DE2631047A1

DE2631047A1 - Einzellige mikroorganismen und verfahren zu ihrer zuechtung

Info

Publication number: DE2631047A1
Application number: DE19762631047
Authority: DE
Inventors: Ludwig Degen; Lamberto Formiconi; Antonio Senni; Pasquale Zaffaroni
Original assignee: SnamProgetti SpA
Current assignee: Anic SpA
Priority date: 1975-07-10
Filing date: 1976-07-09
Publication date: 1977-01-20
Also published as: SE7607909L; FR2317355B1; FR2317355A1; CH629372A5; AU1556476A; ATA508976A; DE2631047B2; NL7607713A; DK141760C; DE2631047C3; AU507816B2; DK141760B; JPS5212991A; GB1522756A; AT354966B; IT1039758B; ZA763893B; LU75347A1; BE843992A; NL175433B

Description

Snamprogetti S.p.A.
Corso Venezia 16, Mailand/Italien

betreffend
Einzellige Mikroorganismen und Verfahren zu ihrer Züchtung

Die Erfindung betrifft Mikroorganismen und ein Verfahren zur Herstellung von biologischen Proteinen durch die Wirkung von Mikroorganismen, die aliphatische Alkohole mit niederem Molekulargewicht oxidieren.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren angewandten Mikroorganismen gehören zur Gruppe Prototheca.

Die Erfindung betrifft auch Proteinprodukte, die abgeleitet sind von Mikroorganismen, die als Nahrungszusatz für Menschen und Tiere angewandt werden können.

In der Literatur sind zahlreiche (Fermentations)-Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen angegeben, die proteinische Substanzen liefern. Es sind z.B. Verfahren zur Züchtung von Hefen auf Kohlenhydraten angegeben .wie sie in Melasse enthalten sind, Sulfitbädern von Papiermühlen und n-Alkanfraktionen von leichtem Benzin. Ähnliche Verfahren sind auch zur Erzeugung von Biomassen mit Hilfe von Bakterien beschrieben.

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Während des Fortschreitens des auf die Bildung von Hefen und Bakterien gerichteten Wachstums (Fermentation) tritt ein beachtlicher Wärmestau (heat-build up) auf, aufgrund der Oxidation des Substrates, der umso stärker ist, je niedriger der Oxidationsgrad des Substrates selbst ist.

Die Anwendung teilweise oxidierter Substrate verringert den Sauerstoffverbrauch und die Wärmeentwicklung. Ferner werden die Kühlkosten wesentlich verringert durch die Anwendung von Mikroorganismen, die bei hohen Temperaturen wachsen.

Bei vielen Verfahren zur Bildung von Biomassen kann eine Extraktion mit organischen Lösungsmitteln erforderlich werden, um unerwünschte Substratrückstände oder schädliche Verbindungen,wie hochmolekulare Kohlenwasserstoffe oder polycyclische Kohlenwasserstoffe und ähnliches, zu entfernen..

Alkohole stellen Substrate dar, die sehr gut geeignet sind zur Bildung von Bioproteinen. Sie sind wasserlöslich, bereits teilweise oxidiert und v/erden in großtechnischem Maßstab in hoher Reinheit hergestellt. Von den aliphatischen Alkoholen werden in erster Linie Methanol und Äthanol angewandt.

Wirtschaftliche Überlegungen machen es erforderlich, daß die Substrate für die Bildung von Bioproteinen billig sind.

Im Vergleich mit Abfallprodukten sind die Kosten für Äthanol verhältnismäßig hoch. Es ist daher erforderlich, daß das Substrat vollständig ausgenutzt wird.

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Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Stämme von heterotrophen Algen von der Art Prototheca zu züchten, die Äthanol als Substrat verwerten. Bei der Verwendung von Äthanol als Substrat werden zahlreiche Nachteile anderer Substrate vermieden. Natürlich ist Äthanol leicht zugänglich und kann als Nährstoff angewandt werden. Es treten keine Toxizitätsprobleme auf, da es in hoher Reinheit hergestellt wird,und außerdem ist Äthanol flüchtig und möglicherweise noch vorhandene Reste können leicht während des Trocknens der Zellen entfernt werden. Ferner tritt kein Problem bezüglich der Verteilung des Substrats in dem Nährmedium auf, wie bei Polysacchariden und Kohlenwasserstoffen.

