DE1617568B - Verfahren zur Abschwächung von Schweinecholeravirus in Schweinezellkulturen - Google Patents

Description

bei dem die Gefahr der Verunreinigung mit Mikro- trennungs- und Züchtungsstufe jeweils einzeln für

Organismen geringer ist. . ^; ■: etwa 80 Passagen wiederholt, wodurch eine wirksame

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe auf Abschwächung des Schweinecholeravirüs erzielt wird, überraschend einfache Art und Weise dadurch gelöst Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel werden kann, daß man zur Attenuierung des Schweine- 5 näher, erläutert. ■
choleravirus die Viren nicht auf jeweils neue Zellkulturen überimpft, wie bei dem vorstehend beschrie- ·''.■' Beispiel
benen bekannten Verfahren, sondern daß die Über- ' :

impfung der virusinfizierten Zellen auf stets neue Gesunde, für HCV hochempfindliche Yorkshire-Nährlösungen erfolgt, wodurch es möglich ist, die io Schweine, die in einer isolierten und geschlossenen vorstehend aufgezeigten Gefahrenquellen vollständig Anstalt unter Beachtung aller gesundheitlichen Regeauszuschalten, lungen gehalten wurden, wurden mit einem virulenten

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren Stamm von HCV geimpft. Der Stamm bestand aus

zur Abschwächung von Schweinecholeravirüs in einem Standardimmunitätstest-Virus und war unter

Zellen, die durch eine einen Phosphatpuffer, 0,1 % 15 strengem Ausschluß von Bakterien- und Viren-Ver-

Trypsin und 0,1 °/₀ EDTA enthaltende Salzlösung unreinigungen gehalten worden. Beim Höhepunkt

getrennt wurden, das durch die folgenden Schritte der Infektion ließ man die Schweine ausbluten und

gekennzeichnet ist: die Nieren wurden aseptisch entnommen. Die Nieren

, _, , „ . ' „ _VT. . , wurden zerkleinert und bei 4° C über Nacht gerührt,

1. Beschaffung der Zellen aus Nieren oder anderen _{2o wobd das Gewebe in einer} p_hoSp_hatp_uffersalzlösung Schweinecholeravirüs enthaltenden Organen eines _{(pBS) aufgetrennt wurde die O25}o/ _{Trypsin und} sonst gesunden Schweines, das frei von einem _{0250/ Pankreatin (auf das Gewicht bezogen)} enthielt. Schweinecholeravirus-Antikorper ist und das mit _{Die ZeHen wurden gesammeIt} g_ewaSchen und in einem Standardimmunitatsvirus geimpft wurde, _{dnem Nährmedium} mit einer Konzentration von wöbe, diese Nieren oder anderen Organe asep- _{25 5}.₁₀5_{Zellen je Mimiiter suspendiert}. _Die ZeIltischL beim.Höhepunkt desinfektion entnommen _{suspension wurde in} Glasgefäße gebracht und stawurden durch Zerstückelung der Niere oder _{tionär bd 36 bis 37}o_{c üchtet Die an der Glas}. der anderen Organe und Trennung des Zellver- _{wand anhaftenden Zel)en bildeten einen zusammen}bandes durch Trypsinisierung bei 4 C, hängenden Einschichtzellrasen.

2. Züchtung eines Zellrasens bei 36 bis 37°C aus ₃₀ Nach vollständiger Ausbildung des Zellrasens den durch Trypsin getrennten, infizierten Zellen wurde die Schicht erneut mit PBS, das 0,1 Gewichts-

^:: in einem Nährmedium zur Erlangung eines pri- prozent Trypsin und 0,1 Gewichtsprozent EDTA

mären Einschichtzellrasens von infizierten Zellen, enthielt, aufgetrennt. Die Zellen wurden wieder

3. Auftrennung der primären Einschichtzellkultur gesammelt, gewaschen und in einem Nährmedium durch eine einen Phosphatpuffer, 0,1 °/₀ Trypsin 35 mit einer Konzentration von etwa 1 · 10⁵ Zellen je und 0,1 °/₀ EDTA enthaltende Salzlösung, Milliliter suspendiert. Die suspendierten Zellen wur-

4. Weiterzüchtung der Zellen der Stufe 3 bei 36 ^{den in} Kulturgefäße gegeben und stationär bei 36 bis 37⁰C in einem frischen Nährmedium, die ^{bis 37}°^c kultiviert, wobei sich wiederum ein zudarin eine neue Generation von infizierten Zellen sammenhängender Einschichtzellrasen bildete.

