DE1642625C3

DE1642625C3 - Verfahren zur Herstellung von Isoamylase durch Fernmentation

Info

Publication number: DE1642625C3
Application number: DE1642625A
Authority: DE
Inventors: Motoyoshi Hongo; Nobuya Nanri; Seinosuke Ueda
Original assignee: Hayashibara Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Co Ltd
Priority date: 1966-09-22
Filing date: 1967-09-20
Publication date: 1973-12-20
Also published as: GB1171964A; DE1642625B2; US3716455A; DE1642625A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Isoamylase durch Züchten eines Mikroorganismus in einem üblichen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen.

Die Isoamylase ist als Enzym bekannt, welches die λ 1—- 6-Bindungen der Stärke ohne Zugabe von Phosphorsäure zersetzt.

Die Herstellung dieses Enzyms unter Verwendung von Hefe wurde im einzelnen durch Maruo und Mitarbeiter (Symposia on Enz. Chem. [1949], S. 50 bis 59) berichtet. Die aus Hefe hergestellte Isoamylase hat jedoch nur eine Optimaltemperatur von 20° C. Sie ist nicht hity.eresistent, da sie bei 10 Minuten langem Erhitzen bei 50° C nahezu zerstört wird. Die Menge an gebildetem Enzym ist gering, und es ist schwierig, das Enzym aus der Hefe zu extrahieren und zu reinigen. Bender und Mitarbeiter berichten, daß das durch Aerobacter aerogenes hergestellte Enzym, welches das durch einen Pullularia-Stamm gebildete Pullularipolysaccharid zersetzt, der Isoamylase ähnliche Eigenschaften aufweist (H. Bender and K. W all en fels, Biochem. Z., Bd. 334, S. 79 bis 95 [1961]).

In dem Artikel in »Biochem. J.«, Bd. 81, 1961, S. 392 bis 398, wird eine Isoamylase aus einer nicht näher bezeichneten Hefe beschrieben. Diese Isoamylase ist thermisch instabil, denn ihre Aktivität ist bei 45° C bereits sehr stark herabgesetzt. Ihre Optimaltemperatur liegt bei nur 25° C.

Die deutsche Patentschrift 1 193 914 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Maltotriose, wobei man einheitlich linear «l->6 verknüpfte Polymere der Maltotriose der Einwirkung eines Enzyms, nämlieh der sogenannten Pullulanase aus Aerobacter aerogenes ATCC 15050 unterwirft.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von Isoamylase durch Züchten eines Mikroorganismus in einem üblichen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen gefunden, mit dem Kennzeichen, daß man die Züchtung mit dem Stamm Escherichia intermedia ATCC 21073 unter aeroben Bedingungen durchführt.

Diese Züchtung kann vorteilhaft als Schüttelkultur oder als luftgemischte Submerskultur durchgeführt werden.

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Das beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Verwendung vorgesehene Kulturmedium kann aus synthetischen Substanzen zusammengesetzt werden oder aus natürlichen Substanzen bestehen. Es sollte Kohlehydrate, andere Kohlenstoffquellen, anorganische Substanzen und andere Nährmittel in geeigneten. Mengen enthalten. Jede Kohlenstoffquelle und jede Stickstoffquelle, welche durch die erfindungsgemäß eingesetzten Organismen verwendet werden können, sind in dem vorliegenden Kulturmedium brauchbar.

Ah Kohlenstoffquellen können Substanzen, wie Maltose, Dextrin, Glucose, Lactose, Pullulan, Stärkehydrolysate, Melassen und ähnliche Substanzen verwendet werden. Die Konzentration der Kohlenstoffquelle im Kulturmedium beträgt 0,5 bis 20%. Darüber hinaus können organische Säuren und Aminosäuren zugegeben werden, und zwar in Konzentrationen von 0,1 bis 0,5%> des Kultuimediums. Als Stickstoffquellen sind Nitrate oder anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniak, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumacetat usw., stickstoffhaltige, organische Substanzen, wie Harnstoff, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, flüssige Maisauszüge, Caseinhydrolysate, Fischmehl und ihre Verdauungssubstanzen, Weizenkleie, Reiskleie, entfettete Sojabohnenabfälle oder ihre Verdauungssubstanzen, Chrysalishydrolysat und ähnliche, Aminosäuren, wie Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin und ähnliche, brauchbar. Als anorganische Substanzen sind Kaliumhydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat und ähnliche verwendbar.

