DE1236132B

DE1236132B - Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Fusafungin

Info

Publication number: DE1236132B
Application number: DES89675A
Authority: DE
Original assignee: Biofarma SA
Current assignee: Biofarma SA
Priority date: 1963-02-25
Filing date: 1964-02-25
Publication date: 1967-03-09
Also published as: GB1018626A; US3385764A; ES296533A1

Description

DEUTSCHES W7WW> PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT Deutsche Kl.: 30 h - 6

Nummer: 1236 132

Aktenzeichen: S 89675IV a/30 h

j[ 236 132 Anmeldetag: 25. Februar 1964

Auslegetag: 9. März 1967

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Fusafungin.

Fusafungin ist in der französischen Patentschrift 1164 181 und seine therapeutische Anwendung als antiinflammatorisches Antibiotikum ist in der französischen Medikamentenpatentschrift (BSM) 1084 M beschrieben.

Das bekannte Verfahren zur Herstellung von Fusafungin hatte den Nachteil, daß die Ausbeuten verhältnismäßig gering und die Fermentationsdauer sehr lang waren. Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines verbesserten Verfahrens, welches diese Nachteile nicht aufweist.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Fusafungin durch submerse Züchtung von Fusarium lateritium Wr (CBS 119.63) in einem üblichen Nährmedium unter Luftzufuhr bei 25 bis 33° C, vorzugsweise 29 bis 30° C, bei einem pH-Wert um 6,5 sowie anschließender Extraktion des Antibiotikums mittels organischer Lösungsmittel zeichnet sich dadurch aus, daß eine Luftzufuhr von 0,7 bis 0,9 Liter Luft pro Minute und pro Liter Kulturmedium angewendet wird.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann die Ausbeute gegenüber dem bekannten Verfahren um 500 bis 600 °/o gesteigert werden, wobei gleichzeitig die Fermentationsdauer von bisher 6 bis 10 Tagen auf etwa 60 bis 70 Stunden herabgesetzt wird. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man daher im gleichen Zeitraum annähernd die 20fache Menge an Fusafungin gegenüber dem Verfahren der französischen Patentschrift 1164 181. Diese überraschende Verbesserung wird nur in dem angegebenen Bereich erzielt, und bereits eine Variation von nur 0,1 Liter Luft pro Minute pro Liter Medium in jeder Richtung hat eine Ausbeuteverminderung auf fast die Hälfte zur Folge. In der Zeichnung wird die Abhängigkeit der Fusafunginbildung in Abhängigkeit von der Stärke der Belüftung gezeigt. Die übrigen Bedingungen entsprachen denen der erwähnten französischen Patentschrift.

Fusafungin ist, abgesehen von anderen möglichen Verabreichungswegen, insbesondere für lokale Anwendungen bei Affektionen der Atmungswege, der Haut und der Mucosa wertvoll, wie beispielsweise bei Rhinitis, Rhinopharyngitis, Sinusitis, Bronchitis, Wunden, infizierten Ulcera u. dgl., in Form von nasalen Lösungen, Aerosolen, Pomaden u. dgl. wertvoll.

Es besitzt ein besonders breites Wirkungsspektrum und ist in geringerer Konzentration gegenüber den Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums
Fusafungin

Anmelder:

Societe Anonyme BIOFARMA,
Neuilly-sur-Seine (Frankreich)

Vertreter:

Dipl.-Ing. F. Weickmann,

Dr.-Ing. A. Weickmann,

Dipl.-Ing. H. Weickmann

und Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke, Patentanwälte,

München 27, Möhlstr. 22

Beanspruchte Priorität:

Großbritannien vom 25. Februar 1963 (7516) - -

meisten pathogenen Mikroorganismen wirksam, wobei es gleichzeitig eine antiinflammatorische Wirkung besitzt, die der von Acetylsalicylsäure überlegen ist.

Das erfindungsgemäße Züchtungsverfahren wird unter Submersbedingungen in Medien, die in sterilem Wasser eine Stickstoffquelle, eine Kohlenstoffquelle, eine Quelle für Wachstumssubstanzen, Mineralsalze und ein oder mehrere Puffermittel enthalten, durchgeführt.

