DE2003595A1 - Verfahren zur Produktion von saurer Protease durch Hefe - Google Patents

Description

ANNASTRASSE 19 FERNSPtECHERi (0611) 555061 TELEGRAMMEi LOMOSAPATENT LANDESZENTRALBANK 4/951 DRESDNER BANK FFM., Nr. 5547« POSTSCHECK-KONTO FFM. 1667

Ajinomoto Go., Ine«

Noβ 7* 1-chome, Takara-cho, Chuo~ku,

Tokyo, Japan©

Verfahren zur Produktion von saurer Protease durch Hefe

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion von saurer Protease durch Mikroorganismen«

Es ist bekannt, daß verschiedene Schimmelpilze Protease produzieren, und alkalische Protease von Candida lipolytica ist die einzige bekannte Hefeprotease (japanische Auslegeschrift 41— 10194).

Es wurde gefunden, daß Hefe, die zu Rhodotorula gehört, große Mengen saurer Protease extrazellular in einem Kulturmedium pro« duziert. Saure Protease findet in der Medizin, in der Nahrunga« mittelindustrie und bei der Hydrolyse von Protein, z.B. der Hydrolyse von Sojabohnenprotein, Anwendung»

Mikroorganismen, die gemäß Erfindung benutzt werden können, sind Hefestämme, die zum Genus Rhodotorula gehören. Beispiele hierfür Bind die Mikroorganismen Ehodotorula glutinis AJ-5193 (NRRL Y~ 7220) sowie Rhodotorula attrauti»oa AJ~3145 (NRRL Y~7219). Rhodotorula glutinis AJ-5193 wurde aus dem Boden von Osaka, Japan, isoliert. Er weist die folgenden mikrobiellen Eigenschaften auf ι

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Wachstum in Hefe-Mais-Brühe bei 25°C für 3 Taget

Die Zellen sind rund, kurz-oval bis oval, bisweilen lang-oval, 2,5 bis 5*3 bis 7»5 ρ und treten einzeln oder in Paaren auf· Es wird eine unvollständiger Ring d Sedimente gebildet.

Wachstum auf Hefe-Malz-Agar bei 25°C für 10 Tagei

Eine Streifenkultur ist leicht rötlich-orange bis rosa* glatt, veich, glänzend und hat einen vollständigen Rand»

Sporenbildung! fehlt

Bildung von Pseudomycel und echtem Myceli fehlt Fermentation! fehlt

Assimilierung von Kohlenstoffverbindungen!

D—Glucose, D—Galactose, Saccharose, Maltose, L—Sorbose (latent), Cellobiose, Trehalose, Raffinose, Melecitose, D-Xylose, L-Arabinose, D-Arabinose, D-Ribose, Glycerin (latent), Adonit, Dulceeit (latent), D-Mannit, D-Sorbit, ^-Methyl-D-glucosi* (latent), Salicin, Kaliumgluconat, Bernsteinsäure und Citronensäure werden assimiliert.

Lactose, Melibiose, Inulin, lösliche Stärke, L-Rhamnose, Äthanol, Erythrit, Calcium-2—ketogluconat, DL—Milchsäure und Inosit werden nicht assimiliert»

Kaliumnitrat wird als einziger Stickstofflieferant benutzt« Urease! positiv

Thiamin wird bei 25°C benötigt«

Gelatine wird nicht verflüssigt (pH 6,2, 25°C)

Bei einem Vergleich der weiter oben angegebenen Eigenschaften mit "The Yeasty a Taxonomio Study» 1952, Seiten 469-470, von JoLodder und Kreger van Rij und "Journal of General and Applied Microbiology» Band 26, Seiten 207-208 1960, wurde AJ~5193 (NRRL-Y-7220)als Rhodotorula glutinis identifiziert·

Das Kulturmedium enthält einen assimilierbaren Kohlenstofflie— feranten, einen assimilierbaren Stickstofflieferanten, anorganische Salze und organische Nährstoffe, Beispiele fUr Kohlenstofflieferanten sind Kohlenhydrate, wie Glucose, oder Stärkehydrolysat, Kohlenwasserstoffe, wie η-Paraffin, und organische Säuren, wie Essigsäure oder Gluconsäure« Beispiele für assimilierbare Stiokst'jfflieferanten sind Ammoniumalfat, Harnstoff oder Ammoniumphosphat, für organische Nährstoffe Maisquell··

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wasser, Hefeextrakte, Sojabohnen- oder Caseinhydrolysat, Casaminosäure, Fleischextrakte oder verschiedene Vitamine.

