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DE19638745C2 - Monoklonale Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne des menschlichen VEGF - Rezeptorproteins (KDR) - Google Patents

Monoklonale Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne des menschlichen VEGF - Rezeptorproteins (KDR)

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DE19638745C2
DE19638745C2 DE19638745A DE19638745A DE19638745C2 DE 19638745 C2 DE19638745 C2 DE 19638745C2 DE 19638745 A DE19638745 A DE 19638745A DE 19638745 A DE19638745 A DE 19638745A DE 19638745 C2 DE19638745 C2 DE 19638745C2
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft von Hybridomzellinien sezernierte monoklonale Antikörper, die gegen ein Epitop der extrazellulären Domänen 1-7 des menschlichen VEGF-Rezeptors KDR (kinase insert domain containing receptor) gerichtet sind, die Verwendung des Verfahren zum Nachweis des menschlichen VEGF-Rezeptors KDR aus Zellysaten oder Gewebeanalysaten und die Verwendung der Antikörper in analytischen Assays, in der Dignostik und als Trägermoleküle für therapeutische Stoffe.
Neue Gefäße entstehen als Kapillaren, die von bestehenden kleinen Gefäßen aussprießen. Dieser als Angiogenese bekannte Vorgang findet als Antwort auf bestimmte Signale statt (Alberts et al., Molekularbiologie der Zelle, Verlag Chemie, Weinheim).
Angiogenese ist ein Prozeß der sorgfältig durch die Interaktion des vaskular endothelialen Wachstumsfaktors (vascular endothelial growth factor) und seines entsprechenden hochaffinen KDR-Rezeptors an Endothelzellen kontrolliert wird. KDR wurde als transmembraner Tyrosinkinase-Rezeptor vom Subtyp 5 charakterisiert, der als Schlüsselregulator der vascularen Endothelzell-Entwicklung während der Embryogenese und der Zellregeneration dient (Cancer and Metastasis Reviews 15: 159-163, 1996).
Weiterhin führt die Disfunktion dieser normalerweise sorgfältig regulierten Liganden- Rezeptor Interaktion zu einem gestörten Angiogeneseprozeß, ein Merkmal vieler Krankheiten.
Als besonder wichtig hat sich herausgestellt, daß das Wachstum von Tumoren und deren Metastasen hochgradig angiogeneseabhängig ist.
Es ist bereits ein monoklonaler Antikörper mit einem begrenzten Reaktionsmuster bekannt. Dieser Antikörper ist gegen die extrazelluläre Domäne des Maus KDR- homologen flk-1 gerichtet und ist in der Lage, die VEGF-Stimulation eines chimären flk-1/fms-Rezeptors, der in transfizierten 3T3 Zellen exprimiert, zu neutralisieren (Rockwell et al., Molecular and Cellular Differentiation, 3 (1): 91-109, (1995)). Es ist ferner bekannt, dass der VEGF-Rezeptor Flt-1 biologische Aktivität vermittelt (Clauss et al., J. Biol. Chem., Vol. 271,30, 17629-17634, (1996). Beschrieben wird in dieser Publikation jedoch ein r-212 polyklonales Serum und kein polyklonaler Antikörper, wie in der vorliegende Anmeldung.
Monoklonale Antikörper, die für ein breites Spektrum analytischer Assays verwendet werden können und Verfahren zum Nachweis des menschlichen VEGF-Rezeptors KDR aus Zellysaten und Gewebeanalysaten unter Verwendung dieser Antikörper sind bisher nicht bekannt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, von Hybridomzellinien sezernierte monoklonale Antikörper bereitzustellen. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können für eine breites Spektrum analytischer Verfahren bzw. Assays, in der Diagnostik und als Trägermolekül für therapeutische Stoffe verwendet werden. Es werden nun monoklonale Antikörper bereitgestellt, die gegen ein Epitop das innerhalb der extrazellulären Domänen 1-7 des menschlichen VEGF- Rezeptors KDR lokalisiert ist, gerichtet sind.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung monoklonale Antikörper, die gegen ein Epitop das innerhalb der extrazellulären Domänen 6 und 7 des menschlichen VEGF-Rezeptors KDR lokalisiert ist, gerichtet sind.
Versuchsgemäß werden diese monoklonalen Antikörper mit AM 2-7-9, AM 2-10-1, AM 5-1-2, AM 5-10-13 und AM 2-4-1 bezeichnet.
