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DE2708668A1 - Nd-impfstoff und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Nd-impfstoff und verfahren zu seiner herstellung

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Publication number
DE2708668A1
DE2708668A1 DE19772708668 DE2708668A DE2708668A1 DE 2708668 A1 DE2708668 A1 DE 2708668A1 DE 19772708668 DE19772708668 DE 19772708668 DE 2708668 A DE2708668 A DE 2708668A DE 2708668 A1 DE2708668 A1 DE 2708668A1
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DE
Germany
Prior art keywords
virus
strain
cold
vaccine
mutant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19772708668
Other languages
English (en)
Inventor
Jacqueline Gits
Nathan Zygraich
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RIT RECH IND THERAPEUT
Original Assignee
RIT RECH IND THERAPEUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RIT RECH IND THERAPEUT filed Critical RIT RECH IND THERAPEUT
Publication of DE2708668A1 publication Critical patent/DE2708668A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Description

u.Z.: M 090 Case: 77-2187
RECHERCHE ET INDUSTRIE THERAPEUTIQUES,R.I.T. Genval, Belgien
■ ND-Impfstoff und Verfahren zu seiner Herstellung "
Die bekannten ND-Lebendimpfstoffe enthalten entweder lentogene oder mesogene NDV-Stämme, und sie werden auf verschiedenen Wegen appliziert. Beispiele sind die Stämme La Sota und Hitchner B1. Die ND-Impfstoffe werden beispielsweise entweder im Trinkwasser suspendiert oder in Form von Augentropfen oder Nasentropfen oder als Aerosol verabreicht.
Bei Massenimpfungen gegen die ND werden bevorzugt vermehrungsfähige lentogene Viren, beispielsweise die Stämme La Sota oder Hitchner B1, in Form eines Aerosols verabreicht. Diese Applikationsart ist Jedoch mit einer beachtlichen Mortalität bei Junghühnern, insbesondere sehr Jungen Küken, be- lastet; vgl. R.E. Gough und W.H. Allan, Vet. Rec, Bd. 95 (1974), S. 263 bis 265-
709836/0830
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen ND-Impfstoff zu schaffen, der sich als Aerosolpräparat auch an 1 bis 8 lage alte Kücken gefahrlos verabfolgen läßt und eine starke immunogene Wirkung aufweist. Diese Aufgabe wird durch die
Erfindung gelöst.
Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
Der Ausdruck "kalter" Stamm bedeutet einen Stamm, der sich signifikant besser als die Elternstämme und bei Temperaturen unterhalb der normalen Vermehrungstemperatur des Elternstammes vermehrt. Der Ausdruck "temperaturempfindlicher Stamm" (TS-Stamm) bedeutet einen modifizierten Virusstamm, dessen Wachstumskapazität bzw. Vermehrungskapazität bei hohen Temperaturen signifikant gehemmt ist, insbesondere bei einer Temperatur, die in der Nähe der inneren Körpertemperatur des Wirtes liegt, während die Vermehrung des Wildstammes bei der gleichen Temperatur nicht beeinträchtigt ist. Der temperatur empfindliche Stamm (TS-Stamm) vermehrt sich deshalb an kalten Stellen des Körpers, während seine Vermehrung in den warmen, tiefergelegenen Organen des Wirts gehemmt ist.
