselben Bedingungen wie bei der Heranführung der Vorstufe, Nach 72 Stunden wird mit dem in den zehn 2 Liter Erlenmeyerkolben enthaltenen Fermentationsbrei (jeder Kolben enthält 200 ml) ein mit 40 Liter obiger steriler Fermentationsnährlösung gefülltes Fermentationsgefäss beimpft, das mit den Einrichtungen für eine Subroersfermentation nach dem Schikanensystem ausgestattet ist. Man fermentiert 120 Stunden bei 25°C unter Rühren und Belüften, worauf der dickbreiige Inhalt in einen grb'Gsq,ren Fermenter überführt wird, der mit 1^0 Liter der gleichen sterilen nährlösung versehen ist* Als Schaumbekärnpfungsmittel wird vorzugsweise Spermöl eingesetzt. Nach 72-sfciindigem Rühren und Lüften bei einem Gegendruck von 0,8 atü wird die Fermentation abgebrochen. Das Erntegut ,wird über eine Druckfilternutsche abgepresst und der Mycelkuchen in einem Hordentrockner bei ca* ^0° G getrocknet. Auf diese Weise erhält man 5,8 kg Trockenmycel, aus dem später die gewünschten Substanzen isoliert werden»
Beispiel 2; Fermentation
Von einer auf gebrochenem Mais herangeführten Kultur von Clitopilus passeckerianus (NRRL 31X50) wird das Mycel mit steriler, physiologischer Kochsalzlösung abgespült. Mit je 5 ml der erhaltenen Suspension werden H St"ck 500 ml-Erlenmeyer-WeithaJs-olben beimpft, die mit je 50 ml folgender steriler Fermentationsnährlösuhg beschickt sind.
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IMI tit·'··' " --- -.
/ .·Ί i 2Ό358Τ4
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Presshefeautolysat-Stickstoff .1,5 g/l
Glucose 30*0 g/l
Dextrin 10,0 g/l
4,0 g/l SO4 5,0 g/l
mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen} pH vor der Sterilisation: 6,0
Die Kolben werden 100 Stunden auf einer Längsschüttelmaschine mit'lO cm Ausladung und 90 Bewegungen pro Minute bei 25° C geschüttelt, worauf mit dem Inhalt je 6 Stück 2 Liter Erlenmeyerlcolben beimpft v;erden, die mit je 400 ml der gleichen sterilen Fermentationsnährlösung beschickt sind. Nach 36-stündigem Schütteln unter den obigen Bedingungen wird der erhaltene Mycelbrei in ein 100 Liter fassendes Submersgefäss überführt, das 50 Liter folgender steriler Fermentationsnährlösung enthält:
Sojabohnen-Stickstoff 2,0 g/l
Rohrzucker 20,0 g/l
Glucose 20,0 g/l
mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllenj pH vor der Sterilisation: 6,5
CaCO, (getrennt sterilisiert) 5j0 g/l
Nach 120-stündiger Fermentation wird mit dem Inhalt dieses Gefässes ein Subraerstank beimpft, der 1000 Liter der letztgenannten Fermentationsnährlösung enthält. Es wird 96 h belüftet und gerührt.(0,5 Liter Luft/Liter Nährlösung/min> Umdrehungen/min.). Als Schaumbekämpfungsmittel v;ird vorzugsweise Spermöl eingesetzt. Nach einem anfänglichen Absinken des pH-Wertes auf 5,5 steigt dieser nach 48 Stunden auf 6,8 an, hat nach 72 Stunden einen Wert von 6,5 und e,r■,-.-.:icht Ferment at ionsande ?.o. Das Myceitfewichi !«,;.. :^t : 3
■ ■ -■ 10 98 08 /22 3S^ - ' '
* β β θ ο ft ff
• * O · β »β
ίο - ■ 970-9609
18 g/1. Da3 Myeel wird über einen Saugzellenrundfilter abfiltrlert und in einem Hordentrockner bei ca. ^O01C getrocknet. Auf diese Weise erhält man 19,3 kg getrocknetes Mycel, welches 'den Hauptanteil der gewünschten biologisch aktiven Verbindungen, enthält.