Diese Antikörper sind spezifisch gegen ein Epitop, das innerhalb der extrazellulären Domänen 6 und 7 des menschlichen VEGF-Rezeptors KDR lokalisiert ist, gerichtet.
Die erfindungsgemäßen Antikörper zeigen eine hohe Selektivität in einem breiten Spektrum analytischer Verfahren bzw. Assays.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper haben den Vorteil, daß sie weder mit der ligandenbindenden Domäne interferieren noch KDR nach der Bindung aktivieren.
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind auch wertvoll für diagnostische Zwecke.
So können die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper verwendet werden für Westerblots, Immunpräzipitation, ELISA, FACS-Analyse und in der indirekten Immunfluoreszenz-Mikroskopie.
Eine weitere Verwendung der monoklonalen Antikörper ist in der Immunhistochemie möglich.
Ferner können die monoklonalen Antikörper zum Screenen nach kleinen agonistischen und antagonistischen Molekülen und zur Detektion mutanter Rezeptorsubtypen verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können ferner in der Diagnostik zur Anwendung kommen, wobei diese in Kombination mit einer geeigneten kontrastgebenden Substanz gekoppelt werden können. Hierbei reagieren die Antikörper mit einem Epitop, das nicht innerhalb der Ligandenbindungsseite des KDR lokalisiert ist und deshalb in der Lage ist, mit allen KDR-Rezeptorpopulationen zu reagieren.
Eine bevorzugte kontrastgebende Substanz die an die Antikörper gekoppelt werden kann ist 99-M Technetium.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können auch bei angiogenetisch abhängigen Phänotypen, wie Tumoren, deren Metastasen, rheumatoider Arthritis oder Psoriasis, oder sich daraus ergebender Krankheitssymptome, gekoppelt mit geeigneten toxischen Substanzen, zur Anwendung kommen.
Geeignete toxische Substanzen sind dem Fachmann hinreichend bekannt und sind z. B. in Byers & Baldwin, Immunology (1988), 65, 329-335 und in Blakey et al., Waldmann H. (ed): Monoclonal Antibody Therapy, Prog. Allergy, Basel, Karger, (1988), vol. 45, 50-90 beschrieben.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der mRNA, die für die schwere und die leichte Kette der erfindungsgemäßen Antikörper kodiert, zur Herstellung rekombinanter "single chain"-Antikörper.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der über die mRNA kodierten rekombinanten Antikörper für Westerblots, Immunpräzipitation, ELISA und FACS- Analyse, in der indirekten Immunfluoreszenz-Mikroskopie und Immunhistochemie und zum Screenen nach kleinen agonistischen und antagonistischen Molekülen und zur Detektion mutanter Rezeptorsubtypen.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung eines Verfahren zum Nachweis des menschlichen VEGF-Rezeptors KDR aus Zellysaten oder Gewebeanalysaten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
  • 1. die monoklonalen Antikörper, die gegen ein Epitop des innerhalb der extra­ zellulären Domänen 1-7 des menschlichen VEGF-Rezeptors KDR lokalisiert ist, gerichtet sind, in gereinigter Form mit einer Konzentration von 1-10 µg/ml in Koppel-Puffer an ELISA-Platten als Fänger-Antikörper gekoppelt und anschließend überschüssige Bindungsstellen mit Blockierungs-Puffer blockiert werden,
  • 2. Zell- oder Gewebeanalysate in einem geeigneten Lysis-Puffer herstellt,
  • 3. die Platten vor Aufbringen der Lysate in Waschpuffer gewaschen werden,
  • 4. die Quantifizierung von zu bestimmendem KDR-Protein in der Probe durch rekombinantes KDR-Protein als Standardkurve erfolgt,
  • 5. die zu messenden Gewebe- und Zellysate anschließend in das Testsystem eingebracht werden,
  • 6. eine Inkubation bei Raumtemperatur für zwei Stunden erfolgt,
  • 7. anschließend die ELISA-Platten gewaschen werden,
  • 8. der Nachweis des "gefangenen" KDR mittels eines polyklonalen anti-KDR Antiserums erfolgt
und schließlich
  • 1. die Detektion mittels eines chromogenen, chemilumineszenten oder radioaktiven Stoffes erfolgt.
