DE2261270C3 - Verfahren zur Herstellung zellwändelysierender Enzymkomplexe, so erhältliche Enzymkomplexe und deren Verwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung zellwändelysierender Enzymkomplexe, die folgende Eigenschaften besitzen:

(a) sie lysieren lebende und tote Zellen zumindest von Aspergillus niger, Penicillium steckii, Saceharomyces cerevisiae, Candida utilis, Candida albicans, Candida lipolitica, Lentinus edodes. Bacillus subtilis, Lactobacillus lactis und Chlorella,

(b) ihre zellwandlysierenden Aktivitäten sind stabil im pH-Bereich von 3 bis 9, wobei der optimale pH-Wert im Bereich von 5 bis 7 liegt,

(c) ihre zellwandlysierenden Aktivitäten sind optimal in einem Temperaturbereich von 30—40⁰C, wobei die optimale Temperatur in Abhängigkeit von der Natur der Mikroorganismen, deren Zellen lysiert werden sollen, variiert,

(d) ihre zellwandlysierenden Aktivitäten sind stabil in einem niedrigen Temperaturbereich, werden jedoch bei Temperaturen oberhalb von 50⁰C schnell inaktiviert,

(e) ihre zellwandlysierenden Aktivitäten werden durch die Gegenwart von Mn⁺+, Ni⁺+ oder Zn⁺ + inaktiviert,

(f) sie zeigen die enzymatischen Aktivitäten von Cellulase bei einem optimalen Temperaturbereich von 40—50⁰C und einem optimalen pH-Wert von 5,0, von Carboxymethylcellulase, von j3-l,3-Glucanase bei einem optimalen Temperaturbereich von 40—50⁰C und einem optimalen pH-Wert von 5,0, von Chitinase bei einer optimalen Temperatur von 35⁰C und einem optimalen pH-Bereich von 4,0—5,5, von Protease, Hemi-cellulase und Amylase, und

(g) sie setzen sich im wesentlichen aus Enzymkomponenten zusammen, die jeweils ein Molekulargewicht von mindestens 50 000 besitzen,

die so erhältlichen Enzymkomplexe und deren Verwendung.

Bekanntlich werden Hefen und Chlorella und dergleichen zur Verwendung in Nahrungsmitteln und Futter in großem Umfang gezüchtet. Weiterhin ist

bekannt, daß Bakterien und Pilze gezüchtet werden, um sie für die Gewinnung von wertvollen Substanzen, wie Antibiotika, Eiweißstoffen, Nukleinsäuren, Aminosäuren, Vitaminen und Enzymen, zu verwenden. Die Zellwände der Hefen und Chlorella sind jedoch so stark, daß sie bei der Verwendung in Nahrungs- und Futtermitteln schwer zu verdauen und abzubauen sind. Daher ist vorgeschlagen worden, die Hefen und Chlorella mit einem Enzym zu behandeln, das die Zellwände dieser Mikroorganismen. aufschließt oder abbaut, um die Auflösbarkeit und Verdaubarkeit zu verbessern. Weiterhin ist vorgeschlagen worden, Bakterienkulturen und Pilzkulturen mit einem die Zellwände lysierenden Enzym zu behandeln, um die Extraktion wertvoller intrazellulärer Substanzen aus den gezüchteten Mikroorganismen zu erleichtern.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, Enzyme bereitzustellen, die in der Lage sind, Zellen und insbesondere die Zellwände verschiedener Mikroorganismen zu lysieren. Bei diesen Untersuchungen wurde ein Enzymkomplex bzw. ein aus verschiedenen Enzymen bestehender Komplex gefunden, der durch die bekannten Stämme der Gattung Pellicularia erzeugt wird und eine hohe Lysierfähigkeit zeigt, das heißt, er löst die Zellen verschiedener Mikroorganismen auf. Der erfindungsgemäße Enzymkomplex kann durch Züchtung bekannter Arten der Gattung Pellicularia in einem Nährboden erhalten werden, der Quellen assimilierbaren Kohlenstoffs und assimilierbaren Stickstoffs enthält, um diesen Enzymkomplex im Nährboden zu erzeugen und zu assimilieren und ihn dann daraus zu isolieren.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung zellwändelysierender Enzymkomplexe der eingangs genannten Art, das sich dadurch auszeichnet, daß ein bekannter Stamm von Pellicularia sasakii oder ein bekannter Stamm von Pellicularia filamentosa in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen und assimilierbare Stickstoffquellen enthält, zur Erzeugung und Anreicherung des Enzymkomnlexes im Nährmedium gezüchtet und dann der Enzymkomplex aus dem Nährmedium isoliert wird.

Der dadurch erzielbare technische Fortschritt liegt darin, daß der erfindungsgemäße Enzymkomplex im Unterschied zum Stand der Technik endo-/M,3-Glucanase enthält, die die Mikroorganismen-Zellwände durch statistisches Aufbrechen ihrer Moleküle in Oligopolysaccharid-Einheiten und durch geringe Protease-Aktivität abzubauen vermag, so daß er solche Zellwände rascher und wirksamer zu lysieren vermag.

Taxonomisch gehört die Gattung Pellicularia zur Familie der Corticiaceae der Ordnung der Aphyllophorales, die zu der Unterklasse der Homolasidiae der Klasse Basidomycetes gehört.

Ein erfindungsgemäß verwendeter, bekannter Stamm von Pellicularia sasakii kann bekanntlich die Pflanzenkrankheit Blattscheidenbrand bei Reispflanzen hervorrufen, ein Stamm der bekannten Art Pellicularia filamentosa die Pflanzenkrankheit Schwarzfäule bei Kartoffelpflanzen. Bekannte Stämme von Pellicularia filamentosa sind unter ATCC No. 14 701,14 702,14 703 und 20 206 hinterlegt worden, sowie ein Stamm von Pellicularia sasakii unter der ATCC No. 13 289, wie auf Seite 120 des »Catalogue of Strains« 9. Ausgabe (1970) der »American Type Culture Collection« angegeben.

Bei den vorliegenden untersuchenden Arbeiten wurde ein Stamm von Pellicularia sasakii aus einer Verletzung bei einer mit Blattscheidenbrand infizierten ReisDflanze isoliert. Dieser Stamm wurde unter F. R. I.

No. 1170 im öffentlichen japanischen Hinterlegungsinstitut »Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology of Japan, Inage, Chiba City, Japan« am 8. November 1971 hinterlegt Dieser Stamm wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, am 12. IZ 1972 unter ATCC No. 20 365 uneingeschränkt hinterlegt Ebenfalls wurde ein Pellicularia filamentosa-Stamm aus einer Verletzung einer mit Schwarzfäule infizierten Kartoffelpflanze isoliert Dieser Stamm wurde unter dem gleichen Datum unter der Nummer F. R. I. No. 1171 hinterlegt Dieser Stamm wurde am IZ IZ 1972 unter ATCC No. 20 366 uneingeschränkt hinterlegt Nichtsdestoweniger ist es bisher nicht gelungen, die Stämme F. R. I. No. 1170 und 1171 von den bekannten Stämmen der Pellicularia sasakii und der Pellicularia filamentosa zu differenzieren (dazu siehe die japanische Veröffentlichung »Microbiology Handbook« Seiten 376—377, veröffentlicht am 25. Dezember 1957 in Tokio).

