DE2011811C

DE2011811C - Verfahren zur Herstellung eines zell wandlosenden Enzyms

Info

Publication number: DE2011811C
Application number: DE19702011811
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Sayama Okazaki (Japan)
Original assignee: Chugai Seiyaku K K , Iizuka, Hiro shi, Tokio
Priority date: 1969-03-12
Filing date: 1970-03-12
Publication date: 1973-04-19

Description

In letzter Zeit wurden großtechnische Verfahren zur Hefe- und Chlorellaherstellung entwickelt. Es wurde versucht, diese Mikroorganismen als Nahrungsmittel oder Futter zu verwenden. Bei der praktischen Verwendung dieser Mikroorganismen ergeben sich jedoch viele Probleme wegen ihrer schweren Verdaulichkeit.

Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung Iytischer, von Mikroorganismen produzierter Enzyme bekannt. In der USA.-Patentschrift 3 124 517 ist ein Verfahren zur Herstellung eines in den Sporen von Bacillus cereus ATCC 14893 enthaltenen lytischen Enzyms beschrieben, das auf bestimmte Bäkterienarten wirkt. Aus der britischen Patentschrift 1 132 678 ist ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen aus der Kulturbrühe von Stämmen der Gattung Flavobacterium bekannt. Diese Enzyme wirken abbauend auf Zellen von Mikroorganismen. Ein Verfahren zur Herstellung eines lysierend wirkenden Enzymkomplexes aus der Kulturbrühe von Cytophaga NCIB 9497 ist in der belgischen Patentschrift 664 444 beschrieben. Schließlich ist aus der französischen Patentschrift 1 333 739 ein Verfahren zum Lösen von Zellwänden von Hefen mittels einer von Mikroorganismen wie z. B. von Trichoderma viridae produzierten extrazellulären /f-Glucanase bekannt. Es ist jedoch wünschenswert, ein Enzym mit höherer Aktivität als die der bekannten Enzyme herzustellen, das auch stabile Zellwände von Mikroorganismen wirksam zu lösen vermag.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines zellwandlösenden Enzyms zu schaffen, um durch den Abbau der Zellwände von Mikroorganismen die Zellinhaltsstoffe leichter zugänglich zu machen. Die Zellwände von z. B. Chlorella sind besondersstabil und können nur auf mechanischem Wege zerstört werden. Die Erfindung beruht auf dem Befund, daß der Mikroorganismus Micropolyspora sp. ATCC 21 489 in der Gärmaischc bei aerober Züchtung ein zellwandlösendes Enzym anreichert.

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung eines zellwandlösenden Enzyms durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus bei hierfür üblichen pH-Wert-Verhältnissen und durch Gewinnung des Enzyms aus dem Fermentationsmedium, das dadurch geken..zeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Micropolyspora sp. ATCC 21 489 in einem flüssigen Nährmedium üblicher Zusammensetzung, das jedoch als Hauptkohlenstoffquellen solche mit einem verhältnismäßig hohen Polymerisationsgrad enthält, bei einer Temperatur von 40 bis 60⁰C einsetzt, das Myzel vom Fermentationsmedium abtrennt und das in der Fermentationsflüssigkeit enthaltene Enzym nach üblichen Methoden gewinnt.

Der Stamm Micropolyspora sp. ATCC 21 489 hat folgende taxonomischen Eigenschaften:

ίο A. Morphologische Eigenschaften

1. Luftmyzel

Ungefähr 0,7 bis 1,0 μ Durchmesser, verzweigt und mäßig am Nährboden haftend, weiß.

2. Substratmyzel

Etwas dünner als das Luftmyzel, ungefähr 0,5 bis 0,7 μ Durchmesser. Es neigt dazu, in den Agai-Nährboden einzudringen.
3. Bildung von lcuppelförmigen Körpern

Häufig wird eine Aggregation von kleinen, kuppe! förmigen Körpern auf der Oberfläche des Agar-Nährbodens beobachtet.
4. Sporen

Sphärisch oder oval, ungefähr 0,8 bis 1,0 μ Durchmesser, hauptsächliche Bildung direkt seitlich dos Myzels. Manchmal werden einzelne Sporen bcobach-

tet. Hauptsächlich treten aber Ketten von 2 bis 10 Sporen auf. Die Ketten sind gerade, Spiralketten werden nicht beobachtet. Die Sporenketten sind verhältnismäßig einfach in einzelne Sporen zu trennen. Bei der Züchtung in Schüttelkultur werden keine Ketten beobach-

tet, die mehr als 2 bis 3 Sporen enthalten. Bei des Keimung der Sporen wird die Bildung von 1 bis 2 Sporenröhren aus einer Spore beobachtet.

5. Myzelspaltung

Bei Plattenzüchtung nicht beobachtet, aber Myzclbruchstücke von 5 bis 20 μ treten oft bei der Herstellung des Abstrichs auf.