Die Verwendung des Verfahrens kann auch als Kinase-Test-Verfahren erfolgen, das den Tyrosin-phosphorylierten KDR nachweist.
Um eine Quantifizierung des verwendeten Test-Verfahrens zu ermöglichen, kann rekombinanter phosphorylierter KDR als Standardprotein eingesetzt werden.
Der Nachweis des menschlichen VEGF-Rezeptors KDR aus Zellysaten oder Gewebeanalysaten kann über das Verfahren sowohl qualitativ als auch quantitativ erfolgen.
Das in Verfahrensstufe 8 verwendete polyklonale anti-KDR Antiserum kann z. B. polyklonales anti-phosphothyrosin Antiserum oder ein monoklonaler anti- Phosphotyrosin Antikörper sein.
Die in Verfahrensstufe 9 durchgeführte Detektion kann vorzugsweise mit Peroxidase markierten sekundären Antikörpern und geeigneten chromogenen oder chemilumineszenten Substraten durchgeführt werden.
Das verwendete Antiserum kann z. B. aus Ziege oder Kaninchen oder aus Schaf, Ratte oder Esel sein, entweder direkt als enzymmarkiertes Immunglobulin oder indirekt mittels enzymmarkierter anti-Ziege-, anti-Kaninchen-, anti-Schaf-, anti-Ratte- bzw. anti-Eselantikörper. Hierzu wird entweder Alkalische Phosphatase oder Peroxidase verwendet.
Die in Verfahrensstufe 1 verwendeten ELISA-Platten können Antikörper-beschich­ tet und blockiert sein.
Der in Verfahrensstufe 2 verwendete Lysis-Puffer enthält 1-5 mM divalente Ionen und 1-15% Glycerin.
Vorzugsweise enthält der Lysis-Puffer 1-2 mM divalente Ionen und 5-12% Glycerin.
Besonders bevorzugt ist ein Lysis-Puffer, der 1,5 mM divalente Ionen und 10% Glycerin enthält.
Ein bevorzugtes divalentes Ion ist z. B. Magnesium.
Für die im Verfahren verwendeten Wasch- und Verdünnungspuffer können alle dem Fachmann hierfür geläufigen Puffer verwendet werden.
Bevorzugte Waschpuffer sind die, die PBS mit 0,05% Detergenz und 0,1% Rinderserumalbumin enthalten.
Bevorzugte Verdünnungspuffer sind solche, die 1% Rinderserumalbumin enthalten.
Beschreibung der Abbildungen
Fig. 1 zeigt ein Gel mit dem spezifischen Reaktionsmuster am Beispiel des monoklonalen Antikörpers AM 2-10-1.
In der Abbildung bedeuten: Spur 1: Schweineaorta-Endothelzellen, 25 µg Gesamtzellysat
Spur 2: Schweineaorta-Endothelzellen, mit humanem KDR transfiziert, 25 µg Gesamtzellysat
Spur 3: CHO-Zellen, mit humanem KDR transfiziert, 25 µg Gesamtzellysat
Spur 4: CHO-Zellen, 25 µg Gesamtzellysat
Spur 5: Menschliche Nabelschnur-Endothelzellen, Passage 6,25 µg Gesamtzellysat
Spur 6: Mäuse Endothelzellen, 25 µg Gesamtzellysat,
Fig. 2 zeigt das Gel der Immunpräzipitation mit den monoklonalen Antikörpern AM 2- 10-1 und AM 2-7-9.
In der Abbildung bedeuten: Spur 1: 5 µg AM 2-7-9
Spur 2: 1 µg AM 2-7-9
Spur 3: 5 µg AM 2-10-1
Spur 4: 1 µg AM 2-10-1
Spur 5: Isotypkontrolle, 10 µg unspezifischer Antikörper der Subklasse IgG1
Fig. 3 zeigt das Epitop-Mapping.
In der Abbildung bedeuten: Spur 1: löslicher KDR, Domäne 1 und 2
Spur 2: löslicher KDR, Domäne 1 bis 3
Spur 3: löslicher KDR, Domäne 1 bis 5
Spur 4: löslicher KDR, Domäne 1 bis 7
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele beschreiben die Herstellung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sowie deren Verwendung, ohne jedoch die Erfindung auf diese Beispiele einzuschränken.
