DE1203261B - Verfahren zur Herstellung von 17beta-Hydroxy-retro-(10alpha-methyl-9beta)-steroiden - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung von 17ß-Hydroxy-retro-(10a-methyl-9fl)-steroiden Die Erfindung betrifft die Herstellung von 17 ß-Hydroxy-retro-(10 a-methyl-9ß)-steroiden.
• Unter Retro-steroiden werden 10,13-Dimethylcyclopentanoperhydrophenanthren-Abkömmlinge verstanden, deren Methylgruppe am Kohlenstoffatom 10 in ca-Konfiguration und das Wasserstoffatom oder der Substituent am Kohlenstoffatom 9, ähnlich wie die Methylgruppe am Kohlenstoff'atom 13 in ß-Konfiguration angeordnet ist.
• Bestimmte Retro-steroide sowie ihre Herstellung und ihre Anwendung sind z. B. aus der belgischen Patentschrift 577.615 bekannt.
• So lassen sich 17 ß-Hydroxy-retro-steroide bequem auf chemischem Wege durch Reduktion der entsprechenden 17-Keto-reto-steroide erhalten. Letztere Verbindungen lassen sich jedoch häufig auf chemischem Wege nur schwierig herstellen, da entweder die erforderlichen Ausgangsstoffe nicht leicht zugänglich sind oder da die Herstellung an sich entweder in verschiedenen Reaktionsstufen oder mit geringer Ausbeute vor sich geht. Die vorgenannten Nachteile treten z. B. bei der Umwandlung von Retro-progesteron in Retro-androst-4-en-3,17-dion oder bei der Oxydation von den sogenannten Lumisterol, in das vorerwähnte 3,17-Diketon auf.
• Beim Zustandekommen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß es möglich ist, auf mikrobiologischem Wege in einer einzigen Stufe 17ß-Hydroxy-retro-steroide aus Retropregnanen herzustellen, die am Kohlenstoffatom 20 oxydiert sind. Mikrobiologische Reaktionen in der normalen Steroidreihe (wobei die Methylgruppe in der Stellung 10 in ß-Konfiguration und das Wasserstoffatom in der Stellung 9 in a-Konfiguration angeordnet ist) waren bereits bekannt. Es war z. B. bereits gelungen, 17-Ketosteroide aus 20-Keto-allopregnanen mittels Enzymsystemen von Pilzen des Geschlechtes Penicillium (niederländische Patentschrift 90.188) herzustellen, und auch 17-Keto-steroide entstanden in Kulturen von Pilzen des Geschlechtes Gliocladium Gorda, denen ein 20-Keto-steroid zugesetzt war, durch das in der niederländischen Patentschrift 89.724 beschriebene Verfahren.
• Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung von 17ß-Hydroxy-retro-(lOca-methyl-9ß)-steroiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der 44-3 Keto- 20-hydroxy- oder 44-3,20-Diketo-lOa-methyl-9ß-pregnan (sogenannte Retropregnan) -reihe in an sich bekannter Weise mit einer Kultur eines Mikroorganismus der Art Sporormia oder deren oxydierenden Enzymsystemen unter üblichen aeroben Bedingungen bebrütet. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die erwähnten Mikroorganismen die betreffende(n) Umwandlungen) mit den Steroiden der Retroreihe und nicht mit den Steroiden der normalen Reihe bewerkstelligen. Mikroorganismen der Art der Sporormia gehören zu der Ordnung der Sphäridalen der Klasse der Ascomyceten. Bei den verschiedenen bekannten Sporormiaarten wurden beim Zustandekommen der Erfindung die besten Resultate mit Sporormia pollaccii Elisei erzielt. Außerdem wurden günstige Resultate mit Sporormia fasciculata, Sporormia leporina und Sporormia montana erzielt.
• Es empfiehlt sich nicht, als Ausgangssteroide 3-Keto-44,8-Diene einzusetzen, da, wenigstens bei der Umwandlung von 6-Dehydro-retroprogesteron, ein weitgehender Abbau des Gesamtretrosteroids erfolgt.
