DE2418365A1

DE2418365A1 - Verfahren zur herstellung von l-arginin durch fermentierung

Info

Publication number: DE2418365A1
Application number: DE2418365A
Authority: DE
Inventors: Ichiro Chibata; Jyoji Kato; Masahiko Kisumi
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1973-04-16
Filing date: 1974-04-16
Publication date: 1974-10-24
Also published as: FR2225519A1; JPS5120599B2; JPS49126891A; CH593338A5; GB1455638A; US3902967A; FR2225519B1

Description

25 281 n/wa

TANABE SEIYAKU CO., LTD., OSAKA-SHI, OSAKA-PU

JAPAN

Verfahren zur Herstellung von L-Arginin durch Fermentierung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von L-Arginin durch Fermentierung. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung von L-Arginin durch Kultivierung eines Pyrimidinstoffwechselantagonisten-

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resistente Mutanten eines Mikroorganismus, der 2ur Erzeugung von L-Arginin in einem Medium fähig ist,und Gewinnung des erzeugten L-Arginins aus der Brühe.

L-Arginin stellt eine der natürlichen Aminosäuren dar und ist als Heilmittel verwendbar, nach dem in jüngster Zeit eine zunehende Nachfrage besteht. Die Produktion von L-Arginin wird normalerweise durch Extraktion von Proteinhydrolysaten durchgeführt, wobei jedoch das Extraktionsverfahren sehr kompliziert ist und das durch herkömmliche Verfahren erzeugte L-Arginin zu teuer ist.

Kürzlich ist ein Fermenterungsverfahren zur Herstellung von L-Arginin unter Verwendung eines Bakteriums beschrieben worden, welches gegenüber L-Arginin-Antagonisten resistent ist, d.h. ein L-Argininstoffwechselantagonisten-resistenter Mutant mit schädlichem bzw. defektem Argininregelmechanismus (Appl. Microbiol. Vol. 22, S. 987-991, 1971; Arg. Biol. Chem. Vol. 36, S.1675-1684, 1972; japanische Patentauslegeschrift Nr. 3391/1973).

Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen verbessern nicht nur die Biosynthese von L-Arginin, sondern auch die Biosynthese der Substanz, die mit dem Zwischenprodukt zur Biosynthese von L-Arginin kondensiert wird.

Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass Carbamylphosphat, das ein Zwischenprodukt für die Biosynthese von Pyrimidinnucleotid darstellt, an der Biosynthese von L-Arginin mittels eines Mikroorganismus, der zur Produktion von L-Arginin fähig ist, teilnimmt, wurde im Rahmen der Erfindung die Mutation des Mikroorganismus zu einem Mutanten versucht, der gegenüber

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Pyrimidinstoffwechselantagonisten, wie 5-Azauracil, 6-Azauracil, 2-Thio_wuracil, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Azacytosin, 6-Aza-cytosin und den entsprechenden Nucleosiden resistent ist, wobei gefunden wurde, dass in dem Pyrimidinstof fwechselantagonisten-resistenten Mutanten die Stoffwechselregulierung der Pyrimidinnucleotidbiosynthese gestört bzw. defekt ist und hierdurch die Fähigkeit zur Erzeugung von Carbamylphosphat als Zwischenprodukt für die Biosynthese erhöht und auch dessen Menge gesteigert wird. Weiter wurde gefunden, dass der resistente Mutant vie^Anehr L-Arginin in einem Nährmedium, das eine übliche Kohlenstoffquelle enthält, im Vergleich zu einem Mikroorganismus ansammeln kann, der lediglich die Biosynthese von L-Arginin verbessert.

Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von L-Arginin durch Kultivierung eines Pyrimidinstoffwechselantagonisten-resistenten Mutanten eines Mikroorganismus , der zur Erzeugung von L-Arginin zur Ansammlung von L-Arginin in einem Medium fähig ist, und durch Abtrennung des erzeugten L-Arginins aus der Brühe geschaffen.