1. Herstellung der monoklonalen Antikörper
Weibliche Balb/c Mäuse (sechs Wochen alt) wurden entweder mit löslichem Rezeptor (20 µg/ Injektion) in Freudschem Komplettadjuvans oder mit Baculovieren infizierten SF-9 Zellen (107 Zellen/Injektion in PBS), die das Vollängen humane KDR Rezeptorprotein exprimieren, hyperimmunisiert. Spezifische Antikörpertiter wurden unter Verwendung der extrazellulären KDR-Dömäne mittels ELISA ermittelt. Drei Tage nach der letzten Immunisierung wurde die Milz entfernt. Die Splenocyten wurden mit SP2O.Ag.14 Murinmyelom-Zellen gemäß bekannter Methoden fusioniert (Köhler und Millstein, Nature 256, 495, 1975). Die gebildeten Kolonien wurden mittels ELISA und Westernblot unter Verwendung der löslichen extrazellulären KDR-Domäne gescreent. Positive Kolonien wurden dreifach durch begrenzte Verdünnung kloniert, mit Protein A-Sepharose-Chromatographie gereinigt und weiter charakterisiert.
2. Verwendung in Westernblots
Komplette Zellysate wurden durch Lyse in einem geeigneten Lyse-Puffer, der die oben beschriebene Konzentration an divalenten Ionen und Glycerin enthält, hergestellt. Gleiche Mengen Protein wurden mittels Polyacrylamidgelelektrophorese unter nicht reduzierenden Bedingungen getrennt, auf Nitrozellulose transferiert und mit den monoklonalen Antikörpern AM 2-7-9 und AM 2-10-1 gemäß an sich bekannter Verfahren sondiert. Die Sichtbarmachung der immunreaktiven Banden wurde entweder mittels Chemilumineszenz oder enzymatisch unter Verwendung von mit Alkalischer Phosphatase markierten sekundären Antikörpern und entsprechenden chromogenen Substraten durchgeführt. In der Fig. 1 ist das Gel eines Westernblots wiedergegeben.
3. Verwendung bei der Immunpräzipitation
Immunpräzipitationen wurden unter Verwendung eines geeigneten Lyse-Puffers (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL® CA-630, 10% (v/v) Glycerin, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 2 mM Na-ortho-Vanadat und Komplett-Protease-Inhibitoren gemäß bekannter Methoden durchgeführt. In der Fig. 2 ist das Gel der Immunpräzipitation abgebildet.
4. Verwendung in der Immunhistochemie
Zellen wurden auf sterilen Deckgläschen bis kurz vor Zusammenwachsen kultiviert und mit Formaldehyd (4% v/v PBS pro 4 g pro Liter Glukose) jeweils vor oder nach der Inkubation mit 20 µg/ml des entsprechenden Antikörpers in PBS fixiert. Die Immunreaktion wurde mit Alkalischer Phosphatase beschickten sekundären Antikörpern und Fast-Naphtolrot als chromogenes Substrat visualisiert.
5. Epitop-Mapping
Jeweils 2 µg rekombinanter löslicher KDR-Rezeptordomänen, die mit einem "myc­ tag" versehen sind, wurden durch SDS-PAGE (10%) aufgetrennt und auf Nitrozellulose transferiert. Anschließend wurden zwei identische Folien mit dem monoklonalen Antikörper AM 2-10-1 oder einem monoklonalen anti myc-Antikörper inkubiert. Immunkomplexe wurden durch alkalische Phosphatase markierte Sekundärantikörper sichtbar gemacht (s. Fig. 3).

Claims (20)

1. Monoklonale Antikörper, die gegen ein Epitop das innerhalb der extrazellulären Domänen 1-7 des menschlichen VEGF-Rezeptors KDR lokalisiert ist, gerichtet sind.
2. Monoklonale Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper gegen ein Epitop das innerhalb der extrazellulären Domänen 6 und 7 des menschlichen VEGF-Rezeptors KDR lokalisiert ist, gerichtet sind.
3. Verwendung der monoklonalen Antikörper gemäß den Ansprüchen 1 und 2 für Westernblots, Immunpräzipitation, ELISA, FACS-Analyse und in der indirekten Immunfluoreszenz-Mikroskopie.
4. Verwendung der monoklonalen Antikörper gemäß den Ansprüchen 1 und 2 in der Immunhistochemie.
5. Verwendung der monoklonalen Antikörper gemäß den Ansprüchen 1 und 2 zum Screenen nach kleinen agonistischen und antagonistischen Molekülen und zur Detektion mutanter Rezeptorsubtypen.