,,bilden, und Gewinnung einer Einschichtzellkultur 40 Dieses Verfahren wird als Zellpassage bezeichnet, in der zweiten Passage, Zellen, die hintereinander mehr als 50mal passiert

5. Wiederholung sowohl'der Auftrennung als auch . ^wurden> ^werden nachfolgend als Träger-Zellstämme "der Züchtung in frischen Nährmedien über 50 bezeichnet.

oder mehr Passagen, um den Schweinecholera- _w ^D _t ^as _u Ausgangsmaterial fur das erfindungsgemaße

virus abzuschwächen, bis der Virus für Schweine « Verfahren, nämlich der in den Nieren befindliche

unschädlich ist und die mit dem abgeschwächten ^HCV' ^wa' ^{fur die oben} beschriebenen Zellpassagen

Virus geimpften Schweine einer Schweinecholera- sowie zur Gewinnung von Tragerzellstammen geeig-

virusinfektion widerstehen können. ^net· Außerdem zeichnete sich dabei die Änderung

des virulenten Virus zu einem nichtpathogenen Virus

'Das Verfahren der Erfindung unterscheidet sich 50 klar ab, wenn Schweine mit der Kulturflüssigkeit,

von dem bekannten Abschwächungsverfahren da- die bei verschiedenen Stufen der Zellpassagen abge-

durch, daß zur Durchführung von 100 Viruspassagen nommen worden waren, geimpft wurden. Die mit

nur einmal ein primärer Einschichtzellrasen hergestellt dem Zellstamm 1-1 und dem Zellstamm 3-2 erhal-

werden muß und daß in den verschiedenen, für die tenen Ergebnisse, die jeweils von zwei infizierten

Abschwächung erforderlichen Passagen nur jeweils 55 Schweinen herstammen, sind in der folgenden Tabelle

ein frisches Nährmedium verwendet werden muß. zusammengefaßt.

Dadurch wird, abgesehen von der Wirtschaftlichkeit Der Zellstamm 1-1 zeigte, falls der HCV bei der

und leichten Durchführbai keit des Verfahrens, die vierzigsten Passage oder vorher abgenommen worden

Gefahr praktisch ausgeschaltet, daß — wie in dem war (was einem Kultjvierungstag von 375 oder früher

bekannten Verfahren — bei der Durchführung der 60 entspricht), keine Änderungen hinsichtlich seiner

Passagen Mikroorganismenverunreinigungen einge- Virulenz. Bei der 66. Passage (was einem Kultivie-

schleppt werden. rungstag von 500 entspricht) war der Virus nicht

Die in dem Verfahren der Erfindung verwendeten mehr letal für Schweine. Die Reaktion eines Schwei-

primären Einschichtzellkulturen können von den nes, das den Virus erhielt, war stark, jedoch erholte

Nieren, der Milz oder anderen Organen oder Geweben 65 es sich wieder und überlebte, wobei es im Wachstum

von Schweinen hergestellt werden, die mit Schweine- zurückblieb. Die mit einem bei der 80. Passage ab-

choleraviren künstlich infiziert worden sind. Gemäß genommenen Virus geimpften Schweine (Kultivie-

einer Ausgestaltung der Erfindung werden die Auf- rungstag 600) blieben gesund und ohne klinische

Symptome. Sämtliche überlebenden Schweine waren immun gegenüber einem Test mit einem virulenten HGV bei der 10⁴fachen. der LD _mi_n. Die Immunität war 10 Tage nach der Impfung mit dem abgeschwächten Virus vorhanden.

Das im Zellstamm 3-3 enthaltene HCV war nicht schädlich für Schweine beim 63. Durchgang (Kultivierungstag 500). Die Reaktion der Schweine auf den Virus war schwach. Beim 80. Durchgang (KuI-tivierungstag 600) war der Virus offensichtlich un-

schädlich für Schweine. Die überlebenden Tiere waren immun gegenüber, der 10⁴fachen LD_min eines virulenten HCV, und zwar bereits 10 Tage nach der Impfung mit dem abgeschwächten Virus.
·. Im Gegensatz hierzu.war ein HCV, der in nichtpassierten Einschichtzellrasen verblieb, welche während mindestens 600 Tagen unter periodischem Wechsel des Mediums gehalten worden waren, noch letal für Schweine. Das waren Kulturen, aus denen die .Trägerzellstämme gewonnen werden konnten.

