DE69112225T2

DE69112225T2 - Immunodiagnostische probe für gelenkrheumatismus.

Info

Publication number: DE69112225T2
Application number: DE69112225T
Authority: DE
Inventors: Ian Lewin; Sarita Nayyar; Denis Stanworth
Original assignee: Peptide Therapeutics Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Holding Ltd
Priority date: 1990-05-25
Filing date: 1991-05-24
Publication date: 1996-01-04
Anticipated expiration: 2011-05-25
Also published as: FI103975B1; ES2077857T3; WO1991019001A1; JPH05508835A; FI925321L; NO924555L; EP0605410B1; AU7737091A; GB9111215D0; DK0605410T3; US5827668A; EP0605410A1; NO924555D0; ATE126540T1; FI925321A0; CA2082529A1; FI103975B; NO304237B1; DE69112225D1; GB2246780A

Description

Hintergrund der Erfindung

Umfeld der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist auf ein Prüfverfahren für rheumatoide Arthritis (RA) gerichtet. Insbesondere ist sie auf den Nachweis des menschlichen Immunoglobulin-A-α&sub1;- Antitrypsin-Komplexes (IgA-α&sub1;AT) bei Patienten gerichtet, die im Verdacht stehen, rheumatoide Arthritis zu haben, oder auf rheumatoide Artrithis behandelt werden.

Beschreibung des Standes der Technik

Rheumatoide Arthritis wurde als eine unheilbare systemische Entzündung beschrieben, bei der immune Fehlfunktionen und genetische Empfänglichkeit eine Rolle spielen. In früheren Stadien ist sie oft durch fluktuierende Remissionen und Verschlimmerungen charakterisiert, und in späteren Stadien durch eine kornbildende Reaktion (Pannusbildung), was zu einer Gewebezerstörung vor allem von Knochen und Knorpeln führt. Die Synovialmembran bei RA hat viele der Kennzeichen eines hyperaktiven, immunologisch stimulierten, lymphoiden Organs, und das Verhältnis der T-Suppressoren zu T-Helfer- Lymphozyten wurde als in signifikanter Weise reduziert gezeigt.
Da es keinen unzweideutigen Test gibt, RA von anderen akuten oder chronischen Entzündungskrankheiten zu unterscheiden, ist eine Unterscheidung zwischen RA und anderen Arthritisformen, wie z.B. systemischer Lupus erythematodes (SLE), Spondylarthritis ankylosans (AS), polyartikularer Gicht (PAG) oder psoriatischer Arthritis (PsA) oft sehr schwierig. Die Diagnose von RA wird gewöhnlich gemäß den Kriterien der American Rheumatism Association (ARA) vorgenommen, d.h.:
1. Morgensteiffigkeit;
2. Gelenkempfindlichkeit oder Bewegungsschmerz;
3. Weichgewebeschwellung des Gelenks;
4. Weichgewebeschwellung eines zweiten Gelenks (innerhalb dreier Monate);
5. Weichgewebeschwellung von symmetrischen Gelenken (ausgenommen distales interphangeales Gelenk);
6. subkutane Knoten;
7. Röntgenstrahlveränderungen;
8. Serumpositiv für rheumatische Faktoren;
wobei eine Diagnose von 3 oder 4 dieser Faktoren als repräsentativ für eine wahrscheinliche RA und eine Diagnose von 5 oder mehr dieser Faktoren als repräsentativ für eine sichere RA betrachtet wird.
Der am meisten benutzte immundiagnostische Test auf RA, der sogenannte Waaler-Rose- Test, basiert auf einem Antiköiper (Rheumafaktor) zum Fc-Bereich von IgG. Der Rheumafaktor (RF) ist etwa bei 60 % bis 70 % der an RA leidenden Individuen präsent. Der Test ist nicht ausreichend, weil er eine nicht hinnehmbar große Zahl von Falschpositiven oder Falschnegativen ergab, und weil er keine Reaktion auf Therapie bewertet oder eine Aktivierung oder eine Reaktivierung des Krankheitsprozesses vorhersagt. Ferner ist er schwer, von einem klinischen Laboratorium zum anderen zu standardisieren, weil er auf einem Hämagglutinations- oder Latexagglutinations-Endpunkt basiert. Noch schwerer wiegt, daß er nur bei etwa 70 % der chronisch an dieser Krankheit Leidenden ein positives Ergebnis hervorbringen kann, und die immunopathogene Rolle des RF wurde nie anerkannt.
Seit kurzem deuten Beweise auf den kovalent gebundenen (S-S) Komplex zwischen IgA und α&sub1;-Antitrypsin (α&sub1;AT) als einen hauptimmunpathologischen Faktor bei RA hin. Dieser Komplex wurde in stark überhöhten Werten in den Seren von den Patienten mit IgA- Myelomatose gefunden, wurde aber auch in abnorm hohen Anteilen im Kreislauf von RA- Patienten entdeckt. Der folgende Beweis schlägt vor, daß die Messung von zirkulierenden Mengen des IgA-α&sub1;AT Komplexes einen relevanteren immundiagnostischen Indikator für rheumatoide Arthritis hervorbringen würde als die, die gegenwärtig benutzt werden:
1. Er ist in abnorm hohen Werten im Kreislauf und in den Gelenkflüssigkeiten von praktisch allen Patienten mit unbehandelter, chronischer, rheumatoider Arthritis vorhanden. (Der gegenwärtig benutzte Rheumafaktor ist in den Seren von nur etwa 70% solcher Patienten nachweisbar).
2. Der Serumspiegel des IgA-α&sub1;AT Komplexes scheint bei jenen Patienten zu fallen, die eine günstige klinische Reaktion auf eine Behandlung mit second-line antirheumatischen Medikamenten zeigen.
3. Er ist auch in abnorm hohen Werten bei solchen AS-Patienten nachweisbar, die erosive Gelenkveränderungen zeigen.
4. Im Gegensatz zu anderen sog. Krankheitsmarkern, die bei RA gemessen werden, wie z.B. Rheumafaktor und Akute-Phase-Proteine (z.B. Haptoglobin und C- reaktives Protein), haben sowohl in-vitro- als auch in-vivo-Studien eine plausible Erklärung der Immunpathogenität des IgA-α&sub1;AT-Komplexes ergeben. So kann nicht nur die Bildung des IgA-α&sub1;AT-Komplexes zum Verbrauch von mindestens einem Drittel des gesamten verfügbaren α&sub1;AT (eines der Hauptantiproteasen) im Serum oder den Gelenkflüssigkeiten von rheumatoiden Patienten führen, sondern der IgA-α&sub1;AT-Komplex selbst ist imstande, eine Abgabe abbauender, proteolytischer Enzyme aus isolierten Makrophagen freizusetzen (durch einen zytolytischen Prozeß, der von der Aktivierung des alternativen komplementären Weges abhängig ist). Darüberhinaus führt eine Injektion des isolierten Komplexes in das Kniegelenk normaler Kaninchen zur schnellen Entwicklung einer akuten Arthritis, die die groben, anatomischen und histopathologischen Merkmale des klinischen Zustandes zeigt (siehe, Stanworth, D.R., "IgA dysfunction in rheumatoid arthritis", Immunology Today, New Directions in Research 6 Seiten 43-45 (1985); Stanworth D.R. "The role of IgA in the immunopathogenesis of rheumatoid arthritis" Kapitel 7 in "Immunogenic Mechanisms of Arthritis" Eds J. Goodacre und D.W. Carson, Seiten 122- 142 (1987) und Dawes, P.T., Jackson R., Shadforth, M.F., Lewin, I.V., und Stanworth, D.R., "The relationship between the complex of immunoglobin A and α&sub1;-antitrypsin, its constituent components and the acute phase response, as measured by C-reactive protein in rheumatoid arthritis treated with gold or D-penicillamine", British Journal of Rheumatology, 26. Seiten 351-353 (1987)).
Die gegenwärtige Methode, den IgA-α&sub1;AT-Komplex zu messen, beruht auf einer zweidimensionalen Immunelektrophorese, die eine erste dimensionale elektrophoretische Trennung des Komplexes von freiem α&sub1;AT in Agarose und seine Identifizierung durch eine zweite dimensionale Elektrophorese gegen Agarose enthaltendes Antiserum enthält, das spezifisch gegen α&sub1;AT gerichtet ist. Der Anteil des Komplexes wird dann dadurch quantifiziert (in willkürlichen Einheiten), daß man die Fläche unter seine Präzipitationsspitze durch Planimetrie bestimmt (auf der nachfolgend getrockneten und fleckigen Platte). Dies ist jedoch eine mühsame und zeitaufwendige Prozedur.
Demgemäß wäre es wünschenswert, einen einfach auszuführenden Test (Assay) für den IgA-α&sub1;AT-Komplex zur Verfügung zu stellen. Anfängliche Versuche wurden unternommen, einen ELISA zu benutzen, bei dem entweder Anti-IgA- oder Anti-α&sub1;AT- Antikörper zunächst auf die Wände von Mikrotitrationsplatten aufgebracht wurden, gefolgt von der Inkubation mit einer Testprobe, die einen IgA-α&sub1;AT-Komplex enthält, einer Reaktion entweder mit Anti-α&sub1;AT-IgG oder mit Anti-IgA-IgG-Antiköiper und finaler Entwicklung mit einem enzymmarkierten Anti-IgG-Antikörper. Es ist jedoch ein Problem, daß ein solcher Komplex nicht verläßlich durch eine Prüfmethode nachgewiesen werden kann, die auf der Bindung des IgA-α&sub1;AT-Komplexes an einen Antikörper zu IgA oder α&sub1;AT beruht, weil dieser Ansatz zur Bindung von nicht komplex gebundenem IgA oder α&sub1;AT führen würde, die auch in nicht quantifizierten Anteilen in der Probe vom Patienten enthalten sind und sich der quantitativen Messung des IgA-α&sub1;AT-Komplexes überlagern.
Daher wurde es notwendig, einen Antikörper zu produzieren, der spezifisch gegen den Human-IgA-α&sub1;AT-Komplex gerichtet ist. Ein anfänglicher Versuch, dies durch Immunisierung von Kaninchen mit gereinigtem IgA-α&sub1;AT-Komplex zu erreichen, scheiterte, da die resultierenden Antiseren auch mit dem nicht komplex gebundenen IgA und α&sub1;AT reagierten.