6. Zusammensetzung der Zellwand

Nach Hydrolyse der Zellwand mit 6 n-HCl wurde papierchromatographisch festgestellt, daß sie mesorv-Diaminopimelinsäure, Arabinose und Galactose enthält. In der Literatur ist beschrieben, daß die Mikroorganismen der Gattung Micropolyspora dicselbe Zusammensetzung wie oben aufweisen.

B. Physiologische Eigenschaften

1. Saccharose-Nitrat-Agar Kein Wachstum.

2. Glucose-Asparagin-Agar Kein Wachstum.

3. Glycerin-Asparagin-Agar

Mäßiges Wachstum, Bildung von engen Schichten an der Oberfläche des Nährbodens, Subslratmyzcl blaßbraun, Luftmyzel weiß.

4. Bouillon-Agar

Gutes Wachstum, Luflmyzel weiß, Substratmyzel blaßbraun, kein lösliches Pigment, der Nährboden weist eine pulvrige Oberfläche auf.

5. Gelatine-Agar

Leichtes Wachstum an der Oberfläche des Nährbodens nach 4 Tagen bei 50° C, am 2. Tag kann keine Verflüssigung der Gelatine festgestellt werden jedoch wird am 4. Tag eine mäßige Verflüssigung beobachtet.

6. Bennet-Medium

Gutes Wachstum, Luftmyzel weiß, Substratmyzel blaßbraun, lösliches Pigment schwachbraun.

7. Stärke-Agär mit anorganischen Salzen

Kein Wachstum nach 4 Tagen bei 5O⁰C keine Stärkeverflüssigung.

8. Stärke-Rinderpepton-Agar

Gutes Wachstum, Luftmyzel weiß, Substratmyzel blaßgelbbraun, lösliches Pigment blaßbraun, die Stärke ist nach 2 Tagen bei 50° C vollständig hydrolysiert.

9. Dextrin-Casein-Agar

(lutes Wachstum, Luftmyze! gelbweiß, lösliches Pigment schwachgelbbraun.

10. Nitrat-Medium

Dünnes, filmartiges Wachstum, Luftmyzel weiß, Ni rat wird nicht reduziert.

11. Lackmus-Milch

Wachstum mit Ringbildung, Peptomsierung wird iv.vch 2 Tagen bei 50⁰C beobachtet.

12. Kartoffelscheiben
Kein Wachstum.·

13. Cellulose-Asparagin-Medium
Kein Wachstum, Cellulose wird nicht zersetzt.
14. Cellulose-Dextrin-Casein-Medium

Mäßiges und kolonienartiges Wachstum, Luftmyzel weiß, es wird fast keine Zersetzung der Cellulose beobachtet.

C. Wachstumstemperatur

Auf einem Agar-Nährboden wird bei 30⁰C kein Wachstum, bei 37" C schwaches Wachstum, bei 40 bis 45° C mäßiges Wachstum, bei 45 bis 55° C gutes Wachstum, bei 55 bis 6O⁰C mäßiges Wachstum mit schlechter Haftung des Luftmyzel j und bei 65° C schlechtes Wachstum beobachtet.

D. Hiztebeständigkeit der Sporen

Bei einer lOminutigen Hitzebehandlung bei 100°C werden die Sporen nicht vernichtet. Bei Extraktion der Sporen mit heißem 80%igem Äthanol stellt man die Anwesenheit von 2,6-Pyridindicarbonsäure fest. Dies wird bei bekannten Mikroorganismen der Gattung Micropolyspora nicht festgestellt.

Wie oben beschrieben, ist der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus hauptsachlich durch seine Morphologie charakterisiert. Einzelne Sporen oder Sporenketten bilden sich sowohl am Luft- als'auch am Substratmyzel. Die Sporenketten werden reichlich gebildet und sind stabil. Die mikroskopische Beobachtung des Abstrichs der Myzelien zeigt eine deutliche Zerstörung derselben. Die Zusammensetzung der Zellwand des Mikroorganismus ist identisch mit der des Mikroorganismus Micropolyspora brcvicatena, der im Jahre 1961 als neue Art beschrieben wurde. Der erfindungsgemaß verwendete Mikroorganismus ist auch in vielen physiologischen Eigenschaften dem Mikroorganismus Micropolyspora brevicatena, aber er unterscheidet sich darin, daß Micropolyspora brt-vicatena auf Bouillon-Agar schlechtes Wachstam zeigt und außerdem bei einer Temperatur von 50° C nicht wächst.