Kalte Stämme verschiedener Viren, beispielsweise Influenza-Virus, Poliovirus und Kasernvirus, sind bekannt; vgl. Nature, Bd 213 (1957), S. 612 bis 614; Perspectives in Virology II, 1961, S. 90; Ann. Paediat, Bd. 202 (1964), S. 241 bis 252. In der Zeitschrift Acta Microbiol. Polonica, Bd. 17 (1968),
L- J
709836/0830
-δι S. 313 bis 318, ist ein NDV-Stamm beschrieben, der aus dem mesogenen Roakin-Stamm durch 30 Passagen in HUhnerembryonen bei 29 bis 30°C erhalten worden ist. Dieser Stamm weist Jedoch keine modifizierten Wachstumseigenschaften bei dieser Temperatür auf, so daß er nicht als kalter Stamm bezeichnet werden kann.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird ein virulenter NDV-Stamm, vorzugsweise ein noch virulenter NDV-Impfstoffstamm,eingesetzt, beispielsweise der NDV-Stamm La Sota. Der eingesetzte NDV-Stamm wird einer mutagenen Behandlung mit UV-Licht oder mit einer gepufferten Lösung von salpetriger Säure unter solchen Bedingungen unterworfen, daß der anfängliche Virusgehalt um einen Faktor von 10^ bis 10 vermindert wird. Aus dem Rest an infektiösem Virusmaterial wird eine kalte Mutante isoliert, die bei 26°C eine signifikant größere Vermehrungsrate als die des Originalvirusstammes bei dieser Temperatur aufweist. Die kalte Mutante ist vorzugsweise auch eine temperaturempfindliche Mutante, deren Wachstum bei 41 +, 1°C signifikant gehemmt ist.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird die mutagene Behandlung beispielsweise so durchgeführt, daß man entweder eine ND-Virussuspension von 10'*^ infekt. Einheiten pro ml mit einer UV-Lampe in einem solchen Abstand und während eines solchen Zeitraums bestrahlt, daß die restliche infektiöse Virusmenge etwa 10 * infekt. Einheiten beträgt, oder man behandelt den Originalvirusstamm 2 bis 5 Minuten mit einer gepufferten Lö-
709836/0830
Γ - 7 - π
sung von salpetriger Säure, vorzugsweise einer 4 molaren Lösung bei einem pH-Wert von 4 bis 4,6. Vorzugsweise wird der Originalvirusstamm 3 Minuten mit einer 4molaren wäßrigen Natriumnitritlösung in einem 1 molaren Essigsäure-Natriumace tat-Puffer bei einem pH-Wert von 4,2 behandelt.
Die Virusmutanten werden nach üblichen Methoden isoliert, beispielsweise durch mehrmaliges Uberimpfen auf Bruteier bei 26°C und anschließendes Klonen bei 26°C durch Verdünnen der virushaltigen AllantoisflUssigkeit des Bruteis in solchem Ausmaß, daß bei der darauffolgenden Passage ein Ei von 10 Eiern eine positive Reaktion ergibt.
Als Ausgangsstamm wird beispielsweise der La Sota Stamm verwendet, der beim WHO-Collaborating Centre for Collection and Evaluation of Data on Comparative Virology beim Institut für Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenmedizin der Ludwig-Maximilians Universität MUnchen unter der Nr. P/76/3 hinterlegt worden ist. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen kalten Mutantenstämme des New castle Disease-Virus wurden ebenfalls bei diesem Institut unter der Hinterlegungsnummer P/76/4 und P/76/5 hinterlegt.
Zur technischen Herstellung des Impfstoffs der Erfindung wird die kalte oder kalte und temperaturempfindliche Mutante in speziell pathogenfreien Bruteiern bei Temperaturen von 34 bis 37°C vermehrt. Nach beispielsweise 3tägiger Inkubation wird das Virusmaterial geerntet. Das geerntete Virusmaterial wird vorzugsweise mit einer einen Stabilisator enthaltenden
709836/0830
-οι LOsung versetzt. Beispiele für verwendbare Stabilisatoren sind Pepton, Arginin und Sucrose oder vorzugsweise deren Gemisch. Hierauf kann der erhaltene Impfstoff in Glasampullen abgefüllt und gefriergetrocknet werden. Der Impfstoff wird in gefriergetrockneter Form dicht verschlossen aufbewahrt und vor der Verabfolgung wieder mit Wasser verdünnt.