Zusammenfassung der Erfindung

Überraschenderweise wurde herausgefunden, daß ein monoklonaler Antikörper produziert werden kann, der praktisch nicht reaktiv mit freiem IgA und α&sub1;AT, aber spezifisch für den natürlich vorkommenden IgA-α&sub1;AT Komplex ist. Darüberhinaus wurde beim Versuch, solche Antikörper aus der Verknüpfung (Fusion) von Mäusemilzzellen mit Myelonizellen darzustellen, herausgefunden, daß die Ausbeute an Milzzellen sehr gering war, was die Produktion von Hybridomen unmöglich macht. Es war nötig, eine Lösung für dieses Problem zu finden, das, wie bekannt wurde, durch die Toxizität des Human-IgA-α&sub1;AT- Komplexes gegenüber Mausmakrophagen hervorgerufen wurde. Es wurde gezeigt, daß die Inkubation von isolierten, peritonealen Mausmakrophagen mit dem Human-IgA-α&sub1;AT- Komplex zu einer beträchtlichen Freisetzung des zytoplasmischen Enzyms LDH und einer nachfolgenden Zerstörung der Makrophagen führt. Das Problem wurde schließlich wie unten beschrieben überwunden.
Weiterhin wurde ein immunogenes Peptid synthetisiert, das ein erstes Peptidfragment, das eine Aininosäurensequenz oder eine immunogene Analoge davon hat, die im Fe-Bereich von menschlichem IgA gefunden wurde, und ein zweites Peptidfragment enthält, das eine Aminosäurensequenz oder eine immunogene Analoge davon hat, das in humanem α&sub1;AT gefunden wurde, wobei das erste und das zweite Fragment kovalent aneinander gebunden sind, wobei ein gegen besagtes Peptid gerichteter Antikörper im wesentlichen nicht reaktiv mit freiem Human-IgA ist, im wesentlichen nicht reaktiv mit freiem Human-α&sub1;AT ist und sich an den natürlich vorkommenen Komplex des Human-IgA und α&sub1;AT (IgA-α&sub1;AT) bindet. Überraschender Weise wurden auch polyklonale Antikörper, die gegen besagtes Peptid gerichtet wurden, als im wesentlichen nicht reaktiv mit freiem IgA und α&sub1;AT befunden. Monoklonale Antikörper derselben oder besserer Spezifität werden zweifelsohne dagegen stellbar sein. Darüberhinaus werden die kürzlich entwickelten chimären Antikörper (Reichmann, L., Clark, M., Waldmann, H. und Winter G., Nature 332, Seiten 323- 327,1988), Einzelkettenantikörper (PCT Patent Anmeldung, Veröffentlichungsnummer WO 88/01649 Genex Corporation) und Einzeldomänenantikörper (Ward, E.S. Güssow, D., Griffiths, A.D., Jones, P.T. und Winter, G. Nature 341, Seiten 544-546, (1989)) die Elemente besitzen, die gegen den besagten, natürlich vorkommenden Komplex und das Peptid gerichtet sind, aller Vorraussicht nach produzierbar sein.
Dementsprechend sieht die Erfindung einen Liganden vor, der eine Antikörperdomäne enthält, die für eine Antigen-Deterininante eines Komplexes aus Human-IgA und α&sub1;- Antitrypsin spezifisch ist, wobei besagte Antikörperdomäne im wesentlichen nicht reaktiv mit freiem Human-IgA und freiem Human-α&sub1;-Antitrypsin ist.
Die Erfindung sieht auch ein Prüfverfahren auf menschliche rheumatoide Arthritis (RA) in einem Analyten vor, der verdächtig ist, einen Komplex von Human-IgA und α&sub1;-Antitrypsin (IgA-α&sub1;AT) als Indikator von RA zu enthalten, das die Feststellung oder Messung der immunologischen Bindung zwischen besagtem Komplex und dem oben erwähnten Liganden enthält.
Diese Erfindung sieht weiterhin einen Prüfkit zur Durchführung eines Prüfverfahrens auf menschlichen RA in einem Analyten vor, der verdächtigt ist, einen Komplex von Human- IgA und α&sub1;-Antitrypsin (IgA-α&sub1;AT) als Indikator von RA zu enthalten, wobei der Prüfkit einen IgA-α&sub1;AT Komplex und einen Liganden enthält, dessen Antikörperdomäne spezifisch für eine Antigen-Determinante von IgA-α&sub1;AT, aber im wesentlichen nicht reaktiv mit freiem Human-IgA und freiem Human-α&sub1;AT ist.

Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen

Die folgenden Definitionen werden in der vorliegenden Beschreibung benutzt:
"Assay" bedeutet eine Nachweismethode oder Messmethode.
"IgA-α&sub1;AT-Komplex" bedeutet den Komplex, wie er im Serum von menschlichen Patienten gefunden wurde, wenn nichts anderweitig angegeben ist, oder vom Zusammenhang gefordert wird.
Das Fab'-Fragment stellt einen "Arm" der beiden "Arme" der "Y"-artig geformten Antikörperkonfiguration dar; das Fragment behält antigenbindende Fähigkeit.
F(ab')2-Fragment stellt die zwei Fab'-"Arme" dar, die durch die Disulfidbindungen gebunden sind; das Fragment behält antigenbindende Fähigkeit.
Fc-Fragment stellt den einzelnen "Schwanz" oder die zentrale Achse des "Y"-förmigen Antikörpers dar.
Die Liganden der Erfindung enthaltend eine Antikörperdomäne, die für eine Antigen- Determinante eines Komplexes aus Human-IgA und Human-α&sub1;AT (IgA-α&sub1;AT) spezifisch ist. Diese Antikörperdomäne ist verhälnismäßig nicht reaktiv mit freiem Human-IgA und freiem α&sub1;AT. Der Komplex aus IgA und α&sub1;AT (IgA-α&sub1;AT) ist der natürlich vorkommende Komplex, der bei Analyten gefunden wird, die von an rheumatoider Arthritis leidenden Patienten entnommen wurden. Höchst vorzugsweise, aber, wie unten veranschaulicht, nicht notwendigerweise, enthält der Ligand einen monoklonalen Antikörper, der gegen einen solchen Komplex auftritt. Die am meisten bevorzugten monoklonalen Antikörper werden aus Hybridomen erhalten, die Gegenstand von weiter unten beschriebenen Patenthinterlegungen sind. Die polyklonalen Antikörper, die gegen den gereinigten, natürlich vorkommenden Komplex erhoben wurden, stellten sich als nicht spezifisch für den IgA-α&sub1;AT Komplex heraus, und die resultierenden Antiseren reagierten auch mit dem nicht komplexgebundenden IgA und α&sub1;AT.
Alternativ kann der Ligand ein Antikörper sein, der gegen ein synthetisches Peptid dieser Erfindung auftritt. Dieses synthetische Peptid ist ein kovalent gebundenes Konjugat aus Kurzkettenpeptiden, die jene Teile der großen IgA-Kette und der α&sub1;AT-Kettensequenzen repräsentieren, die eine IgA-α&sub1;AT-komplexspezifische immunogene Determinante enthalten. In einem speziellen Ausführungsbeispiel sieht die vorliegende Erfindung vor und benutzt ein erstes Peptidfragment, das eine Aininosäurensequenz, die im Fc-Bereich von Human-IgA gefunden wurde, oder eine immunogene Analoge dieser besagten Sequenz enthält, und ein zweites Peptidfragment, das eine Aminosäurensequenz, die in Humanα&sub1;AT gefunden wurde oder eine immunogene Analoge dieser besagten Sequenz enthält, die kovalent aneinander gebunden sind. Die bevorzugte Form der kovalenten Bindung ist eine S-S-Bindung, die die immunogene, dreidimensionale Gestaltung der Bindung des vorletzten Cysteinrestes, relativ zum C-terminalen Ende von Human-IgA, im Fc-Bereich von Human-IgA zu Human-α&sub1;AT bewahrt. Die Struktur des bevorzugten IgA-α&sub1;AT- Komplexes wurde noch nicht aufgeklärt. Jedoch ist es wahrscheinlich, daß die kovalente S-S-Brücke zwischen dem einzigen Cysteinrest (Nummer 232) des Human-α&sub1;AT und dem Cysteinrest (Nummer 495) auftritt, das die vorletzte Cysteinposition in der α-Kette von Human-IgA belegt, zu der bekanntermaßen die J-Kette bei der Bildung von polymerem IgA konjugiert.
Das erste Peptid-Fragment entspricht vorzugsweise einer Aininosäurensequenz des Fc- Bereichs von Human IgA, das den vorletzten Cysteinrest aufweist, relativ zum C-terminalen Ende des Human-IgA, und enthält 5 - 20 Amminosäurereste, vorzugsweise 10 - 15 Amminosäurereste oder immunogene Analoge davon. Das erste Peptidfragment enthält vorzugsweise mindestens die Amminosäurensequenz Val-Met-Ala-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr, was den Resten 487-496 der Human-IgA-α- Kette entspricht, oder eine immunogene Analoge davon. Das ist die minimale Sequenzlänge, die zur Bildung eines stabilen Konjugats führt. Am meisten bevorzugt enthält die Amminosäurensequenz Val-Ser-Val-Val-Met-Ala-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr, was den Resten 484-496 der Human-IgA-α-Kette entspricht, oder eine ünmunogene Analoge davon.
Das zweite Peptidfragment entspricht vorzugsweise einer Amminosäurensequenz des Human-α&sub1;AT, einschließlich des Cysteinrests, der sich kovalent mit der IgA α-Kette verbindet, und enthält 5 - 20 Amminosäurenreste, vorzugsweise 10 - 15 Amminosäurenreste, oder immunogene Analoge davon. Das zweite Peptidfragment enthält vorzugsweise mindestens die Amminosäurensequenz
His-Cys-Lys-Lys, was den Resten 231-234 von Human-α&sub1;-AT entspricht, oder eine immunogene Analoge davon. Dies wird als die minimale Sequenzlänge angesehen, die zur Bildung einer stabilen Verbindung führt. Am meisten bevorzugt enthält die Amminosäuresequenz
Gly-Met-Phe-Asn-Ile-Gln-His-Cys-Lys-Lys-Leu-Ser-Ser, was den Resten 225-237 des Human-α&sub1;-AT entspricht, oder eine immunogene Analoge davon.
Dementsprechend enthält ein besonders bevorzugtes immunogenes Peptid dieser Erfindung mindestens die folgende Amminosäurensequenz:
oder eine immunogene Analoge davon.
Am meisten bevorzugt enthält das immunogene Peptid das Peptidkonjugat der folgenden Amminosäurensequenz:
oder eine immunogene Analoge davon (im folgenden nun als Peptid F017-F018 bezeichnet).
Antikörper zum IgA-α&sub1;AT-Komplex (sowohl zum natürlichen Komplex als auch zum synthetischen Peptid) können durch in der Fachwelt wohlbekannte Techniken leicht hergestellt werden. So können polyklonale Antikörper durch Blutentnahme von immunisierten Kaninchen erhalten werden. Monoklonale Antikörper können mit Hilfe der Köhler- Milstein-Methode in Mäusen hergestellt werden, vorausgesetzt, daß die Milzzellen immer im Überschuß bei der Anellierung (Fusion) benutzt werden und daß die Zytolyse der sich ergebenen Hybridome durch Hinzufügen von frischen Milzzellen wie erforderlich bekämpft wird. Die Hybridome müssen dann auf Spezifität zum Komplex gescreent werden. Die Fab'- und F(ab')2-Fragmente solcher monoklonalen oder polyklonalen Antikörper können auf wohlbekannten Wegen hergestellt werden. Jedes dieser Moleküle, das Antikörperdomänen zum Komplex liefert, kann benutzt werden.
Für diagnostische Zwecke wird der Antikörper mit dem natürlich vorkommenden IgA- α&sub1;AT-Komplex des untersuchten Individuums reagieren, um ein nachweisbares Produkt zu erzeugen. Eine Antikörperzusammensetzung, die in irgendeinem Test benutzt wird, der zur Quantifizierung des Vorhandenseins von IgA-α&sub1;AT eingerichtet wird, muß genügend Antikörper enthalten, um mit dem gesamten natürlich vorkommenden IgA-α&sub1;AT Komplex zu reagieren. Solche für die Diagnose relevanten Mengen an Antikörper variieren merklich mit einer Reihe von Faktoren, die dem Fachmann wohl bekannt sind. Diese beinhalten z.B. die Sensitivität oder Spezifität des angewandten Tests, die verfügbare Geräteausstattung und die Menge des im Test befindlichen Analyten. Der am meisten bevorzugte Analyt ist eine Serumprobe, weil diese eine bessere Indikation von RA als Gelenkflüssigkeiten ermöglicht.
Der Nachweis und die Messung von Anteilen des IgA-α&sub1;AT Komplexes, vorzugsweise in Serum oder in Gelenkflüssigkeit, kann auch als ein prognostischer Indikator von RA benutzt werden, um die Behandlung von Patienten mit "früher" RA (Vorerosions-Stadium) zu erleichtern, wo die Diagnose normalerweise schwierig ist.
Obwohl der sog. heterogene Enzym-Immunassay (ELISA) in dieser Erfindung der Vorzug gegeben wird, können auch andere Assays (Tests) benutzt werden, z.B. der Radio- Immunassay, Präzipitation, Agglutination, direkte und indirekte Immunfluoreszenz und Komplementfixation. Diese Prüfmethoden können jedes beliebige Protokoll wie z.B. vom Kompetitions-, Inhibitions- oder Sandwichtyp verwenden.
Die Assays erfordern im allgemeinen eine nachweisbare Markierung. Der Anti-IgA-α&sub1;A- Antikörper, ein Anti-Antikörper (z.B. das Ziegen-Anti-Hasen-Serum), ein Anti-IgA- Antikörper oder ein Anti-α&sub1;AT-Antikörper können markiert werden. Nützliche Markierungen beinhalten Fluoreszenz-Markierungen wie z.B. Fluorescein, Rhodamin oder Auramin und Radioisotope wie ¹&sup4;C, ¹³¹I, ¹²&sup5;I und ³&sup5;S Die bevorzugten Enzymmarkierungen schließen Meerrettich Peroxidase, β-D-Glukosidase, β-D-Galaktosidase, Urease, Glukoseoxidase plus Peroxidase und saure Posphatase ein.
Die gegenwärtig verfügbaren Methoden zum Nachweis der oben erwähnten Markierungen sind wohl bekannt und beinhalten kolorimetrische, luminometrische und fluorometrische Techniken sowie verschiedene instrumentelle Methoden zum Nachweis der Radioisotope.
Die Assays werden normalerweise so ausgeführt, daß das Nachweisprodukt an einen Träger gebunden wird, um eine leichte Trennung von der ungebundenen Serumprobe zu gewährleisten.
Gewöhliche Träger enthalten Glas- oder Plastikoberflächen, insbesondere die innere Oberfläche von Teströhrchen oder eine Oberfläche einer Testplatte. Typische Beispiele ebener Oberflächen, die beim heterogenen Enzym-Immunassay (ELISA) oder beim Radioimmunonassay (RIA) nützlich sind, enthalten Glas, Nitrozellulosepapier oder Kunststoffe wie Polystyrol, Polycarbonat oder verschiedene Polyvinyle. Partikel, die für makroskopische Methoden benutzt werden können, bei denen das Reaktionsprodukt visuell nachgewiesen werden kann, wie z.B. die Hämagglutinationsmethode, enthalten biologische Partikel wie z.B. rote Blutzellen vom Schaf oder rote Blutzellen der Humangruppe 0 und biologisch inerte Partikel wie Holzkohle, Bentonit oder Latexperlen. Solche Perlen können aus Polystyrol, Polyvinylpyrrolidon oder verschiendenen Polyvinylen gebildet sein.
Das Anbringen an der Trägeroberfläche kann durch direkte Adsorption, erzwungene Adsorption oder durch chemische Kopplung in Übereinstimmung mit bekannten Methoden erfolgen.
Bevorzugte Bindungsschemata sind folgende (* = markierte Substanz):