Das im Verfahren der Erfindung verwendete Nährmedium enthält geeignete Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und organische Nährstoffe. Die Hauptkohlenstoffquellen sind Polymere mit einem verhältnismäßig hohen Polymerisationsgrad, wie Stärke, Dextran, Dextrin oder Inulin. Zucker mit einem niederen Polymerisationsgrad, wie Monosaccharide, oder Disaccharide, sind nicht geeignet. Als Stickstoffquellen können Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat oder Ammoniumnitrat verwendet werden. Die anorganischen Salze werden dem Nährmedium zugesetzt, um verschiedene für das Wachstum des Mikroorganismus essentielle Elemente zu liefern. Es kann eine geeignete Mischung verschiedener Phosphate. Kaliumsalze, Magnesiumsalze, Kupfersalze. Eisensalze, Mangansalze und Zinksalze verwendet werden. Dem Medium werden organische Nährstoffe zugesetzt, um Substanzen, wie Vitamine oder Aminosäuren, die zum Wachstum des Mikroorganismus notwendig sind, bereitzustellen. Zu diesem Zweck wird z. B. Hefe- oder Malzextrakt verwendet.

Wie oben beschrieben, kann als Nährmedium zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung eines der verschiedenen Gemische der genannten Nährstoffe verwendet werden. Das Nährmedium kann aber auch aus den essentiellen anorganischen Salzen und Zellen bzw. Zelltrümmern bestimmter Hefen, Chlorella, Pilze oder Bakterien, die gegenüber dem erfindungsgemaß hergestellten zellwandlösenden Enzym empfindlich sind, bestehen. Im letzteren Fall dienen die Zellen bzw. Zelltrümmer als Hauptkohlenstoffquellen und Stickstoffquellen, und sie liefern organische Nährstoffe. Ferner kann man diesem Nährmedium noch Hefe- oder Malzextrakt als weitere Quelle für organische NährstolTe zusetzen.

Bei Züchtungsbeginn wird die Kultur von Micropolyspora sp. ATCC 21489 im allgemeinen mittels einer Platinöse aus einem Schrägröhrchen in sterilisiertem Wasser suspendiert. Mit dieser Anzuchtsuspension wird ein Nährmedium der oben beschriebenen Art angeimpft und üblicherweise 16 bis 48 Stunden bei einer Temperatur von 40 bis 60 C unter aeroben Bedingungen gezüchtet. Das erfindungsgemiiß hergestellte zellwandlösende Enzym reichert sich während der Züchtung in der Garmaische an. Nach der Entfernung des Myzels, z. B. durch Abzentrifugieren, kann die Fermentationsflüssigkeil direkt zum Lösen von Zellwiinden verwendet werden, oder sie kann zur Gewinnung eines pulverförmigcn Enzympräparates gefriergetrocknet weiden.

Zur Gewinnung eines reineren Enzympräparates wird die Fermentationsflüssigkeit mit dem rohen Enzym mit Ammoniumsulfat ausgesalzen oder /ur Fallung des Enzyms mit Aceton behandelt. Zum Aussalzen versetzt man die Enzymlösung bis zu einem Siiuigungsgrad von 0,4 mit Ammoniumsulfat. entfernt den gebildete η Niederschlag, setzt weiteres Ammoniumsulfat hi zu einem Sättigungsgrad von 0,6 zu und gewinnt den dabei entstehenden Enzymniedcrschlag.

ELie andere Möglichkeit besteht darin, die Zugabe von Ammoniumsulfat zur Enzymlösung auf einmal vorzunehmen, wobei in diesem Fall bessere Ergebnisse erhalten werden, wenn das \mmoniumsulfat direkt bis zu einem Sättigungsgrad von 0,8 zugesetzt wird. Bei der Acetonfällung wird die rohe Enzymlösung mit Aceton zur Bildung des Enzymniederschlags versetzt Die besten Ergebnisse erhält man bei langsamer Acetonzugabe bis zu einer Konzentration von 60%. Nach ungefähr einstündigem Rühren isoliert man den gebildeten Niederschlag. Das so erhaltene Enzym wird in einem geeigneten Puffer (z. B. 0,01 m-KH₂PO₄-Puffer vom pH-Wert 7,0) gelöst und anschließend 20 Stunden gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die in der Dialysiermembran verbleibende dialysierte Lösung enthält hochgereinigtes Enzym und kann auf die gleiche Weise, wie oben für die rohe Enzymlösung beschrieben ist, gefriergetrocknet werden.

Die so erhaltene Substanz ist ein neues Enzym, das leicht Zellwände verschiedener Mikroorganismen, wie Hefe, Bakterien, Pilze und Chlorella, z. B. Candida rugosa, Candida krusei, Candida utilis, Candida pseudotropicalis, Candida parapsilosis, Candida lipolytica, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces chevalieri, Pichia membranaefaciens, Hansenula anomala und Schizosaccharomyces pombe, löst.

Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist in folgendem Schema wiedergegeben:

Nährmedium

Anzuchtsuspension

Züchtung I 20 Stunden bei 50' C

Abzentrifugieren

(5000 U/Min., 10 Minuten)

Zellen

überstand

Acetonbehandlung

(Rohe
Enzymlösung)

Aussalzen mit
Ammoniumsulfat

Abzentrifugieren

(10000 U/Min., 10 Minuten)

Niederschlag überstand

< Pufferlösung

Dialyse

Dialysierbad

Retentat

(gereinigte Enzymlösung) Abgesehen von den in den untenstehenden Beispielen angegebenen Eigenschaften weist das erfindungsgemäß hergestellte zellwandlösende Enzym folgende Merkmale auf:

a) Es ist im pH-Bereich 5,0 bis 9,0 stabil. Sein pH-Optimum liegt im Bereich 7,0 bis 8,0.

b) Es ist bei einer Temperatur von 40 bis 70⁰C, insbesondere von 50 bis 6O⁰C, aktiv.

c) Im wesentlichen ist es bei niederen Temperaturen stabil und wird bei einer Temperatur von O⁰C •nicht inaktiviert. Bei einer lOminutigen Behandlung bei 100⁰C wird es inaktiviert.

d) Es ist in Wasser und verdünnten Salzlösungen leicht löslich, in Aceton jedoch unlöslich.

e) DurchAg⁺, Cu⁺⁺, Hg⁺⁺, Fe⁺⁺, Zn⁺⁺, Cd⁺⁺ und Ni⁺⁺ wird es stark und durch Mn⁺⁺ und Co^{+ +} mäßig gehemmt, während es durch Mg^{+ +} aktiviert wird.

Das erfindungsgemäß hergestellte zellwandlösende Enzym ermöglicht es, wertvolle intrazelluläre Substanzen, z. B. Proteine, Nucleinsäuren, Aminosäuren, Vitamine und Enzyme, aus Mikroorganismen zu gewinnen.

Oie Durchführung von Vergleichsversuchen ergab, daß das Enzym aus Micropolyspora sp. ATCC 21489 gegenüber verschiedenen Hefen und gegen Chlorella insgesamt eine beträchtlich höhere zellwandlösende Aktivität besitzt als Enzyme, die von Mikroorganismen

to nach bisher aus dem vorgenannten Stand der Technik bekannten Verfahren produziert werden. Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1.

Das 5 g lebende Zellen von Candida rugosa JF-IOl, 1 g K₂HPO₄, 0,5 g MgSO₄ · 7H₂O in 1000 ml destilliertem Wasser enthaltende Nährmedium vom pH-Wert 7,4 wurde mit Micropolyspora sp. ATCC 21 489 angeimpft und unter Schütteln 24 Stunden bei 50 bis 55⁰C gezüchtet. Die lebenden Zellen von Candida rugosa JF-IOl wurden vollkommen gelöst. Die entstandene Gärmaische wurde dann 10 Minuten bei 5000 LJ Min. zentrifugiert.

Candida rugosa JF-IOl ist im Institute of Applied Microbiology, Tokyo University, hinterlegt und erhältlich.

Nach dem Entfernen der Zellen und Sporen wurde eine rohe Enzymlösung von starker zellwandlösender Aktivität erhalten.

Eine Zellsuspension, die die in Tabelle I aufgeführten Hefen jeweils in einer Konzentration von 10⁸/ml sowie 0,1% K₂HPO₄ und 0,05% MgSO₄- 7H₂O in destilliertem Wasser enthielt, wurde hergestellt und auf den pH-Wert 7,4 eingestellt. Die verwendeten Hess fen waren lebende Zellen, die hergestellt wurden, indem ein Glucose, (NH₄J₂SO₄, KH₂PO₄, MgSO₄ 7H₂O, Malzextrakt und Hefeextrakt enthaltende! Nährmedium vom pH-Wert 5,4 mit den jeweiliger Heien angeimpft und 24 Stunden bei 30° C untei Schütteln gezüchtet wurde.

Die erhaltene rohe Enzymlösung wurde auf der pH-Wert 7.4 eingestellt, und zu jeweils 3 ml diesel Lösung wurden jeweils 0,2 ml der oben hergestellter Zellsuspensionen gegeben. Diese Gemische wurder unter leichtem Schütteln 4 Stunden bei 50⁰C gehalten Die in Tabelle I aufgeführten Ergebnisse zeigen, dai große Mengen der Hefezellcn zerstört und verdaut wur

Die Verminderung der Trübung des Reaktionsgemisches, die in Tabelle I angegeben ist, wurde visuell bestimmt. Das Symbol » I- I H-« bedeutet eine vollständige Lösung der Zellen, das Symbol »++« eine mäßige Lösung der Zellen und das Symbol >χπ·« eine geringe Lösung.

Der Lösungsgrad der Zellen wurde nach folgender Gleichung bestimmt:

Lösungsgrad (%) = ^S'~^S" · KX).

wobei »Si« die ursprüngliche Anzahl der Zellen und »S«« die Anzahl der im Reaktionsgemiseh verbleibenden, nichtgelöstcn Zellen bedeutet.

vom pll-Werl 7,4 an Stelle der Enzymlösung versetz wurde.

