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Verfahren zur Herstellung von 11a,17a,21-Trihydroxy-9,8, l0a-pregn-4-en-3,20-dion.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 11
a,17a,21-Trihydroxy-9ß,l0a-pregn-4-en-3,20-dion, welches der Formel
entspricht. Im Gegensatz zu normalen IOß,9a-Steroiden, bei denen die vier Ringe
des Kohlenstoffskeletts etwa in einer Ebene liegen, weist das Steroidskelett der
erfindungsgemäß herstellbaren Verbindung einen Knick längs der Verbindungsleitung
der Kohlenstoffatome 9 und 8 auf. Auch infolge dieses Umstandes ist die Konfiguration
der Methylgruppen und Wasserstoffatome an den Kohlenstoffatomen 10, 9, 8, 13 und
14 nicht überall gleich der bei den normalen Steroiden. Die Konfiguration dieser
Gruppen und Wasserstoffatome an den erwähnten Kohlenstoffatomen ist bei der erfindungsgemäß
herstellbaren Verbindung 10a, 9ß, 8ß. 13(3. 14a, während sie bei der.normalen Steroiden
10ß. 9a, 8ß, 13ß, 14a ist.
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Die erfindungsgemäß herstellbare Verbindung hat überraschende pharmakologische
Eigenschaften. So hat dieser Stoff keine antientzündliche Wirksamkeit, keinen Einfluß
auf die Elektrolytausscheidung des Körpers, wohl aber eine glukokortikoidische Wirksamkeit.
Diese Eigenschaften weichen deutlich von denen der entsprechenden Verbindung der
normalen Reihe ab, welche keine pharmakologisch wertvolle Eigenschaften aufweist.
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Die erfindungsgemäß herstellbare Verbindung hat weiterhin keine uterotropische
und keine antiuterotropische Wirkung.
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Sie ist außerdem ein wichtiges Ausgangsprodukt für die Herstellung
anderer 9ß.I0a-Steroide. Es kann z. B. durch Oxydation der 11-Hydroxygruppe 17a,21-Dihydroxy-9ii,
lOa-pregn-4-en-3,11,20-trion hergestellt werden, oder, durch Methylierung am Kohlenstoffatom
2 kann z. B. durch Reaktion mit Diäthyloxalat und Natriumhydrid und anschließende
Umsetzung mit Methyljodid bei Vorhandensein von getrocknetem Kaliumcarbonat 2-Methyl-1
l a,17a,21-trihydroxy-9ß, I Oa-pregn-4-en-3,20-dion erhalten werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man
17a,21 - Dihydroxy-9ß, IOa-pregn-4-en-3,20-dion in an sich bekannter Weise mit einer
Kultur eines Mikroorganismus oder den daraus gewonnenen oxydierend wirkenden Enzymen,
welche in Verbindungen der normalen Steroidreihe (9a,lOß) eine 11a- oder llß-ständige
Hydroxygruppe einzuführen vermögen, unter aeroben Bedingungen bebrütet.
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Als solche können Mikroorganismen des Geschlechts Moniliaceae genannt
werden. Von diesem Geschlecht können insbesondere folgende Sorten genannt werden,
z. B.
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Aspergillns, wie A. niger, A. nidulans; Cunninghamella, wie C. blakesleeana;
Absidia, wie A. glauca; Pycnosporium sp. QM 703; Pestalotia, wie P. foedans; Beauveria
; Fusarium, wie F. elegans; Helminthosporium, wie H. sativum; Colletotrichum, wie
C. pisi; Rhizopus, wie R. nigricans.
Insbesondere wurden beim Zustandekommen
der Erfindung günstige Ergebnisse mit Aspergillus ochraceus erzielt.
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Das Verfahren nach der Erfindung wird auf eine Wei: °. durchgeführt,
die den bekannten mikrobiologischen Umsetzungen entspricht, z. B. dadurch, daß die
Unterlage unter den dazu geeigneten Verhältnissen mit einer Kultur einer obenerwähnten
Schimmelart und/oder deren Enzymsysteme in Kontakt gebracht wird. Dazu läßt man
z. B. zuerst eine j Kultur der Schimmelart unter aeroben Verhältnissen in einer
Nährlösung wachsen, worauf man ein Substrat, das das zu oxygenierende Steroid enthält,
das in Lösung oder Suspension zugesetzt werden kann, der oxybiontischen Dissimilationswirkung
des entstandenen Myceliums unterwirft. Die Nährlösung besteht im wesentlichen aus
einer Kohlenstoff- und einer Stickstoffquelle, z. B. einem Kohlenhydrat, wie Glukose,
Maltose oder Stärkemehl, und einer organischen Stickstoffquelle, wie Maisweich-
. wasser oder Hefeextrakt, Albuminhydrolysaten, Aminosäuren, oder einer anorganischen
Stickstoffquelle, wie Ammoniumsalzen oder Alkalimetallnitraten. Dem Mittel, das
das zu oxygenierende Steroid und eine oder mehrere der vorerwähnten Nahrungsquellen
enthält, kann gewünschtenfalls auch noch ein Antischaummittel, z. B. Glycerylmonostearat,
zugesetzt werden.
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Die geeignete Gärungstemperatur liegt gewöhnlich zwischen 20 und 28°C,
obzwar höhere oder niedrigere Temperaturen, die zwischen 15 und 35°C liegen, im
allgemeinen auch brauchbar sind.