Sandwichassays

Träger/Anti-IgA-α&sub1;AT/IgA-α&sub1;AT-Analyt/Anti-IgA*;
Träger/Anti-IgA-α&sub1;AT/IgA-α&sub1;AT-Analyt/Anti-α&sub1;AT*;
Träger/Anti-IgA-α&sub1;AT/IgA-α&sub1;AT-Analyt/Anti-IgA-α&sub1;AT* (wobei der zweite Antikörper eine andere Spezifität als der erste besitzt).

Inhibitionsassay

Träger/IgA-α&sub1;AT/Anti-IgA-α&sub1;AT* + Analyt (vor dem Hinzufügen an das Träger/IgA- α&sub1;AT vorinkubiert). Kompetitionsassays
Ein breites Spektrum von Kits ist möglich, um Prüfungen der vorliegenden Erfindung auszuführen. Sie enthalten einen Liganden der Erfindung und einen IgA-α&sub1;AT Komplex. Das Prüfkit sieht vorzugsweise Mittel vor, um den Komplex nachzuweisen entweder durch (A) einen Sandwichassay, indem das Kit zusätzlich zu dem obigen einen zweiten Nachweisliganden vorsieht, der eine Antikörperdomäne enthält, die bei Bindung an den ersten Liganden dazu imstande ist, den IgA-α&sub1;AT-Kompkx nachzuweisen, oder (B) durch einen Kompetititions- oder Inhibitionsassay, bei dem die besagte IgA-α&sub1;AT-Komplexkomponente des Nachweiskits eine immunogene Analoge und bevorzugter ein immunogenens, synthetisches Peptid des natürlich vorkommenden Komplexes ist. Die Liganden sind vorzugsweise polyklonale oder monokonale Antikörper, wie oben dargelegt wurde, und Fabq - oder F(ab')2-Fragmente davon oder Einzeldomtonen- oder Einzelketten-Antikörper, wie für den Fachmann offensichtlich ist.
Der Nachweisligand in einem Sandwichassay braucht nicht ein Antikörper sein, der eine Spezifität zum gesamten Komplex besitzt. Jeder derartige Ligand, der Mittel vorsieht, eine Markierung am Analyten IgA-α&sub1;AT anzubringen (ohne die Bindung des Analyten an den Einfangantikörper zu stören) ist brauchbar. So kann er günstigerweise ein Antikörper sein, der gegen IgA oder α&sub1;AT auftritt.
Der Nachweisligand bei der Sandwichmethode, der Antikörper, der mit dem Analyten bei der Kompetitionsmethode konkurriert, und der Antikörper, der mit dem Analyten bei der Inhlbitionsmethode vorreagiert, muß in irgendeinem Stadium markiert werden. Während diese Reagenzien als fertig markierte Konjugate vorgesehen sein können, ist es normalerweise zweckmäßiger, sie lediglich dadurch zu markieren, daß ein weiterer Antikörper für sie vorgesehen wird, der als separate Komponente markiert wurde. Typischerweise ist der zweite Antikörper ein Immunglobulin, und der weitere Antikörper sieht ein Anti-Immunglobulin vor, indem er in einem anderem Wirtstier gezüchtet wird.
Normalerweise werden alle Komponenten des Kits in getrennten Behältern zur Verfügung gestellt.
Geeignete Wasch-, Enzymsubstrat-, und Pufferlösungen wären zusammen mit einer detallierten Gebrauchsanweisung, die auf die Berechnung und auf die Interpretation der Ergebnisse eingeht, in dem Nachweiskit enthalten.
Obwohl das synthetische Peptid oder der gereinigte, natürlich vorkommende IgA-α&sub1;AT- Komplex (kovalent gebunden) relativ stabil ist, könnte er dissoziert werden, wenn die Testproben nicht korrekt behandelt wurden (z.B. wenn sie reduzierenden Bedingungen ausgesetzt werden.
Es ist wichtig, den Analyten wie Proben von Seren und Gelenkflüssigkeiten während des kurzen Zeitraums beim Warten auf das Assay bei 4º C aufzubewahren. Wenn sie jedoch nicht innerhalb eines oder zweier Tage getestet werden können, so sollten sie im gefrorenen Zustand (bei oder besser noch unter - 20º C) aufgehoben werden, nachdem zelluläre und nichtzelluläre Abriebteilchen durch vorsichtige Zentrifugierung von ihnen entfernt worden sind.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. "Tween" ist eine registrierte Handelsmarke.