Die Kultivierung sollte bei einem pH zwischen 1,5 und 4 durchgeführt werden· Tabelle 1 zeigt, daß saure Protease in neutralem pH-Bereich nicht gebildet wird, obgleich unter den Bedingungen ein reichliches Wachstum erzielt wird«

Tabelle 1

Kultivie«	Anfangs-pH 3*0.	Wachstum	Aktivität (E/ccm)	Anfangs-pH '	Wachs tum	7.0
rungsdaua· (Tage)	End-pH	0,860	41,2	End-pH	0,730	Aktivi tät (E/ccm)
2	2,05	0,820	62,8	6,2	0,850	3,2
3	1,9	0,750	73,2	6,3	0,766	0,8
4	1,9	0,750	74,2	6,7		2,0
5	H9		»4

Rhodotorula glutinis AJ-5193 (NRRL Y-7220) wurde auf einem Medium kultiviert, das
5 g/100 ecm Glucose

1 g/100 ecm Hefeextrakte
0,5 g/100 ecm KH₂PO.

0,04 g/100 ecm MgSO^ · 7 H₂O

2 ppm Fe- und Mn-Ionen

und den in der Tabelle weiter oben angegebenen pH aufwies. Das Wachstum wurde durch Messung des Lichtabsorptionsvermögens bei 560 mu des kultivierten Mediums nach Verdünnung auf das 26-fache seines Anfangavolumens bestimmt·

Es wurde eine 1,5#ige Lösung von Milchcasein in 1/10 M Milchsäure-Natriumlactat-Pufferlösung vom pH 3,0 hergestellt, 1 ecm der verdünnten Proteaselösung, die zuvor 6 Minuten auf 37⁰C erwärmt worden war, zu 3 ecm der Caseinlösung »«gegeben und die Mischung 10 Minuten bei 37°0 der Inkubation unterworfen. Die erhaltene Mischung versetzte man mit 4 ecm 0,4 M Trichlor« eseigsäure, ließ sie weitere 25 Minuten stehen und filtriert· ausgefallenen Niederschlag ab. 1 ecm des Piltrats mischte man mit 5 ecm 0,4 M Na₂CO, und 1 com Folin»s Reagens. Die Menge der

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bei 37⁰G in 10 Minuten in Trichloressigsäure lösliche Fraktion freigesetzten Arylsäure wurde aus dem Lichtabsorptionsvermögen der Mischung bei 660 πψ. bestimmt. Eine Proteaseeinheit ((f) entspricht der Proteaseaktivität, die 1 ug Tyrosin in Trichloressigsäure lösliche Fraktion pro Minute freisetzt.

Zur Isolierung der sauren Protease aus dem kultivierten Medium können die konventionellen Methoden für die Isolierung saurer Protease angewandt werden, z.B» Fällung, Aussalzen, Fällung mit organischem Lösungsmittel und/oder Chromatographie.

Die gemäß Erfindung produzierte saure Protease hat folgende Eigenschafteni

optimaler pH-Wert gegen Milchcaseinsubstrati 2,0 -2,5 optimale Temperatur! 60 - 65° C bei pH 2,5

Inaktivierung konnte beim Erhitzen auf 5O⁰C für 2 Stunden bei pH 1,5 - 6,0 nicht festgestellt werden.

Die gemäß Erfindung erhaltene saure Protease wurde durch Natriumlaurylsulfat nicht inaktiviert, im Gegensatz zu der Inaktivierung der durch bekannte Schimmelpilze produzierten sauren Protease.

Die spezifische Aktivität pro Mengeneinheit Protein gemäß der Erfindung beträgt das 4fache der von Pepsin des Handels und das 2,5-fache der von "Molsine" (Handelename für saure Protease von Schimmelpilzen)«

Beispiel 1

Es wurde ein Kulturmedium hergestellt, das 5 g/100 ocm Glucose

0,3 g/100 ecm KH₂PO₄

Of04 g/100 ecm MgSO₄ .7H₂O

2 ppm Fe- und Mn-Ionen und 1 g/100 ocm Hefeextrakte

enthielt, der pH des Mediums auf 3#0 eingestellt und je 50 ecm von dem Medium in 500 ccm-SchUttelkolben gegeben. Nach Sterilisation bei 115⁰C für 10 Minuten wurde dae Medium mit Rhodotorula glutinis AJ-5193 (NRRL Y-7220) beimpft, der zuvor auf einer Schrägschnitte derselben Zusammensetzung wie oben

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kultiviert wo.rden war und die Kultivierung bei 31°C 4 Tage unter Schütteln durchgetihrt. Das kultivierte Medium enthielt, wie gefunden wurde, 120 E/ccm saure Protease·