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Der pH-Wert des Mittels kann auf die normale Weise eingestellt werden
und wird vorzugsweise auf einen Wert zwischen 6 und 7 gebracht.
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Die zur Oxydation des Steroids erforderliche Zeit kann sich zwischen
weiten Grenzen ändern, aber gewöhnlich ist eine Oxygenierungsperiode von 10 bis
48 Stunden für eine vollständige Umsetzung optimal.
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Die nach Beendigung des Oxygenierungsvorgangs erhaltene 11-Hydroxysteroidverbindung
kann auf eine der üblichen Weisen aus dem Mittel und/oder dem Mycelium, vorzugsweise
durch Extraktion mit nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie
Diäthyläther, Äthylacetat, Amylacetat, Methylisobutylketon oder anderen Estern und
Ketonen, isoliert werden. Insbesondere ist Methylisobutylketon ein geeignetes Extraktionsmittel.
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Das oxygenierte Steroid kann auch durch chromatographische Verfahren,
gegebenenfalls in Kombination mit Extraktion aus dem Gärungsmittel, isoliert und
gereinigt werden.
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Nach der Erfindung kann das 11-Hydroxysteroid auch dadurch erhalten
werden, daß man Sporen der betreffenden Mikroorganismen auf Lösungen oder Dispersionen
der angegebenen Ausgangssteroide einwirken läßt.
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Die erhaltene Verbindung kann in normaler Weise zu Tabletten, Pillen,
Kapseln und Flüssigkeiten für orale Verabreichung und in flüssiger Form für parenterale
Verabreichung verarbeitet werden.
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Beispiel Eine 120 g eingedicktes Maisweichwasser und 120 g Glukose
in 61 destilliertem Wasser enthaltende Nährlösung wurde nach Einstellung mit Hilfe
einer wäßrigen 2 n-Natriumhydroxydlösung auf pH 6,5 und nach einer 20 Minuten dauernden
Sterilisation bei einer Temperatur von 120° C mit einer auf Hafermalzagar gewachsenen
Kultur von Aspergillus ochraceus geimpft. Diese Impfkultur wurde, in zwölf Schüttelkolben
von je 21 Inhalt, 36 Stunden bei 26°C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (250
Umdr./Min.) geschüttelt, worauf das entstandene Myceliumgemisch in einen rostfreien
stählernen Gärungsbehälter von 5001 mit einem Rührwerk und Aerator übergebracht
wurde, in dem folgendes, unter den obenerwähnten Verhältnissen sterilisiertes Gärungsmittel
vorhanden war: Maisweichwasser (berechnet auf trocknen Stoff) .......................
1110 g Glukose ........................... 1110 g Leitungswasser . . _ . . . .
... . .......... 2201 pH 6,5 (Natronlaugelösung) Diesem Fermentationsmittel
wurde 24 Stunden nach dem Impfen 66 g Retro-comp. S (17a,21-Dihydroxy-9/3,10a-pregn-4-en
3,20-dion) in 22,2 1 Methylcellosolve gelöst, zugesetzt, worauf nochmals 41 Stunden
bei 26°C fermentiert wurde (Drehzahl 160/Min., Luftzufuhr: 0,9 m3/m2 Bodenfläche/Min.).
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Das Filtrat der Kultur (2601) wurde dann fünfmal jeweils mit 651 Methylisobutylketon
extrahiert. Der totale Extrakt wurde in Vakuum bis 101 eingedampft und mit aktivierter
Kohle behandelt. Darauf wurde die Lösung in Vakuum zu einem teilweise kristallinen
Uberrest eingedampft. Dieser Öberrest wurde aus 150 ml Dichloräthan umkristallisiert,
woraus sich 39 g kristallines Produkt ergab. Die Mutterlauge wurde zur Trockne eingedampft,
und der Uberrest wurde aus 35 ml Dichloräthan kristallisiert, wodurch weitere 12,8
g kristallines Produkt erhalten wurden.
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Die vereinigten Kristalle (51,8 g) wurden zweimal kristallisiert,
jeweils aus etwa 1 1 Dichloräthan. Auf diese Weise wurde 44,16 g Endprodukt erhalten,
das als 11 a-Hydroxy-Retro-comp. S plus 1 Mol Dichloräthan identifiziert wurde.
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Das Kristallösungsmittel konnte durch Trocknen im Vakuum (0,5 mm HZ)
bei 80°C (6 Stunden) daraus entfernt werden. Das Produkt hatte folgende physikalische
Konstanten Schmelzpunkt 189 bis 194°C (getrocknetes Präparat 191,5 bis 194,3°C).
UV-Absorptionsspektrum in Methanol max.
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242 m#L, E = 16 600 (sowohl vom getrockneten als auch vom nicht getrockneten
Präparat). [a]" = -61,7°C (c = 1, Dioxan) (getrocknetes Präparat -72,3°C).
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Elementaranalyse: C 59,890%, H 7,390%, Cl 15;620%.
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Berechnet für C23H340@C12: C 59,870%, H 7,430%, Cl 15,36%.
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IR = 3310, 1693, 1642, 1611, 1417, 1275, 1238, 1213,
1117, 1077, 1057, 1000, 949, 870.
bei .1"« 242 = 476.