Beispiel 1

Bildung von gemischtem Disulfid zwischen den Peptiden F017 und F018

Beide Peptide F017 und F018 wurden mittels der 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-(FMOC)- Festphasen-Peptidsynthesenchemie in einem LKB Biolynx 4170-Peptidsynthesizer synthetisiert. Die Cystein-(Cys)-Reste in beiden Peptiden F017 und F018 hatten Seitenkettenschutz von S-Triphenylmethyl (TRT).
15 mMol Jod in Essigsäure: Wasser (8:2) wurden einer Mischung aus 5 mMol F018 und 5 mMol F017 in Essigsäure-Wasser (8:2) hinzugefügt. Die Mischung wurde beim Hinzufügen vorsichtig verrührt und dann bei 40 C 16 Stunden lang stehen gelassen.
Die Peptide F017-F0L8 wurden auch in ähnlicher Weise getrennt behandelt, um als Kontrollen zu dienen. Jeder Peptidansatz wurde dann auf einer Necleosil-5 C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule mit einem Methanolgradienten (A = 5 % Methanol in Wasser, B = 95 % Methanol in Wasser) gefahren. Die HPLC-Spuren wurden verglichen, und die Fraktionen, die den Extrapeak enthalten, der aus der F017- und der F018- Mischung erhalten wird, wurden gesammelt und als F017-F018-Peptid-Komplex benutzt.
Auf ähnliche Weise können die Peptide Val-Met-Ala-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr und His-Cys-Lys-Lys dargestellt werden.
Entsprechend kann auch das Peptidkonjugat
in der gleichen Weise dargestellt werden.

Beispiel 2

Herstellung von Kaninchen Anti-IgA-α&sub1;AT

Neuseeländische Weißkaninchen wurden subkutan mit 200 ug gereinigtem Human-IgA- α&sub1;AT Komplex oder 200 ug Peptidkonjugat (F017-F018), emulgiert in vollständigem Freundschem Adjuvans, injiziert, gefolgt von weiteren Injektionen derselben Menge des Komplexes oder des Peptidkonjugats, emulgiert in unvollständigem Freudschem Adjuvants an 14 bis 28 Tagen. Etwa einen Monat später waren die Tiere verblutet.

Beispiel 3

Isolation von IgG aus Kaninchen-Anti-Serum und die Darstellung verschiedener Kluftfragmente

Ein Volumenanteil gesättigter (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Lösung pH 6.5 wurde unter ständigem Umrühren bei 4º C tropfenweise einem Volumenanteil Kaninchenserum zugefügt (um eine endgültige Salzkonzentration von 50 % Sättigung zu geben).
Nachdem es 6 Stunden stehengelassen wurde, wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren (3000g 30 Minuten lang) separiert, und der Überstand wurde verworfen. Der Niederschlag wurde in 0.3 Volumeneinheiten von 0.01M-Phosphatpuffer pH 8.0 wiederaufgelöst und gegen drei Wechsel desselben Puffers dialysiert. Diese letzte dialysierte Lösung (z.B. 5ml) wurde auf einer DEAE-Sephadex-(RTM)-Säule (z.B. 12.0 x 1 cm) plaziert, die zuvor mit 0.01M Phosphatpuffer pH 8.0 ins Gleichgewicht gebracht wurde, und mit demselben Puffer eluiert. 2.0 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die dem Protein-(d.h. IgG-) Peak entsprechenden Fraktionen wurden zusammengelegt und durch Ultrafiltraüon konzentriert. Weitere IgG enthaltende Fraktionen wurden aus der Säule durch den Einsatz eines Salzgradienten (d.h. 0.01M - 0. 10M PO&sub4;) gewonnen, wobei drei Säulenvolumen eines jeden Puffers in einem Gradientenerzeuger benutzt wurden.
Die Zusammensetzung aller Fraktionen wurde wiedergewonnen und durch Immunelektrophorese gegen Anti-Ganzhumanserum geprüft; und jene Fraktionen, die nur IgG enthielten, wurden zusammengelegt, durch Ultrafiltration konzentriert und unterhalb von - 200 C gespeichert.

Darstellung von proteolytischen Kluftfragmenten

(a) Darstellung von Fab'- und Fc-Fragmenten

Natives IgG wird in der Gelenkregion durch Papain hydrolisiert, um zwei antigenbindende Fragmente zu bilden, Fab' und ein Dimer der C-terminalen Hälfte der großen Kette, Fc' (Porter 1959). Diese besitzen alle ähnliche Größe (50 000 Mulekulargewicht), aber sie können durch Ionenaustauschchromatographie separiert werden. Im allgemeinen können proteolytische Fragmente von Immunglobulin unter nicht denaturierenden Bedingungen separiert werden, weil sie nicht durch nichtkovalente Bindungen gehalten werden.

Verfahrensweise:

1. Löse 1 mg Papain in 100 ul 0.1M Natriumphosphatpuffer und füge schnell 50 ul davon dem IgG bei. Mische vorsichtig und inkubiere bei 370 C über Nacht (16 Stunden).
2. Dialysiere gegen Wasser und dann 3 x 500 ml von 0.01M Natriumacetat pH 5.5.
3. Bringe den Ionenaustauscher mit 0.01M des Acetatpuffers ins Gleichgewicht und packe ihn in die Säule und wasche mit demselben Puffer bei Zimmertemperatur.
4. Wenn sowohl Probe als auch Austauscher völlig im Gleichgewicht sind, führe die Probe der Säule zu und eluiere mit wenigstens 60 ml des Startpuffers, bis das Absorptionsmaß bei 280 nm zur Grundlinie zurückgekehrt ist. Führe dann einen linearen Gradienten zu, Gesamtvolumen 200 ml von 0.01M bis 1M Acetat, immer bei Zimmertemperatur. Sammle 5 ml Fraktionen und überwache das Absorptionsmaß bei 280 nm.
5. Mit dem Startpuffer und dem ersten Peak im Gradienten eluiertes Protein besteht fast nur aus Fab'. Der dritte Peak ist Fc. Die Proteinausbeute in den drei Peaks sollte etwa 90 % des Original-IgG sein.

(b) Darstellung von F(ab')2-, Fab'- und pFc'-Fragmenten

Natives IgG wird auch durch Pepsin hydolisiert. Dieses Enzym spaltet jedoch auf der C- terminalen Seite von mindestens einer α-α-Kette die Sulfidbindung und ergibt ein divalentes antigenbindendes Fragment F(ab')2. Es baut auch einen Teil des Fc-Abschnitts zu kleinen Peptiden ab, und hinterläßt ein Dimer des C-terminalen Viertels der α-Kette, pFc'. Das F(ab')2-Fragment kann zum monovalenten Fab' reduziert werden.

Verfahrensweise:

1. Löse 2 mg von Protein in 200 ul des Acetatpuffers auf und füge 100 ul davon der IgG-Lösung zu. Rühre vorsichtig um und inkubiere bei 37º C über Nacht (16 Stunden).
2. Neutralisiere mit 2M Tris (ungefahr 300 ul - dies inaktiviert das Enzym irreversibel) und zentrifugiere bei 2000 g 10 Minuten lang, um jeden Niederschlag zu entfernen.
3. Füge den Flüssigkeitsüberstand der G-200 Säule zu und eluiere mit TBS. Sammle 2.5 ml Fraktionen und überwache das Absorptionsmaß bei 280 nm.
4. Der erste Hauptpeak ist F(ab')2. Davor wird nicht aufgeschlossenes Material und gleich dahinter wird alles Fab'oder intaktes Fc gebildet. Diese Nebenprodukte werden manchmal nicht vollständig vom F(ab')2 gelöst und bilden Schultern am Hauptpeak. pFc' im nächsten Peak und kleine Peptide werden im Gesamtsäulenvolumen Fab' eluiert. F(ab')2 kann durch folgende Prozedur direkt zu Fab' reduziert werden, falls es erforderlich ist:
A. Lege die F(ab')2 enthaltenden Fraktionen zusammen und konzentriere zu 5 ml (das sollte eine Proteinkonzentration von etwa 6 mg/ml ergeben). Füge 0.5 ml des 1M Tris-Puffers und 50 ul der EDTA-Lösung dazu.
B. Füge 50 ul Dithiothreitollösung hinzu (0.1M Dithiothreitol in 1M Tris- Puffer, frisch zubereitet) und inkubiere in einem verschlossenen Röhrchen bei Zimmertemperatur unter Umrühren 1 Stunde lang.
C. Kühle auf Eis, bedecke mit Folie und füge 50 ul Jodacetamidlösung zu. Inkubiere in einem Eisbad 30 Minuten lang mit Umrühren.
D. Füge 5 ul Dithiothreitollösung dazu, inkubiere bei Zimmertemperatur 15 min lang und führe die Mischung der G-200 Säule zu. Eluiere wie für den Peptidaufschluß. Es wird einen kleinen Peak von undissoziiertem F(ab')2 an seiner Originalposition geben, gefolgt von einem Hauptpeak von Fab.

Beispiel 4

Spezifitätsauswertung von Kaninchen-(polyklonal)-Anti-Komplex-Antiseren

Flexible 96 Mulden-Prüfplatten (Falcan 3912) wurden mit Antigen beschichtet. Durch Inkubation über Nacht bei 4º C mit 120 ul wurden Aliquoten von einem der folgenden:
( i) IgA-α&sub1;AT (5ug/ml)
(ii) IgA (5 ug/ml)
(iii) α&sub1;AT (5 ug/ml)
in 0.05M Carbonat/Bicarbonatpuffer (pH 9.6) hergestellt.
Die Platten wurden dann drei mal eine Minute lang, jeweils mit phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), ph 7.2, enthaltend 0.05 % Tween 20 (PBS/Tween ), gewaschen.
Normale (NRS) und Test-(Anti-Komplex)-Kaninchen-Seren (100ul), wie in Beispiel 2 zubereitet, wurden in PBS/Tween titriert (rein bis 1 in 2 Verdünnungen oder rein bis 1 in 5 Verdünnungen) und den mit Antigen beschichteten Platten zugefügt. Die Platten wurden dann 1 Stunde lang bei 370 C ikkubiert. (Negativkontrolle: PBS/Tween , allein benutzt oder mit leerer Platte, inkubiert mit normalem Kaninchenserum). Die Platten wurden nach der Inkubation wie vorher gewaschen.
100ml Aliquote von Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Meerrettich-Peroxidase wurden bei einer Verdünnung von 1/1000 PBS/Tween zugefügt, und die Platten wurden danach 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten gewaschen wie zuvor.
100ul Aliquote des Substrats wurden dazugefügt, wobei das Substrat enthält:
20 mg o-Phenylendiamin;
250 ul H&sub2;O&sub2;; und
50 ml 0. 15 M Citratphosphatpuffer (ph 5).
Die Farbe durfte sich während 5-15 Minuten entwickeln, und dann wurde die enzyomatische Farbreaktion durch Hinzufügen von 25 % H&sub2;SO&sub4; zu allen Mulden gestoppt.
Die optische Dichte der Inhalte jeder Mulde wurde bei 492 nm (OD492) in einem automatischen Titertek -Plattenleser gelesen. Die in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß die Antiseren eine beträchtliche Spezifität für den Komplex hatten und ein hohes OD492 bei hohen Antikörperverdünnungen, eine gewisse Reaktion gegenüber α&sub1;AT und keinen signifikanten Unterschied über Kontrollen gegnüber IgA ergeben. Tabelle 1 Spezifitätsauswertung von polykonalen Kaninchen-Anti-IgA-α&sub1;AT-Komplex-Antiserum durch ELISA. Mittlere, auf den Nullwert eingestellte Werte der optishen Dichte, gemessen bei 492 nm. ANTIGEN-BESCHICHTUNG AUF ELISA-PLATTE Antikörperverdünnung Anti-Komplex-Antikörper