Der ND-Impfstoff der Erfindung kann in Form eines Aerosolpräparats verabreicht werden. Derartige Aerosolpräparate enthalten ein Verdünnungsmittel sowie den abgeschwächten kalten Stamm, beispielsweise den NDV-Stamm P/76/4, oder vorzugsweise einen kalten und temperaturempfindlichen Stamm, beispielsweise den NDV-Stamm P/76/5,in einer wirksamen Dosis, die mindestens
10'»" EID5O an VirUs/28'32 dm3 Luft ergibt. 15
Der ND-Impfstoff der Erfindung kann mit anderen Lebendimpfstoffen gegen Krankheiten der Atmungsorgane von Geflügel, beispielsweise mit Vakzine gegen infektiöse Bronchitis vermischt werden, die in Form eines Aerosolpräparats gegeben werden können.
Zur Impfung wird der gefriergetrocknete Impfstoff rehydrati-
z.B.
siert und/Hühnern nach üblichen Methoden in Form eines Aerosols
gegeben.
25
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
709836/0890
r - 9 - π
Beispiel 1
1 ml einer Allantoisflüssigkeit eines Hühnereis mit 109'5 Viren des Stammes P/76/3 wird 10 Hinuten mit einer Hineralight A 52 UV-Lampe in einem Abstand von 15 cm bestrahlt. Hierbei vermindert sich die Viruspopulation um einen Faktor von 10 .
Die bestrahlte Virensuspension wird in die Allantoisflüssigkeit von 9 bis 11 Tage vorbebrüteten Hühnereiern Uberimpft und letztere werden 6 Tage bei 26°C inkubiert. Sodann wird die Allantoisflüssigkeit der infizierten Bruteier geerntet und zunächst werden drei weitere Passagen unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. Hieran schließen sich drei weitere Passagen bei 260C unter Verwendung von Allantoisflüssigkeit an,
die auf 10"' bis 10 verdünnt wurde.
Das aus der 7· Passage geerntete Virusmaterial wird bei 26°C geklont, indem man die virushaltige Allantoisflüssigkeit soweit verdünnt, daß bei der anschließenden Eipassage ein Ei von 10 Eiern eine positive Reaktion ergibt, die Allantoisflüssigkeit des positiven Eies erntet und diese Endpunkt-Vermehrung zweimal wiederholt.
Zwei der nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellten NDV-Stämme werden mit RIT 4029 bzw. P/76/5 be zeichnet.
709836/0830
Beispiel 2 1 ml der AllantoisflUssigkeit von Hühnereiern mit 1O9'5 Viren des Stammes P/76/3 wird mit 0,5 ml einer wäßrigen A molaren Natriumnitritlösung in 0,5 ml eines 1 molaren Essigsäure- Natriumacetat-Puffers versetzt. Der End-pH-Wert beträgt 4,2. Das Gemisch wird 3 Minuten bei Raumtemperatur (etwa 200C) stehengelassen. Sodann wird die Behandlung durch tropfenweise Zugabe von 1 η Natronlauge unter Rühren bis zu einem pH-Wert von 7,5 abgebrochen. Durch diese Behandlung wird die Viruspopulation um einen Faktor von 10 vermindert.
Die erhaltene Virussuspension wird gemäß Beispiel 1 7 Passagen unterworfen und geklont. Aus den erhaltenen Klonen wird ein Klon ausgewählt. Dieser Stamm erhält die Bezeichnung P/76/4.
Beispiel 3
Eigenschaften der Stämme RIT 4029. P/76/4 und P/76/5. (a) Kaitecharakterlstika
Die Virusproduktion der Stämme P/76/3, RIT 4029, P/76/4 und P/76/5 wird in Bruteiern bei 26°C und bei Normaltemperatur bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt·
709836/0830
Tabelle I
Infektionstlter In Eiern v ' nach 6 Tagen bei ?6°C nach 4 Tagen bei 57°C
P/76/3 2,3 e»7
RIT 4029 ***° 8'2
P/76/4 6,5 8»3
P/76/5 ^tO 8»°
Anm.: (♦) Ausgedruckt als 1Og10EID50 (50 % Ei-infektiöse Dosis) pro 0,2 ml.
Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß die Stämme RIT 4029, P/76/4 und P/76/5 kalte Stämme sind.
0>) "TSw-Charakter des P/76/5-Stammes Zur Untersuchung des temperaturempfindlichen Charakters des mutierten Stammes wird dieser in HUhner-Embryofibroblastenzellen bei 35°sowie 410C vermehrt. Das nach 3 Tagen bei diesen Temperaturen geerntete Virusmaterial wird bei 35°C in HUhner-Embryofibroblasten-Zellkulturen titriert. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt ·
Tabelle II
Stamm
P/76/3 3,2 3,2 0
P/76/5 2,29 0,5 V79
Anm: (*) in log 10 KID50 (50 % Kulturinfektiöse Dosis) pro 1 ml.
709836/0830
Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß der P/76/5-Stamm thermoempfindlich und in seiner Vermehrung bei 410C signifikant gehemmt ist.
Beispiel 4 Die in Beispiel 1 erhaltenen NDV-Stämme RIT 4029 und P/76/5 und der in Beispiel 2 erhaltenen P/76/4-Stamm werden in spezifisch pathogenfreien Bruteiern 3 Tage bei 34 bis 37°C gezüchtet. Sodann wird aus der gewonnenen Allantoisflüssigkeit nach Klärzentrifugation der Überstand geerntet und mit einer 10 Gewichtsprozent/Volumen Pep ton, 3 Gewichtsprozent/ Volumen Arginin und 5 Gewichtsprozent/Volumen Sucrose enthal tenden Stabilisatorlösung versetzt. Das Gemisch wird in 5 ml fassende Glasampullen in einer Menge von 10* EIDcQ/ml abge füllt und gefriergetrocknet. Sodann werden die Ampullen dicht verschlossen. Der Inhalt der Ampullen kann zur Herstellung von Aerosolpräparaten verwendet werden.
Beispiel 5
Klinische Versuche an den NDV-Stämmen RIT 402Q. P/76/4 und P/76/5
Zur Untersuchung der Unschädlichkeit der NDV-Stämme RIT 4029» P/76/4 und P/76/5 werden Proben der gemäß Beispiel 4 hergestellten Impfstoffe verschiedenen Gruppen von 40 spezifisch pathogenfreien 1 Tage alten und 40 spezifisch pathogenfreien 6 Tage alten Küken mit einem Turbair-Aerosol-Generator verabfolgt. Die Endkonzentration beträgt 107'5 EID50^e, 32 dm5 Luft la Impfraum.
U -J
709836/0830
Eine Gruppe von 40 spezifisch pathogenfreien 1 Tage alten Küken sowie eine Gruppe von 40 spezifisch pathogenfreien 8 Tage alten Küken wird unter den gleichen Bedingungen zum Vergleich mit dem P/76/3-Stamm geimpft. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.
Tabelle III
1 Ta« Al alt ter bei der 8 Pathogeni-
tätsindex 		Impfung
Pathogen!-
tätsindex
ix) 		befallene
Tiere,
% 		0,11
0,00
0,00
0,00 		Tafte alt
Impf- 0,39
0,27
0,11
0,06 		75,7
57,5
13,3
17,5 		befallene
Tiere,
54
etamm 27,5
0,0
0,0
0,0
P/76/3
RIT 4029
P/76/4
P/76/5
.s (χ) Pathogen!tätsindex (PI ), berechnet für einen Be-.. obachtungszeitraum von 10 Tagen nach der Impfung.
PI · S»iwffie der Punkte Zahl der Beobachtungen Für die Morbid!tat wurden 1 Punkt,für die Mortalität 2 Punkte gerechnet.
Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß die Stämme RIT 4029, P/76/4 und P/76/5 deutlich weniger virulent für junge Küken bei Verabfolgung als Aerosol sind, als der Elternstamm P/76/3.