Tabelle Il

('hlorclhi/cllcn

Lebende Zellen

Hitzcbchandcltc Zellen
llitzcbehandelte Zellen

Reaktions	'früh
zeit. SIcI.	Slancliird-
	lösunt!
3	0.78
19	0.77
3	0,84
19	0,80

Reaktion* gemisch

Tabelle 1 Beispiel 3

Stamm

Candida rugosa .IF-IOl

Candida krusei IAM 4801

Candida krusei IAM 4489

Candida utilis IAM 4215

Candida utilis IAM 4295

Candida pscudolropicalis

IAM 4829

Candida parapsilosis IAM 4488. Candida lipolytica IAM 4947 ... Saccharomyccs ccrevisiac

IAM 4009

Saccharomyccs ccrevisiac

IAM 4308

Saccharomyccs chevalicri

IAM 4801

Pichia membranaefacicns

IAM 4025

Hanscnula anomala IAM 4668 .. Schizosaccharomyccs pombe

IAM 4879

Vermin.

iming _tler TTühungim KciikUous-

gemisch

H H

H f

H H H-

H H- H-

H- H- H-

H- H- + + H H-

H +

H-

4 H-Die gemäß Beispiel 1 erhaltene rohe Fnzymlösunj wurde bis zu einem Sättigungsgrad von 0,4 mit Ammo niumsulfat versetzt. Der erhaltene Niederschlag wurd< I'm/cm 20 entfernt und weiteres Ammoniumsulfal wurde bis zi einem Sättigungsgrad von 0,6 zugesetzt. Der entslan dene Niederschlag wurde abzentrifugicrl und in de stillicrtcm Wasser suspendiert. Die Suspension wurdi in einem Behälter aus regenerierter Cellulose dialysicrl Man erhielt das gereinigte Enzym als Retentat.

Das gereinigte Enzym wurde zu einer Flüssigkeit probe gegeben, die hitzcbehandeltcs Myzel von Asper gillus oryzac IAM 2024 enthielt. Nach 4stündigen Stehen des Gemisches bei 50 C waren die mcistcr Zcllwände des Myzels zerstört.

2.0 ml der gemäß Beispiel 3 erhaltenen Fnzymlösunj wurden zu 0.3 ml einer Zcllsuspcnsion (K)" ml) vor Escherichia coii IAM 1264 gegeben, die 3 Minuter bei 90' C hitzcbehandelt worden waren. Nach Ein stellen des pH-Wertes auf 7,4 wurde das Gcmiscl 4 Stunden bei 50 C stehengelassen. Es wurden ungefähr 70% der Zellen zerstört.

ZcII-lösunps-

81

90

KK)

>90

86

83 92 93

42

61 81

77 86

65

Beispiel 2

F.in 10 g befeuchtete Zellen von Chlorella cllipsoidea Tamiya sowie 1 g K₂HPO₄. 0.5 g MgSO₄ ■ 7H₂O und 1 g Hcfccxtrakt in KK)OmI destilliertem Wasser enthaltendes Nährmedium vom pH-Wert 7.4 wurde 3 Minuten bei 120 C sterilisiert, mit Micropolyspora sp. ATCC 21489 angeimpft und 24 Stunden bei 50 C gezüchtet. Das Myzel des Stammes ATCC 21 489 und die nichtgclösten Chlorellazellen wurden durch Abzcntrifugieren entfernt. Man erhielt eine rohe Enzymlösung, die eine starke Aktivität sowohl Gegenüber lebenden als auch hitzebehandclten (bei 98 C, 3 Minuten) Chlorellazellen aufwies.

Zu 3.0 ml der so erhaltenen rohen Lösung wurden 0.2 ml einer Suspension von Chlorcllazcllcn (3 · 10" ml) gegeben, und das Gemisch wurde 18 Stunden bei 50 C leicht geschüttelt. Die F.rgcbnissc sind in Tabelle U wiedergegeben, wobei die Trübung als optische Dichte (OD) bei 530 mii wiedergegeben ist. Line Standardlösung wurde hergestellt, indem die Chlorcllasuspcnsion mit der entsprechenden Menge Phosphalpuffer

Beispiel 4

Fin 20g Stärke. 2g (NII₄J₂SO₄, 2 g KH₂PO₄ 5 g K₂HPO₄. 2 g MgSO₄-7H₂O. 0,006 g CuSO₄ 5H₂O. 0.001 g IcSO₄-7 H,O, 0,008 g MnCl₂-4 H₂O 0.002 g ZnSO₄ -7 H₂O und'lO gHefccxtrakt in KKK)m destilliertem Wasser enthaltendes Nährmedium vorr pil-Wert 7,4 wurde mit Micropolyspora sp. ATCC 21489 angcimpfl und 24 Stunden bei 50 C untci Schütteln gezüchtet. Die Gärmaischc wurde 10 Minuten bei 5000 U, Min. zentrifugiert, und das Myzel und die Sporen des verwendeten Stammes wurden cntfcrnt. Man erhielt eine rohe Enzymlösung mit cinei starken zellwandlösenden Aktivität.