Beispiel 5

Produktion monoklonaler Antikörper

Immunisierung

BALB/c-Mänse wurden intraperitoneal (i.p.) mit 50ug IgA-α&sub1;AT-Komplex injiziert, der in gleichen Volumenanteilen mit vollständigem Freundschem Adjuvans emulgiert wurde. Die Injektionen wurden am 14ten Tag und am 2Bsten Tag mit einem IgA-α&sub1;AT-Komplex wiederholt, der in unvollständigem Freudschem Adjuvans emulgiert wurde. Schwanzblutentnahmen zu Testzwecken, die am 28sten Tag oder später vorgenommen wurden, wurden durch indirekte ELISA auf die Anwesenheit von Antipeptid-Antikörpern untersucht. 3 Tage vor der Anellierung erhielten Mäuse, die erhöhte Serumantikörpertiter zeigten, eine weitere Verstärkungsinjektion (i.p.) von 50ug IgA-α&sub1;AT-Komplex in PBS.

Anellierung (Fusion)

Hyperimmunisierte Mäuse wurden durch cervikale Dislokation getötet, die Miiz entfernt und die Zellen isoliert und gewaschen. Die Milzzellen wurden mit einer Mausmyelomzelllinie (Ag. 8.653 oder NSO oder NSI) von einer Kultur in logarithmischem Wachstum anelliert. Durch Abänderung der Köhler- und Milsteln-Methode (Köhler, G. und Milstein, C., Nature (London), 256, S. 495 (1975)) wurden Milz- und Myelomzellen unter Benutzung von 40 % PEG (Polyethylenglycol -Mol. Gewicht 1450) im Verhältnis von 2:1 jeweils anelliert. 1 ml PEG wurde tropfenweise über den Zeitraum von 1 Minute dem Körnchen gemischter Zellen (Milz und Myelom) zugefügt und mit serumfreiem Medium verdünnt. Die Anellierungssuspension wurde in 96-Mulden-Platten verteilt und in einem Medium gezüchtet, das HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) enthielt. Das langsame Wachstum der Hybridonizellen wurde korrigiert durch Hinzufügen normaler Mausmilzzellen (sofort nach der Anellierung) als Quelle frischer Makrophagen, um jene zu ersetzen, die durch den inizierten IgA-α&sub1;AT-Komplex zytolisiert waren.
Nach 10 Tagen wurden die Platten auf Wachstum von Hybridomen untersucht. Der von diesen Zellen entfernte Flüssigkeitsüberstand wurde durch indirekte ELISA auf die Anwesenheit von Anti-IgA-α&sub1;AT-Komplex-Antikörpern durch indirekte ELISA untersucht. Folgendes Bindungsschema wurde angewendet (* = markierte Substanz): Träger/IgA-α&sub1;AT/Anti-IgA-α&sub1;AT/Ziege-Anti-Maus-IgG*

Klonen

Wenn positive Mulden als den gewünschten Antikörper produzierend identifiziert wurden, wurden die Hybridzellen durch Begrenzen der Verdünnung geklont und die Klone erneut untersucht. Die Hybridome wurden in Kolben kultiviert oder in Mäusen aufgezogen. Ascitische Flüssigkeit wurde in BALB/c-Mäusen gezüchtet, die wenige Tage vor einer Injektion mit 10&sup5; Hybridzellen mit Pristan (0,5 ml injiziert i.p.) sensibilisiert worden waren. Die Tumorbildung sollte nach etwa 2 - 4 Wochen erfolgen, und die angesammelte ascitische Flüssigkeit wurde entfernt, indem die Maus getötet und der Inhalt der Bauchhöhle mit einer Pipette entfernt wurde. Die Konzentration monoklonaler Antikörper in der ascitischen Flüssigkeit wurde bei jeder Tumorpassage bestimmt; diese bewegte sich zwischen 5 und 15 mg/ml.

Screening

Die zum Screening der monoklonalen Antikörper angewandte Methode war wie folgt. Die Platten wurden präpariert, indem folgendes Layout zur Anwendung kam:
(a) Platte beschichtet mit Human-IgA-α&sub1;AT-Komplex (durch Inkubation mit einer Lösung, die 5ug Protein pro ml enthält) plus Zellenüberstand plus mit Ziegen- Antimaus-Peroxidase markierter Antikörper;
(b) Platte beschichtet mit freiem Human-IgA (5ug/ml-Lösung) plus nachfolgende Schritte wie oben;
(c) Platte beschichtet mit freiem Human-α&sub1;AT (5ug/ml-Lösung) plus nachfolgende Schritte wie oben.
Die Zellen, die jene Überstände produzierten, die nur in obigen Systemen (a) positiv reagierten, wurden als Hybridome ausgewählt, die monklonale Antikörper produzierten, die spezifisch gegen den IgA-α&sub1;AT-Komplex gerichtet waren (während sie nicht reaktiv mit freiem IgA oder freiem α&sub1;AT sind).
Zwei solcher Hybridenzell-Linien, die monoklonale Antikörper zum natürlich vorkommenden IgA-α&sub1;AT-Komplex absondern, wurden bei der European Collection of Animal Cell Cultures, PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, England hinterlegt. Der erste mit der Bezeichnung NLW.54 wurde am 6. Februar 1990 unter der Zugangsnummer ECACC 90020611 nach den Bestimmungen des Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure hinterlegt. Der am meisten bevorzugte Antikörper, als NLW.50 bezeichnet, wurde am 13. Dezember 1990 unter der Zugangsnummer ECACC 90121302 hinterlegt.

Beispiel 6

Die Messung des IgA-α&sub1;AT-Komplexes durch 2-dimensionale Immunelektrophorese (2D- IEP)

Eine Lösung von 1 % Agarose (Sea kem HGT Agarose ICN Biomedical Ltd.) in 0.05M Barbitonpuffer ph. 8.6 wurde hergestellt. 4 ml dieser Schmelzagaroselösung wurden auf eine 7.6 x 5.0 cm Glasplatte gegossen und sich setzen gelassen, worauf 1.1 x 5. 0 cm Streifen abgeschnitten und auf saubere, 7.6 x 5.0 cm große Glasplatten transferiert wurden (1 Streifen Agarose pro Platte). Eine Mulde mit 2 mm Durchmesser wurde in die Agarose geschnitten, 15 mm vom linken Rand und 7 mm vom Boden der Platte entfernt. 3 ul des Testserums wurden auf die Mulde aufgebracht, und ein kleiner Klecks Bromophenolblau wurde der Probe hinzugefügt. Die Platten wurden auf den Elektrophoreseapparat gestellt, mit der Probenmulde nahe der Kathode und dem Agarosestreifen längs in Richtung Anode laufend. Filterpapierdochte wurden auf der Agarose plaziert, 1 cm darin von jedem Ende. Die Platten wurden dann bei 20 mA/6 Platten unter Kühlung elektrophorisiert, bis der sich langsamer bewegende (Aibuminbindung) blaue Bromphenolmarkerklecks den Docht auf der Anodenseite des Apparats erreichte (ca. 2 Stunden). 50 ul Schafantihuman-α&sub1;AT wurden bei 56 ºC 4 ml Schmelzagarose zugegeben und auf die Glasplatten in den Raum oberhalb des 1.6 x 7.6 cm breiten Streifens gegossen. Die Platten wurden dann bei 20 mA / 6 Platten über Nacht unter 90º zur ersten Elektrophorese elektrophorisiert. Die Platten wurden vom Elektrophoreseapparat entfernt und 30 Minuten lang zwischen beschwertes Filterpapier gelegt. Die Platten wurden danach in einen Inkubator transferiert, bis sie völlig trocken waren. Die Platten wurden mit 0.05 % Coomassie-Brillantblau (Coomassie ist eine registrierte Handelsmarke) 10 Minuten lang angefärbt und dann mit Methanol/Essigsäure/Wasser (40:4:56) entfärbt, bis Präzpitinlinien klar gesehen werden konnten. Die Fläche des sich "langsamer" bewegenden Peaks (IgA-α&sub1;AT-Komplex) wurde mit einem Planimeter gemessen, und die Komplexkonzentration wurde als Fläche im cm² angegeben.
Die Konzentration des IgA-α&sub1;AT-Komplexes in einem Paneltest pathologischer Proben wurde durch diese Methode gemessen. Die Ergebnisse sind unten in Tab. 2 gezeigt. Tabelle 2 Patient Diagnose Probe IgA-α&sub1;AT-Komplex-Konzentration (2D-IEP-Wert) (willkürliche Einheiten) 2D-IEP-Rang geschwollenes Knie IgA-Myelomatose Polymyalgie Serum Gelenkflüssigkeit RA = rheumatoide Arthritis AS = Spondylarthritis alikylosanz * = steroid behandelter Patient

Beispiel 7

Messung des IgA-α&sub1;AT-Komplexes durch Sandwich-ELISA-Assays

Allgemeine Methode

Eine flexible 96-Mulden-Prüfplatte (Falcon 3912) wurde mit einem ersten oder Einfang- Antikörper optimaler Konzentration beschichtet, die in einem Beschichtungspuffer (0.05M Carbonat/Bicarbonat-Puffer ph 9.6) hergestellt wurde. 120 ul Aliquote dieses Antikörpers (z.B. 1/16000 Verdünnung) wurden auf der Platte durch Inkubation bei 37º C während 1 Stunde, bei Zimmertemperatur 1 Stunde lang oder über Nacht bei 4º C adsorbiert. Die Platte wurde dann 3 mal 1 Minute lang gewaschen, jedes Mal mit phosphatgepufferter Salzlösung (ph 7.2), die 0.05 % Tween 20 enthält.
100ul Aliquote des IgA-α&sub1;AT-Komplexes oder Testserumproben (2-fach oder 5-fach verdünnt) wurden der Platte zugefügt und 1 Stunde lang bei 37º C inkubiert. Die Platten wurden dann gewaschen wie vorher.
100ul Aliquote eines zweiten Antikörpers optimaler Konzentration (z.B. 1/6000 Kaninchen-Anti-IgA-α&sub1;AT-Komplex) wurden der Platte zugefügt und dann bei 37ºC 1 Stunde lang inkubiert. Die Platte wurde wieder gewaschen wie vorher. Dann wurden 100 ul Aliquote eines dritten Antikörpers optimaler Verdünnung zugefügt. Dieser Antikörper (z.B. Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG) wurde mit dem Meerrettich-Peroxidase-Enzym markiert. Die Platten wurden bei 37ºC 1 Stunde lang inkubiert und dann wie zuvor gewaschen.
100ul Aliquote des Substrats für das Meerrettich-Peroxidase-Enzym wurde zugefügt. Das Substrat enthielt 20 mg o-Phenylendiamin, 250ul H&sub2;O&sub2; und 50 ml 0.15M Zitrat-Phosphat- Puffer, ph 5.0. Die Farbe durfte sich 5 - 15 Minuten lang entwickeln, dann wurde die enzymatische Farbreaktion durch Zufuhr von 25ul 25 %iger H&sub2;SO&sub4; zu allen Mulden gestoppt. Die optische Dichte aller Muldeninhalte wurde bei 492 nm (OD492) in einem automatischen Titertek -Plattenleser gelesen.