Zur Untersuchung der Immunantwort von jungen Küken, die mit den ND-Impfstoffen der Erfindung stimuliert worden sind, werden verschiedene Gruppen von 40 spezifisch pathogenfreien 1 Tage alten Küken und 40 spezifisch pathogenfreien 8 Tage alten Küken mittels eines Aerosols geimpft, das mit einem
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Turbair-Aerosol-Generator erzeugt wurde. Die Dosis beträgt 1O7'5 EID^/28,32 dm3 Luft. Eine Gruppe wird mit dem P/76/3 Impf stoff stamm zur Kontrolle geimpft. Den Tieren wird 14 Tage bzw. 21 Tage nach der Impfung (p.i.) Blut entnommen. Aus den in Tabelle IV zusammengefaßten Ergebnissen geht hervor, daß die NDV-Stämme P/76/4 und P/76/5 nur geringfügig weniger
Tabelle IV der Blutentnahme ImDfunff alt
Alter bei der 21 Tage
T). i. 		8 Tafte utentnähme
Impfstamm 1 Ta* alt 6,7
NT
6,8 		Ta« der Bl 21 Tage
T). i.
Tag, 14 Tage
D.i. 		7,2
6,1
6,4
P/76/3
P/76/4
P/76/5 		14 Tage
p.i. 		8
6,0
7,4
6,7(x)
NT
6,8
Anm.i (x) Geometrisches Mittel des Titers in der Hämaggluti-
nationshemmung (HI) ausgedrückt als log2-NT nicht bestimmt.
Zur Bestimmung der Immunogenität einer erfindungsgemäß herge stellten kalten und temperaturempfindlichen Virusmutante in Gegenwart von maternalen Antikörpern wird eine Gruppe von
passiv
zwanzig 8 Tage alten Küken aus einer gegen ND/immunen konventionellen Herde mittels eines durch einen Turbair-Aerosol» Generator erzeugten Aerosols mit dem P/76/5-Stamm in einer Dosis von 10"^ EID5o Pro 28»32 dnr Luft geimpft. Andere Gruppen von 8 Tage alten Küken werden unter den gleichen Bedingungen mit dem P/76/3-Stamm und dem Ulster 2c-Stamm (die-
709836/0830
eer Stamm ist beispielsweise in Vet. Rec, Bd. 95 (1974), S. 263 bis 265 beschrieben) geimpft. Eine Gruppe dient als Kontrollgruppe. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt.
Tabelle V
Immuno^eMtat bei passiv immun 1 Kontrolle Tag alt Alter bei der Blutentnahme 4,8 14 Tage 27 Tage alt • 6,4
(nicht ge D.i. * 19 Tage 5,4
impft) 8 Tage alt 22 Tage alt 2,5 T). i. 1,6
Impfstamm P/76/3 6,7(x) S 4,8 <2
P/76/5 4,8
Ulster 2c 4,8 6,1
6,7(x) 5,8
6.7(x) 1,5
6,7(x)
Anm.: (x) * geometrisches Mittel des HI-Titers, ausgedrückt
als log2·
Aus Tabelle V ist ersichtlich, daß der kalte und temperaturempfindliche Stamm P/76/5 eine nur wenig geringere Immunogenität aufweist als der Elternstamm P/76/3, während der abgeschwächte Ulster 2c-Stamm bei passiv immunisierter Küken nicht immunogen 1st.
Um den Grad des Schutzes durch den kalten und temperaturempfindlichen Stamm der Erfindung in Gegenwart verschiedener Spiegel von restlichen maternalen Antikörpern zu prüfen ; werden Gruppen von sechzig 8 Tage alten Küken und sechzig 21 Tage alten konventionellen Hühnern mittels des Turbalr-Aerosol-Generators mit einem Aerosolpräparat mit 107'5
709836/0630
des Ρ/76/5-Stammes pro 28,32 dm3 Luft geimpft und 21 Tage später intranasal mit unterschiedlichen Dosen des virulenten ND-Stammes Hertz 33/56 belastet.