Die erfindungsgemäß angewandten Stämme besitzen darüberhinaus den Vorteil, daß sie bei Temperaturen bis zu 40°C,vorzugsweise bei 33 bis 37⁰C bei einem weiten pH-Bereich (pH 1,0 bis 8,0), vorzugsweise pH 3»0 bis 5»0 wachsen, eine Tatsache, die die Gefahr einer bakteriellen Infektion während des Wachstums verringert. Viele Mikroorganismen wachsen nicht in alkoholhaltigen Substraten, andere wachsen nur dann, wenn die Konzentrationen niedrig sind. Die erfindungsgemäß angewandten Stämme wachsen im. Gegensatz dazu auch bei hohen Konzentrationen gut und nur Konzentrationen über 4 % hemmen das Wachstum.

Die erfindungsgemäßen Prototheca-Stämme wurden isoliert und ausgewählt aus Erdproben, die entnommen worden sind bei Harcourt, Nigeria, und werden bezeichnet durch die Nummern 855 A, 855 B und 855 C. Die Kultur- und physiologischen Charakteristika sind in Tabelle I zusammengefaßt.

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Tabelle I Züchtungs-und physiologische Charakteristika

A. Züchtungscharakteristika

festes Medium (24 h): (Pepton-Glukose)

flüssiges Medium (24 h): (Pep ton-GLuko se)

Durchmesser der Kolonien: 2 Ms 3 mm, brüchig, grob, opak, ohne Pigmente

Sediment, dünner Film

B. Charakteristika des Vegetationszyklus Bildung von 2 bis 8 Aplanosporen (Endosporen) Nach dem Aufbrechen der Mutterzelle wiederholen die Aplanosporen den Zyklus und einige bilden Hypnosporen ("ruhende Zellen")

C. Charakteristika der vegetativen Zellen

Spheroid oder ellipsoid mit einer Größe von 15 bis 25 x bis 30 /um. Bildung von Aggregaten. Kern und Vorratsvakuolen (storage granules) gut sichtbar.

D. Geschlecht

Es wurde kein Sexualzyklus beobachtet.

E. Physiologische Eigenschaft

1) Ausnutzung verschiedener Kohlenstoffquellen a. fermentative Verwertung (zum Wachstum)

Glukose sauer, ohne Gas, langsam

Galaktose negativ

Sucrose negativ

Maltose negativ

Lactose negativ

Raffinose negativ

Melibiose negativ

Inulin negativ

Stärke negativ

0( -Methyl-D-glukosid negativ

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b. assimilative Verwertung D-Glukose D-Galaktose Sucrose Fructose Maltose Lactose Raffinose Melibiose Inulin lösliche Stärke # -Methyl-D-glukosid L-Sorbose Salicin Arbutin Cellobiose Trealose Melizitose D-Xylose D-Arabinose L-Arabinose D-Ribose L-Rhamnose Methanol Äthanol n-Propanol Iso-propanol n-Butanol tert.-Butanol Cyclohexanol Glycerin Erythrit Ribit Dulcit D-Mannit Sorbit

von Kohlenstoffquellen positiv negativ negativ positiv negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ positiv positiv negativ positiv negativ negativ positiv negativ negativ negativ negativ negativ

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Inosit . negativ

DL-Milchsäure negativ

Bernsteinsäure negativ

Citronensäure negativ

η-Paraffin positiv

2) Verwertung verschiedener Stickstoffquellen Ammonium, Nitrat und Harnstoff

3) Wachstumsfaktoren

erfordert Thiamin

4) Wachstum bei unterschiedlichen Temperaturen 4°C negativ 15 Ms 42°C positiv 54⁰C negativ

Arnold und Ahearn (Mycologia, Band 64, Seite 265, 1972) haben vor einiger Zeit einen Schlüssel zur Klassifizierung von Prototheca vorgeschlagen, nach dem die erfindungsgemäßen Stämme zur Gruppe der P. Zopfii-Arten gehören.

Die mit den Symbolen 855 A, B und C bezeichneten Stämme unterscheiden sich jedoch gegenüber der Standardbeschreibung von P. Zopfii und gegenüber den in den Sammlungen vorhandenen Stämmen (wie von Prof. Liferri, Pavia erhalten, siehe Tabellen).