Die Zufuhr von Stickstoff kann durch eine oder mehrere der folgenden, in das Medium eingebrachten Substanzen erfolgen: Hefeextrakt, Aminosäuren, Peptone, Kichererbsenmehl, Fischmehl, Sojamehl, lösliche Maisextrakte, lösliche Getreideextrakte, Fleischextrakte, Harnstoff, Ammoniumnitrat.

Diese Bestandteile, die leicht im Handel in roher Form erhältlich sind, besitzen den Vorteil, auch Spuren von Wachstumsfaktoren sowie beträchtliche Mengen an Nährmineralien zuzuführen.

Die Zufuhr von Kohlenstoff kann durch Kohlehydrate in gereinigter Form oder in konzentrierter Form durch folgende Substanzen erfolgen: Saccharose, Melasse, lösliche Stärke, Glucose, Glucosekonzentrate, Gerelose, Maltose, Galactose, Fructose, Lactose.

Die Menge dieser Kohlenstoffquellen, die zur Erzielung der besten Produktion von Fusafungin geeignet ist, schwankt von 3 bis 7 Gewichtsprozent des Fermentationsmediums.

709 518M0

Die Mineralsalze werden so gewählt, daß in das Medium zwei oder mehrere der folgenden Ionen eingeführt werden: Chlorid, Phosphat, Nitrat, Sulfat, Carbonat, Citrat, Tartrat; Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Magnesium, Zink, Eisen, Kupfer.

Der pH-Wert des Fermentationsmediums kann in ziemlich weiten Grenzen zwischen 4,5 und 7 schwanken, beträgt jedoch vorzugsweise zu Beginn der Fermentation 5,5 bis 6. Dieser pH-Wert wird durch Zugabe von Puffersubstanzen, wie beispielsweise Lösungen von Phosphaten, Citraten oder Tartraten, in geeigneten Grenzen gehalten.

Die Temperatur der Fermentation kann von 25 bis 33° C schwanken, doch arbeitet man vorzugsweise bei 29 bis 30° C, um einen erhöhten Gehalt an Antibiotikum in dem durch die Fermentation erzeugten Mycel zu erhalten.

Die Fermentationsdauer kann in beträchtlicher Weise vermindert werden, indem eine Belüftung der Züchtung in der Größenordnung von 0,7 bis 0,9 Liter Luft pro Minute je 1 Liter Nährlösung und auch ein geeignetes Inbewegunghalten der Lösung gewährleistet werden. Eine Dauer von 60 bis 70 Stunden gibt im allgemeinen gute Ergebnisse.

Man verfolgt die Entwicklung der Kultur, indem man alle 5 Stunden eine Probe von etwa 1 Liter Fermentationsmaische entnimmt und mit dieser Probe eine Bestimmung des Antibiotikums vornimmt. Diese Bestimmung wird durch die Methode der Papierchromatographie durchgeführt. Man bricht die Fermentation ab, wenn der Prozentgehalt an Fusafungin sich nicht mehr in merklicher Weise erhöht.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

In einem 5-Liter-Zweihalskolben, dessen einer Hals für die spätere Verbindung mit einer Quelle für sterile Luft vorgesehen ist, stellt man 2 Liter Medium mit folgender Rezeptur her:

Peton 1%

Glucosekonzentrat 3%

Natriumnitrat 0,1%

Dikaliumphosphat 0,1%

Magnesiumsulfat 0,05%

Kaliumchlorid 0,05%

Wasser ad 100%

Man verstopft jede öffnung des Kolbens mit Baumwolle und sterilisiert das Medium durch Einbringen in einen Autoklav während 30 Minuten bei 120° C Man läßt auf 29 bis 30° C abkühlen und entnimmt ein kleines Volumen, um die Sterilität und den pH-Wert zu kontrollieren, welch letzterer in der Nähe von 5 liegt.

Man extrahiert die Sporen des Stammes einer Schrägkultur auf Agarmedium mit zuvor sterilisiertem destilliertem Wasser, um eine Suspension zu erhalten, die etwa 600 000 Sporen je Kubikzentimeter enthält.