Der in der Erfindung verwendete resistente Mutant schliesst Pyrimidinstoffwechselantagonisten-resistente Mutanten ein, die von einem Mikroorganismus, der zur Erzeugung von L-Arginin fähig ist, abgeleitet sind, wobei geeignete Beispiele hierfür 6-Aza^uracil-resistente Mutanten, 2-Thiouracil-resistente Mutanten und 6-Azauridin-resistente Mutanten darstellen können, die von einem Argininhydroxamat-resistenten Mutanten von Bacillus subtilis abgeleitet werden können. Die repräsentativen Mutanten sind bei der American Type Culture Collection, USA (nachstehend als ATCC bezeichnet) und dem Fermentation

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Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan (nachstehend als FERM bezeichnet) hinterlegt. Es sind Bacillus subtilis AHr.AUr-9 (Argininhydroxamat-resistenter und 6-Azauracil-resistenter Mutant: ATCC Nr. 31002; FERM-P Nr. 1998), Bacillus subtilis AHr.TUr-61 (Argininhydroxamat-resistenter und 2-Thiouracil-resistenter Mutant: ATCC Nr. 31 003; FERM-P Nr. 1999) und Bacillus subtilis AHr.AUDr-62 (Argininhydroxamat-resistenter und 6-Aza-uridin-resistenter Mutant: ATCC Nr. 31004; FERM-P Nr. 2000).

Diese resistenten Mutanten können durch Mutation eines ursprünglichen Stammes durch ein herkömmliches Mutationsverfahren erhalten werden, beispielsweise durch Ultraviolettbestrahlung oder ein chemisches mutierendes Agens (z.B. N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin oder Äthylmethansulfonat), Kultivierung des derart erhaltenen Mutanten in einem Plattenmedium (z.B. Spizizen's Minimalmedium), welches 6-Aza-uracil (0,5 mg/ml), 2-Thiouracil (0,5 mg/ml) oder 6-Aza-uridin (2 mg/ml) enthält, während 3 bis 4 Tagen, und Abtrennung der hierdurch erzeugten grossen Kolon—ien.

Die resistenten Mutanten können auch durch jegliche anderen Mutationsverfahren erhalten werden, beispielsweise dadurch, dass man einem Mikroorganismus, der zur Erzeugung von L-Arginin fähig ist, eine Pyrimidinstoffwechsel-Resistenz verleiht oder umgekehrt, indem man einem Mikroorganismus zunächst eine Pyrimidinstoffwechsel-Resistenz verleiht und sodann eine Fähigkeit zur Herstellung von L-Arginin verleiht oder indem man gleichzeitig beide Eigenschaften dem Mikroorganismus verleiht.

Das zur Kultivierung der resistenten Mutanten gemäss der

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Erfindung verwendete Medium kann 5 bis 15 Gew.% Saccharide (ζ. B. Glucose oder Stärkehydrolysate) als Kohlenstoffquelle, 0,5 bis 4 Gew.% eines anorganischen Ammoniumsalzes (z.B. Ämmoniumchlorid oder Ammoniumsulfat), Harnstoff oder dergleichen als Stickstoffquelle und 0,02 bis 2 Gew.% eines Peptones, Hefeextraktes, Maisstärkesaftes oder dergleichen als organisches Nährmittel und gegebenenfalls eine kleine Menge eines anorganischen Salzes (z.B. Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat oderEisen(III)sulfat) einschliessen. Die Zugabe von Kaliumcarbonat oder dergleichen, zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes des Mediums auf einem Wert von 6 bis 9 ist bevorzugt. Darüber hinaus ist die Zugabe von 1 bis 5 Gew.% Glutaminsäure und/oder Asparaginsäure zu dem Medium zur Begünstigung der sich anhäufenden Menge des gewünschten L-Arginins, bevorzugt.

Gemäss der Erfindung kann der resistente Mutant in ein Medium, das die vorstehend arweführten Komponenten enthält, inoc-uliert werden und wird unter aeroben Bedingungen, wie beispielsweise durch starkes Schütteln bei 25 bis 37°C während 1 bis Tagen, kultiviert, wodurch sich das gewünschte L-Arginin in der Brühe anhäuft. Das L-Arginin wird in einer grossen Menge in der Brühe angehäuft, während andererseits die als Nebenprodukt entstehenden, von L-Arginin verschiedenen Aminosäuren, in äusserst geringer Menge mit eingeschlossen werden. Das hierdurch erzeugte L-Arginin kann sehr leicht durch ein herkömmliches Verfahren, beispielsweise unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes, gewonnen werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Die in den Beispielen angegebenen prozentualen Werte stellen Gewichtsprozente dar.

