DE1203261B

DE1203261B - Process for the preparation of 17beta-hydroxy-retro (10alpha-methyl-9beta) -steroids

Info

Publication number: DE1203261B
Application number: DEN23883A
Authority: DE
Inventors: Jan De Flines; Willem Frederik Van Der Waard
Original assignee: Philips Gloeilampenfabrieken NV
Current assignee: Koninklijke Philips NV
Priority date: 1962-10-16
Filing date: 1963-10-14
Publication date: 1965-10-21

Description

Verfahren zur Herstellung von 17ß-Hydroxy-retro-(10a-methyl-9fl)-steroiden Die Erfindung betrifft die Herstellung von 17 ß-Hydroxy-retro-(10 a-methyl-9ß)-steroiden.Process for the preparation of 17β-hydroxy-retro- (10a-methyl-9fl) -steroids The invention relates to the production of 17β-hydroxy-retro- (10α-methyl-9β) -steroids.

Unter Retro-steroiden werden 10,13-Dimethylcyclopentanoperhydrophenanthren-Abkömmlinge verstanden, deren Methylgruppe am Kohlenstoffatom 10 in ca-Konfiguration und das Wasserstoffatom oder der Substituent am Kohlenstoffatom 9, ähnlich wie die Methylgruppe am Kohlenstoff'atom 13 in ß-Konfiguration angeordnet ist.Under retro-steroids are 10,13-dimethylcyclopentanoperhydrophenanthrene derivatives understood whose methyl group on carbon atom 10 in ca configuration and that Hydrogen atom or the substituent on carbon atom 9, similar to the methyl group at the carbon atom 13 is arranged in the ß-configuration.

Bestimmte Retro-steroide sowie ihre Herstellung und ihre Anwendung sind z. B. aus der belgischen Patentschrift 577.615 bekannt.Certain retro steroids, how they are made and how they are used are z. B. from the Belgian patent 577.615 known.

So lassen sich 17 ß-Hydroxy-retro-steroide bequem auf chemischem Wege durch Reduktion der entsprechenden 17-Keto-reto-steroide erhalten. Letztere Verbindungen lassen sich jedoch häufig auf chemischem Wege nur schwierig herstellen, da entweder die erforderlichen Ausgangsstoffe nicht leicht zugänglich sind oder da die Herstellung an sich entweder in verschiedenen Reaktionsstufen oder mit geringer Ausbeute vor sich geht. Die vorgenannten Nachteile treten z. B. bei der Umwandlung von Retro-progesteron in Retro-androst-4-en-3,17-dion oder bei der Oxydation von den sogenannten Lumisterol, in das vorerwähnte 3,17-Diketon auf.So 17 ß-hydroxy-retro-steroids can be conveniently chemically obtained by reducing the corresponding 17-keto-reto-steroids. The latter connections however, can often only be produced with difficulty by chemical means, since either the necessary starting materials are not readily available or because the manufacture per se either in different reaction stages or with low yield is going. The aforementioned disadvantages occur z. B. in the conversion of retro-progesterone in retro-androst-4-en-3,17-dione or in the oxidation of the so-called Lumisterol, into the aforementioned 3,17-diketone.

Beim Zustandekommen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß es möglich ist, auf mikrobiologischem Wege in einer einzigen Stufe 17ß-Hydroxy-retro-steroide aus Retropregnanen herzustellen, die am Kohlenstoffatom 20 oxydiert sind. Mikrobiologische Reaktionen in der normalen Steroidreihe (wobei die Methylgruppe in der Stellung 10 in ß-Konfiguration und das Wasserstoffatom in der Stellung 9 in a-Konfiguration angeordnet ist) waren bereits bekannt. Es war z. B. bereits gelungen, 17-Ketosteroide aus 20-Keto-allopregnanen mittels Enzymsystemen von Pilzen des Geschlechtes Penicillium (niederländische Patentschrift 90.188) herzustellen, und auch 17-Keto-steroide entstanden in Kulturen von Pilzen des Geschlechtes Gliocladium Gorda, denen ein 20-Keto-steroid zugesetzt war, durch das in der niederländischen Patentschrift 89.724 beschriebene Verfahren.In making the present invention, it was found that It is possible to use 17ß-hydroxy-retro-steroids microbiologically in a single stage made from retroregnanes which are oxidized at carbon atom 20. Microbiological Reactions in the normal steroid series (with the methyl group in the 10 in ß-configuration and the hydrogen atom in position 9 in a-configuration is arranged) were already known. It was z. B. already succeeded in 17-ketosteroids from 20-keto-allopregnanen using enzyme systems from fungi of the Penicillium family (Dutch patent 90.188), and 17-keto-steroids were also created in cultures of fungi of the Gliocladium Gorda sex, which are a 20-keto steroid was added by that described in Dutch patent 89,724 Procedure.

Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung von 17ß-Hydroxy-retro-(lOca-methyl-9ß)-steroiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der 44-3 Keto- 20-hydroxy- oder 44-3,20-Diketo-lOa-methyl-9ß-pregnan (sogenannte Retropregnan) -reihe in an sich bekannter Weise mit einer Kultur eines Mikroorganismus der Art Sporormia oder deren oxydierenden Enzymsystemen unter üblichen aeroben Bedingungen bebrütet. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die erwähnten Mikroorganismen die betreffende(n) Umwandlungen) mit den Steroiden der Retroreihe und nicht mit den Steroiden der normalen Reihe bewerkstelligen. Mikroorganismen der Art der Sporormia gehören zu der Ordnung der Sphäridalen der Klasse der Ascomyceten. Bei den verschiedenen bekannten Sporormiaarten wurden beim Zustandekommen der Erfindung die besten Resultate mit Sporormia pollaccii Elisei erzielt. Außerdem wurden günstige Resultate mit Sporormia fasciculata, Sporormia leporina und Sporormia montana erzielt.The invention now relates to a process for the production of 17β-hydroxy-retro- (lOca-methyl-9β) -steroids, which is characterized in that a compound of 44-3 keto 20-hydroxy or 44-3,20-diketo-10a-methyl-9ß-pregnane (so-called retropregnane) series in an known manner with a culture of a microorganism of the species Sporormia or their oxidizing enzyme systems are incubated under normal aerobic conditions. It it was surprisingly found that the microorganisms mentioned Conversions) with the steroids of the retro range and not with the steroids of the normal Accomplish series. Microorganisms of the type of Sporormia belong to the order of the spheres of the class of the Ascomycetes. In the various known types of Sporormia When the invention came about, the best results were obtained with Sporormia pollaccii Elisei scored. In addition, favorable results have been obtained with Sporormia fasciculata, Sporormia leporina and Sporormia montana.

Es empfiehlt sich nicht, als Ausgangssteroide 3-Keto-44,8-Diene einzusetzen, da, wenigstens bei der Umwandlung von 6-Dehydro-retroprogesteron, ein weitgehender Abbau des Gesamtretrosteroids erfolgt.It is not recommended to use 3-keto-44,8-dienes as starting steroids, there, at least in the conversion of 6-dehydro-retroprogesterone, an extensive one The total retrosteroid is broken down.