Man verwendet diese Suspension zur Beimpfung des vorgenannten Mediums.

Man inkubiert den Inhalt des Kolbens bei 27° C.

Das Einblasen von steriler Luft in die Flüssigkeit ermöglicht eine wirksame Bewegung durch Aufrühren und eine konstante Zufuhr von Sauerstoff.

Nach 55stündiger Fermentation überführt man den Inhalt des Kolbens unter aseptischen Bedingungen in ein Metallreaktionsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 100 Liter, in welchem man 60 Liter eine; sterilen Mediums der folgenden Rezeptur hergesteil hat:

Peptone 0,5%

Saccharose 4%

Ammoniumnitrat 0,5%

Monokaliumphosphat... 0,1 %

Kaliumchlorid 0,05%

ίο Magnesiumsulfat 0,05%

Ferrisulfat 0,002%

Wasser ad 100%

Man inkubiert die Kultur bei einer Temperatur von 28° C in dem Reaktionsgefäß während 60 Stunden unter mechanischem Rühren bzw. Schütteln und unter konstanter Belüftung. Man verwendet die erhaltene Bouillon zur Beimpfung von 600 Liter sterilem Medium, das in einem metallischen Fermenao tationsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 1800 Litern hergestellt ist und die folgende Zusammensetzung aufweist:

Saccharose 5%

Cerelose 0,5%

Ammoniumnitrat 1%

Natriumchlorid 0,3%

Magnesiumsulfat 0,25%

Kaliumchlorid 0,03%

Schmalzöl 0,1%

Wasser ad 100%

Man inkubiert die Kultur 55 Stunden bei 28° C, wobei man eine konstante verstärkte Belüftung und Bewegung aufrechterhält, und man verwendet die Kulturbrühe zur Beimpfung des Produktionsmediums.

In einem Fermentationsgefäß von 12 m³, das mit einer geeigneten Rührvorrichtung, einem Doppelmantel zur Regulierung der Temperatur, einer geeigneten Vorrichtung zur Verteilung steriler Luft und einer Vorrichtung zum automatischen Einspritzen von sterilem Antischaummittel, falls dies erforderlich ist, ausgestattet ist, stellt man 6 m³ Nährmedium her, indem man die folgenden Bestandteile mischt:

Saccharose 5,5%

Cerelose 0,5%

Ammoniumnitrat 1%

Natriumchlorid 0,3%

Monokaliumphosphat ... 0,5%

Magnesiumsulfat 0,25%

Wasser ad 100%

Man sterilisiert das Medium durch Erhitzen bei 120° C während 30 Minuten und kühlt dann auf 30° C ab.

Man beimpft und inkubiert dann 60 Stunden, wobei man die Temperatur bei 30° C hält.

Während der gesamten Fermentationszeit wird das Rühren mit einer Geschwindigkeit von 20 bis 40 Umdrehungen pro Minute aufrechterhalten, und sterile Luft wird am unteren Teil in einer Menge von 4,8 m^s pro Minute durch die Verteilungsvorrichtung eingeführt.

Die Fermentation wird abgebrochen, wenn der Verbrauch der Kohlehydrate 90% erreicht.

Der Gehalt der Fermentationsmaische an Fusafungin beträgt dann im Durchschnitt 0,5 bis 0,8 g je Liter.

Man filtriert die Fermentationsmaische durch eine Filterpresse und wäscht den Inhalt der Rahmen mit 2 m³ Wasser; dann trocknet man den Kuchen durch Einblasen von kompromierter Luft teilweise. Das Mycel wird anschließend in einem Umluftofen während 30 Stunden bei 70° C getrocknet und anschließend vermählen.

Man erhält so 88 kg Trockenprodukt mit einem Gehalt von 5,71 ^fl/o Fusafungin.