Die Konzentrationen dieser Stickstoffquellen und der anorganischen Substanzen im Kulturmedium sind beispielsweise nachfolgende:

Pepton 1 ".'·

Hefeextrakt O,5°.o

K₁HPO₄ O.io/o

KCl 0,05 Vo

MgSO₄ · 7H..O 0,05° 0

FeSO₄^H₄O 0,001 ·-«

Harnstoff 0,4° 0

K₁HPO₄ 0,1 °/o

KCl 0,05» 0

MgSO₄ · 7HjO 0,05° 0

FeSO₄-7H..O 0,001 »0

Milchkaseinextrakt 1 °,Ό

K₂HPO₄ 0,1 »/0

KCl 0,05·.

MgSO₄ · 7H₂O 0,05·/.

FeSO₄-7H₂O 0,001·.«

(NHJ₂SO₄ 0,8·/.,

CaCO₃ 0,5·/.

K₁HPO₄ 0,1·/·

KCl 0,05·/.

MgSO₄ · 7HjO 0,05·/.

FeSO₄-7H₂O 0,001 ·/.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens arbeitet man so, daß die Schüttelkultur nachfolgend zu einer stationären Kultur abgeändert wird.

Der pH-Wert des Kulturmediums ist'6 bis 9, und

die Temperatur der Kultur liegt zwischen 20 und 40° C Die Zeitdauer der Kultivierung liegt gewöhnlich bei 24 bis 72 Stunden. In diesem Zeitraum wird eine erhebJiche Menge an Isoamylase in'dem Kulturmedium gebildet und angesammelt. Nach Ablauf der Kultivierung kann der ganze kultivierte Liquor als Enzymlösung und auf diese Weise das Enzym in und außerhalb der Zellen vollständig verwendet werden, oder aber es kann die Fermentationsflüssigkeit verwendet werden, nachdem die Zellen abfiltriert wurden, wie dies in den Beispielen aufgezeigt wird. Die Reinigung des Enzyms kann durch die Ammoniumsulfataussalzung des Kulturfiltrats, durch die Absorption auf Calciumphosphatgel und weiter durch Chromatographieren mit einer Diäthylaminoäthylcellulose-Säule durchgeführt werden.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Escherichia intermedia ATCC 21073 wurde als Impf-Mikroorganismus verwendet. Der vorausgehend bezeichnete Mikroorganismus, der durch Impfen in dem Kulturmedium, das 0,5 Gewichtsprozent Maltose, 1 Gewichtsprozent Pepton, 1 Gewichtsprozent Fleischextrakt und 0,5 Gewichtsprozent NaNO₃ enthielt, kultiviert wurde, wurde in das Fermentationsmedium in einer Inoculum-Größe von 5 Volumprozent des Fermentationsmediums geimpft. Es wurde das Fermentationsmedium der nachfolgenden Zusammensetzung verwendet, und die Schüttelkultivierung wurde bei 30" C durchgeführt.

Zusammensetzung des Fe.mentationsmediums: 5 Gewichtsprozent Dextrin, 1 Gewichtsprozent Pepton, 0,5 Gewichtsprozent K.,HPO₄, 0,05 Gewichtsprozent MgSO₄-7 H₂O, 0,05 Gewichtsprozent KCl, 0,001 Gewichtsprozent FeSO₄ - 7 H₃O und 0,5 Gewichtsprozent NaNO₃. Der pH-Wert" wurde vor dem Sterilisieren auf 7,5 eingestellt. Das 48 Stunden lang kultivierte Fermentationsmedium zeigte 11,1 Einheiten Isoamylaseaktivität. Die enzymatisch^ Aktivität wurde wie folgt gemessen: 1 ml 0,5 n-Acetatpufferlösung von einem pH-Wert von 6,0 wurde zu 5 ml einer l°.oigen wäßrigen Lösung von löslicher glutinhaltiger Reisstärke, die nach dem Lindner-Verfahren hergestellt wurde, und hierzu noch 1 ml Enzymlösung zugegeben. Man ließ die Lösung bei 40^J C 1 Stunde stehen. Zu 1 ml der Lösung werden 1 ml 0,01 n-Jodkaliumjodidlösung und Wasser zugegeben, um eine Gesamtmenge von 25 ml herzustellen. Die Extinktion bei 620 πΐμ wird gemessen. Zur Kontrolle wird die Extinktion der Lösung bei Beginn gemessen. Die Zunahme der Extinktion war proportional der Enzymmenge, wenn sie im Bereich von ungefähr 0,1 Extinktionseinheiten lag. Unter diesen Bedingungen entsprach eine Zunahme der Extinktion von 0,1 einer Enzytnaktivität in der Probe von definitionsgemäß 10 Einheiten.