Die morphologischen Eigenschaften der oben angegebenen Pellicularia sasakii- und Pellicularia filamentosa-Stämme werden im folgenden kurz angegeben:

1. Das pflanzliche Mycel ist fasrig oder hat eine Pilzhut-Form, ist anfänglich farblos und ändert seine Farbe in eine gelblich-braune Faibe nach Alterung.

2. Das Mycel besitzt im allgemeinen einen Durchmesser von 8 bis 12 μπι.

3. Das Sklerotium wird gebildet

4. Die Basidie besitzt die Form eines Zylinders oder eiförmige Gestalt und trägt 4 bis 8 Verzweigungen.

5. Es werden farblose Sporen mit einer glatten Oberfläche gebildet

6. Das Hymenium ist flach.

7. Der Fruchtkörper bildet eine vernetzte Membran.

Pellicularia sasakii und Pellicularia filamentosa können dadurch voneinander differenziert werden, daß Pellicularia jasakii bei Reispflanzen Blattscheidenbrand und Pellicularia filamentosa bei Kartoffelpflanzen die Schwarzfäule und bei Auberginen die Umfallkrankheit (der Keimlinge) verursacht Weiterhin bildet Pellicularia sasakii ein schwarzbraun gefärbtes Sklerotium von 5 bis 13 mm, eine Basidie von 18χ9μΐη und Sporen von 9x7 μιη. Pellicularia filamentosa bildet ein braun gefärbtes Sklerotium von 1 bis 3 mm, eine Basidie von 15x8 μίτι und Sporen von 9x7 μπι. Jedoch haben einige Taxonomen die Ansicht geäußert, daß Pellicularia sasakii lediglich eine natürliche Variante von Pellicularia filamentosa sei.

Zur Herstellung des erfindungsgemäßen, die Zellwände lysierenden Enzymkomplexes kann jeder der oben angegebenen Stämme von Pellicularia sasakii oder filamentosa verwendet werden.

Beim Verfahren nach der Erfindung wird ein bekannter Stamm von Pellicularia sasakii oder Pellicularia filamentosa in einem Nährmedium gezüchtet, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, um den Enzymkomplex zu erzeugen und zu akkumulieren und ihn dann aus dem Medium zu isolieren.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann ein Stamm von Pellicularia sasakii oder Pellicularia filamentosa entweder in einem flüssigen Nährmedium oder in einem festen Nährmedium gezüchtet werden, wobei bekannte Fermentationsverfahren angewandt werden. Vorzugsweise wird der Pellicularia-Stamm bei einer InkubationstemDeratur

von 15 bis 40° C 48 bis 240 h gezüchtet, obgleich die Züchtungsbedingungen je nach Art des benutzten Züchtungsverfahrens variieren können.

Der Nährboden, in dem der Pellicukria-Stamm nach einem Verfahren nach der Erfindung gezüchtet wird, kann assimilierbare Kohlenstoff- and Stickstoffquellen enthalten. Als Kohlenstoffquellen können beispielsweise Kohlenhydrate wie Stärke, Glycose, Saccharose, Weizenkleie, Reiskleie und dergleichen verwendet werden. Als Stickstoffquellen könne« beispielsweise Ammoniumsalze, Nitrate, Peptone, Fleischextrakte, Hefeextrakte, entfettetes Sojabohnenmehl und dergleichen verwendet werden. Auch kann eine geeignete Menge einer das Wachstum fördernden Substanz, wie beispielsweise Vitamine, dem Nährboden zugegeben werden. Ebenso kann ein Pulver aus Trockenhefe, Chlorella und/oder Pilzen zugesetzt werden, um die Enzymbildung zu fördern. Weiterhin können Spuren von organischen Salzen, wie beispielsweise Kaliumsalzen, Calciumsalzen, Magnesiumsalzen, Eisensalzen, Phosphaten und dergleichen, dem Nährboden zugesetzt werden, um verschiedenartige Spurenelemente zuzuführen, die für das Wachstum des Pellicularia-Stamms wesentlich sind.

Die Züchtung des Pellicularia-Stammes wird so lange fortgesetzt, bis eine ausreichende Menge des erwünschten Enzymkomplexes erzeugt und im Nährboden akkumuliert worden ist. Der Pellicularia-Stamm wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen gezüchtet.

Die Züchtung in flüssigem Nährmedium erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 bis 33° C 48 bis 120 h unter aeroben Submersbedingungen. Die Züchtung auf festem Nährboden erfolgt vorzugsweise bei 20 bis 35° C 3 bis 10 Tage.

Der auf die Zellwände verschiedener Mikroorganismen Iysierend wirkende Enzymkomplex wird während der Züchtung in der Pellicularia-Zuchtkultur erzeugt und akkumuliert. Die überstehende Kulturbrühe, die durch Abfiltrieren oder Zentrifugieren des festen Materials wie beispielsweise des Mycels und der festen Rückstände aus dem Nährmedium erhalten wird, kann als solche zum Lysieren der Zellwände verschiedener Mikroorganismen verwendet werden. Diese Überstandsflüssigkeit kann ebenfalls gefriergetrocknet werden, um ein rohes Enzympräparat herzustellen. Wenn eine Züchtung im festen Nährboden durchgeführt wird, kann die angefallene feste Kultur mit Wasser oder gepuffertem Wasser von einem pH-Wert von 4,0 bis 7,0 extrahiert werden. Das dabei erhaltene wäßrige Extrakt enthält den Enzymkomplex, der in ähnlicher Weise wie das oben erwähnte Filtrat benutzt werden kann.

Um den Enzymkomplex in Form eines reineren Enzympräparates zu isolieren, kann das die Enzyme enthaltende Nährmedium von festen Stoffen beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren befreit werden, oder man kann diese mit Wasser oder gepuffertem Wasser extrahieren. Die so hergestellte wäßrige Rohlösung des Enzymkomplcxes kann dann einer Behandlung mit bekannten Aussalzmitteln, wie Ammoniumsulfat, Natriumchlorid und dergleichen, unterworfen werden oder es wird mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel behandelt, wie mit den niederen aliphatischen Alkoholen Methylalkohol oder Äthylalkohol, oder mit Aceton, um den Enzymkomplex aus der Rohlösung auszufällen. Zur weiteren Reinigung kann der ausgefällte Enzymkomplex in einer geeigneten Pufferlösung gelöst werden. Eine solche Pufferlösung ist ein 0,1 m Acetat-gepuffertes Wasser. Die Enzymlösung kann anschließend einer Dialyse oder einer Gel-Filtration unterworfen werden. Die gereinigte Enzymlösung kann dann gefriergetrocknet werden und ergibt ein Enzympräparat, das im wesentlichen aus dem erwünschten Enzymkomplex besteht. Die erfindungsgemäß hergestellten Enzymkomplexe aus Pellicularia sasakii und aus Pellicularia filamentosa sind in Wasser Iöslirh, in Aceton und Äthanol unlöslich und besitzen folgende Eigenschaften:

a) Sie können lebende und tote Zellen von Bakterien, Pilzen, Hefen, Basidiomyceten und Chlorella lysieren,

b) die zellwändelysierenden Aktivitäten sind stabil in einem pH-Bereich von 3 bis 9, wobei der optimale pH-Bereich im Bereich von 5 bis 7 liegt,

c) optimale Aktivität und insbesondere zellwändelysierende Aktivität liegt in einem Temperaturbereich von 30 bis 40° C, jedoch kann die optimale Temperatur je nach der Art der Mikroorganismen, deren Zellen lysiert werden sollen, etwas variieren,

d) die zellwändelysierenden Aktivitäten sind stabil in niederem Temperaturbereich, sie werden jedoch schnell bei Temperaturen über 50° C inaktiviert,

e) die zellwändeiysierenden Aktivitäten werden durch die Gegenwart von Mn⁺+, Ni⁺+ oder Zn⁺ + inaktiviert,

f) der Enzymkomplex zeigt die enzymatischen Aktivitäten von Zellulase, Glucanase, Chitinase, Protease, Hemi-Cellulase und Carboxymethylcellulase und

g) der Enzymkomplex setzt sich im wesentlichen aus Enzymkomponenten zusammen, die jeweils mindestens ein Molekulargewicht von 50 000 besitzen.