Die rohe Enzymlösung wurde bis zu einem Sättigungsgrad von 0,8 mit Ammoniumsulfat versetzt, und das Gemisch wurde 4 bis 5 Stunden bei 5° C gerührt. Der entstandene braune Niederschlag wurde bei 10000 U Min. abzentrifugiert. in 9OmI 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gelöst und 20 Stunder bei 5 C gegen den gleichen 0,01 m Phosphatpuffei dialysiert. Im Dialysierbehälter blieb eine gereinigte

Enzymlösung zurück. Diese Lösung wurde lyophilisiert. Man erhielt 195 mg reines Enzym in Pulverform.

Beispiel 5

I">ic gemäß Beispiel 4 erhaltene rohe EnTymlösung wurde bei 5 C unter Rühren mit eiskaltem >\ceton bis zu einem Acctongchalt von 60% versetzt. Das Rührer wurde 4 bis 5 Stunden fortgesetzt. Der gebildete Nie-

clerschliig wurde IO Minuten bei K)OOO U;Min. ab-/entril'ugicrl und in 90 ml 0,01 m Phosphiitpuffer vom pH-Wert 7,0 gelöst. Die entstandene Lösung wurde 20 Stunden gegen den gleichen 0,01 m Phosphat puffer bei 5 Cdialysiert. DasRetenlat bestand aus gereinigter Enz.ymlösung.

Der technische Forlschrill des eiTmdungsgemäßen Verfahrens ist aus dem nachstellenden Versuehsbericht ersichtlich. Das von Micropolyspora sp. ATCC 21 489 produzierte Enzym wirkt nicht nur gegenüber liefen stärker lysicrend, sondern baut auch die äußerst stabilen Zellwände von Chlorella mehrfach stärker ab als die bekannten Enzyme.

Vergleichs versuche
I. Veiwendete Mikroorganismen

(a) Flavobaclcrium sp. ATCC 21 045
(britische Patentschrift 1 132 078).

(b) Trichodcrma viridae IFO 5836
(französische Patentschrift 1 333 739).

(C) Cytophaga NCIB 9497

(belgische Patentschrift 664 444).
(d) Micropolyspora sp. ATCC 21 489

(erfindungsgeinäß eingesetzter Mikroorganismus).

Der in der USA.-Patentschrift 3 124 51 7 verwendete Mikroorganismus Bacillus cereus Nr. 5832. ATCC 14893 ist im Katalog der American Type Culture Collection. 9. Ausgabe. 1970. nicht aufgeführt.

II. Substrat

Als um den betreffenden hn/ymen zu verdauende Zellen wurden Hefe- und Chlorella/eilen ausgewählt, da diese in der Praxis die wichtigsten zu lysierenden Substrate sind.

111. Durchführung der Versuche

I. Herstellung der Enzyme
(a) von Cytophaga NClB 9497 produziertes Enzym

40 ml eines aus 4.0% Mal lose. 2.4".. Malzextrakt, 1.0% Pepton und destilliertem Wasser (pH 7.0) bestehendes Medium in einem 250 ml fassenden Erlcnmcyer-Kolben werden mit Cytophaga NCIB 9497 beimpft, wobei der Organismus vorher in einem Bouillon-Agar-Medium gezüchtet wurde. Das beimpfte Nährmedium wird 2 Tage bei 26 C auf einer Rundsehü'Uelmaschine inkubiert. Die Kulturbrühe wird dann 10 Minuten bei 10(XX) U Min. zentrifugiert. Der erhaltene Dbcrstand wird als F.nzymlösung verwendet.

(b) von Flavobacterium sp. ATCC 21 045
produziertes Fnzym

20 ml eines aus 2% Glucose, 0.33% Fleischextrakt. 1.0% Pepton, 0,33% Na(I und 0.33% K₂HPO₄ (pH 7.0) bestehendes Nährmedium in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben wird mit auf Bouillon-Agar gezüchtetem Flavobacterium sp. ATCC 21045 beimpft. Das beimpfte Nährmedium wird 2 Tage bei einer Temperatur von 30 C auf einer Rundschüttelmaschine inkubiert. Die Kulturbrühe wird dann 10 Minuten bei 9000 U/Min, zentrifugiert. Der erhaltene tiberstand wird als F.nzymlösung verwendet.

(c) von Trichoderma viridae IFO-5836
produziertes Enzym

80 ml Wasser werden zu 100 g Weizen kleie gegeben Das Gemisch wird 30 Minuten mit Wasserdampi unter Normaldruck sterilisiert. Das so erhaltene Nährmedium wird mit Myzel von Trichoderma viridae beimpft. Das Myzel wurde auf einem Glucose-! lefeexlrakl-Malzexlrakt-Medium gezüchtet. Das beimpfte ίο Nährmediuni wird 3 Tage bei einer Temperatur von 30 C in statischer Kultur gezüchtet. Das erhaltene feste Kulturmedium wird dann mit 500 ml Wasser versetzt, und aus diesem Gemisch wird das Enzym I Slundo bei 30 C extrahiert. Nach dem Filtrieren des is Gemisches wirci das Filtral 10 Minuten bei K)OOOl) Min. zentrifugiert. Is wird eine klare Enzymlösung erhalten.