Ergebnisse:

1. Sandwich-ELISAs, die polyklonale gegen IgA oder α&sub1;AT gerichtete Antikörper inkorporieren. Der Einfang-Antikörper ist Anti-IgA

Die Prozedur, nach der die Sandwich-ELISAS ausgeführt wurden, war wie oben beschrieben. Es wurden vier Assays durchgeführt, bei denen 2 Schaf- und 2 Kamnchen-Polyklonale-Anti-IgA-Antikörper als Einfang- oder erster Antikörper zur Verwendung kamen. Die Bindungsschemata für diese ELISA-Assays sind unten gezeigt:
Assay 1: Träger/Sch.(1)Anti-IgA/IgA-α&sub1;AT-Komplex/Sch.-Anti-α&sub1;AT + markierter Anti- Schaf-Antikörper.
Assay 2: Träger/Sch.(2)Anti-IgA/IgA-α&sub1;AT-Komplex/Sch.-Anti-α&sub1;AT + markierter Anti-Schaf-Antikörper.
Assay 3: Träger/Ka.(1)Anti-IgA/IgA-α&sub1;AT-Komplex/Sch.-Anti-α&sub1;AT + markierter Anti- Schaf-Antikörper.
Assay 4: Träger/Ka. (2)Anti-IgA/IgA-α&sub1;AT-Komplex/Sch.-Anti-α&sub1;AT + markierter Anti- Schaf-Antikörper.
20 Sch. = Schaf.
Ka. = Kaninchen.
Die Ergebnisse der obigen Assays 1 - 4 sind in Tabelle 3 unten gezeigt. Die Proben 1 - 12 sind dieselben wie die Proben in Tabelle 2 von Beispiel 6, wo die Konzentrationen des IgA-α&sub1;AT-Komplexes durch 2D-IEP gemessen wurden. Ihre Rangfolge nach 2D-IEP ist in Tabelle 3 wegen des leichteren Vergleiches reproduziert. Tabelle 3 Probe Nr. Assay Rang in Rang
Wie qualitativ durch Vergleich der Rangstufen gesehen und durch statistische Analyse bestätigt werden kann, bestätigte ELISA die Ergebnisse der 2D-IEP nicht. Beispielsweise ergaben bei den Assays 1 und 3 die Proben 6, 7 und 9 jeweils niedrige Werte trotz ihrer hohen 2D-IEP-Werte, und die Komplexkonzentration bei Probe 10 erschien bei 2D-IEP niedrig, aber hoch durch den ELISA-Wert.
Bei den Assays 2 und 4 geben die Proben 6, 7 und 9 sämtlich niedrige ELISA-Werte trotz ihrer hohen 2D-IEP-Werte. Diese Ergebnisse zeigen, daß dieser Ansatz nicht benutzt werden kann, um den IgA-α&sub1;AT-Komplex zu messen. Die Diskrepanzen in den Ergebnissen, die durch die beiden Methoden (ELISA und 2D-IEP) erhalten wurden, sind wahrscheinlich auf die Bindung des freien IgA bevorzugt an die Anti-IgA-Antikörper-Beschichtung der ELISA-Platte zurückzuführen, wodurch eine Bindung des IgA-α&sub1;AT-Komplexes verhindert wird.

2. Sandwich-ELISA-Systeme. die polyklonale Antikörper inkorporieren, die gegen IgA oder α&sub1;AT gerichtet sind. Der Einfang-Antikörper ist Anti-α&sub1;AT

Eine Sandwich-ELISA-Prozedur wurde ausgeführt, wie sie oben beschrieben wurde. Das folgende Bindungschema wurde benutzt:
Träger/Schaf-Anti-α&sub1;AT/IgA-α&sub1;AT-Komplex/polyklonaler Anti-IgA + markierter Antikörper
In diesem Beispiel wurden verschiedene pathologische Proben ausgemessen und mit den Messungen derselben Proben durch 2D-IEP verglichen. Die Ergebnisse sind unten in Tab. 4 dargestellt: Tabelle 4 Name des Patienten Diagnose ELISA-Ergebnisse&spplus; bei Serumverdünnungen von: Komplex-Spiegel bestimmt durch 2-dimensionale I.E.* Weaver White Reid Barton Wright snape Albandol Jones Myelome + = OD- (optische Dichte) Einheiten * = wirkürliche Einheiten
Die großen Unterschiede in den Ergebnissen, die durch die beiden Methoden erhalten wurden, sind wahrscheinlich, wie z.B. aus den Rangfolgen ersehen werden kann, der Bindung des freien α&sub1;AT vorzugsweise an den beschichtenden Antikörper zuzuordnen, wodurch eine Bindung des IgA-α&sub1;AT-Komplexes verhindert wird.

3. ELISA-Sandwich-Assays unter Verwendung von Antikörpern (monoklonal oder polyklonal) zum natürlich erzeugten Komplex als Einfang- oder erste Antikörper

Bei der Ausführung einer Sandwich-ELISA-Prozedur, wie sie beschrieben wurde, wurden folgende Bindungsschemata benutzt:
1. Träger/Mk.-Anti-IgA-α&sub1;AT/IgA-α&sub1;AT-Komplex/Sch.-Pk.-Anti-IgA + markierter Anti-Schaf-Antikörper.
2. Träger/Mk.-Anti-IgA-α&sub1;AT/IgA-α&sub1;AT-Komplex/Sch.-Pk-Anti-α&sub1;AT + markierter Anti-Schaf-Antikörper.
3. Träger/Mk.-Anti-IgA-α&sub1;AT/IgA-α&sub1;AT-Komplex/Ka.-IgA-α&sub1;AT + markierter Anti-Kaninchen-Antikörper.
4. Träger/Ka.-Pk-Anti-IgA-α&sub1;AT/IgA-α&sub1;AT-Komplex/Sch.-Pk-Anti-IgA + markierter Anti-Schaf-Antikörper.
5. Träger/Ka.-Pk.-Anti-IgA-α&sub1;AT/IgA-α&sub1;AT-Komplex/Sch.-Pk.-Anti-α&sub1;AT + markierter Anti-Schaf-Antikörper.
6. Träger/Ka.-Pk.-Anti-IgA-α&sub1;AT/IgA-α&sub1;AT-Komplex/Mk.-Anti-IgA-α&sub1;AT + markierter Anti-Schaf-Antikörper.
Pk. = Polyklonaler Antikörper, gerichtet gegen den gereinigten Komplex, IgA oder α&sub1;AT, wie in den obigen Bindungsschemata gezeigt.
Mk. = Monoklonaler Antikörper, durch Hybridom NLW54 in Übereinstimmung mit der Erfindung abgeschieden.
Sch. = Schaf.
Ka. = Kaninchen.
Die Ergebnisse einer Sandwich-ELISA, die das obige Bindungsschema (3) beinhaltet, ist unten in Tabelle 5 gezeigt. Diese Tabelle zeigt einen Vergleich von OD492-Werten, die mit ELISA erhalten wurden, mit den Ergebnissen der 2D-IEP. Tabelle 5 Serum Nr. 2D-IEP-Werte ELISA (OD492) Rang Werte gereinigter, isolierter IgA-α&sub1;AT-Komplex
Wie aus Tabelle 5 hervorgeht, zeigen drei der vier Proben vom Bindungschema (3) mit hohen 2D-IEP-Werten 03.0 Einheiten) auch höhrere OD492-Werte. Obwohl in Serumproben, die geringere Werte des IgA-α&sub1;AT-Komplexes enthalten, geringe Unterschiede bei den gemessenen ELISA-Werten bestehen, kann dieses Ergebnis durch ein Erhöhen der Empfindlichkeit der Sensitivität des Assay behoben werden.
Die Ergebnisse der ELISA-Assays, die die Bindungsschemata 1 und 2 (Daten nicht gezeigt) inkorporieren, zeigen einen ähnlichen Trend wie jene für das Schema (3). Diese Ergebnisse zeigen, daß in einem Sandwichassay der Nachweisantikörper gegen den gesamten Komplex oder gegen jede Komponente davon sein kann.
Die Ergebnisse, die aus den Assays erhalten wurden, die die Bindungsschemata 4, 5 und 6 inkorporieren, zeigen, daß es nicht möglich ist, den IgA-α&sub1;AT-Komplex durch Benutzung von Platten zu messen, die mit polyklonalem Kaninchen-Antikomplex-Antikörper beschichtet sind (Daten nicht gezeigt).