Es wird angenommen, daß die von Pellicularia sasakii und Pellicularia filamentosa erzeugten Enzymkomplexe eine Mischung aus Cellulase, Glucanase, Chitinase, Protease, Hemi-Cellulase und Carboxymethylcellulase in Form eines Komplexes sind und ihre hohe Aktivität beim Lysieren von Zellen verschiedener Mikroorganismen aufgrund eines synergistischen Effekts der Wirkungen der einzelnen Enzymkomponenten zeigen, obgleich ebenfalls angenommen wird, daß diese Enzymkomplexe, die durch die verschiedenen Pellicularia-Arten erzeugt werden, Zusammensetzungen besitzen, die mehr oder weniger voneinander unterschiedlich sind. Es wurde nämlich beobachtet, daß diese Enzymkomplexe mehr oder weniger unterschiedliche Eigenschaften und Wirkungsstärken für die einzelnen enzymatischen Aktivitäten zeigen.

Die aus einem bekannten Stamm von Pellicularia sasakii und Pellicularia filamentosa hergestellten zellwändelysierenden Enzymkomplexe besitzen, weiterhin folgende gemeinsame Eigenschaften:

a) Sie können lebende und tote Zellen zumindest von Aspergillus niger, Penicillium steckii Saccharomyces ceirevisiae, Candida utilis, Candida albicans, Candida Iipolitica, Lentinus edodes, Bacillus subtilis, Lactobacillus lactis und Chlorella lysieren:

b) ihre zellwändelysierenden Aktivitäten sind stabil in einem pH-Bereich von 3 bis 9, wobei der optimale pH-Bereich bei 5 bis 7 liegt;

c) ihre zellwändelysierenden Aktivitäten sind optimal in einem Temperaturbereich von 30 bis 40° C, jedoch kann die optimale Temperatur je nach Art der Mikroorganismen, deren Zellen lysiert werden sollen, variieren;

d) ihre zellwändelysierenden Aktivitäten sind stabil in niedrigem Temperaturbereich, sie werden jedoch schnell inaktiviert bei einer Temperatur oberhalb 50° C;

e) ihre zellwändelysierenden Aktivitäten werden durch die Gegenwart von Mn++, Ni + + oder Zn ⁺ + inaktiviert,

f) sie zeigen die enzymalischen Aktivitäten von Cellulase, Carboxymethylcellulase, Glucanase, Chi·· tinase, Protease, Hemi-Cellulase und Amylase und

g) sie setzen sich im wesentlichen aus einzelnen Enzymkomponenten zusammen, die ein Molekulargewicht von mindestens 50 000 besitzen.

to

15

Der von Pellicularia sasakii gebildete Enzymkomplex zeigt weiterhin eine Cellulaseaktivität, die einen optimalen Temperaturbereich von 40 bis 50° C und einen optimalen pH-Wert von 5,0 besitzt, eine |3-1,3-Glucanase-Aktivität, die einen optimalen Temperaturbereich von 40 bis 50° C und einen optimalen pH-Wert von 5,0 besitzt, und eine Chitinase-Aktivität, die einen optimalen Temperaturbereich von 35° C und einen optimalen pH-Wert von 4,0 bis 5,5 besitzt. Der von Pellicularia filamentosa gebildete Enzymkomplex zeigt weiterhin eine Cellulase-Aktivität, die einen optimalen Temperaturbereich von 40 bis 50° C und einen optimalen pH-Wert von 5,0 besitzt, eine /M,3-Glucanase-Aktivität, die einen optimalen Temperaturbereich von 40 bis 50°C und einen optimalen pH-Wert von 5,0 besitzt und eine Chitinase-Aktivität, die einen optimalen Temperaturbereich von 35° C und einen optimalen pH-Wert von 4,0 bis 5,5 zeigt.

Die zellwändelysierenden Aktivitäten der oben angegebenen allgemeinen Eigenschaften b)—e) der erfindungsgemäßen Enzyinkomplexe werden wie folgt bestimmt: Der Enzymkomplex wird mit 5 ml einer Suspension von Zellen von Candida utilis IFO-0396 umgesetzt, die anfänglich eine Trübung besitzt, die einem Wert optischer Dichte (O. D.) von 1,0 entspricht, gemessen bei einer Wellenlänge von 660 nm. Die Reaktion wird bei 35° C 60 min bei einem pH-Wert von 5,0 durchgeführt. Nach dieser Reaktion wird die optische Dichte der Zellensuspension, die die lysierten Zellen und die nicht lysierten Zellen enthält, bei 660 nm gemessen. Wenn die zur Reaktion gebrachte Zellensuspension eine Reduzierung von 1% der Trübung (oder des O. D.-Wertes) im Vergleich mit der anfänglichen Zellensuspension zeigt, dann kann angenommen werden, daß diese Menge des Enzymkomplexpräparates eine Wirkungsstärke von einer Einheit von je zeliwändeiysierende Aktivität besitzt Die CeÜuiase-Aktivität, die J3-1,3-Glucanase-Aktivität und die Chitinase-Aktivität des Enzymkomplexes nach der Erfindung werden wie später in Beispiel 13 beschrieben gemessen.

Wenn die Zellwände von Mikroorganismen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Enzymkomplexes lysiert oder aufgelöst werden, wird der Enzymkomplex mit den in Wasser suspendierten Zellen des Mikroorganismus umgesetzt Diese Reaktion kann in geeigneter Weise bei einer Temperatur von 20 bis 60° C und vorzugsweise bei 30 bis 40°C und bei einem pH-Wert von 2 bis 10 und vorzugsweise bei einem pH-Wert von 3,4 bis 8 durchgeführt werden. Die angewendete Reaktionstemperatur und der pH-Wert können je nach der Natur des Mikroorganismus gewählt werden, dessen Zellen unter der Wirkung des Enzymkomplexes lysiert werden sojjen. Die zu lysierenden Zellen der Mikroorganismen können lebende oder tote Zellen sein, wenn sie mit dem Enzym in Kontakt gebracht werden. In jedem Fall können die Zellen im wesentlichen ganz aufgelöst werden, wobei die Zellwände und die zellulären Substanzen der Zellwände in die wäßrige Phase der Zellensuspension gehen, und zwar innerhalb 20 h nach Beginn der Reaktion.