Die erfindungsgemäße Umwandlung wird vorzugsweise mit Kulturen der Sporormiaarten oder mit den oxydierenden Enzymsystemen derselben durchgeführt. Außerdem ist es jedoch auch möglich, die Umwandlung mit Konidien von Sporormia durchzuführen. Zu diesem Zweck wird z. B. zunächst eine Kultur der Pilzart unter aeroben Bedingungen in einer Nährlösung entwickelt, worauf ein Gärmedium, das das umzuwandelnde Retro-steroid enthält, und das in Lösung oder Suspension zugesetzt werden kann, der oxybiontischen Dissimilationswirkung des entstandenen Myceliums unterworfen wird. Die Nährlösung besteht im wesentlichen aus einer Kohlenstoff und einer Stickstoffquelle z. B. einem Kohlehydrat, wie Glucose, Maltose oder Stärke, und einer organischen Stickstoffquelle, wie Maisquellwasser oder Hefeextrakt, Eiweißhydrolysaten, Aminosäuren oder einer anorganischen Stickstoffquelle, z. B. Ammoniumsalzen oder Alkalimetallnitraten. Dem Medium, das das zu oxydierende Steroid und eine oder mehrere der vorerwähnten Nährquellen enthält, kann gewünschtenfalls noch ein Antischaummittel z. B. Glycerylmonostearat zugesetzt werden. Die geeigneteste Gärtemperatur liegt gewöhnlich zwischen 20 und 28'C, obgleich höhere oder niedrigere Temperaturen zwischen 15 und 35°C im allgemeinen auch brauchbar sind. Die zur Umwandlung des Retro-steroids erforderliche Zeit kann zwischen weiten Grenzen schwanken, aber gewöhnlich ist eine Oxydationsperiode von 10 bis 48 Stunden optimal für eine vollständige Umwandlung. Das nach Beendigung des Oxydationsvorganges erhaltene 17ß-Hydroxy-retro-steroid kann auf übliche Weise aus dem Medium und/oder dem Mycelium abgetrennt werden, z. B. mit nicht mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmitteln, wie Diäthyläther, Äthylacetat, Amylacetat, Methylisobutylketon oder anderen Estern und Ketonen. Insbesondere Methylisobutylketon eignet sich als Extraktionsmittel. Das so erhaltene Steroid kann auch durch chromatographische Verfahren allein oder in Kombination mit Extraktionsverfahren aus den Gärmedium abgetrennt und gereinigt werden.The conversion according to the invention is preferably carried out with cultures of the Sporormiaarten or carried out with the oxidizing enzyme systems of the same. aside from that however, it is also possible to carry out the transformation with conidia from Sporormia. For this purpose z. B. first a culture of the fungus species under aerobic conditions Developed in a nutrient solution, whereupon a fermentation medium containing the retro-steroid to be converted and which can be added in solution or suspension to the oxybion tables Dissimilation action of the resulting mycelium is subjected. The nutrient solution consists consisting essentially of a carbon and a nitrogen source e.g. B. a carbohydrate, such as glucose, maltose or starch, and an organic nitrogen source such as corn steep liquor or yeast extract, protein hydrolysates, amino acids or an inorganic nitrogen source, z. B. ammonium salts or alkali metal nitrates. The medium that is to be oxidized Steroid containing one or more of the aforementioned nutrient sources can if desired another antifoam z. B. glyceryl monostearate can be added. The most suitable Fermentation temperature is usually between 20 and 28'C, although higher or lower Temperatures between 15 and 35 ° C are generally also useful. The conversion The time required for the retro steroid can vary between wide limits, however usually an oxidation period of 10 to 48 hours is optimal for a complete one Conversion. The 17β-hydroxy-retro-steroid obtained after the end of the oxidation process can be separated from the medium and / or the mycelium in a conventional manner, e.g. B. with water-immiscible, organic solvents such as diethyl ether, Ethyl acetate, amyl acetate, methyl isobutyl ketone or other esters and ketones. In particular Methyl isobutyl ketone is suitable as an extractant. The steroid thus obtained can also be done by chromatographic methods alone or in combination with extraction methods separated from the fermentation medium and cleaned.

Das Verfahren nach der Erfindung kann auch dadurch durchgeführt werden, daß Konidien von Sporormiaarten auf wäßrige Dipersionen der erwähnten Ausgangs-Retro-steroide einwirken.The method according to the invention can also be carried out by that conidia of Sporormia species on aqueous dispersions of the aforementioned starting retro-steroids act.

Die Erfindung wird an Hand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert. Beispiel I Umwandlung von Retro-progesteron in Retro-testosteron in Schüttelkolben.The invention is explained in more detail by means of the following examples. Example I Conversion of retro-progesterone to retro-testosterone in shake flasks.