Beispiel 8

Messung des IgA-α&sub1;AT-Komplexes durch Inhibitions-ELISA

Eine starre 96-Mulden-Platte (Falcon 3040) wurde mit 500 ug/ml&supmin;¹ Rinderserum-Albumin (BSA) beschichtet. 200ul-Aliquote wurden jeder Mulde zugeführt, und die Platte wurde bei 37ºC eine Stunde lang inkubiert. Die Platte wurde dreimal jeweils 1 Minute lang mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ph 7.2 gewaschen, die 0.05 % Tween 20 (PBS/Tween 20) enthält. 100ul-Aliquote des IgA-α&sub1;AT-Komplexes oder Testserumproben 15 wurden titriert (2-fach oder 5-fach verdünnt in PBS/Tween 20), danach wurden 100ul- Aliquote des monoklonalen Antikörpers zum IgA-α&sub1;AT-Komplex aus der NLW54- Zellenlinie einer optimalen Konzentration zugegeben (z.B. 1/20000, um eine Endkonzentration von 1/40000 zu erreichen), und die Platte wurde über Nacht bei 4ºC inkubiert.
Nach der oben beschriebenen Inkubation über Nacht wurde die Platte bei 3000 U.p.M. 15 min zentrifügiert, und 90 ul Aliquote wurden von jeder Mulde auf eine andere Platte transferiert, die mit dem IgA-α&sub1;AT-Komplex vorbeschichtet war. Diese Platte wurde wie folgt vorbeschichtet. Eine flexible 96-Mulden-Assayplatte (Falcon 3912) wurde mit 100ul Aliquoten des IgA-α&sub1;AT-Komplexes mit der Konzentration 5ug ml&supmin;¹ beschichtet, hergestellt in einem Beschichtungspuffer (0.05M Carbonat/Bicarbonat-Puffer pH 9.6). Diese Platte wurde dann bei 37ºC eine Stunde lang, bei Zimmertemperatur 2 Stunden lang oder bei 4ºC über Nacht inkubiert und dann wie oben beschrieben gewaschen.
100ul Aliquote des Antikörpers, markiert mit dem Meerrettich-Peroxidase-Enzym und von optimaler Verdünnung (z.B. markierte Ziegen-Antimaus-IgG bei 1/1000 Verdünnung), wurden hinzugefugt, und die Platte wurde bei 37ºC eine Stunde lang inkubiert. Die Platte wurde wie zuvor gewaschen. 100ul Aliquote der Substratlösung wurden zugefügt. Die Substratlösung enthielt 20mg o-Phenylendiamin, 250ul H&sub2;O&sub2; und Soml 0. 15M Zitrat-Phosphat-Puffer, ph 5.0. Die Farbe durfte sich 5 - 15 Minuten lang entwickeln, bevor die enzymatische Reaktion durch Hinzufügen von 25ul 25 %iger H&sub2;SO&sub4; zu allen Mulden beendet wurde.
Die optische Dichte aller Muldeninhalte wurde in einem automatischen Titertek-Plattenleser bei 492 nm (OD492) gelesen. Die Berechnung des Inhibitionsprozentsatzes war wie folgt:
% Inhibition = 1 - OD492-Probe - OD492-Leerwert/OD492-nichtinhibierte Probe - OD492-Leerwert x 100.
Die Ergebnisse dieses Assay sind in Tabelle 6 gezeigt. Die Ergebnisse wurden mit der Messung derselben Seren durch eine konventionelle 2D-IEP-Prozedur verglichen. Die ELISA-Resultate werden ausgedrückt als das Reziproke der Verdünnung des Serums (des Titers), das zugegeben werden muß, um 50% Inhibition des markierten Antikörpers zu ergeben. Tabelle 6 Rheumatoides Serum Kehrwert des Serumtiters, der 50% Inhibition ergibt Rang 2D-IEP (willkürliche Flächeneinheiten) 2D-IEP Rang
Wie aus den Auswertungen in Tabelle 6 ersichtlich ist, gab es zwischen ELISA und 2D-IEP eine gute Übereinstimmung. Diese wurde statistisch zu etwa 69 % berechnet. Dieser Prozentsatz wird noch beeindruckender (89%), wenn die Ergebnisse für Serum 32 (die Probe mit dem höchsten ELISA-Inhibitionswert) ignoriert werden.

Beispiel 9

Messung des IgA-α&sub1;AT-Komplexes durch ELISA mit doppeltem Antikörper-Einfang

Flexible 96 Mulden-Prüfplatten (Falcon 3912) wurden mit dem Einfang-Antikörper optimaler Konzentration beschichtet, der in Beschichtungspuffer (0.05M Carbonat/Bicarbonat; ph 9.6) hergestellt wurde.
Aliquote (120ul) des Antikörpers mit einer Verdünnung von 1/1000 wurden durch Inkubation bei 37ºC eine Stunde lang, bei Zimmertemperatur zwei Stunden lang oder bei 4ºC über Nacht auf eine Platte absorbiert. Die Platte wurde dann mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), ph 7.2, enthaltend 0.05 % Tween 20, gewaschen (3 x 1 min).
Zu der oben erwähnten, vorbeschichteten Platte wurde monoklonaler Antikörper zum IgAα&sub1;AT-Komplex, sezerniert durch Hybridom NLW54 in Übereinstimmung mit der Erfindung, zugefügt, und der Assay wurde entsprechend dem früher in Beispiel 7 beschriebenen Protokoll ausgeführt. Folgendes Bindungsschema wurde angewandt:
Träger/Mk.-Ratten-Antimaus-IgG/Mk-Maus-Anti-IgA-α&sub1;AT-Komplex/IgA-α&sub1;AT-Komplex/Pk.-Ka.-Anti-IgA-α&sub1;AT/markierter Anti-Kaninchen-Antikörper
Mk. = Monoklonaler Antikörper
Pk. = Polyklonaler Antikörper
Ka. = Kaninchen.
Die Ergebnisse der Bestimmung des Wertes des IgA-α&sub1;AT-Komplexes in einem Feld von Testseren (rheumatoide Arthritis und normale Kontrollen) durch das obige Verfahren mit doppeltem Antikörper-Einfang wurden mit den Werten des IgA-α&sub1;AT-Komplexes verglichen, die durch 2D-Immunelektrophorese, Einzelantikörper-Einfang-ELISA (wie in Beispiel 7(3), dem Bindungsschema 3 folgend) und Inhibitions-ELISA-Techniken (wie in Beispiel 8 beschrieben) gemessen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7 Probe 2D-IEP (cm²) Doppelter Antikörper-ELISA (Serumverdünnung 1/40) O.D. 492 nm Einzel-Antikörper-ELISA (Serumverdünnung 1/40) O.D. 492 nm Inhibitions ELISA 50% Inhibitions-Titer Normale seren Komplex enthaltende Seren Diese Probe (*) zeigt anormales Verhalten darin, daß sie durchgehend hohe ELISA-Werte und niedrige 2D-IEP-Werte zeigt. Sie ergibt wahrscheinlich falsche niedrige 2D-IEP- Ablesungen.

Beispiel 10

Vergleich der Ergebnisse von der Anwendung monoklonalen Murins NLW.50 und NLW.54 im ELISA-System

Es wurde auch ein Doppel-Antikörper-Einfang-Assay durchgeführt, in dem der monoklonale Antikörper zum IgA-α&sub1;AT-Komplex durch das Hybridom NLW.50 in Überein- Stimmung mit der Erfindung abgeschieden wurde. Bei dieser Nachweismethode wurden Polystyrolplatten angewendet (Dynatech-Immulon 4). Die Nachweismethode wurde, wie oben in Beispiel 9 beschrieben, durchgeführt, außer daß das Testserum 1/100 verdünnt war. Die Anwendung eines besseren monoklonalen Antikörpers, verbunden mit der Benutzung von Polystyrolplatten, trug zur erhöhten Sensitivität dieser Nachweismethode bei. Das folgende Bindungschema wurde angewendet:
Träger/Ratten-Mk-Anti-Maus-IgG/Mk. Anti-IgA-α&sub1;AT/IgA-α1AT-Komplex/Ka.-Pk.-Anti- IgA-α&sub1;AT/markierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper.
Mk. = Monoklonaler Antkörper
Pk. = Polyklonaler Antikörper
Z. = Ziege
Ka. = Kaninchen
Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8 SERUM PROBE 2D-IEP ERGEBNISSE (willkürliche Einheiten) ELISA-ERGEBNlSSE (OD 492) Wert Rang
Wenn die Ergebnisse als ELISA-Ergebnisse für NLW.54 und NLW.50 gegen die 2D-IEP- Messung aufgetragen wurden, dann ergibt sich ein Korrelationskoeffizient von 0.56 bzw. 0.72, was bestätigt, daß NLW.50 etwas sensitiver ist als NLW.54 und der Grund dafür ist, warum es daher der bevorzugte Antikörper ist.

Beispiel 11

Auswirkung von einem oder von zwei Nachweisantikörpern in einem Doppel-Antikörper- Einfang-ELISA-Assay

Ein Doppel-Antikörper-Einfang-ELISA-Assay wurde ausgeführt, wie früher in Beispiel 9 beschrieben ist, außer daß die Polystyrolplatten (Dynatech-Immulon 4) zur Anwendung kamen und das Testserum 1/100 verdünnt war. Es wurde die Wirkung der Anwendung von einem oder von zwei Nachweisantikörpern im ELISA-Assay untersucht. Folgende Bindungsschemata wurden angewendet:
(1) Träger/Ratten-Mk.-Anti-Maus-IgG/Maus-Mk.-Anti-IgA-α&sub1;AT/IgA-α&sub1;AT-Komplex/Sch.-Pk.-Anti-IgA/E.-Anti-Schaf markierter Antikörper.
(2) Träger/Ratten-Mk.-Anti-Maus-IgG/Maus-Mk.-Anti-IgA-α&sub1;AT/IgA-α&sub1;AT-Komplex/Sch.-Pk.-Anti-IgA markiert.
Mk. = Monoklonaler Antikörper.
Pk. = Polyklonaler Antikörper.
Sch. = Schaf.
E. = Esel.
Der monoklonale Anti-IgA-α&sub1;AT-Antikörper war der, der durch Hybridom NLW.50 in Übereinstimmung mit der Erfindung abgeschieden wurde.
Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9 IgA-α&sub1;AT SERUM Komplexkonzentrationen (willkürliche Einheiten) Bindungsschema
Die Ergebnisse dieses Nachweises zeigen, daß es keinen Sensitivitätsverlust gab, als ein Nachweis-Antikörper anstelle von Zweien zur Anwendung kamen, wie es bei ELISA- Assays Tradition ist. Dies hat den Vorteil, daß es die zur Durchführung des Assays benötigte Zeit um eine Stunde reduziert, und auch die Kosten zur Durchführung eines solchen Assays werden reduziert.
Wenn man die Ergebnisse der beiden Assays vergleicht, indem man die Ergebnisse für Bindungsschema 1 gegen die für Bindungsschema 2 aufträgt, so ergibt sich ein Korrelationskoeffizient von 0.88 und eine Standardabweichung < 0.001, was sehr signifikant ist. Der Punkt, der die Serumprobe Nr. 2 darstellt, wurde aus der statistischen Analyse herausgenommen (falls er darin eingeschlossen ist, beträgt der Korrelationskoeffizient 0.97).