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Beispiel 1

In einen 500 ml-Schüttelkolben wird ein Medium (pH 7,6; 30 ml), das 8 % Glucose, 2,5 % Ammoniumchlorid, 3,5 % L-GIutaminsäure, 0,1 % Pepton, 0,1 % Hefeextrakt, 0,5 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 % Magnesiumsulfat und 2 % Kaliumcarbonat enthält, eingegeben und das Gemisch wird unter Druck sterilisiert. Die dem Medium zugefügte Glucose und das Kalciumcarbonat werden zuvor sterilisiert. Das Medium wird mit einer Platinschleife von Bacillus subtilis AHr.AUr-9 (ATCC Nr. 31002; FERM-P Nr. 1998) inoc-uliert und einer Schüttelkultur bei 30°C während 72 Stunden unterworfen. L-Arginin wird in einer Menge von 28,6 mg/ml in der Brühe erzeugt.

Beispiel 2

In einen 500 ml-Schüttelkolben wird ein Medium (pH 7,6; 30 ml), das 8 % Glucose, 2,5 % Ammoniumchlorid, 3,5 % L-Asparaginsäure, 0,1 % Pepton, 0,1 % Hefeextrakt, O,5 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 % Magnesiumsulfat und 2 % Kalciumcarbonat enthält, eingegeben und das Gemisch wird unter Druck sterilisiert. Die dem Medium zugefügte Glucose und das Kalciumcarbonat werden zuvor sterilisiert. Das Medium wird mit einer Platinschleife von Bacillus subtilis AHr.AUr-9 (ATCC Nr. 31002; FERM-P Nr. 1998) inoc-uliert. Es wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. L-Arginin wird in einer Menge von 31,2 mg/ml in der Brühe gebildet.

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Die hierdurch erhaltene Brühe (1 1) wird gesammelt, erhitzt und sodann filtriert. Das Filtrat wird durch eine mit Amberlit IR-120 (Η-Typus) gefüllte Säule geführt und sodann die Säule mit Wasser gewaschen. Das adsorbierte L-Arginin wird mit 5 %igem wässrigen Ammoniak eluiert. Das Eluat wird unter verringertem Druck konzentriert. Zu dem Rückstand werden Chlorwasserstoffsäure und Methanol hinzugegeben und die ausgefällten Kristalle werden durch Filtration abgetrennt. Die Kristalle werden aus wasserhaltigem Methanol unter Erhalt von L-Argininhydrochlorid (29 g) umkristallisiert.

Beispiel 3

Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass Bacillus subtilis AHr.TUr-61 (ATCC Nr. 31003; FERM-P Nr. 1999) anstelle von Bacillus subtilis AHr.AUr-9 (ATCC Nr. 31002; FERM-P Nr. 1998) verwendet wird. L-Arginin wird in einer Menge von 20,5 mg/ml in der Brühe erzeugt.

Beispiel 4

Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass Bacillus subtilis AHr.AUDr-62 (ATCC Nr. 31004; FERM-P Nr. 2000) anstelle von Bacillus subtilis AHr.AUr -9 (ATCC Nr. 31002; FERM-P Nr. 1998) verwendet wird. L-Arginin wird in einer Menge von 23,9 mg/ml in der Brühe erzeugt.

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Claims

P at entansprüche

Π), Verfahren zur Erzeugung von L-Arginin_f dadurch gekennzeichnet , dass man einen Pyrimidinstoffwechselantagonisten-resistenten Mutanten eines
Mikroorganismus/ der zur Erzeugung von L-Arginin fähig ist, in einem Medium kultiviert und das erzeugte L-Arginin aus der Brühe gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der Pyrimidinstoffwechselantagonist eine unter 5-Azauracil, 6-Azauracil, 2-Thiouracil, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Azacytosin, 6-Azocytosin und den entsprechenden Nucleosiden ausgewählte Verbindung darstellt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der resistente Mutant Bacillus subtilis AHr.AUr-9 (Argininhydroxamat-resistenter und
6-Azauracil-resistenter Mutant: ATCC Nr. 31002; FERM-P Nr. 1998) darstellt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, d-durch gekennzeichnet, dass der resistente Mutant Bacillus subtilis AHr.Tür-61 (Argininhydroxamat-resistenter und 2-Thiouracil-resistenter Mutant: ATCC Nr. 31003; FERM-P Nr. 1999) darstellt.

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5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet / dass der resistente Mutant Bacillus subtilis AHr.AUDr-62 (Argininhydroxamat-resistenter und 6-Azauridin-resistenter Mutant: ATCC Nr. 31004; Ferm-P Nr. 2000) darstellt.

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