Eine Nährlösung mit 20 g eingedicktem Maisquellwasser, 15 g Glucose und 6 g Hefehydrolysat pro 1000 ml Leitungswasser wurde nach dem Einstellen auf einen pH-Wert von 6,6 und nach Sterilisierung bei 120°C während 20 Minuten mit einer auf Malzagar gewachsenen Kultur von Sporormia pollaccii in Anteilen von 250 ml in Schüttelkolben von 1000 ml geimpft. Diese Impfungskulturen wurden nach 48stündigem Schütteln (250 Umdrehungen je Minute) bei 26°C weitergeimpft (Impfungsstärke 5 °/n), und zwar in 12 Erlenmeyerkolben von 2000 ml mit je einer sterilisierten Nährlösung von 1000 ml, bestehend aus Maisquellwasser 0,3 °/o (berechnet auf den trockenen Stoff), Glucose 0,40/,), Glyceryhnonostearat 0,04°/0; pH = 6,8 (mit 2n Natriumhydroxydlösung). Diese Kulturen wurden 24 Stunden unter den vorerwähnten Bedingungen rotiert, worauf unter aseptischen Bedingungen jeder Kultur 200 mg Retroprogesteron in 10 ml Glycohnonomethyläther (bekannt unter dem Handelsnamen Methylcellosolve) zugesetzt wurde. Nach 48stündigem Schütteln wurde die Gärung bei einem pH von 4,6 unterbrochen, nachdem papierchromatographisch (System Benzol-Formamid) gezeigt war, daß die Umwandlung in Retro-testosteron praktisch vollständig stattgefunden hatte. Die Schüttelkulturen wurden vereinigt und durch Filtrieren von dem Mycelium befreit. Das Kulturfiltrat (121) wurde dreimal mit 2400 ml Methylisobutylketon extrahiert und dann im Vakuum auf 300 ml eingedampft. Diese Menge wurde weiter mit 30 ml 1 n-Natriumhydroxydlösung, 30 m10,01 n-Natriumhydroxydlösung und schließlich dreimal mit 30 ml destilliertem Wasser gewaschen. Der eingedampfte und gewaschene Extrakt wurde darauf mit Kohle entfärbt und schließlich bis zu einem weißen, kristallinen Rückstand eingedampft. Dieser Rückstand wurde in 5 ml siedendem Aceton gelöst, worauf 15 ml Heptan zugesetzt wurden. Nach Abdestillieren des Acetons kristallisierte 1,56 g Retro-testosteron aus. Dieser Vorgang wurde wiederholt, wobei 1,3 g reines Retro-testosteron mit einem Schmelzpunkt von 153,5 bis 154,5°C erhalten wurde; [x]ö° = -150° (c = 1, Chloroform). Beispiel 11 Umwandlung von Retro-progesteron in Retro-testosteron in Gärbottichen Eine nach Beispiel I erhaltene, 48stündige Impfkultur von Sporormia pollaccii von 2000 ml wurde in einen Gärbottich von 601 gebracht, der mit einem Rührer und einem Ärator versehen war und der 401 Nährmedium enthielt, das aus einer sterilisierten Lösung von 200 g Maisquellwasser (berechnet auf den trockenen Stoff), 200 g Glucose, 12,5 g Glycerylmonostearat in Leitungswasser (pH = 6,4 mit 2n Natriumhydroxydlösung) bestand. Nach 24stündiger Inkubation bei 25°C (Umdrehungszahl 140 pro Minute; Luftzufuhr 101 pro Minute) wurden 13,4 g Retro-progesteron, in 450 ml Aceton gelöst, unter aseptischen Bedingungen zugesetzt, worauf die Gärung noch 24 Stunden fortgesetzt wurde. Das Kulturfiltrat wurde auf die im Beispiel I erwähnte Weise verarbeitet. Nach der Doppelumkristallisierung mittels Aceton-Heptan wurde das kristalline Endprodukt (7,2 g) noch dadurch umkristallisiert, daß er in 30 ml Methanol gelöst, mit Kohle behandelt, filtriert, mit Methanol bis auf 50 ml verdünnt und dann unter Erwärmen 50 ml destilliertes Wasser beigefügt wurden. Nach Abkühlung trennten sich aus dieser Lösung 6 g reines Retro-testosteron ab. Aus den Mutterlaugen wurden noch 800 mg Endprodukt ausgeschieden. Das Endprodukt wies die gleichen physikalischen Konstanten auf wie im Beispiel I.A nutrient solution with 20 g of concentrated corn steep water, 15 g of glucose and 6 g of yeast hydrolyzate per 1000 ml of tap water was after adjustment to a pH of 6.6 and after sterilization at 120 ° C for 20 minutes with a culture of Sporormia grown on malt agar pollaccii in