Beispiel 12

Vergleich des ELISA-Sandwich-Assay unter Anwendung eines Nachweisantikörpers nur mit 2D-IEP-Messungen

Ein Doppel-Antikörper-Einfang-ELISA-Assay wurde in Übereinstimmung mit der Methode, wie sie in Beispiel 9 beschrieben wurde, durchgeführt. Polystyrolplatten (Dynatech-Immulon 4) wurden angewendet, und das Testserum war 1/100 verdünnt. Der monoklonale Einfang-Antikörper war derjenige, der durch das Hybridom NLW.50 in Übereinstimmung mit der Erfindung abgeschieden wurde. Folgendes Bindungsschema wurde angewendet:
Träger/Ratten-Mk.-Anti-Maus-IgG/Mk.-Anti-IgA-α&sub1;AT/IgA-α&sub1;AT-Komplex/Sch.-Pk.- Anti-IgA/markierter-E.-Anti-Schaf-IgA-Antikörper
Mk. = Monoklonaler Antikörper.
Pk. = Polyklonaler Antikörper.
E. = Esel.
Sch. = Schaf.
Die Messung des IgA-α&sub1;AT-Komplexes durch 2D-IEP wurde gemäß Beispiel 6 durchgeführt. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10 SERUM 2D-IEP (cm²) ELISA (willkürliche Einheiten) Wert Rang
Wenn diese Werte in einer 2D-IEP und ELISA vergleichenden Darstellung aufgetragen werden, ergibt sich ein Korrelaüonskoeffizient von 0.73, was signifikant ist.

Formular-Sequenz-Auflistung

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANMELDER:
(ii) TITEL DER ERFINDUNG:
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN:
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT:
(B) STRAßE:
(C) STADT:
(D) STAAT:
(E) LAND: USA
(F) ZIP:
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUM-TYP:
(B) COMPUTER:
(C) BETRIEBSSYSTEM:
(D) SOFWARE:
(vi) DATEN DER GEGENWÄRTIGEN ANMELDUNG:
(vii) DATEN DER FRÜHEREN ANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) ANMELDUNGSDATUM:
(viii) ANWALTS/VERTRETER-INFORMATION:
(A) NAME:
(B) REGISTRATIONSNUMMER:
(C) BEZUGS/AKTEN-NUMMER:
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATIONEN:
(A) TELEFON:
(B) TELEFAX:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR:1:
(i) SEQUENZKENNZEICHNUNGEN:
(A) LANGE: 10 Aminosäuren
(B) TYP: Polypeptid
(C) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP:
(v) FPAGMENTTYP: C-terminales Fragment
(ix) MERKMAL:
(D) ANDERE INFORMATIONEN: Reste 487 - 496 der Human-IgA-Kette
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:1:
(3) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) TYP: Polypeptid
(C) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP:
(v) FRAGMENTTYP: C-terminales Fragment
(ix) MERKMAL:
(D) ANDERE INFORMATIONEN: Reste 484-496 der Human-IgAα-Kette
(xi) SEQUENZBESCHRIEBUNG: SEQ ID NR: 2:
(4) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) TYP: Polypeptid
(C) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP:
(v) FRAGMENTTYP: innen befindlich
(ix) MERKMAL:
(D) ANDERE INFORMATIONEN: Reste 231 - 234 des Human-α&sub1;AT
(xi) SEQUENZBESCHRIEBUNG: SEQ ID NR: 3:
(4) INFORMATION FÜR SEQ ID NR 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) TYP: Polypeptid
(C) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP:
(v) FRAGMENTTYP: innen liegend
(ix) MERKMAL:
(D) ANDERE INFORMATIONEN: Reste 225-237 des Human-α&sub1;-AT
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:4:

Claims

1. Ligand, enthaltend eine Antikörperdomäne, die für eine Antigen-Determinante eines Komplexes aus Human-IgA und α&sub1;-Anütrypsin spezifisch ist, wobei die Antikörperdomäne nicht reaktiv mit freiem Human-IgA und freiem Human-α&sub1;-Antitrypsin ist.

2. Ligand nach Anspruch 1, bei dem die Domäne spezifisch für den natürlich vorkommenden Komplex aus IgA und α&sub1;-Anütrypsin (IgA-α&sub1;AT) ist.

3. Ligand nach Anspruch 1, bei dem die Domäne für ein synthetisches Peptid spezifisch ist, das ein erstes Peptidfragment mit einer im Fc-Bereich des Human-IgA gefundenen Aminosäurensequenz oder einer Analogen davon und ein zweites, kovalent an das erste gebundenes Peptidfragment mit einer im Human-α&sub1;AT gefundenen Aminosäurensequenz oder einer Analogen davon umfaßt.

4. Ligand nach Anspruch 1, 2 oder 3 in Form eines monoklonalen Antikörpers.

5. Ligand nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 in Form eines Fab'-Fragments dieses Antikörpers.

6. Ligand nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 in Form eines F(ab')2-Fragments dieses Antikörpers.

7. Immunogenes Peptid, enthaltend ein erstes Peptidfragment mit einer im Fc-Bereich des Human-IgA gefundenen Aminosäurensequenz oder einer Analogen davon und ein zweites Peptidfragment mit einer im Human-α&sub1;AT gefundenen Aminosäurensequenz oder einer Analogen davon, wobei das erste und zweite Peptidfragment jeweils einen Cysteinrest aufweisen und sie über diese Cysteinreste kovalent aneinander gebunden sind, worin ein gegen das Peptid auftretender Antikörper nicht reaktiv mit freiem Human-IgA und nicht reaktiv mit freiem Human-α&sub1;AT ist und sich an den natürlich vorkommenden Komplex von Human-IgA und α&sub1;AT bindet.

8. Immunogenes Peptid nach Anspruch 7, bei dem das erste Peptidfragment eine Aminosäurensequenz, die den vorietzten Cysteinrest des Fc-Bereichs des Human-IgA aufweist, oder eine Analoge davon enthält, relativ zum C-terminalen Ende von Human- IgA.

9. Immunogenes Peptid nach Anspruch 7 oder 8, bei dem das erste Peptidfragment eine Val-Met-Ala-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr-Sequenz oder eine immunogene Analoge davon enthält.

10. Immunogenes Peptid nach Anspruch 9, bei dem das erste Peptidfragment eine Val-Ser-Val-Val-Met-Ala-Glu-Val-Asp-Gly-Thr-Cys-Tyr-Sequenz oder eine immunogene Analoge davon enthält.

11. Immunogenes Peptid nach Anspruch 7, 8, 9 oder 10, bei dem das zweite Peptidfragment eine His-Cys-Lys-Lys-Sequenz oder eine immunogene Analoge davon enthält.

12. Immunogenes Peptid nach Anspruch 7, 8, 9 oder 10, bei dem das zweite Peptid eine Gly-Met-Phe-Asn-Ile-Gln-His-Cys-Lys-Lys-Leu-Ser-Ser-Sequenz oder eine immunogene Analoge davon enthält.

13. Immunogenes Peptid nach Anspruch 7, bei dem das erste und zweite Fragment ein Peptid die Sequenz

immunogene Analoge davon enthält.

14. Ligand nach Anspruch 3, bei dem die Domäne spezifisch für ein in Anspruch 7, 8, 9, 10,11,12 oder 13 beanspruchtes Peptid ist.

15. Antikörper, der mit der als NLW.50 bezeichneten Hybridoma-Zellen-Linie hergestellt ist, die am 13. Dezember 1990 bei der European Collection of Animal Cell Cultures PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SPA OJG, England unter der Zugangs-Nummer ECACC 90121302 hinterlegt wurde.

16. Prüfverfahren auf menschliche rheumatoide Arthritis (RA) in einem Analyten, der verdächtig ist, einen Komplex von Human-IgA und u&sub1;-Antitrypsin (IgA-α&sub1;AT) als Indikator von RA zu enthalten, das den Nachweis oder Messung der immunologischen Bindung zwischen diesem Komplex und einem in den Ansprüchen 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 14 beanspruchten Liganden oder dem in Anspruch 15 beanspruchten Antikörper enthält.

17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Probe vom Sandwich-Typ ist und enthält: das Einfangen des IgA-α&sub1;AT, indem es zur Bindung an den Liganden als erstem oder Einfang-Liganden veranlaßt wird, und Prüfung dieser Bindung, indem das IgA-α&sub1;AT zur Bindung an einen zweiten, markierten oder Nachweis-Liganden veranlaßt wird, der eine zum Nachweis des IgA-α&sub1;AT geeignete Antikörperdomäne aufweist, und Nachweis oder Messung der dadurch eingefangenen Markierung, wenn sie an den ersten Liganden gebunden ist, wobei die genannte Domäne eine Antikörperdomäne zu IgA, α&sub1;AT oder dem Komplex davon sein kann.

18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die Prüfung in Lösung durchgeführt, der Einfang-Ligand an einen unlöslichen Träger gebunden, nach der Bindung der Träger aus der Lösung abgetrennt und die Anwesenheit oder die Menge der Markierung auf dem Träger festgestellt oder gemessen wird.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, bei dem der Nachweis-Ligand ein Antikörper zu IgA, α&sub1;AT oder einem Komplex davon ist.

20. Prüfkit zur Durchführung eines Prüfverfahrens auf menschliche rheumatoide Arthritis in einem Analyten, der verdächtig ist, einen Komplex von Human-IgA und α&sub1;-Antitrypsin (IgA-α&sub1;AT) als Indikator von RA zu enthalten, wobei der Prüfkit enthält:

(1) einen in den Ansprüchen 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 14 beanspruchten Liganden oder den im Anspruch 15 beanspruchten Antikörper,

(2) einen IgA-α&sub1;AT-Komplex.

21. Prüfkit nach Anspruch 20 zum Gebrauch in einer Sandwich-Probe nach Anspruch 17, weiterhin enthaltend:

(3) einen zweiten Liganden, der eine Antikörperdomäne enthält, die geeignet ist, einen IgA-α&sub1;AT-Komplex festzustellen, wenn er an den Liganden (1) gebunden ist.

22. Prüfkit nach Anspruch 20 zur Verwendung in einem konkurrierenden oder hemmenden Test, wobei die IgA-α&sub1;AT-Komplexkomponente des Kits ein immunogenes Analogon des natürlich vorkommenden Komplexes ist, das sich in Konkurrenz mit diesem bindet.

23. Prüfkit nach Anspruch 22, bei dem das immunogene Analogon ein Peptid nach einem der Ansprüche 7 bis 13 ist.