(d) von Micropolyspora sp. AlCC 21 489
produziertes Enzym

50ml eines aus 1,5"·» Stärke, 1,0"« llefeexliakl 0.264% (NI I₄),SO₄, 0,238"« KH₂PO₄. 0,565", K₂HPO₄. 0.1% MgSO₄-7H₂O und 0,1% (V V) dei Spiirenelementlösiing nach Pridham & Gottlieb (vgl

2s Wa k smaii, The Actinomycctes, Bd. 2. S. 332 (pH 7.4) bestehenden Nährmediums in einem 500 m fassenden Schüttelkolben wurden mit den Conidien vor Mikropolyspora sp. Al(C 2I4H9 beimpft, die aiii einem Agar-Medium gezüchtet wurden, das aus K)"-Zellen ml Candida rugosa .IE-IOl. 0,1",, K₁IIPO₄. 0.05"-'(i MgSO₄ 7H₂O. 0.1"« Hefeextrakt und 1.5"., Agar bestand und einen pH-Wert von 7.4 hatte. Das beimpfte Nährmedium wird 20 Stunden bei M) C oder K) Stunden bei 55 C schiiltelnd inkuhiert. Der aus dei

is Kulturbrühe erhaltene klare Π bet stand wird als Enzym lösung verwendet.

2. Züchtung der llcfrzcllen

Ein 500 ml fassender Schütlclkolben enthält K)O m eines flüssigen Mediums, das 5% Glucose. O.X", (NIl₁I₁SO₄₁O.!",, Na₁HPO₄. 0.1",, KIl₁PO₄. 0.2", MgSi)₄-711₂O. 0.2",, KCI. 0.02% Malzextrakt mit 0.02"-(i Hefeextrakt enthält. Der pH-Wert des Medium* beträgt 5.2. Dieses Medium wird mit den nach stehend aufgeführten Hefen beimpft. Die so beiinpiiei Nährmcdien werden 48 Stunden bei 30 C schütteliu inkubiert. Die gewachsenen Hefezellen werden abzen trifugiert. 2mal mit einer ().2%igen wäßrigen KCI-Lösung gewaschen und dem Test unterworfen.

Die Kohlenwasserstoff assimilierenden Hefen wer den in gleicher Weise, wie oben beschrieben, gezüch tet. mit der Ausnahme, daß an Stelle von 5"« Glucosi als Kohlenstoffquelle 2"., Kerosin oder n-Dccan ein gesetzt wird. Nach beendeter Züchtung wird die Gär maische mit einer geringen Menge einer IO%iger Seifenlösung versetzt. Das Gemisch wird gründlicl geschüttelt und zentrifugiert. Die Hefezellen werdet 4mal mit einer 0.2"«igen wäßrigen K('!-Lösung gewaschen und dem Test unterworfen.

Hefe

Candida utilis IAM 4215 (Futterhefe). Candida lipolytica IAM 4947(Kohlemvasserstofi

assimilierende Hefe), Candida rugosa JF-IOI (Kohlenwasserstoff

assimilierende Hefe), .

Klocckcra japonica IFO 0151, Hansenula saturnus IAM 4776,

ΙΛΜ = Abkürzung für Institute of Applied Microbiology. University of Tokyo,

HO = Abkürzung für Institute of Fermentation, Osaka.

JF = Abkürzung für »Jet Fuel«, weist auf die Isolicrungsqucllc hin.

3. Züchtung der Chlorella/eilen

Fin Kolben wird mit einem Nährmedium beschickt, das 1.26g KNO,. 1.22g KIKIO₄, 0.46g MgSO₄-7H₂O. 0.0028 g IeSO₄- 711,0 und K)OOmI Wasser enthält. Dieses Medium wird mit Chloreila cllypsoidea lamiya beimpft. Der Organismus wird dann in i_S einem ihermostatisierten Fermenter 5 Tage bei 25 C bei einer i.ichteinslrahlung von 10000 bis 20000 Lux gezüchtet, wobei das Medium mit Hilfe eines Kompressors mit 5"/o Kohlendioxid cnlhallender 1 oh belüftet wird. Nach vollständiger Züchtung werden die Chlorellazellen abzentrifugiert und mit Wasser gewaschen.

IV. Reaktionsbedingungen

und Bestimmungsmet boden

I. Aktivität des zellwandlösenden l-nzyms gegen I Icle

Jeweils 0.1 ml einer Suspension (10"' Zellen ml) der vorstehend gezüchteten Hefen wird zu 2 ml der von den Testorganismen gebildeten Rohen/ymlösimg gegeben. Das Gemisch wird dann 3 Stunden unter Schütteln beim jeweiligen Temperaturoptimum (37 C für Flavobacterium sp. AT(C 21 045 und Cytophaga NCIH 9497. 45 C für Trichoderma viridae IFO 5X36 und 50 C für Micropolyspora sp. ATCC 21 4X9) reagieren gelassen. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit Wasser bis auf 10 ml aufgefüllt. Fs wird die optische Dichte (OD) des Gemisches bei 660 itw bestimmt.