Reaktion von Schweinen auf Schweinecholeravirus, der bei verschiedenen Stufen von Zellpassagen von virustragenden Schweineniereneinschichtzellstämmen abgenommen worden war

	Inoculurr	ι für Versuchsschweine	Virus- titer	Anzahl der Schweine***)	Reaktion der Schweine	Reaktion der Schweine	. . .
ZeIl-	Anzahl	Kulti	2,75*)	4	auf das Inoculum	auf Immunitätstest
stamm- bezeich- nung	der Passagen	vierungs- tag			Tod durch Schweine		. . .
	10	151	2,50	9	cholera (9)**)		5 Wochen keine Reak
					Tod durch Schweine		tion****)
	24	300	4,25	13	cholera (22)
					Tod durch Schweine- .	2 Wochen keine Reaktion
1-1	40	375	3,75	17	cholera (16)	10 Tage keine Reaktion
					krank, jedoch Erholung,
	66	500			aber im Wuchs zurück
			3,75	24	geblieben
			3,75	25	blieb gesund	....
	80	600	5,00	6	blieb gesund
	80	600			Tod durch Schweine-	; . .
	20	200	1,50	11	cholera(ll)	3 Wochen keine Reaktion
					Tod durch Schweine
	35	300	2,83	15	cholera (27)	2 Wochen keine Reaktion
					Tod durch Schweine	10 Tage keine Reaktion
3-2	44	350	5,00	19	cholera (37)
					Überleben mit schwacher
	63	500	5,25	26	Reaktion
			5,25	27	blieb gesund
	80	600			blieb gesund
	80	600

*) LogioTCIDjo-Virustiter je Impflösung (1 ml), erhalten nach END-Test. **) Tage bis zum Tod.

***) Yorkshire-Schwein, frei von HCV-Antikörper, 50 bis 60 Tage alt. ***.*) Zeitraum zwischen Impfung und Ansprechen auf Immunitätsversuch.

Aus der vorstehenden Tabelle ergibt sich, daß das in Zellkultuien überlebende HCV hinsichtlich seiner Virulenz durch Passagen der Zellen abgeschwächt worden war.

Claims (5)

Gestehungskosten ^dieser Vakzine wegen des teuren Patentansprüche: , Ausgangsmaterials. (zu ihrer Herstellung muß defibri- riiertes Gesamtblut von .-infizierten Schweinen ver-

1. Verfahren zur Abschwächung von Schweine- wendet werden) sehr hoch sind.

choleravirus in Zellen, die durch eine einen Phos- 5 Man war daher bestrebt, die Nachteile dieser phatpuffer, 0,1 °/o Trypsin und 0,1 °/₀ Äthylen- Vakzine mit abgetöteten Viren durch Verwendung diamintetraessigsäure enthaltende Salzlösung ge- von Vakzinen mit Lebendvirus zu beseitigen. Hier trennt wurden, gekennzeichnet durch hat sich jedoch gezeigt, daß bestimmte Lebendvirusfolgende Schritte: vakzine, beispielsweise ein lapinisierter Virus, hin- _ _, . ~. _ ., ... . ίο sichtlich der Virulenz des Virus mit großer Vorsicht

1. Beschaffung der Zellen aus Nieren oder betrachtet werden müssen.

anderen Schweinecholeravirus enthaltenden _{£s wird all in anerkannti daß die} ideale Virus-Organen eines sonst gesunden ^Schweines, _{vakzine eine so}i_{che mit einem} abgeschwächten Virus das frei von einem Schweinecholeravirus- _{darsteU da eine Vakzine jn jeder Hinsicht sichef} Antikörper ist und das mit einem Standard- _{gein muß und bd niedri Dosie eine schnelle} immumtatsvirus geimpft wurde, wobei diese _{Entwicklung der} i_mmunität herbeiführen soll, die Nieren oder anderen Organe aseptisch beim _für j _{Zek anhäU Dies Iäßt sich zufriedenstellend} Höhepunkt der Infektion entnommen wurden, _nur ^ _{einen sicher abgeschwächten} virusstamm durch Zerstückelung der Niere oder der _erreichen. Außerdem können dadurch die Gestehungsanderen Organe und Trennung des Zellver- _{2o kosten drastisch herabgese}t_zt werden, da zur Herbandes durch Trypsinisierung bei 4 C, _{steUung soJcher Vakzine G}ewebekulturverfahren ein-

2. Züchtung eines Zellrasens bei 36 bis 37° C gesetzt werden können.

aus den durch Trypsin getrennten, infizierten _{Es wurde nun} bereits auf die verschiedenste Art