• Die erfindungsgemäße Umwandlung wird vorzugsweise mit Kulturen der Sporormiaarten oder mit den oxydierenden Enzymsystemen derselben durchgeführt. Außerdem ist es jedoch auch möglich, die Umwandlung mit Konidien von Sporormia durchzuführen. Zu diesem Zweck wird z. B. zunächst eine Kultur der Pilzart unter aeroben Bedingungen in einer Nährlösung entwickelt, worauf ein Gärmedium, das das umzuwandelnde Retro-steroid enthält, und das in Lösung oder Suspension zugesetzt werden kann, der oxybiontischen Dissimilationswirkung des entstandenen Myceliums unterworfen wird. Die Nährlösung besteht im wesentlichen aus einer Kohlenstoff und einer Stickstoffquelle z. B. einem Kohlehydrat, wie Glucose, Maltose oder Stärke, und einer organischen Stickstoffquelle, wie Maisquellwasser oder Hefeextrakt, Eiweißhydrolysaten, Aminosäuren oder einer anorganischen Stickstoffquelle, z. B. Ammoniumsalzen oder Alkalimetallnitraten. Dem Medium, das das zu oxydierende Steroid und eine oder mehrere der vorerwähnten Nährquellen enthält, kann gewünschtenfalls noch ein Antischaummittel z. B. Glycerylmonostearat zugesetzt werden. Die geeigneteste Gärtemperatur liegt gewöhnlich zwischen 20 und 28'C, obgleich höhere oder niedrigere Temperaturen zwischen 15 und 35°C im allgemeinen auch brauchbar sind. Die zur Umwandlung des Retro-steroids erforderliche Zeit kann zwischen weiten Grenzen schwanken, aber gewöhnlich ist eine Oxydationsperiode von 10 bis 48 Stunden optimal für eine vollständige Umwandlung. Das nach Beendigung des Oxydationsvorganges erhaltene 17ß-Hydroxy-retro-steroid kann auf übliche Weise aus dem Medium und/oder dem Mycelium abgetrennt werden, z. B. mit nicht mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmitteln, wie Diäthyläther, Äthylacetat, Amylacetat, Methylisobutylketon oder anderen Estern und Ketonen. Insbesondere Methylisobutylketon eignet sich als Extraktionsmittel. Das so erhaltene Steroid kann auch durch chromatographische Verfahren allein oder in Kombination mit Extraktionsverfahren aus den Gärmedium abgetrennt und gereinigt werden.
• Das Verfahren nach der Erfindung kann auch dadurch durchgeführt werden, daß Konidien von Sporormiaarten auf wäßrige Dipersionen der erwähnten Ausgangs-Retro-steroide einwirken.
• Die Erfindung wird an Hand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert. Beispiel I Umwandlung von Retro-progesteron in Retro-testosteron in Schüttelkolben.