Um die Reaktion des Enzymkompkxes mit den Zellen der Mikroorganismen durchzuführen, kann das Enzympräparat in Form eines festen Pulvers oder einer wäßrigen Lösung oder die Nährbrühe oder ein Extrakt der Nährbrühe einer Suspension der Zellen in Wasser zugesetzt werden, die auf einen optimalen pH-Wert abgepuffert worden ist, um die enzymatische Reaktion zu bewirken. Die Zellen können alternativ zu einer Lösung des Enzympräparates in Wasser oder in einer gepufferten Lösung gegeben werden, die auf den optimalen pH-Wert eingestellt worden ist, um die enzymatische Reaktion zu bewirken. Wenn die Reaktion abgelaufen ist, sind die Zellen vollständig aufgelöst, ohne daß ein fesler Rückstand in der Lösung zurückbleibt. In manchen Fällen bleibt jedoch ein fester Rückstand selbst nach Beendigung der Reaktion zurück. Ob die Zellen bis zu dem erwünschten Grad aufgelöst worden sind, kann bestimmt werden, indem die Veränderung der Trübung der Zellensuspension oder die Konzentration einer wäßrigen Komponente des Zellenprotoplasmas bestimmt wird, oder durch mikroskopisch Beobachtung der Bedingungen der Zellen in der Suspension. Auf diese Weise kann eine wäßrige Zellenlösung erhalten werden, in der das Material der Zellmembranen und des Protoplasmas der Zellen zusammen mit dem verwendeten Enzymkomplex in Wasser aufgelöst worden ist. Falls erwünscht, kann die so erhaltene Zellenlösung abfiltriert werden, um mögliche feste Rückstände zu entfernen. Diese Lösung kann erwärmt werden, um die übriggebliebenen Enzyme falls notwendig zu desaktivieren. Die Zellenlösung kann dann anschließend im Vakuum entwässert oder eingeengt werden, um ein Trockenprodukt zu erhalten. Die so behandelte Zellenlösung kann auch in geeigneter Weise extrahiert oder Chromatographien werden, um die brauchbaren Substanzen daraus zu isolieren.

Der Enzymkomplex nach der Erfindung kann die Zellen, genauer gesagt die Zellwände verschiedener Mikroorganismen lysieren. Solche Mikroorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefe, Basidiomyceten sowie Chlorella, eine der Algen.

Diese Eigenschaften des erfindungsgemäßen Enzymkomplexes sind bedeutend vorteilhafter im Vergleich z. B. mit dem bekannten Enzym, das aus Corticium rolfsii-Kulturen nach dem Verfahren der veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 11 978/67 isoliert wird. Das aus Corticium rolfsii isolierte Enzym hat einen optimalen pH-Bereich von 2,0—2,5 und eine auf das Auflösen der Zellwand lediglich von Hefe und Chlorella begrenzte Lysierfähigkeit Der Mikroorganismus der Gattung Corticium kann von der Gattung Pellicularia dadurch differenziert werden, daß die erstere ein kontinuierliches Hymenium produziert, worin die Basidie Seite an Seite kontinuierlich angeordnet ist, während die letztere ein diskontinuierliches Hymenium produziert, worin die Basidie in Abständen voneinander angeordnet ist

Der Zellwände lysierende Enzymkomplex nach der Erfindung kann bei der Extraktion von wertvollen intrazellulären Substanzen aus den Zellen sowie zur Erzeugung eines konzentrierten Extraktes verwendet

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werden, der Nährstoffe und andere wertvolle Substanzen enthält, die im Protoplasma der Zelle verschiedener Mikroorganismen, wie von Hefen, Chlorella, Bakterien und Pilzen, vorhanden sind. Zu diesem Zweck werden die Zellen mit dem Enzymkomplex in Wasser behandelt, um die Zellwände zu lysieren und das Protoplasma freizusetzen, so daß man eine Zellenlösung enthält, die man dann teilweise entwässern kann oder vollständig in ein Konzentrat oder in ein Trockenpulver umwandeln kann. Der Zellwände lysierende Enzymkomplex nach der Erfindung kann weiterhin dazu verwendet werden, daß man Nahrungsmittel oder Getränke vor dem Verderben bewahrt, indem eine wirksame Menge des Enzymkomplexes zugesetzt wird und man dadurch die Zeilen eventueii vorhandener Bakterien oder Piize auflöst. Aufgrund der vorteilhaften Eigenschaften können die Enzymkomplexe nach der Erfindung auf den verschiedensten Gebieten der Lebensmittelindustrie, der pharmazeutischen Industrie, der Futtermittel herstellenden Industrie und der Schädlingsvertilgungsmittel herstellenden Industrie verwendet werden.

Der Enzymkomplex nach der Erfindung und das Verfahren zur Herstellung desselben werden in den folgenden Beispielen anhand bevorzugter Ausführungsformen im einzelnen erläutert.

Beispiel 1

In einen 300 ml-Erlenmeyerkolben wurden 19 g Weizenkleie, 1 g getrocknete Hefe und 18 ml Wasser gegeben. Der Kolben wurde dann erwärmt und der Inhalt des Kolbens wurde zu einer gleichmäßigen pastösen Mischung gerührt Der Nährboden wurde zur Sterilisation 20 min bei 120⁰C mit Dampf behandelt. Eine Pellicularia sasakii-Stammkultur (F. R. I. No. 1170) wurde auf den sterilen Nährboden aufgeimpft Die Festbodenkultur des Pellicularia-Stammes wurde 120 h bei einer konstanten Temperatur von 28° C durchgeführt. Die dabei erhaltene Kultur wurde mit 80 ml einer Acetatpufferlösung vom pH-Wert 4,0 vermischt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 h bewegt, um sicherzustellen, daß die Enzyme in die flüssige Phase extrahiert wurden. Die Mischung wurde dann unter Druck abfiltriert und das zentrifugierte Filtrat ergab 70 ml einer klären Lösung, die den von Pellicularia sasakii gebildeten Enzymkomplex enthielt Zu dieser klären Lösung wurden 210 ml Aceton zugesetzt so daß der Enzymkomplex ausfiel. Der ausgefallene Enzymkomplex wurde abfiltriert und getrocknet und ergab 700 mg eines Enzympräparats in Pulverform. Dieses Enzympräparat besaß eine ausgezeichnete lysierende Äkiiviiät für Zeüwäüdc der verschiedenen Mikroorganismen einschließlich Bakterien, Pilze, Hefen, Basidiomyceten und Chlorella.

Beispiel 2

In einen 300 ml-Erlenmeyerkolben wurden 10 g Weizenkleie, 10 g Reiskleie, 2 g Pepton und 20 ml Wasser gebracht Der Kolben wurde erwärmt und der Inhalt des Kolbens wurde bewegt um eine gleichmäßige pastöse Mischung zu erhalten. Dieser Nährboden wurde zur Sterilisation 20 min bei 120° C mit Wasserdampf behandelt Eine Pellicularia filamentosa-StammkuItur (F. R. L No. 1172) wurde auf den sterilen Nährboden aufgeimpft Die Festbodenkultur erfolgte 170 h bei 28° C. Die so erhaltene Kultur wurde dann mit 80 ml Wasser vermischt, und diese Mischung wurde bei Raumtemperatur gut bewegt um sicherzustellen, daß die Enzyme in die wäßrige Phase extrahiert wurden. Die Mischung wurde dann unter Druck filtriert und das Filtrat zentrifugiert, wobei eine klare Lösung erhalten wurde, die den durch Pellicularia filamentosa erzeugten Enzynikomplex enthielt. Zu der klären Lösung wurde Ammoniumsulfat bis zu 70%iger Sättigung zugesetzt, so daß der Enzymkomplex ausfiel. Der Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet und ergab 1 g eines Enzympräparates in Pulverform. Dieses Enzympräparat erwies sich als die Zellwände verschiedenster Mikroorganismen, wie von Bakterien, Pilzen, Hefen, Basidiomyceten und Chlorella, lysierend aktiv.