Die Hefezellen zentrifugierte man aus 1,5 1 des Kulturmediums ab, kühlte das erhaltene Filtrat und versetzte es mit 55 fi (Volumenteilen) Aceton, um die Verunreinigungen zu fallen, die man dann abzentrifugierte. Zu der üoerstehenden Flüssigkeit gab man Aceton bis zu einer 75$igen Acetunkonzentration, um die saure Protease zu ictllen, die man abzentrifugierte und im Vakuum trocknete» Man erhielt 1,45 g rohes Enzympulver· 1 g des Enzympulvers löste man in 200 ecm Citronensäure-HOl-Puiferlösung von pH 4_t0, führte die Enzymlösung durch eta Kolonne, gapackt mit Sephadex G-200 (Handelsname) von 8x200 cm, das zuvor mit einer Pufferlösung behandelt worden war, und sammelte die Fraktionen mit saurer Proteaseaktivitat· Die vereinigten Fraktionen versetzte man nanh und nach mit Aceton, kühlte die Mischung über Nacht in einer Eisbox, wobei rohe farblose Kristalle ausfielen, die man isolierte· Die .Rohkristalle kristallisierte man wiederholt aus Aceton um, wobei man 0,62 g kristalline saure Protease erhielt· Das Enzympräparat zeigte folgende Charakteristiken Λmax 280 ία und Amjn 230 ma

?8Ω
und Efg/ * 1ο,ο· Die spezifische saure Proteaseaktivitat des Enzympräparats betrug das 5t24-fache der von kristallinem Pepsin der Sigma Chemical Co., USA, dessen E w « 12,4 war«

.Beispiel 2

Ein Kulturmedium, das

5 g/100 ecm Glucose,
0,3 g/100 oom KH₂PO₄,
0,04 g/100 com MgSO₄ . 7 H₃O,

1 g/100 oom Uasaminosäure,
50 ug/100 oem Vitamin B₁ und

2 ppm Fe- und Mn-ionen

enthielt und pH 2,5 aufwies, wurde mit Hhodotorula glutinia AJ-* 5193 (NRRL Y-7220) üeimpft und die Kultivierung 4 Tage bei 25*0 unter Sohütteln durohgettführt· Das kultivierte Medium enthielt, wie gefunden wurde, 190 E/oom saure Protease. 3»5 1 des Kulturmediums wurden in der in Beispiel 1 angegebenen Weise

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weiter aufgearbeitet, wobei man 5»35 g rohes Enzympulver erhielt»

Beispiel 3

Ein Kulturmedium mit

9,0 g/100 ecm Glucose,

O₉3 g/100 ecm KH₂PO.,

0,04 g/100 oem MgSO₄ · 7 H₂O,

2 ppm Pe- und Mn-Ionen und 1 g/100 ecm Sojabohnenproteinextrakte

von pH 3f0 wurde mit Rhodotorula aurantiaca AJ-4860 (NRRL Y—7219) beimpft und die Kultivierung 4 Tage bei 31,5⁰C durchgeführt* Das kultivierte Medium enthielt - wie gefunden wurde 100 E/ccm saure Protease»

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Claims (6)

Patentansprüche

1) Saure Protease folgender Eigenschaftens

1) optimaler pH gegen Milchcaseinsubstratt 2,0 "bis 2,5

2) optimal Temperatur 60 bis 65°C bei pH 2,5

3) durch Natriumlaurylsulfat keine Inaktivierung

4) beständig beim Erhitzen auf 5O⁰O bei pH 1,5 bis 6,0 für 2 Stunden«

2) Verfahren zur Herstellung saurer Protease gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hefestamm des Genus Rhodotorula in wäßrigem saurem Medium sonst üblicher Zusammensetzung unter aeroben Bedingungen kultiviert wird, bis das Medium extracellulare saure Proteaseaktivitat aufweist und die saure Protease aus dem Medium isoliert wird«

3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Medium als Lieferanten für assimilierbaren Kohlenstoff Glucose und als Lieferanten für assimilierbaren Stickstoff Protein sowie organische Nährstoffe, die das Wachstum begünstigen, enthält»

4) Verfahren nach Anspruch 1-3» dadurch gekennzeichnet, daß als Hefestamm ein solcher der Art Rhodotorula glutihis oder Rhodotorula aurantiaca verwendet wird*

5) Verfahren nach Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, daß als Hefestamm Rhodotorula glutinis AJ-5193 (NRRL Y-7220) oder Rhodotorula aurantiaca AJ-4860 (NRRL Y-7219) verwendet wird.

6) Verfahren nach Anspruch 1-5» dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung der Hefe in einem Medium von pH 1,5 bis 4 durchgeführt wird.

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