Das Rohprodukt wird anschließend in folgender Weise extrahiert:

Man suspendiert das Pulver in 836 Liter Methanol, setzt dann 44 Liter Essigsäurepuffer von pH 4,25 (0,05 molar) zu und rührt 1 Stunde bei gewöhnlicher Temperatur. Dann saugt man zur Abtrennung des extrahierten Pulvers von der methanolischen Lösung ab. Diese Lösung wird in einen Verdampfer übergeführt, in welchem ihr Volumen auf 200 Liter vermindert wird.

Man setzt 100 Liter Hexan zu und läßt dann unter Rühren 200 Liter Wasser zufließen. Nach 15minütigem Rühren läßt man 30 Minuten stehen und entfernt dann die untere Phase.

Der Hexanextrakt wird dreimal mit je 25 Liter eines Methanol-Wasser-Gemisches (3 :1 Volumina) extrahiert. Das methanolische Gemisch wird anschließend unter vermindertem Druck auf 12,5 Liter eingeengt. Während des Einengens verdampft das Methanol, der Gehalt an Wasser des Rückstands steigt regelmäßig an, und das Fusafungin fällt aus.

Man bringt anschließend die erhaltene Suspension in einen Kolben ein, der mit einem Abstreifrührer ausgestattet ist, und rührt dann 48 Stunden in einem Eisbad. Das Antibiotikum wird aus der Mutterlauge durch Filtrieren durch einen Büchnertrichter isoliert.

Man wäscht den Kuchen mit 5 Liter eines zuvor auf +4° C abgekühlten Gemisches von Methylalkohol und Wasser (1: 2,5 Volumina). Nach Trocknen in einem Vakuumschrank erhält man 2,805 kg Rohprodukt von graugelber Farbe.

Man löst das Rohprodukt in 140 Liter wasserfreiem, nichtdenaturiertem Methylalkohol und setzt dann 100 g Entfärbungskohle und eine Filterhilfe in einer Gewichtsmenge, die dem Gewicht der Kohle gleich ist, zu.

Man rührt 30 Minuten.

Man entfernt die Entfärbungskohle, die Filterhilfe und die unlöslichen Verunreinigungen durch Filtrieren. Man wäscht den Kuchen mit 14 Liter Methylalkohol.

Man bringt das Filtrat in ein Gefäß und setzt dann unter Rühren langsam 280 Liter zuvor auf 70° C erhitztes destilliertes Wasser zu. Man hält ein langsames Rühren aufrecht und läßt vorsichtig auf etwa 35° C abkühlen.

Man bringt die Kristallisation durch Zugabe von einigen Kristallen von reinem Fusafungin in Gang und rührt dann noch 12 Stunden.

Man läßt 48 Stunden bei +4° C reifen.

Man gewinnt die Kristalle von reinem Fusafungin durch Filtrieren.

Man wäscht den Kuchen mit 10 Liter eines zuvor auf +4° C abgekühlten Methanol-Wasser-Gemisches (1:2 Volumina) und dann mit 20 Liter destilliertem Wasser.

Die Kristalle werden im Trockenschrank im Vakuum bei 40° C getrocknet. Man erhält 2,110 kg reines Antibiotikum.

Das vorstehende Beispiel kann natürlichen zahlreichen Änderungen bezüglich der Fermentationsbedingungen sowie der Bedingungen der Extraktion und derjenigen der Reinigung unterzogen werden. Die Löslichkeit des Fusafungins in Wasser ist praktisch Null, und das Antibiotikum findet sich in dem Mycel konzentriert, doch ist die Abtrennung dieses letzteren durch Filtrieren oder Zentrifugieren zur Extraktion des wirksamen Prinzips nicht obligat.

Beispiel 2

Zu 1 Liter der gemäß Beispiel 1 hergestellten Fermentationsmaische setzt man unter Rühren 0,25 Liter n-Butylalkohol zu und stellt dann den pH-Wert des Gemisches mit Hilfe einer Säure auf 4 (±0,3) ein. Man hält das Rühren 30 Minuten bei konstantem pH-Wert aufrecht. Nach 2stündigem Stehenlassen entfernt man die untere Phase.
Man isoliert anschließend das ausgezogene Mycel von dem Butanolextrakt durch Filtrieren in Gegenwart einer Filterhilfe, wie beispielsweise Supercel.