Beispiel 3

In einen 1 1-Erlenmeyerkolben wurden 9 g Saccharose, b g Reiskleie, 0,6 g eines Pulvers aus getrockneten Pilzen (Cortinellus shiitake), 1,5 g Ammoniumsulfat, 1,5 g Monokaliumphosphat, 0,3 g Kaliumchlorid, 0,4 g Magnesiumsulfat und 0,003 g Eisen(II)-sulfat gebracht. Dazu wurden zum Auflösen 300 ml Wasser zugesetzt.

Der Nährboden in Form einer wäßrigen Lösung wurde mit Wasserdampf 20 min lang bei 120° C sterilisiert. Eine Stammkultur von Pellicularia filamentosa (F. R. I. 1172) wurde auf das sterile flüssige Nährmedium aufgeimpft. Die Schüttelkultur des Pellicularia-Stammes wurde 120 h bei 23° C durchgeführt Die dabei erhaltene Kulturbrühe wurde filtriert, um die vorhandenen Feststoffe zu entfernen, und das dabei erhaltene klare Filtrat, das die Enzyme enthielt, wurde auf ein Drittel des ursprünglichen Volumens konzentriert und anschlie-Bend durch eine Dialysemembran dialysiert Der konzentrierten Lösung wurden 400 ml wäßrigen 99%igen Äthylalkohols zugesetzt, so daß der Enzymkomplex ausfiel. Der Niederschlag wurde abfillrierl und getrocknet und ergab 450 mg eines Enzympräparats in Pulverform. Dieses Enzympräparat zeigte eine gute Aktivität und lysierte Zellwände verschiedener Mikroorganismen, einschließlich Bakterien, Pilze, Hefen, Basidiomyceten und Chlorella.

Beispiel 4

In einen 300 ml-Erlenmeyerkolben wurden 5 g feinzerteilte Weizenkleie, 0,5 g Ammoniumsulfat 0,5 g Monokaliphosphat 0,1 g Kaliumchlorid, 0,1 g Magnesiumsulfat, 0,001 g Eisen(II)-suIfat und 100 ml Wasser gebracht Der Kolbeninhalt wurde mittels Wasserdampf 20 min bei 120° C sterilisiert Eine Stammkultur von Pellicularia sasakii (F. R. I. No. 1170) wurde auf das sterile flüssige Nährmedium aufgeimpft Die Schüttelinkubation wurde 24 h lang bei 28° C mittels eines Drehschüttlers durchgeführt um eine Saatflüssigkultur herzusieiien. Parailel dazu wurden 200 g Weizenkleie, 5 g eines Pulvers getrockneter Pilze (Cortinellus shiitake) und 160 ml einer 5%igen wäßrigen Ammoniumsulfatlösung in 5 Holzschalen gebracht In jeder Schale wurden die Materialien gut vermischt um eine einheitliche Mischung zu ergeben, die dann mit Wasserdampf sterilisiert wurde. 20 ml der obigen Saatflüssigkultur wurden auf den Nährboden in jeder Schale aufgeimpft Die Stationskultur erfolgte 96 h bei 28° C. Die Kulturen in diesen Schalen wurden gereinigt und die kombinierte Kultur wurde mit 41 einer wäßrigen Lösung aus einem Acetatpuffer von einem pH-Wert von 4,0 extrahiert Der Extrakt wurde unter Druck filtriert und das zentrifugierte Filtrat ergab 3,61 einer klären Lösung, die den von Pellicularia sasakii gebildeten Enzymkomplex enthielt Dieser klären Lösung wurde Ammoniumsulfat bis zu 7O°/oiger Sättigung zugesetzt, so daß der Enzymkomplex ausfiel.

Der Niederschlag wurde gesammelt und in 900 ml Wasser aufgenommen. Die wäßrige Enzymlösung wurde im Vakuum lyophilisiert und ergab 32 g eines Enzympräparates in Pulverform. Dieses Enzympräparat erwies sich als Zellwände verschiedener Mikroorganismen, wie von Bakterien, Pilzen, Hefen, Basidiomyceten und Chlorella, lysierend aktiv.

Beispiel 5

In drei 300 ml-Erlenmeyerkolben wurden je 19 g Weizenkleie, Ig Trockenhefe und 18 ml Wasser gebracht, und der Inhalt eines jeden Kolbens wurde erwärmt und zu einer gleichförmigen pastösen Masse gerührt. Dieses Kulturmedium wurde dann 20 rnin mit Wasserdampf bei 120°C sterilisiert. Stammkulturen von Pellicularia sasakii und Pellicularia filamentosa wurden auf die sterilen Kulturmedien in allen drei Kolben aufgeimpft. Die Festbodenkultivierung wurde 120 h lang bei einer konstanten Temperatur von 28° C durchgeführt Danach wurden die erhaltenen Kulturen mit 80 ml-Portionen einer 0,1 η Acetatpufferlösung (pH 5,0) vermischt, und die Mischungen wurden bei Raumtemperatur 1 h bewegt, um sicherzustellen, daß die Enzymkomplexe, die durch die verschiedenen Pelliculariaarten erzeugt worden waren, in die flüssige Phasen extrahiert wurden. Die Mischungen wurden unter Druck filtriert, und die Filtrate ergaben nach dem Zentrifugieren 70 ml-Portionen von 2 klaren Lösungen, die die Enzymkomplexe enthielten.

Parallel dazu wurden Zellsuspensionen von Pilzen, Hefen, Bakterien und Chlorella in Wasser aus Kulturen von Aspergillus niger, Penicülium steckii, Saccharomyces cerevisiae IFO-0209, Candida utilis IFO-0396, Candida albicans, Candida lipolitica und Lentinus edodes, jede in einem Malzmedium inkubiert, hergestellt; Kulturen aus Bacillus subtilis und Lactobacillus lactis wurden in einem Bouillonmedium inkubiert; und die Chlorella pyrenoidosa-Kultur wurde in einem Nakamuramedium inkubiert. Jede dieser Zellsuspensionen wurde in 3 Reagenzgläser gebracht 20 ml-Portionen der oben angegebenen drei klaren Lösungen des Enzymkomplexes wurden dann in die 3 Reagenzgläser gegeben, die die Zellsuspensionen enthielten. Der Inhalt

ίο eines jeden Reagenzglases wurde 20 h leicht in einem Wasserbad bei einer konstanten Temperatur von 35° C geschüttelt, so daß die Enzyme mit den Zellwänden umgesetzt wurden, um die Zellen in der Suspension aufzulösen. Die Zellsuspensionen wurden unter dem irlikroskop beobachtet, um festzustellen, bis zu weichern Grad die Zellen unter der Wirkung der Enzymkomplexe von Pellicularia sasakii und Pellicularia filamentosa aufgelöst oder abgebaut worden waren. Der Grad der Auflösung der Zellen wurde nach der folgenden Skala beurteilt:

+ + bezeichnet vollständige Auflösung der Zellen,
+ bezeichnet die Auflösung eines größeren Teils der Zellen,
± bezeichnet die Auflösung eines kleineren Teiles der Zellen,

- bedeutet, daß keine Auflösung der Zellen festgestellt werden konnte.

Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt. Zum Vergleich wurde das Verfahren wiederholt, indem 2 ml der Acetatpufferlösung anstatt der oben erwähnten klären Enzymlösungen zugesetzt wurde. Bei den Vergleichsversuchen wurde keine Auflösung der Zellen festgestellt

Tabelle I

Art der aufzulösenden Zeiien	Enzymzusatz	Aufiösungsgrad der Zeiien durch
		Enzym von Enzym von
		Pellicularia Pellucularia
		sasakii filamentosa
Aspergillus niger	zugesetzt	++ ++
	nicht zugesetzt	— —
Penicillium steckii	zugesetzt	++ ++
	nicht zugesetzt	- -
OHUlnMOl UlliJTUGS UCICVIMiIC	zugesetzt
	nicht zugesetzt	— —
Candida utilis	zugesetzt	++ ++
	nicht zugesetzt	— —
Candida albicans	zugesetzt	++ ++
	nicht zugesetzt	— —
Candida lipolitica	zugesetzt	++ ++
	nicht zugesetzt	— —
Lentinus edodes	zugesetzt	+ +
	nicht zugesetzt	— —
Bacillus subtilis	zugesetzt	± ±
	nicht zugesetzt	— —
Lactobacillus lactis	zugesetzt	+ +
	nicht zugesetzt	— -
Chlorella pyronoidosa	zugesetzt	+ +
	nicht zugesetzt	— —

Beispiel 6

Zellsuspensionen in physiologischer Kochsalzlösung wurden aus Candida utilis IFO-0396, Saccharomyces cerevisiae IFO-0209 und Hansenula anomala IFO-0122 hergestellt, die jeweils durch Schüttelkultur der Mikroorganismen in einem flüssigen Nährboden erhalten wurden, der 3% Glucose, 0,8% (NHi)₂SO₄, 0,5% KH₂PO₄, 0,2% NaCl, 0,2% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,1% Hefeextrakt (Gewichtsprozent) enthielt, und zwar bei einem pH-Wert von 5,2 und über einen Zeitraum von 20 h. Während dieser Zeit wurde mit einem Rotator (200 UpM) geschüttelt Ein Tropfen einer jeden Zellsuspension wurde auf einen Objektträger gebracht, und ein Tropfen der klaren Lösung des Enzymkompiexes von Pellicularia sasakü, wie in Beispiel 1, wurde diesem Tropfen der Zellsuspension auf dem Objektträger zugesetzt Die Flüssigkeiten dieser Tropfen wurden schnell vermischt und dann mit dem Deckglas zugedeckt Die so hergestellten Objektträger wurden in einem Raum bei einer konstanten Temperatur von 30⁰C aufbewahrt, und die Veränderung der Zellen in der

flüssigen Masse auf der Glasplatte wurde unter dem Mikroskop über bestimmte Zeit beobachtet Es konnte festgestellt werden, daß die Zellen mit der Zeit allmählich aufgelöst wurden. Der Grad der Auflösung der beobachteten Zellen wurde nach der folgenden Skala festgestellt:

+ bedeutet, daß die Auflösung der Zellen begonnen hat,

IU + + bedeutet, daß die Auflösung der Zellen fortschreitet,

+ + + bedeutet, daß die Auflösung der Zellen aufgehört hat,

— bedeutet, daß keine Veränderung bei den Zellen zu beobachten war.

Die Untersuchungsergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengefaßt Zum Vergleich wurde ein Versuch durchgeführt, bei dem ein Tropfen der Acetatpufferlösung an Stelle des Tropfens der Enzymlösung zugesetzt wurde. Bei den Vergleichsversuchen wurde keine Auflösung der Zellen beobachtet.

Tabelle II

Aufzulösender Mikro- Enzymorganismus zusatz

Grad der Auflösung der Zellen der Mikroorganismen mit Ablauf der Zeit (Minuten) 1 3 5 10 15 30 60 90

Candida utilis	ja
	nein
Saccharomyces	ja
cerevisiae	nein
Hansenula anomala	ja
	nein
	Beispiel 7

In einen konischen 300 ml-ErlenmeyerkoIben wurden 20 g Weizenkleie, 0,5 g eines Pulvers getrockneter Pilze (Cortinellus shiitake) und 16 ml einer wäßrigen 5%igen Ammoniumsulfatlösung gegeben, und der Inhalt des Kolbens wurde erwärmt und zu einer geiehförmigen .pastösen Mischung gerührt Dieses Nährmedium wurde 20 min bei 120° C mit Wasserdampf sterilisiert Eine Stammkultur von Pellicularia filamentosa wurde auf das sterile Kulturmedium aufgeimpft und die Festbodenkultur wurde 144 h lang bei 25⁰C durchgeführt Die hierbei erhaltene Kulrur wurde mit 8Om! entionisicrtcrn Wasser vermischt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde bewegt um sicherzustellen, daß der von Pellicularia filamentosa erzeugte Enzymkomplex in die flüssige Schicht extrahiert wurde. Die Mischung wurde dann unter Druck Filtriert, das Filtrat zentrifugiert, und man erhielt 65 ml einer klaren, den Enzymkomplex enthaltenden Lösung. Dieser klären Lösung wurde Ammoniumsulfat bis zu 70%iger Sättigung zugesetzt, so daß der Enzymkomplex ausfiel. Der Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet und man erhielt 1,7 g eines Enzympräparates in Pulverform.

Dieses Enzympräparat wurde in einer Acetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 5,0 aufgelöst um eine Enzymlösung herzustellen, die 1 % des Enzympräparats enthielt 10 ml dieser Enzymlösung wurden in ein L-förmiges Rohr gegeben undl g Trockenhefe oder 1 g getrockneter Chlorella wurden zusätzlich in das L-Rohr gegeben. Die Trockenhefe wurde aus einer Candida-Art hergestellt die inkubiert wurde, indem ein Nährmedium verwendet wurde, das eine paraffinische Erdöl-Kohlenwasserstoff-Fraktion als Kohlenstoffquelle enthielt Das L-Rohr wurde bei einer konstanten Temperatur von 40⁰C geschüttelt so daß die Enzyme mit den Zellen der Hefe oder der Chlorella zur Reaktion gebracht wurden und die Lysis der Zellwände bewirkten. Nach einer Reaktionszeit von i h oder 3 h wurden 3 ml einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung der Reaktionsmischung zugesetzt urn den pH-Wert auf etwa 7 ciüZüSiciicin. D;c fviiSCuUng Würde ΰαϊϊϊϊ Wiederum weitere 15 min geschüttelt und zentrifugiert um die Feststoffe zu entfernen. Die so erhaltene klare Lösung wurde auf den Gehalt an Zucker und Proteinen analysiert die aus den Zellen herausgelöst worden waren. Die Zucker wurden bestimmt durch eine kolorimetrische Methode bei 530 nm unter Verwendung von 3,5-Dinitrosalicylsäure als Farbentwicklungsmittel. Die Menge an Zucker wurde als Glucosemenge ausgedrückt Der Proteingehalt wurde berechnet, indem der Stickstoffgehalt der Proteine durch die bekannte Kjeldahl-Ninhydrinmethode bestimmt und der festgestellte Stickstoffgehalt mit 6,25 multipliziert wurde. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III zusammengefaßt Zu Vergleichszwecken wurde ein Versuch durchgeführt, in dem 10 ml einer Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5,0 an Stelle der oben angegebenen Enzymlösung verwendet wurde.

Tabelle ΠΙ

Aufzulösende Mikro- Enzym

organismen zusatz

Reaktionszeit	Gehalt an aus den Zellen her	Proteine
	ausgelösten Substanzen (in mg)	291,0
(Stunden)	Zucker	368,2
1	70,2	95,1
3	75,4	95,4
1	5,7	162,2
3	5,6	198,9
1	30,3	40,1
3	34,1	30,6
1	0,4
3	0,4

Getrocknete Hefe

Getrocknete
Chlorella

ja
nein

ja
nein

Beispiel 8

Durch diesen Versuch sollte gezeigt werden, daß der Enzymkomplex nach der vorliegenden Erfindung sich auch dazu eignet, verschiedene Nahrungsmittel und Getränke wie beispielsweise Tomatensaft, Kartoffelsaft und Orangensaft, vor dem Verderb zu bewahren.