12

Vl. Frgebnisse

I. Aktivität des /.ellwandlösenden lin/.yms gegen I IeIe-' zellen.jJie in einem Glucose als Kohlciistoltquelle enthaltenden Nährmedium gezüchtet wurden

l'abelle

	Hefe	Vermin
		dem nt
		der
Tcslo^unismu.s	C. utilis IAM 4215	opli-
	C. lipolytica IAM 4947	schen
	C. rugosa JF-IOl	Dichte "/(I
Flavohaclcriiim	K. japonica IFO 0151	60
sp. ATCC 21 045	II. saturnus IAM 4116	38
	C. utilis IAM 4215	30
	C. lipolytica IAM 4947	50
	C. rugosaJ F-101	80
Cytophaga	K. japonica IFO 0151	61
NCIH 9497	H. saturnus IAM 41 16	25
	C. utilis IAM 4215	24
	C. lipolytica IAM 4947	73
	C. rugosa JF-IOI	35
rrichoderma	K. japonica IFO 0151	80
viridae IFO 5836	11. saturnus IAM 41 16	45
	C. utilis IAM 4215	51
	C. lipolytica IAM Ί947	XO
	C. rugosa JF-H)I	82
Micropolyspora	K. japonica IFO 0151	85
sp. ATCC 21 489	II. saturnus IAM 4116	90
	82
	100
	77

2. Aktivität des zellwandlösenden Fnzyms
L'ogen ί 'hlorella/cllcn

2. Aktivität des zellwandlösenden Enzyms gegen Hefezeüen, die in einem Kerosin als KohlcnstoiTquellc enthaltenden Nährmedium gezüchtet wurden

Die F.nzymlösungen werden mit Chlorellazellcn bis zu einer Konzentration von K)¹'Zellen ml versetzt. Nach 5siündiger Reaktion wird die optische Dichte (OD) de> Reaktionsgemisches bei 530 irw gemessen.

V. Hnzymaklivitäl

Die F.nzymaktivität wird gemäß britischer Patentschrift 1 132 67S. Gleichung auf S. 3, Mitte, bestimmt.

fio

Verminderung der optischen Dichte, %

OD₀-OD₁
OD₀

OD_n = Optische Dichte nach 0 Minuten.
OD, = Optische Dichte nach t Minuten.

100

Testorg;inismus

Flavobacterium

sp. ATCC 21 045
Trichoderma

viridae IFO 5836
Cytophaga

NCIB 9497
Micropolyspora

sp. ATCC 21489

Tabelle II

Hefe

C. lipolytica IAM 4947

C. rugosa JF-IOl

C. lipolytica IAM 4947

C. rugosa JF-IOl

C. lipolytica IAM 4947

C. rngosa JF-IOl

C. lipolytica IAM 4947

C. rugosa JF-101

Verminderung der optischen Dichte

13

3. Aklivitiil des zcllwandlösenden Hnzyms gegen Chlorella/.cllen

Tabelle

cslorpanismus

Flavobactcrium sp.

ATCC 21045
Trichodcrma viridae

IR) 5836
Cytophaga

NCIB 9497

Optische Dichte bei 5.10 mn

Blindwert 0.76 Probe 0.73 Blindwerl 0,85 Probe 0.73 Blindwert 0,72 Probe 0,69

Verminderung

der

optischen Dichte

lortset/ung

Optische Dichte bei 5M

Micropolyspora sp.
ATCC 21 489

Blindwert 0.78 Probe 0,50

Vcrminderunj;

der

optischen Dichte

36

Aus den vorstehenden Werten ist ersichtlich, daß das von Micropolyspora sp. ATCC 21 489 produzierte Knzym eine höhere Aktivität auf Hefe- und Chlorellazellen ausübt als die anderen hnzyme. mit der Ausnahme des von Trichodcrma viridae produzierten Hnzyms. das auf Hanscnula salurnus IAIvI 4116 eine etwas höhere Aktivität als das von Micropolyspora sp. ATC^-C 2! 489 produzierte ünzym ausübt.

Claims

Patentanspruch:

Verfahien zur Herstellung eines zellwandlösenden Enzyms durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus bei hierfür üblichen pH-Wert-Verhältnissen und durch Gewinnung des Enzyms aus dem Fermentationsmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Micropolyspora sp. ATCC 21489 in einem flüssigen Nährmedium üblicher Zusammensetzung, das jedoch als Hauptkohlenstoffquellen solche mit einem verhältnismäßig hohen PoIymerisationsgrad enthält, bei einer Temperatur von 40 bis 60° C einsetzt, das Myzel vom Fermentationsmedium abtrennt und das in der Fermentationsflüssigkeit enthaltene Enzym nach üblichen Methoden gewinnt.