Andere Gruppen von 60 Tieren werden in gleicher Weise mit dem P/76/3- und Ulster 2c-Stamm geimpft und ebenfalls 21 Tage nach der Impfung mit den gleichen Dosen des Stammes Hertz 33/56 belastet. 2 Gruppen von jeweils 25 Tieren werden zur
Kontrolle verwendet.
IO
Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefaßt. Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß der P/76/5-Stamra ein Schutzvermögen aufweist, das vergleichbar ist mit dem des Elternstammes
P/76/3.
15
Tabelle VI
Lethale Dosis des Stammes Hertz 33/56 bei mit dem Stamm P/76/5 als Aerosol geimpften HUhnern
Impf stamm Alter bei der Impfung (HI-Titer vor der Imp fung in log2) 8 Tage alt (U. 8) 21 Tage alt (1.7)
x) <6,5
Kontrolle <5,5(
(nicht ge
impft)
P/76/3 ^8,5
P/76/5 >8,5
Ulster 2c 7,15
>9,5 >9,5 Ulster 2c 715 >9,5
Anm.: (x) = ausgedrückt als log
1Q
709836/083Π

Claims (1)

  1. RECHERCME ET INDUSTRIE THERAPEUTIQUES,R.I.T. Genval, Belgien
    10
    " MD-Impfstoff und Verfahren zu seiner Herstellung B
    Priorität: 1. 3. 1976, V.St.A., Nr. 662 770
    Patentansprüche
    15
    1. ND-Impfstoff, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem abgeschwächten "kalten" Stamm des ND-Virus, hergestellt durch mutagene Behandlung einer virulenten ND-Virussuspension mit UV-Licht oder salpetriger Säure, die eine Reduzierung des anfänglichen Virusgehalts um einen Faktor von 10 bis 10 mit sich bringt, Isolierung einer"kalten" Virusmutante aus dem Rest an infektiösem Virus mit einer bei 260C signifikant größeren Vermehrungsrate als sie der Originalvirusstamm bei dieser Temperatur aufweist, Züchtung der isolierten kalten Virusmutante im Brutei und Ernte des entstandenen Virusmaterials, sowie gegebenenfalls einem Stabilisator.
    709836/Ö830 ORIGINAL INSPECTED
    2, ND-Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der abgeschwächte kalte Sti P/76/3 hergestellt worden ist.
    daß der abgeschwächte kalte Stamm aus dem NDV-Stamm
    3. ND-Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der abgeschwächte kalte Stamm der NDV-Stamm P/76/5 ist.
    4. ND-Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
    Jj ι.
    daß der abgeschwächte kalte Stamm der NDV-Stamm P/76/4 ist. 10
    5. ND-Impfstoff nach Anspruch 1 bis 4 in Form eines Aerosolpräparats .
    6. Verfahren zur Herstellung des ND-Impfstoffs nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine virulente ND-Virus suspension mit UV-Licht oder salpetriger Säure bis zu einer Verminderung des anfänglichen Virusgehalts um einen Faktor von 1(r bis 10 einer mutagenen Behandlung unterwirft, aus dem Rest an infektiösem Virus eine kalte Virusmutante mit einer bei 26°C signifikant größeren Vermehrungsrate als der des Originalvirusstammes bei dieser Temperatur isoliert, die isolierte'kalte" Virusmutante im Brutei züchtet und das entstandene Virusmaterial erntet und gegebenenfalls mit einem Stabilisator versetzt.
    7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als NDV-Stamm einen noch virulenten Impfstoffstamm einsetzt.
    709836/0830
    θ. Verfahren nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß nan die erhaltene"kalte" Virusmutante mit einem Stabilisator versetzt und gefriertrocknet.
    9· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man den Impfstoff zu einem Aerosolpräparat konfektioniert.
    709838/0830
DE19772708668 1976-03-01 1977-02-28 Nd-impfstoff und verfahren zu seiner herstellung Withdrawn DE2708668A1 (de)

Applications Claiming Priority (1)

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