• Eine Nährlösung mit 20 g eingedicktem Maisquellwasser, 15 g Glucose und 6 g Hefehydrolysat pro 1000 ml Leitungswasser wurde nach dem Einstellen auf einen pH-Wert von 6,6 und nach Sterilisierung bei 120°C während 20 Minuten mit einer auf Malzagar gewachsenen Kultur von Sporormia pollaccii in Anteilen von 250 ml in Schüttelkolben von 1000 ml geimpft. Diese Impfungskulturen wurden nach 48stündigem Schütteln (250 Umdrehungen je Minute) bei 26°C weitergeimpft (Impfungsstärke 5 °/n), und zwar in 12 Erlenmeyerkolben von 2000 ml mit je einer sterilisierten Nährlösung von 1000 ml, bestehend aus Maisquellwasser 0,3 °/o (berechnet auf den trockenen Stoff), Glucose 0,40/,), Glyceryhnonostearat 0,04°/0; pH = 6,8 (mit 2n Natriumhydroxydlösung). Diese Kulturen wurden 24 Stunden unter den vorerwähnten Bedingungen rotiert, worauf unter aseptischen Bedingungen jeder Kultur 200 mg Retroprogesteron in 10 ml Glycohnonomethyläther (bekannt unter dem Handelsnamen Methylcellosolve) zugesetzt wurde. Nach 48stündigem Schütteln wurde die Gärung bei einem pH von 4,6 unterbrochen, nachdem papierchromatographisch (System Benzol-Formamid) gezeigt war, daß die Umwandlung in Retro-testosteron praktisch vollständig stattgefunden hatte. Die Schüttelkulturen wurden vereinigt und durch Filtrieren von dem Mycelium befreit. Das Kulturfiltrat (121) wurde dreimal mit 2400 ml Methylisobutylketon extrahiert und dann im Vakuum auf 300 ml eingedampft. Diese Menge wurde weiter mit 30 ml 1 n-Natriumhydroxydlösung, 30 m10,01 n-Natriumhydroxydlösung und schließlich dreimal mit 30 ml destilliertem Wasser gewaschen. Der eingedampfte und gewaschene Extrakt wurde darauf mit Kohle entfärbt und schließlich bis zu einem weißen, kristallinen Rückstand eingedampft. Dieser Rückstand wurde in 5 ml siedendem Aceton gelöst, worauf 15 ml Heptan zugesetzt wurden. Nach Abdestillieren des Acetons kristallisierte 1,56 g Retro-testosteron aus. Dieser Vorgang wurde wiederholt, wobei 1,3 g reines Retro-testosteron mit einem Schmelzpunkt von 153,5 bis 154,5°C erhalten wurde; [x]ö° = -150° (c = 1, Chloroform). Beispiel 11 Umwandlung von Retro-progesteron in Retro-testosteron in Gärbottichen Eine nach Beispiel I erhaltene, 48stündige Impfkultur von Sporormia pollaccii von 2000 ml wurde in einen Gärbottich von 601 gebracht, der mit einem Rührer und einem Ärator versehen war und der 401 Nährmedium enthielt, das aus einer sterilisierten Lösung von 200 g Maisquellwasser (berechnet auf den trockenen Stoff), 200 g Glucose, 12,5 g Glycerylmonostearat in Leitungswasser (pH = 6,4 mit 2n Natriumhydroxydlösung) bestand. Nach 24stündiger Inkubation bei 25°C (Umdrehungszahl 140 pro Minute; Luftzufuhr 101 pro Minute) wurden 13,4 g Retro-progesteron, in 450 ml Aceton gelöst, unter aseptischen Bedingungen zugesetzt, worauf die Gärung noch 24 Stunden fortgesetzt wurde. Das Kulturfiltrat wurde auf die im Beispiel I erwähnte Weise verarbeitet. Nach der Doppelumkristallisierung mittels Aceton-Heptan wurde das kristalline Endprodukt (7,2 g) noch dadurch umkristallisiert, daß er in 30 ml Methanol gelöst, mit Kohle behandelt, filtriert, mit Methanol bis auf 50 ml verdünnt und dann unter Erwärmen 50 ml destilliertes Wasser beigefügt wurden. Nach Abkühlung trennten sich aus dieser Lösung 6 g reines Retro-testosteron ab. Aus den Mutterlaugen wurden noch 800 mg Endprodukt ausgeschieden. Das Endprodukt wies die gleichen physikalischen Konstanten auf wie im Beispiel I.

Claims (2)

1. Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung von 17ß-Hydroxyretro-(10a-methyl-9ß)-steroiden, d a d u r c h g ek e n n z e i c h n e t, daß man eine Verbindung der d 4-3-Keto-20-hydroxy- oder d 4-3,20-Diketo-10a-methyl-9ß-pregnan (sogenannten Retropregnan)-reihe in an sich bekannter Weise mit einer Kultur eines Mikroorganismus der Art Sporormia oder deren oxydierenden Enzymsystemen unter üblichen aeroben Bedingungen bebrütet.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umwandlung mit Sporormia pollaccii (elysei), Sporormia fasciculata, Sporormia leporina oder Sporormia montana durchgeführt wird.