portions of 250 ml in shake flasks of 1000 ml. After shaking for 48 hours (250 revolutions per minute), these inoculation cultures were further inoculated at 26 ° C (vaccination strength 5 ° / n), in 12 Erlenmeyer flasks of 2000 ml each with a sterilized nutrient solution of 1000 ml, consisting of corn steep water 0.3 ° / o (calculated on the dry substance), glucose 0.40%,), glyceryl non-stearate 0.04%; pH = 6.8 (with 2N sodium hydroxide solution). These cultures were rotated for 24 hours under the aforementioned conditions, after which 200 mg of retroprogesterone in 10 ml of glyconomethyl ether (known under the trade name methylcellosolve) was added to each culture under aseptic conditions. After 48 hours of shaking, fermentation was interrupted at a pH of 4.6 after paper chromatography (benzene-formamide system) had shown that the conversion to retro-testosterone had taken place practically completely. The shaking cultures were pooled and the mycelium removed by filtration. The culture filtrate (121) was extracted three times with 2400 ml of methyl isobutyl ketone and then evaporated to 300 ml in vacuo. This amount was further washed with 30 ml of 1N sodium hydroxide solution, 30 ml of 10.01 N sodium hydroxide solution and finally three times with 30 ml of distilled water. The evaporated and washed extract was then decolorized with charcoal and finally evaporated to a white, crystalline residue. This residue was dissolved in 5 ml of boiling acetone, followed by the addition of 15 ml of heptane. After the acetone had been distilled off, 1.56 g of retro-testosterone crystallized out. This process was repeated to obtain 1.3 g of pure retro-testosterone with a melting point of 153.5 to 154.5 ° C; [x] δ ° = -150 ° (c = 1, chloroform). Example 11 Conversion of retro-progesterone into retro-testosterone in fermentation vats A 48-hour inoculation culture of Sporormia pollaccii of 2000 ml obtained according to Example I was placed in a fermentation vat of 601 which was provided with a stirrer and an aerator and which contained 401 nutrient medium, which consisted of a sterilized solution of 200 g corn steep liquor (calculated on the dry substance), 200 g glucose, 12.5 g glyceryl monostearate in tap water (pH = 6.4 with 2N sodium hydroxide solution). After incubation for 24 hours at 25 ° C. (number of revolutions 140 per minute; air supply 101 per minute), 13.4 g of retro-progesterone, dissolved in 450 ml of acetone, were added under aseptic conditions, after which fermentation was continued for a further 24 hours. The culture filtrate was processed in the manner mentioned in Example I. After double recrystallization using acetone-heptane, the crystalline end product (7.2 g) was recrystallized in that it was dissolved in 30 ml of methanol, treated with charcoal, filtered, diluted with methanol to 50 ml and then 50 ml of distilled water with heating were attached. After cooling, 6 g of pure retro-testosterone separated from this solution. Another 800 mg of end product were excreted from the mother liquors. The end product had the same physical constants as in Example I.

Claims

Claims: 1. Process for the production of 17ß-hydroxyretro- (10a-methyl-9ß) -steroids, d a d u r c h g ek e n n z e i c h n e t that a compound of the d 4-3-keto-20-hydroxy- or d 4-3,20-diketo-10a-methyl-9ß-pregnane (so-called retropregnane) series in an known manner with a culture of a microorganism of the species Sporormia or their oxidizing enzyme systems are incubated under normal aerobic conditions.

2. Process according to Claim 1, characterized in that the conversion with Sporormia pollaccii (elysei), Sporormia fasciculata, Sporormia leporina or Sporormia montana is carried out.