Das durch Entfernen der Zellen aus dem Fermentationsmedium erhaltene Filtrat wurde nach dem herkömmlichen Verfahren mit einer wäßrigen Ammoniumsulfatlösung (0,15 bis 0,45 Sättigung) ausgesalzen.

Das, Wieder-Aussalzen wurde mit einer wäßrigen Ammoniumsulfatlösung (0.18 bis 0,40 Sättigung) durchgeführt. Nachfolgend wurde die Lösung an Calciumphosphat adsorbiert und weiterhin durch Chromatographieren über eine DEAE-Cellulose-Säule gereinigt. Die spezifische Aktivität der Lösung zeigte eine etwa hundertfache Zunahme.

Die Aktivitäten wurden in jeder Stufe, wie nachfolgend aufgezeigt, bestimmt.

Bei der Bestimmung der Aktivität gemäß der obigen Vorschrift wird, wenn 1 ml Enzymlösung für die Reaktion verwendet wird, die Enzymmenge, die im Reaktionsansatz 0,1 Zunahme der Extinktion ergibt, 10 Enzymeinheiien/m! Enzymlösu-ig gleichgesetzt.

Die spezifische Aktivität wird errechnet durch Dividieren des obigen Werts der Enzymeinheiten durch die Anzahl der Milligramm des in 1 ml der Enzymlösung vorhandenen Proteins.

	Gesamt	Gesamt-	Spezi	Aus
	volumen	akiiviiai	fische	beute
	(ml)	(Ein heiten)	Aktivität	("'»)
20 Überstehende
Lösung des
Filtrates der
Fermentations
brühe	3000	33 000	0,88	100
Aussalzen I ..	230	26 730	14,2	81
Aussalzen II	50	23 100	18,1	70
Calcium
phosphatgel ...	21	11 550	53,0	35
,. DEAE-Cellulose	10	6 600	99»)	22

*) Auf den etwa 112fachen Wert angestiegen.

Dieses gereinigte Enzym wies ungefähr 47 C als

optimale Temperatur und ungefähr 6,0 als optimalen pH-Wert auf. Das vorliegende Enzym setzte sich mit /i-Grenzdextrin von Glykogen um. Es wurde als Isoamylase festgestellt.

Beispiel 2

Es wurde eine ähnliche Fermentation wie in Beispiel 1 durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß zunächst die Schüttelkultur durchgeführt und die Kultur nach 10 Stunden Fermentation in eine stationäre Kultur umgewandelt und dem Kulturmedium

gleichzeitig 0,1 Gewichtsprozent Toluol zugegeben wurde. Das Fermentationsmedium zeigte 24 Stunden nach dem Beginn der Kultivierung einen Wert für die Isoamylaseaktivität von 7,8 Einheiten.

Um den technischen Fortschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem Verfahren gemäß der deutschen Patentschrift 1 193 914 zu zeigen, wurden folgende Vergleichsversuche durchgeführt.

Die Herstellung der beiden Enzyme wurde wie folgt durchgeführt:

Herstellung von Pullulanase

(A) 1000 ml einer Kulturlösung, enthaltend 5 g Natriumnitrat, 1 g Dikaliumhydrogenphosphat, 0,5 g Magnesiumsulfat · 7 H₂O, 0,5 g Kaliumchlorid, 0,01 g

Eisen(II)-sulfat-7H₂O, 5 g Maltose und 8 g Pepton wurden durch Erhitzen sterilisiert, mit einer Vorkultur von Aerobacter aerogenes ATCC 15050 geimpft und die Kultivierung bei 28° C in einem Zeitraum von 48 Stunden unter Schütteln nach dem Verfahren des Beispiels der deutschen Patentschrift 1 193 914 durchgeführt. Aus der erhaltenen Kulturbrühe wurden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt. 1500 ml Aceton wurden zu dem Kulturfiltrat

zuggeben. Diese Flüssigkeit wurde bei (J "C 24 Stunden lang stehengelassen, der Niederschlag abzentrifugiert und in KKKI ml Wasser gelöst (Enzym-Lösung A).