Der Butanolextrakt wird anschließend unter vermindertem Druck eingeengt, bis man einen viskosen Sirup von gelbbrauner Farbe erhält, der das Antibiotikum enthält.

Man löst den »Sirup« in Hexan und extrahiert anschließend die erhaltene Lösung nacheinander dreimal mit einem geringen Volumen eines mit Hexan nicht mischbaren wäßrig-alkoholischen Gemisches.

Man vereinigt die alkoholischen Extrakte und bringt sie dann durch Anwendung eines Vakuums auf ein kleines Volumen.

Das Antibiotikum fällt in Form einer gelblichen Festsubstanz im Maße der Verarmung der Lösung an Alkohol aus.

Die Ausfällung des Fusafungins erreicht ihr Maximum nach Einengen auf ein Fünftel des ursprünglichen Volumens und ist nach einer Verweilzeit von 48 Stunden bei +4° C praktisch vollständig.

Man gewinnt das Antibiotikum in »rohem« Zustand durch Filtrieren und trocknet es dann im Vakuum.

Beispiel 3

Man stellt den pH-Wert einer gemäß Beispiel 1 hergestellten Fermentationsmaische auf 6,5 ein und extrahiert mit Methylisobutylketon oder Methyläthylketon.

Man trennt den Ketonextrakt ab und. engt ihn ein, bis man einen »Sirup« erhält, den man wie im Beispiel 1 beschrieben, reinigt.

Beispiel 4

Man extrahiert die gemäß Beispiel 1 erhaltene Fermentationsmaische bei pH 9 mit Äthylacetat oder Amylacetat.

Man trennt das organische Lösungsmittel ab, wäscht es mit einer Pufferlösung von pH 4,25 (Acetatpuffer) und engt ein, bis man einen »Sirup« erhält, den man wie im Beispiel 1 beschrieben reinigt.

Beispiel 5

Man kann durch Filtrieren der Fermentationsmaische ohne vorhergehende Änderung des ph-Werts das Antibiotikum mit dem Mycel in dem Kuchen zurückhalten, was die Entfernung des Hauptteils der in dem Filtrat löslichen Verunreinigungen ermöglicht.

Claims

Die Zugabe einer Filtrierhilfe ist nicht unbedingt notwendig.

Man wäscht den Kuchen, trocknet ihn in einem Umluftofen und vermählt ihn dann fein.

Das wirksame Material wird unter Verwendung von einem oder mehreren der folgenden Lösungsmittel extrahiert: Äthylacetat, Isoamylacetat, Butylacetat, Methylalkohol, Äthylalkohol, Isopropylalkohol, n-Butylalkohol, Aceton, Methyläthylketon, Methylisobutylketon, Äthyläther, Isopropyläther, Butyläther, Benzol, Hexan, Petroläther, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Methylenchlorid, Dichloräthan, Trichloräthylen, Pyridin u. dgl.

Alle diese Lösungsmittel lösen das Fusafungin, jedoch gewisse selektiver, und lassen in dem zurückbleibenden Kuchen einen mehr oder weniger großen Teil von Verunreinigungen zurück.

Man entfernt den ausgezogenen Kuchen durch Filtrieren und engt das Filtrat auf ein kleines Volumen ein.

Man löst das erhaltene sirupartige Konzentrat in Hexan oder Petroläther und extrahiert dann das wirksame Prinzip mit einem wäßrig-methanolischen Gemisch wie im Beispiel 1 beschrieben.

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Fusafungin durch submerse Züchtung von Fusarium lateritium Wr (CBS 119.63) in einem

ίο üblichen Nährmedium unter Luftzufuhr bei 25 bis 33° C, vorzugsweise 29 bis 30° C, bei einem pH-Wert um 6,5 sowie anschließender Extraktion des Antibiotikums mittels organischer Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß eine Luftzufuhr von 0,7 bis 0,9 Liter Luft pro Minute und pro Liter Kulturmedium angewendet wird.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Französische Patentschrift Nr. 1164181.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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