Tabelle II

855 A P. Zopfii P. Zopfii

(Literatur)

D-Galaktose negativ positiv positiv Jso-Pentanol negativ negativ positiv Wachstum bei 42⁰C positiv negativ —

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Der Stamm 855 A (wilder Typ) kann so als stabile und definierte Variante der Spezies P. Zopfii angesehen werden. Es wird der Name Prototheca Zopfii, Var. Harcourt,"vorgeschlagen, bei der in Tabelle I angegebenen Standardbeschreibung. Der Stamm wurde beim Centraalbureau voor Schimmelcultures Baarn hinterlegt und erhielt die Nummer CB5 26S.75.

Die Zellen von Prototheca Zopfii, Var. Harcourt 855A, wie sie erfindungsgemäß zur Bildung von Bioproteinen angewandt werden, werden in Kulturmedien gezüchtet, die bis zu 4 % Äthanol als Kohlenstoffquelle, Stickstoffquellen, Mineralsalze und Wachstumsfaktoren enthalten. Thiamin kann als solches oder in Form von Maiswasser oder Melasse oder Hefeextrakt zugesetzt werden. Das Äthanol als Kohlenstoffquelle kann auf einmal vor der Fermentation oder in kleinen Anteilen während der Fermentation zugesetzt v/erden. Es ist jedoch bevorzugt, Äthanol kontinuierlich während der fortschreitenden Fermentation zuzusetzen, um eine vollständigere Verwertung zu ermöglichen.

Die Fermentation wird bei Temperaturen im Bereich von 15 bis 40°C, vorzugsweise 30 bis 38⁰C bei einem pH-Wert im Bereich von 1 bis 8, vorzugsweise von 3,0 bis 5,0 durchgeführt.

Nach dem oben beschriebenen Verfahren wird eine Ausbeute von 60 bis 70 % (g/Biomasse/g Äthanol) erhalten bei einer Zellkonzentration in der Kultur von 20 bis 60 g/l.

Ein außergewöhnlicher Vorteil dieses Verfahrens ist die Anwendung von heterotrophen Algen von der Art Prototheca. Aufgrund ihrer Größe sind sie natürlich leicht gewinnbar.

Bei ansatzweisem Arbeiten werden die Zellen gewonnen durch Sedimentation oder Filtration nach vollständiger Fermentation. Das gleiche Verfahren wird angewandt, um die Biomasse bei kontinuierlichen Verfahren zu gewinnen.

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Die auf diese Weise erhaltene und getrocknete Biomasse enthält ungefähr 50 bis 60 % rohe Proteine zusammen mit Polysacchariden, Lipiden und Nuc.leinsäuren.

Erfindungsgemäße ist es möglich, Biomassen mit hohen Proteingehalten herzustellen durch Züchtung von heterotrophen Algen der Art Prototheca in einem einfachen Kulturmedium, das Äthanol als einzige Kohlenstoffquelle enthält.

Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

(NH₄)₂S0₄	5 g/l
NaH₂PO₄.H₂O	10 g/l
KH₂PO₄ . .	10 g/l
MgSO₄.7H₂O	0,2 g/l
FeSO₄.7H₂O	2 mg/1
ZnSO₄.7H₂O	2 mg/1
CaCl₂	2 m.g/1
Hefeextrakt	500 mg/1
Lösung von Spuren-	1 ml

Die Lösung der Spurenelemente bestand aus: CuSO₄.5H₂O 5 mg/1

H₃BO₃ 500 mg/1

MnSO₄.H₂O 500 mg/1

KJ 10 mg/1

CaCl₂.6H₂O 10 mg/1

MoO₃ 10 mg/1

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Nach Einstellung des pH-Wertes auf 5,0 wurde das Medium in Mengen von jeweils 100-ml in 500-ml-Kolben gegeben und nach 30 Minuten langem Sterilisieren bei 116⁰C wurde 1 % Äthanol (Vol./Vol.) zugegeben. Die Kolben wurden dann mit einer 3 Tage alten Kultur (30⁰C) des Stammes 855A von einer Schräge beimpft, enthaltend das gleiche Medium und 2 % Agar-Agar, und anschließend unter Rühren (Orbital-Rührer) bei 220 UpM bei 30⁰C inkubiert. Nach 24 Stunden langer Inkubation wurden weitere 2 % Äthanol zugegeben.