6. Verwendung der monoklonalen Antikörper gemäß den Ansprüchen 1 und 2, in Kombination mit einer geeigneten kontrastgebenden Substanz, wobei die monoklonalen Antikörper an die kontrastgebende Substanz gekoppelt werden und so zur Anwendung kommen.
7. Verwendung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die kontrastgebende Substanz, die an den Antikörper gekoppelt ist, 99 M Technetium ist.
8. Verwendung der monoklonalen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, die mit geeigneten toxischen Substanzen gekoppelt sind, bei angiogenetisch abhängigen Phänotypen, die Tumoren, rheumatoide Arthritis oder Psoriasis sind.
9. Verwendung gemäß Anspruch 8 bei Metastasen.
10. Verwendung der mRNA, die für die schwere und die leichte Kette der erfindungsgemäßen Antikörper kodiert zur Herstellung rekombinanter "single chain"-Antikörper.
11. Verwendung der über die mRNA gemäß Anspruch 10 kodierten rekombinaten Antikörper für Westernblots, Immunpräzipitation, ELISA, FACS-Analyse, in der indirekten Immunfluoreszenz-Mikroskopie und in der Immunhistochemie.
12. Verwendung eines Verfahrens zum Nachweis des menschlichen VEGF- Rezeptors KDR aus Zellysaten oder Gewebeanalysaten, dadurch gekennzeichnet, daß
  • 1. die monoklonalen Antikörper, die gegen ein Epitop das innerhalb der extrazellulären Domänen 1-7 des menschlichen VEGF-Rezeptors KDR lokalisiert ist, gerichtet sind, in gereinigter Form mit einer Konzentration von 1-10 µg/ml in Koppel-Puffer an ELISA-Platten als Fänger-Antikörper gekoppelt und anschließend überschüssige Bindungsstellen mit Blockierungs-Puffer blockiert werden,
  • 2. Zell- oder Gewebeanalysate in einem geeigneten Lysis-Puffer herstellt,
  • 3. die Platten vor Aufbringen der Lysate in Waschpuffer gewaschen werden,
  • 4. die Quantifizierung von zu bestimmendem KDR-Protein in der Probe durch rekombinantes KDR-Protein als Standardkurve erfolgt,
  • 5. die zu messenden Gewebe- und Zellysate anschließend in das Testsystem eingebracht werden,
  • 6. eine Inkubation bei Raumtemperatur für zwei Stunden erfolgt,
  • 7. anschließend die ELISA-Platten gewaschen werden,
  • 8. der Nachweis des "gefangenen" KDR mittels eines polyklonalen anti-KDR Antiserums erfolgt
und schließlich
  • 1. die Detektion mittels eines chromogenen, chemilumineszenten oder radioaktiven Stoffes erfolgt.
13. Verwendung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Verwendung des Verfahrens als Kinase-Test-Verfahren erfolgt, das den Tyrosin-phosphorylierten KDR nachweist.
14. Verwendung gemäß den Ansprüchen 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß rekombinante phosphorylierte KDR als Standardprotein eingesetzt wird.
15. Verwendung gemäß den Ansprüchen 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das unter Punkt 8 verwendete polyklonale anti-KDR-Antiserum polyklonales anti-phosphothyrosin Antiserum oder ein monoklonaler anti- Phosphotyrosin Antikörper ist.
16. Verwendung gemäß den Ansprüchen 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, die unter Punkt 9 zur Detektion verwendete Substanz ein mit Peroxi­ dase markierter sekundärer Antikörper mit geeigneten chromogenen oder chemilumineszenten Substraten ist.
17. Verwendung gemäß den Ansprüchen 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der unter Punkt 2 verwendete Lysis-Puffer 1 bis 5 mM divalente Ionen und 1 bis 15% Glycerin enthält.
18. Verwendung gemäß den Ansprüchen 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der unter Punkt 2 verwendete Lysis-Puffer 1 bis 2 mM divalente Ionen und 5 bis 12% Glycerin enthält.
19. Verwendung gemäß den Ansprüchen 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der unter Punkt 2 verwendete Lysis-Puffer 1,5 mM divalente Ionen und 10% Glycerin enthält.
20. Verwendung gemäß den Ansprüchen 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das divalente Ion Magnesium ist.
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