Beispiel 3; Enzymatische Acetylierung von Mutilin zu 14-Des6xyl4-acetoxymutilln
Mit einer auf gebrochenem Mais herangeführten Kultur von Glitopilus passeckerianus (NRRL 3IOO) werden 120 mieder in Beispiel 2 genannten Fermentationsnährlösung in einem 500 ml Erlenmeyerkolben beimpft und 72 Std. bei 24° C unter guter Belüftung ge- . schüttelt«, Mit dieser. Impf gutstufe werden 20 Stück 500 ml Erlenmeyerkolben beschickt, v/elche mit je 50 ml folgender Nährlösung gefüllt sind:
N als Cornsteep solids 1,2 g/l
Glucose " 50,0 g/l
MgSO4 . 7 H2O ' ■ ' 2,0 g/l
mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllenj pH vor der Sterilisation: 6,0
Die auf dieser Nährlösung bei 2^°C und guter Belüftung während 72 Stunden herangeführte Hauptstufe wird steril über Glasfilternutschen abgesaugt und das Mycel jedes Kolbens in je 50 ml Replaceraentmedium suspendiert, das aus Phosphatpuffer mit pH-rWeft 6,5 (0,066 molar) und einer Kohlenstoff quelle besteht. Als ' "; Kohlenstoffquelle wird Maisöl in einer Konzentration von 2 % verwendet» Die Substratkonzentration beträgt 3 g Mutilin pro Liter Kultur. Nach %8-stündiger Belüftung der Ansätze bei 24°C ist das eingesetzte Mutilin zu 95 % in l^-Desoxy-l^-acetoxymutilin umgewandelt. ■
Ί0 910 8/22 3 8
- η - 970-9609
Beispiel 'U- Isolierung von !'f-Desoxy-l't-acetoxymutilin, gebildet durch enzytnatische Acetylierung von h'utilin im Replacement verfahren,
Der Inhalt von 5 Kolben (ca. 230 ml), die (entsprechend Beispiel 2) zu 95 ίβ acetyliertes Mutilin enthalten, wird homogenisiert und dreimal mit je 115 ml Essigsäureäthylester extrahiert. Die vereinigten und entwässerten Extrakte werden mit 0,5 Gew-J« Aktivkohle behändeIt, auf ca. 5 ml im Vakuum eingeengt, mit 15 ml Diisopropyläther versetzt und in den Eisschrank gestellt. Kurz darauf fällt das lJ}-I}esoxy-l4-acetoxynjutilin in kristalliner Form aus. Es wird anschliesEend zweimal umkristallisiert. Die Ausbeute beträgt .-'1Ol mg Kristallisat mit einem Smp. von l8j$°c (unkorr.).
BeinnIeI 5: Isolierung der ungesättigten Pleuromutilinfettsäureester und des l^-Dssox.v-l^-ncetQxymutilins.
1 kg Trockenmyeel, hergestellt gemüss Beispiel 1 oder 2, v/ird fünfmal mit je 5 Liter 60 fßigem Methanol extrahiert, worauf man den Methanolextrakt zweimal mit je 2,5 Liter Petroläther entfettet. Nach Entwässern und weitgehenden Einengen der Petroliitherphase v/ird der dickflÜESige Rückstand über 10 Stufen zwischen S5^igem Methanol und Petroläther (Verhältnis 1 : 1) verteilt. Die 3. bis 8. Stufe enthält die Pleurömutilinfettsäureester, die 9. und 10. Stufe das iV-Desoxy-l'i-aoetoximutilin. Die 5. bis 8. Stufe wird vereinigt, entwässert, soweit als möglich eingeengt, mit der 10-fachen Menge Hexan Versetzt Λ gekühlt und von ausgeschiedenem Material abfiltriert. Nach abermaligem Einengen bleibt ein gelbes, dickflüssiges OeI zurück. Dieses v/ird in DiisopropylätheT aufgenoraien und mit 10 Gew.-jC Aktivkohle behandelt. Hierbei erhalt man ein dünnschichtchromatographisch reines Gemisch der verschiedenenFettsäureester des Pleuromutilins. Die Ausbeute beträgt 5,3g.
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- 12 - . 97O-9ÖO9
Um Näheres über die prozentuelle Zusammensetzungzu erfahren, wird 1 g des Substanzgemisches in 20 ml Petroiäther gelöst, mit 10 ml methanolischer Kalilauge überschlchtet- und eine Stunde unter ständigem Schütteln und Lichtausschluss bei -5°C gehalten. Die Petrolätherphase wird mit 1 $ - iger Salzsäure sowie mit Wasser gewaschen und getrocknet, worauf man die Methylester der jeweiligen Fettsäuren erhält. Ein Teil der Methylester wird gaschromatographisch analysiert, wobei sich folgende Zusammensetzung ergibt:
40 - 45 Jo Qelsäuremethy!ester
45 - 50 % Linolsäuremethy!ester
ca. 5 cf> Gadoleinsäuremethylester
200 mg Estergemisch v/erden in 20 ml Ecsigester mit 2,0 g Palladiumkohle hydriert. Die Wacserstoffaufnahme kommt bereits nach 30 Minuten zum Stillstand. Eine IR-Aufnahmc der hydrierten Ester zeigt, dass die Verbindungen durchhydriert sind. Die Ester werden anschließend gespalten und die entstandenen Säuren papierchrornatographisch untersucht. Das Gemisch besteht zu über 90 % aus einer C^g- Säure, der Rest aus einer C20- Säure.