Herstellung von Isoamylase durch Kultivierung
des Escherichia intermedia ATCC 21073

(B) Die Kultivierung dieses Stammes wurde nach dem Verfahren des Beispiels 1 der vorliegenden Anmeldung durchgeführt. Die Zusammensetzung des in dem Beispiel angegebenen Mediums ist als Zapek-Medium bekannt und besitzt im wesentlichen die gleiche Zusammensetzung wie das in der genannten deutschen Patentschrift angewandte Medium. Es wurden HK)OmI eines Mediums, enthaltend 0,5 °/o Maltose, 0,8%> Pepton, 0,1⁰Zo Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Kaliumchlorid, 0,5% Natriumnitrat, 0,05°/n Magnesiumsulfat ■ 7 H₂O und 0,001"/O Eisen(II)-sulfat mit dem vorerwähnten Stamm Escherichia intermedia geimpft und die Kultivierung ao bei 30^? C in einem Zeitraum von 48 Stunden unter Schütteln durchgeführt. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt und die überstehende Lösung als Enzym-Lösung B verwendet.

(B') In einem getrennten Versuch wurden 1000 ml »5 des gleichen Mediums, wie es in dem Beispiel der deutschen Patentschrift 1193 914 beschrieben ist, mit dem vorerwähnten Stamm %'on Escherichia intermedia geimpft und unter den Bedingungen des Beispiels 1 der vorerwähnten deutschen Patentschrift kultiviert. Nach Abtrennen der Zellen durch Zentrifugieren wurden 1,5 Volumina Aceton zu der Bouillon und diese bei 0° C 24 Stunden lang stehengelassen. Der durch Zentrifugieren erhaltene Enzym-Niederschlag wurde in 1000 ml Wasser gelöst (Enzym-Lösung B').

Diese drei Enzym-Lösungen wurden zusammen mit /i-Amylase der Reaktion in einer Stärkelösung unterworfen und die gebildete Maltose quantitativ nach dem Somogi-Verfahren bestimmt. Die Reaktionsbedingungen und die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend wiedergegeben:

Reaktionslösung und Reaktionsbedingungen

Verflüssigte Lösung einer wachsigen Maisstärke (Konzentration 10 Gewichtsprozent) 100 ml

Fullulanase- oder Isoamylase-

Lösung 5 bis 50 ml

/?-Amylase, extrahiert aus Weizenkleie 20 Einheiten

je g Stärke

Temperatur 45° C

pH-Wert 6,0

Reaktionszeit 20 Stunden

Gesamtvolumen 200 ml

Durch /J-Amylolyse gebildete Maltose-Menge

	Pullulanase	Enzym	hergestellt
Menge	hergestellt		gemäß (B')
an Enzym	gemüß(A)	Isoamylase	50 mg/ml
	48 mg/ml	hergestellt	49 mg/ml
!0OmI	44 mg/ml	gemäß (R)	45 mg/ml
30 ml	36 mg/ml	49 mg/ml	38 mg/ml
10 ml	35 mg/ml	48 mg/ml
5 ml	44 mg/ml
	36 mg/ml

Die Ergebnisse zeigen:

1. 100 ml der eingesetzten Pullulanase sind je 30 ml der eingesetzten Isoamylasen äquivalent, und die Aktivität der letzteren beträgt in diesem Fall etwa das dreifache der Enzym-Lösung nach dem Stande der Technik.

2. Die Pullulanase wurde durch Aceton-Fällung gereinigt, wohingegen die Isoamylase-Präparate gemäß der Erfindung aus dem ungereinigten Kultur- filtrat bestand.

Claims

1 Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Isoamylase durch Züchten eines Mikroorganismus in einem üblichen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung mit dem Stamm Escherichia intermedia ATCC 21073 unter aeroben Bedingungen durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die aerobe Züchtung als Schüttelkultur oder als luftgemischte Submerskultur durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Schüttelkultur nachfolgend zu einer stationären Kultur abgeändert wird.