Die Ausbeute an trockenen Zellen nach 33 Stunden langer Inkubation betrug 18,7 g/l.

Beispiel 2

Es wurde eine Fermentation bei 40°C durchgeführt, wobei die anderen Bedingungen des Beispiels 1 nicht verändert wurden. Die Ausbeute an trockenen Zellen nach 48 Stunden langer Inkubation betrug 13,5 g/l.

Beispiel 5

Es wurde ein Kulturmedium wie in Beispiel 1 hergestellt, das jedoch anstelle von Hefeextrakt 1,5 g/l Maiswasser (C.S.L.) enthielt. Die...Ausbeute,als Trockengewicht, nach 34 Stunden langer Fermentation unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen bei 35°C betrug 17,5 g/l. ■

Beispiel 4

In kleine Laborfermenter, die mit einem Turbinenrührer und 4 (antisloshing) Prallplatten versehen waren und ein Volumen von 16 1 besaßen, wurden 10 1 des Mediums entsprechend Beispiel 1 gegeben,mit dem einzigen Unterschied, daß die Konzentration an Phosphatsalzen 2 g/l anstelle von 10 g/l betrug. Nach 30 Minuten langem Sterili-

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sieren bei 116⁰C wurden die Fermenter mit 10 % einer 21 Stunden alten Kultur von dem Stamm 855A in einem Kolben mit dem gleichen Medium wie in Beispiel 1 von 35°C beimpft. Die Züchtung wurde bei 35⁰C unter Rühren mit 1000 UpM und einer Belüftung von 0,5 Vol./Vol. χ min. durchgeführt. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von Soda während der ganzen Fermentationszeit auf 4,0 gehalten. Äthanol wurde zu Beginn (1 VoI.-^) und nach 24 Stunden (2 Vo 1*-%) zugegeben.

Nach 43 Stunden langer Fermentation wurden die Zellen auf Papier abfiltriert und nach dem Waschen mit Wasser bei 90⁰C im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an trockenen Zellen betrug 50,5 g/l, enthaltend 52,56 % rohe Proteine (N χ 6,25) und 4,73 % Lipide.

Beispiel 5

Ein Laborfermenter mit einem Volumen von 20 1, enthaltend 12 1 des in Beispiel 4 angewandten KuIturmediums_f, wurde, wie in diesem Beispiel angegeben,beimpft und 24 Stunden unter Rühren (800 UpM) bei 35°C inkubiert unter Einleiten von 0,5 Vol./Vol. χ min. Luft.

Zwei Laborfermenter der in Beispiel 4 beschriebenen Art, enthaltend jeweils 10 1 des gleichen Kulturmediums und 1 % Äthanol,wurden mit jeweils 1,5 1 dieser Vorkultur beimpft. Die Fermenter wurden mit 1000 UpM gerührt und mit 0,5 Vol./Vol. χ min. belüftet. Die Fermentationstemperatur eines Fermenters betrug 30⁰C, die des anderen 35°C. Um den pH-Wert auf dem gewünschten Wert (ungefähr 4) Zu_- halten, wurde ein Gemisch angewandt, bestehend aus 32 W wäßrigem Ammoniak und 95 %'Mnanol im Verhältnis 20 : 80. Durch Zugabe dieses Gemisches wurde nicht nur der pH-Wert auf einem optimalen Wert für das Wachstum gehalten, sondern auch die Kohlenstoffquelle automatisch zugegeben.

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Nach 20 Stunden langer Inkubation betrug die Konzentration an Biomasse 20,6 g/l (30⁰C) bzw. 21,3 g/l (35⁰C).

Die Rührgeschwindigkeit wurde dann auf 1500 UpM erhöht und mit 0,75 Vol./Vol. χ min. belüftet. Nach weiteren 25 Stunden betrugen die Konzentrationen an Biomasse 53,2 g/l (30°C) bzw. 58,1 g/l (35°C).