10 ml-Portionen Tomatensaft, Kartollfelsaft und Orangensaft wurden in kleine Schalen gegeben. Das nach Beispiel 1 hergestellte Enzympräparat wurde mit einem Ionenaustauschharz gereinigt. 0,1 mg, 1 mg und 10 mg des gereinigten Enzympräparates wurden dem Inhalt der Schalen zugesetzt. Einigen Schalen der verschiedenen Getränke wurden keine Enzympräparate zugesetzt. Man ließ dann die Schalen an Luft bestimmte Zeit bei 28° C stehen, und ein Verderben wurde dadurch festgestellt, daß die Verfärbung das Aussehen und der Geruch der Säfte geprüft wurden. Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengefaßt. Das Symbol — gibt an, daß der Saft nicht verdorben war.

Tabelle IV	Enzymzusatz	Zeitablauf (Tage)	2	4	7
Material		1	iii +	III +	+ +Il
	kein Zusatz 0,1 mg/10 ml 1 mg/10 ml 10 mg/10 ml	I I I I	III +	:	+
Tomatensaft	kein Zusatz 0,1 mg/10 ml 1 mg/10 ml 10 mg/10 ml	111 +	I I I I	III +	III +
KartofTelsaft	kein Zusatz 0,1 mg/10 ml lmg/10 ml 10 mg/10 ml	I I I I
Orangensaft

Beispiel 9

Zu 100 g eines getrockneten Zellkuchens einer Candida lipolitica-Hefe wurde 1 1 einer wäßrigen Lösung (pH 5,0) eines O,5°/oigen, nach Beispiel 2 hergestellten Enzympräparates zugesetzt. Die Mischung wurde 30 min bei 35° C gehalten, um die enzymatische Reaktion durchzuführen. Anschließend wurde die Reaktionsmischung 1 1 einer wäßrigen 0,2 η Natriumhydroxidlösung zugesetzt Die Mischung wurde 30 min auf 50° C erwärmt, um sicherzustellen, daß das Protein der Hefezellen in die wäßrige Phase extrahiert wurde. Der dabei erhaltene wäßrige Extrakt wurde zentrifugiert, um den Zellkuchen zu entfernen, und die überstehende Flüssigkeit wurde mit 6 η-Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt, so daß das Protein beim isoelektrischen Punkt ausfiel. Die Menge des ausgefallenen Proteins entspricht 76% des gesamten Proteingehalts der Hefezellen. Wenn dieser Versuch ohne das Enzympräparat wiederholt wurde, beträgt die Menge des ausgefällten und isolierten Proteins nur 15% des gesamten Proteingehalts der Hefezellen.

Beispiel 10

10 g eines Futters, das aus getrockneten Candida utilis-Zellen bestand, wurden zu 100 ml einer wäßrigen Lösung (pH-Wert 6,0) gegeben, die 0,5% des nach Beispiel 3 hergestellten Enzympräparates enthielt. Die Mischung wurde 1 h bei 35°C gehalten, so daß die Enzyme mit den Zellwänden der Hefe reagierten. Die Reaktionsmischung wurde dann gefriergetrocknet und ergab ein pulverförmiges Futtermittel, das aus dsr mit Enzym behandelten Candida-Hefe bestand. Der Versuch wurde ohne Zusatz des Enzympräparates wiederholt, und man erhielt ein gepulvertes Futtermittel, das lediglich aus der gefriergetrockneten Candida-Hefe bestand. Die anfängliche getrocknete unbehandelte Candida-Hefe, die enzymbehandelte Candida-Hefe und die lediglich gefriergetrocknete Hefe wurden mit Pepsin behandelt, um die Verdaubarkeit festzustellen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V zusammengefaßt.

Tabelle V

Proben

Verdaubarkeit
durch Pepsin

Getrocknete Candidahefe
Unbehandelt (Vergleich)

Lediglich gefriergetrocknete
Candidahefe (Vergleich)

Candidahefe, behandelt mit dem
erfindungsgemäßen Enzymkomplex

58,4%
60,2%
97,7%

11

Beispiel

Einem Volumen einer klaren Lösung, die den nach Beispiel 5 mit Pellicularia sasakii hergestellten Enzym-

030 208/153

komplex enthielt, wurde zweimal Aceton zugesetzt, so daß der Enzymkomplex ausfiel. Der Niederschlag wurtle gesammelt und getrocknet und ergab ein pulverförmiges Enzympräparat 20 g eines nassen Kuchens (Feststoffgehalt: 48 Gewichtsprozent), der aus Candida utilis-Zellen bestand, wurde zu 100 ml einer wäßrigen Lösung (pH-Wert 4,0) gegeben, die ein Prozent des gepulverten Enzympräparates enthielt Die Mischung wurde dann 1 h bei 35⁰C leicht geschüttelt, um die enzymatische Reaktion durchzuführen. Nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung zentrifugiert, um die zurückbleibenden Feststoffe zu entfernen. Die überstehende Flüssigkeit wurde lyophilisiert, und man erhielt 7,8 g eines trockenen pulverförmigen Extrakts der löslichen intrazellulären Substanz der Candida utilis-Zellen. Die Analyse ergab, daß der trockene pulverförmige Extrakt 54,3% Rohproteine, 4,0% Rohfette, 1,7% rohe faserartige Materialien, 6,4% Asche und 33,6% lösliche Stickstoff-haltige Substanzen enthielt.

Das Verfahren wurde wiederholt, indem 100 ml Acetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 4,0 an Stelle der Enzymlösung zugesetzt wurden, und man erhielt lediglich 1,7 g eines trockenen Pulvers nach dem Lyophilisieren der überstehenden Lösung.

Beispiel 12

Ein Impfstoff aus der pathogenen Hefe Candida albicans wurde hergestellt, indem eine Schrägkultur dieser Hefe auf 100 ml eines Kartoffel-GIucose-Nährbodens aufgeimpft wurde. Dieser Ansatz wurde 24 h bei 30⁰C inkubiert, und der Nährboden wurde dann mit Wasser auf das lOfache Volumen des ursprünglichen Volumens verdünnt 1 ml-Portionen des so hergestellten Impfstoffs (der 6 χ lO^-Zellenkolonien ml enthielt)

wurden 10 ml-Portionen eines Kartoffel-Glucose-Nährbodens (pH-Wert 6,0) zugesetzt, der 0,5 mg, 1 mg, 2 mg, 4 mg, 8 mg, 16 mg bzw. 32 mg/ml) des Enzympräparates aus Pellicularia sasakii nach Beispiel 1 enthielt Der geimpfte Nährboden wurde stationär 24 h lang bei 35° C inkubiert, und dann wurde die Zahl der nicht lysierten Zellen von Candida albicans festgestellt Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefaßt

Tabelle VI

Gehalt an Enzympräparat im inkubierten Nährboden

(mg/ml)

Anzahl der Zellkolonien
je ml des Nährbodens

0,5

16
32

2X10⁶

IXlO⁵

7X10⁴

4X10⁴

2X10²

Beispiel 13

In diesem Beispiel wurden die enzymatischen Aktivitäten der Enzymkomplexe untersucht, die mit Pellicularia sasakii und Pellicularia filamentosa nach den Beispielen 4 und 2 hergestellt wurden. Die Bestimmung der enzymatischen Aktivitäten wurde in folgender Weise durchgeführt:

1) Cellulase-Aktivität: 5 ml einer Enzymlösung (pH-Wert 5,0), wurde in ein L-förmiges Rohr gegeben, und 2 Filterpapierstücke (1 cm χ 1 cm) wurden in die Enzymlösung in dem Rohr getaucht Die Lösung wurde mit einem Monod-Schüttler bei 40⁰C geschüttelt Es wurde die Zeit bestimmt, die notwendig war, bis die Filterpapierstücke vollständig zerfallen waren. Die Stärke der Cellulase-Aktivität wurde nach der folgenden Geichung berechnet:

Wirkungsstärke =

150

χ 1000

worin (x) die Zeit in Minuten bezeichnet, die notwendig war, bis das Filterpapier vollständig zerfallen war, und (y) das Volumen in ml der verwendeten Enzymlösung angibt.
2) /?-l,3-Glucanase-Aktivität: 0,5 ml einer Lösung von 1 % Laminarin wurde in ein Reagenzglas gegeben, und es wurden 0,5 ml einer verdünnten Enzymlösung (pH-Wert 5,0) zugesetzt. Die Mischung wurde 30 min auf 45°C erwärmt Anschließend wurde die in der Reaktionsmischung vorhandene Glucosemenge kolorimetrisch bestimmt. 1 ml der in der Reaktionsmischung gebildeten Glucose wurde als einer Einheit der /M.S-Glucanase-Aktivität je 0,5 ml der verdünnten Enzymlösung entsprechend gewertet.

3) Chitinase-Aktivität: Diese Aktivität wurde gemessen, indem 1 ml einer l%igen Suspension eines gepulverten Poly-N-acetylglucosamins (0,147 mm) bei pH 5 verwendet wurde und diese mit 1 ml verdünnter Enzymlösung 2 h bei 45°C umgesetzt wurde. Die Bildung von 1 μg/ml des N-Acetylglucosamins in der Reaktionsmischung wurde als die einer Einheit der Chitanase-Aktivität je ml der Enzymlösung entsprechende Menge gewertet.

Die optimale Temperatur und der optimale pH-Wert für die Enzymaktivitäten wurden, für die durch Pellicularia sasakii und Pellicularia filamentosa erzeugten Enzympräparate gemessen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen VII und VIII zusammengefaßt.

Die Enzymaktivitäten wurden mit einer nach Beispiel 5 hergestellten Enzymlösung gemessen.

Tabelle VH

Eigenschaften des von P. sasakii erzeugten Enzymkomplexes

Enzymatische Aktivität	Wirkungsstätte	Optimale	Optimaler
		Temperatur	pH-Wert
	(E/ml)	CQ
Zellwändelysierende Aktivität	210	30-40	5-7
Cellulase	500	40-50	5,0
jff-l,3-Glucanase	17,0	40-50	5,0
Chitinase	12,0	35	4,0-5,5

Tabelle VIII

Eigenschaften des von P. filamentosa erzeugten Enzymkomplexes

Enzymatische Aktivität	Wirkungsstärke	Optimale	Optimaler
		Temperatur	pH-Wert
	(E/ml)	TQ
Zellwandlysierende Aktivität	220	30-40	5-7
Cellulase	500	40-50	5
^-1,3-Flucanase	17,2	40-50	5,0
Chitinase	12,0	35	4,0-5,5

Claims (7)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung zellwändelysierender Enzymkomplexe, die folgende Eigenschaften besitzen:

(a) sie lysieren lebende und tote Zellen zumindest von Aspergillus niger, Penicillium steckii, Saceharomyces cerevisiae, Candida utilis, Candida albicans, Candida lipolitica, Lentinus edodes, Bacillus subtilis, Lactobacillus lactis und Chlorella,

(b) ihre zellwandlysierenden Aktivitäten sind stabil im pH-Bereich von 3 bis 9, wobei der optimale pH-Wert im Bereich von 5 bis 7 liegt,

(c) ihre zellwandlysierenden Aktivitäten sind optimal in einem Temperaturbereich von 30—40⁰C, wobei die optimale Temperatur in Abhängigkeit von der Natur der Mikroorganismen, deren Zellen lysiert werden sollen, variiert,

(d) ihre zellwandlysierenden Aktivitäten sind stabil in einem niedrigen Temperaturbereich, werden jedoch bei Temperaturen oberhalb von 50⁰C schnell inaktiviert,

(e) ihre zellwandlysierenden Aktivitäten werden durch die Gegenwart von Mn⁺⁺, Ni⁺⁺ oder Zn ^{+ +} inaktiviert,

(f) sie zeigen die enzymatischen Aktivitäten von Cellulase bei einem optimalen Temperaturbereich von 40-50⁰C und einem optimalen pH-Wert von 5,0, von Carboxymethylcellulase, von jS-l,3-Glucanase bei einem optimalen Temperaturbereich von 40—50⁰C und einem optimalen pH-Wert von 5,0, von Chitinase bei einer optimalen Temperatur von 35° C und einem optimalen pH-Bereich von 4,0-5,5, von Protease, Hemi-cellulase und Amylase, und

(g) sie setzen sich im wesentlichen aus Enzymkomponenten zusammen, die jeweils ein Molekulargewicht von mindestens 50 000 besitzen,

dadurch gekennzeichnet, daß ein bekannter Stamm von Pellicularia sasakii oder ein bekannter Stamm von Pellicularia filamentosa in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenwasserstoffquellen und assimilierbare Stickstoffquellen enthält, zur Erzeugung und Anreicherung des Enzymkomplexes im Nährmedium gezüchtet und dann der Enzymkomplex aus dem Nährmedium isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein bekannter Pellicularia-Stamm 48 bis 120 Stunden bei einer Temperatur von 20 bis 35"C unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Medium gezüchtet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein bekannter pellicularia-Stamm 3—10 Tage bei einer Temperatur von 20 —35°C in festem Nährboden gezüchtet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als eine der assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen Kleie verwendet, das Nährmedium mit Wasser oder gepuffertem Wasser zu einer wäßrigen Extraktlösung des Enzymkomplexes extrahiert, der Enzymkomplex aus dem Extrakt durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder durch Zusatz von Aceton oder Äthylalkohol ausgefällt und der Niederschlag dann getrocknet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in einem flüssigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet, entstandene Kulturbrühe zum Entfernen der Feststoffe filtriert, das erhaltene klare Filtrat durch eine Dialyse-Membran dialytisch konzentriert, der Enzymkomplex aus dem konzentrierten Filtrat durch Aussalzen oder durch Zugabe von Aceton oder Äthylalkohol ausgefällt und der Niederschlag dann getrocknet wird.

6. Zellwändelysierende Enzymkomplexe, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach dem den Verfahren gemäß Anspruch 1 —5 erhältlich sind.

7. Verwendung der zellwändelysierenden Enzymkomplexe gemäß Anspruch 6 zum Auflösen von Zellen von Mikroorganismen, einschließlich Bakterien, Pilzen, Hefen, Basidiomyceten und Chlorella, wobei die in einem wäßrigen Medium suspendierten Zellen mit den Enzymkomplexen oder mit den Enzymkomplexen in Form der entsprechenden Zuchtbrühe oder in Form eines Extraktes aus einem entsprechenden festen Nährboden behandelt werden.