Das bei der Umesterung der Fettsäureester entstandene Pleuromutllln wird aus der Methanolphase isoliert und mit einem durch Fermentation gewonnenen Material im Smp., IR und UV verglichen. Die Verbindungen sind identisch. Auch liefert eine alkalische Verseifung in jedem Fall Mutilin.
Die 9· und 10. Stufe der Verteilung, welche das 14-Desoxy-l4-acetoxymutilin enthält, wird entwässert und im Vakuum stark eingeengt. Die weitere Reinigung erfolgt durch Chromatographie an einer Kieselgelsäule. Das Verhältnis von aufgegebenem Material zu Adsorbens beträgt 1: 100. Man eluiert mit Chloroform
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und erhält nach Einengen der aktiven. Fraktionen und Zugabe von Diisopropylather die gewünschte-Verbindung in kristalliner Form. Sie wird zweimalaus Diisopropyläther umkrlstallisiert und getrocknet. Ausbeute:1^23 g mit einem Smp. vcn 1830C (unkorr.).
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Claims (4)

  1. 20358U
    970-9609
    Patentansprüche
    / 4. j Verfahren zur Herstellung neuer Pleurorautilin-Derivate der V / Formel I, ' -
    CH3 -CH3 0-C-CH0-H ^CH=CH2 S r ι
    CH,     ί ■
    OH
    worin B für eine CH3-(OTg)7-CHsCH-(CHg)^TCOO-,
    -(CH2I9-CHsCH-(PHg)7-COO- Gruppe
    oder für Wasserstoff''steht» dadurch gekennzeichnet, dass man
    a) $ur Eisest ellung von Verbindungen; 49F F©ctb®1 I, worin R obige B®de«tung besitzt ^ sin@n Organisiaus - der Spezies CXitöpilus paasecfcerianus (PiIo) Sipg«, .(MOTIi 3100) bzw β dessen Variante (WBHIL 3279 }a ü®r Speaies .. ■ ■
    Clitopilus prunulus (Scop, ex Er.)
    Ku:nmsr (NRRL 3^73) sowie der Spezies Clitopilus pinsitua (l?r.) ss. Romägn. Joss. (NRRL JhJh) bzw. deren Varianten oder Mutanten in einer wässrigen, eine Stickstoff und eine Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährlösung züchtet oder
    b) zur Herstellung von l^-Desoxy-l^l-aeetoxymutilin der Formel Ia
    O-C-CH-
    Ia
    CH=CH,
    Mutilin mit Hilfe tines Organismus der Spesits Clitopilus passeckerianus (Pil.) Sing. (NRRL 3100) bzw. dessen Variante (NRRL 3279}* der Spesies Clitopilus prunulus (Sccp. ex Fr.) Kummer (NRRL 3*73) sowie der Spezies Clitopilus plftsitus (Fr.) es; Hoeagn, Joss. (MBRL 3474) bzw. deren Varianten oder Mutanten oder mit Enzynextrakten bzw. Trokkenmycelen dieser Mikroorganismen in einer wässrigen, eine Stickstoff- und eine Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährlösung enzymatisch acetyliert.
    109808/223$
    20-358 U
    970-9609 Deutschland
  2. 2. Neue Pleuromutilin-Derivate der Formel I,
    O CH
    O I
    0-C-CH0-R ι c-
    .-CH=CH,
    worin R für eine
    -COO-,
    3- (CH2) ^-CH=CIIrClTg-CH=CH-CH5-(CH2) -GH=CH-(CH2J7-COO- Gruppe
    oder für Wasserstoff steht«
  3. 3. Tierarzneimittel enthaltend mindestens ein neues Pleuronutilin-Deriyat der Formel I. .
  4. 4. Futtermittelzusatz enthaltend mindestens ein neues Pleuromutilin-Derivat der Formel I.
    109808/2236
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