Mt 2 1 der 35°C-Kultur wurde ein dritter Fermenter der gleichen Art, enthaltend 10 1 des gleichen Kulturmediums beimpft und ebenfalls bei 35⁰C unter Rühren mit 1500 UpM und einer Luftzufuhr von 0,75 Vol./Vol. χ min. inkubiert. Nach 8 Stunden langer Inkubation erhöhte sich die Konzentration an Biomasse von 10,3 g/l auf 33,1 g/l.

Beispiel 6

In einem 16-1-Fermenter, der mit einem Turbinenröhrer und 4 (antisloshing) Prallplatten versehen war und 7 1 Medium enthielt, wurde eine Kultur des Stammes 855A entsprechend Beispiel 4 hergestellt.

Für die kontinuierliche Fermentation wurde ein Nährmedium (Einspeislösung) hergestellt der folgenden Zusammensetzung:

Na₂HPO₄.H_£0	2,0 g/l
KH₂PO₄	2,0 g/l
(NH₄)₂S0₄	5,0 g/l
MgSO₄.7H₂O FeSO₄.7H₂O	0,2 g/l 22 mg/1
ZnSO₄.7H₂O	20 mg/1
CaCl₂	20 mg/1
Lösung von Spuren elementen Hefeextrakt Äthanol (S₀)	2 ml/1 0,5 g/l 37,6 g/l

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Das Medium (ohne Äthanol) wurde auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und 30 Minuten bei 116⁰C sterilisiert.

Mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit (D = /u) von 0,190 h~¹, 2000 UpM und einer Belüftung von 1,5 Vol./ Vol. χ niin. erhielt man die folgenden Ergebnisse:

S = Konzentration von Äthanol in

der Kultur 0,067 g/l

X = Konzentration von Biomasse

in der Kultur 25,12 g/l

Y = Ausbeute (g Biomasse/g Substrat) 0,66

P = Produktivität 4,8 g/lxh

Die Biomasse wurde abzentrifugiert und nach Waschen mit V/asser wurde sie im Vakuumofen getrocknet. Die Zusammensetzung der Biomasse ist in Tabelle III angegeben.

Tabelle III

Analysedaten der Biomasse von Prototheca Zopfii, Var. Harcourt 855A

Feuchtigkeit 0,60 %

Aschen 7,04 %

N (Kjeldahl) 8,45 %

rohe Proteine (Nx6,25) 52,62 %

Protein (Biuret) 45,70 %

rohe Lipide 4,82 %

Fettsäuren 3,08 %

lösliche Kohlenhydrate 11,96 %

rohe Fasern 2,50 %

RNS 15J7 %

DNS 0,42 %

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Elementaranalyse:
C = 46,10 %
H = 6,71 %
N = 8,32 %

prozentuale Zusammensetzung der Fettsäuren:

n-C_i4 1,38 %

n-C_i6 29,12 %

n-C_i6:1*) 0,90 %

n-C₁₈ 4,44 %

n-C₁₈:1 28,46 %

n-C₁₈:2 35,70 %

prozentuale Zusammensetzung der Aminosäuren (g/100 g trockner Biomasse)

Lysin 1,88

Histidin 0,779

Arginin . . 5,11

Aspartinsäure 3,03

Threonin 1,73

Serin 1,56

Glutaminsäure 4,85

Prolin. 3,13

Glycin 1,98

Alanin 2,26

Valin 2,11

Methionin 0,83

Isoleucin 1,12

Leucin 2,95

Tyrosin 1,32

Phenylalanin 1,55

Tryptophan 0,23

*) Doppelbindungen

../Patentansprüche 609883/0957

Claims

Patentansprüche

nj Einzellige Mikroorganismen der Art Prototheca, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem Kulturmedium gewachsen sind, das Äthanol als einzige Kohlenstoffquelle enthält.
2.0 Mikroorganismen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem Kulturmedium gewachsen sind, in dem Äthanol in einer Menge bis zu 4 Gew.-% ent-.halten ist.
3. Verfahren zur Züchtung der Mikroorganismen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man die Fermentation bei einer Temperatur von 15 bis 40⁰C, vorzugsweise 30 bis 38°C durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet , daß man die Fermentation bei einem pH-Wert zwischen 1 und 8, vorzugsweise zwischen 3 und 5 durchführt.

5, Verwendung der Mikroorganismen nach Anspruch 1 oder zur Herstellung von Bioproteinen.

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