Zellen in einem Nährmedium zur Erlangung _{und We}j_se versucht, unter Anwendung von Gewebe-

eines primären Einschichtzellrasens von infi- ₂₅ kulturverfahren abgeschwächte Schweinecholeraviren

zierten Zellen, (nachfolgend abgekürzt mit HCV) herzustellen. Bei

3. Auftrennung der primären Einschichtzellkultur vielen dieser Versuche ging man davon aus, Schweinedurch eine einen Phosphatpuffer, 0,1 °/₀ Tryp- choleraviren auf Gewebekulturen zu überimpfen, die sin und 0,1 °/₀ Äthylendiamintetraessigsäure von gesunden Tieren hergestellt worden waren. So enthaltende Salzlösung, 30 ist beispielsweise in der USA.-Patentschrift 3 226 296

4. Weiterzüchtung der Zellen der Stufe 3 bei ein Verfahren zur Abschwächung von Schweine-36 bis 37°C in einem frischen Nährmedium, choleravirus beschrieben, bei dem Schweinecholeradie darin eine neue Generation von infizierten ^viren auf Zellkulturen von Gewebeteilen· eines Schwei-Zellen bilden, und Gewinnung einer Einschicht- nes überimpft werden. Dabei erfolgt eine Attenuiezellkultur in der zweiten Passage, 35 rung des Schweinecholeravirus durch wiederholtes

5. Wiederholung sowohl der Auftrennungsstufen Überimpfen der Kulturbrühe auf stets neue Zellais auch der Züchtung in frischen Nähr- !^t;^ur?ⁿ'.₁. ,. _{ΛΤ r} , · „ „
medien über 50 oder mehr Passagen, um _L Nachteilig an diesem Verfahren ist, daß es verden Schweinecholeravirus abzuschwächen, bis hältnismaßig kostspielig ist einen großen apparativen der Virus für Schweine unschädlich ist und *° Aufwand erfordert und die Möglichkeit zur Verdie mit dem abgeschwächten Virus geimpften unreinigung mit Mikroorganismen verhältnismäßig Schweine einer Schweinecholeravirusinfektion S^r°^ß _r ^lst· ^Be! ^d'^e,^sem bekannten Verfahren muß namwiderstehen können. hch fur jede Viruspassage zur Abschwachung des

Schweinecholeravirus ein neuer primärer Einschicht-

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- 45 zeilrasen der Schweineniere verwendet werden. Wenn zeichnet, daß. die Auftrennungsstufe und die z.B. 100 Passagen durchgeführt werden sollen, so Züchtungsstufe jeweils einzeln für etwa 80 Pas- müssen lOOmal primäre Einschichtzellrasen aus sagen wiederholt werden. Schweinenieren hergestellt werden, d. h., es müssen

100 Schweine getötet werden. Die Verwendung von .,,,50 derart vielen Schweinen zur Erzielung einer aus-

^; ■-.■■■■■■>·■> .· _rei_cnenden Abschwachung des Schweinecholeravirus

ist aber nicht nur teuer und arbeitstechnisch sehr aufwendig und zeitraubend, da die Herstellung von

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ab- Einschichtzellrasen verhältnismäßig schwierig ist, sonschwächung von Schweinecholeravirus in Schweine- 55 dem es besteht auch die große Gefahr, daß die jeweils zellkulturen. -'■■■■■■■ " ' :■:-ü::': :., verwendeten Primärzellen Bakterien- und Virusver-Schweinecholera ist eine bekannte Krankheit der unreinigungen enthalten, d. h. durch die Verwendung Schweine, die in den verschiedensten Ländern auf der vielen verschiedenen primären Einschichtzellrasen dem Gebiet der Schweinezucht große wirtschaftliche für die Passagen zur Abschwächung des Schweine-Schäden anrichtet. Zur Bekämpfung der Schweine- 60 choleravirus wird nach diesem bekannten Verfahren cholera wurden Schweinecholeravakzine entwickelt, auch die Gefahr vergrößert, daß in die Zellkulturen die aus abgetöteten oder lebenden Viren bestehen. unerwünschte Verunreinigungen eingeschleppt werden. Ein typisches Beispiel für eine Vakzine mit abgetöteten Aufgabe der Erfindung ist es nun, ein Verfahren Viren ist die Kristallviolettvakzine. Nachteilig an zur Abschwächung von Schweinecholeravirus in dieser Vakzine ist jedoch, daß zur Erzielung einer 65 Zellen anzugeben, bei dem die vorstehend geschilstarken Immunität große Dosen erforderlich sind derten Nachteile möglichst vermieden werden und und die Immunität sich nur langsam entwickelt und das vor allem billiger ist, einen geringeren arbeitsnur kurze Zeit anhält. Nachteilig ist ferner, daß die technischen und zeitlichen Aufwand erfordert und