DE1178172B

DE1178172B - Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Siomycin

Info

Publication number: DE1178172B
Application number: DES76614A
Authority: DE
Inventors: Haruo Nishimura
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1960-11-10
Filing date: 1961-11-08
Publication date: 1964-09-17

Description

Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Siomycin Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, des Siomycins; dieses Verfahren setzt sich aus der Herstellung des Siomycins auf fermentativem Wege und aus der Gerinnung und Konzentration aus rohen Lösungen, wie der Fermen tationsbrühe, und dessen Reinigung zusammen. Dies so erzeugte Produkt ist besonders nützlich bei der Bekämpfung von pathogenen Mikroorganismen.

Das erfindungsgemäß hergestellte neue Antibiotikum ist ähnlich dem von V a n d e p u t t e und Mitarbeitern isolierten Thiostrepton mit den Unterschieden in der spezifischen Rotation, in der Aminosäurezusammensetzüng und im Verhalten bei der Papierchromatographie. Das neue Antibiotikum bildet sich beim Züchten unter kontrollierten Bedingungen einer neuen Art Mikroorganismus, welcher in der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Nummer ATCC 13989 deponiert und als Streptomyces sioyaenis n. sp. benannt wurde. Dieser Organismus wurde vor kurzem aus einer Erdprobe isoliert und wies die folgenden mikrobiologischen Charakteristiken auf Morphologische Charakteristiken Die morphologischen Eigenschaften des Stammes wurden auf Glukose-Asparagin-Agar beobachtet, und genauere Feststellungen wurden mit Hilfe der Agar-

Züchtungseigenschaften

Medium Wachstum und Charakteristiken der Bakteriengruppe

Sporenbildung

Oberfläche Schärfe Höhe

Synthetisches Agar . . . . . . . . . . . ausgezeichnet) pulverförmig, I vollkommen f -

konzentrierte I

Ringe

Glukose-Asparagin-Agar ...... ausgezeichnet pulverförmig, fimbrig kissenartig bis

konzentrierte konvex

Ringe

Calciummalat-Agar ........... ausgezeichnet") dicht ` vollkommen konvex

pulverförmig

Nährstoff Agar . . . . . . . . . . . . . . . gemäßigt kleine Kolonne - -

Glukosebouillon-Agar . . . . . . . . . ausgezeichnet) pulverförmig, zerrissen bis kopfförmig bis

konzentrierte ohrförmig polsterartig

Ringe

*) An der Oberfläche des Aeralmyceliums erschienen einige klare Tropfen; diese Oberfläche wurde aber nicht feucht und hygro-

skopisch.

**) Es wurde eine klare Zone beobachtet.

Zylindermethode (s. N i s h i m u r a und Mitarbeiter, Ser. A, 10 [5], S. 227 [1957]) gemacht. Die mikroskopische Beobachtung des aeralen Myzeliums ist durch die Bildung von Hauptstangen mit unregelmäßigen Nebenabzweigungen charakterisiert. Die meisten Sporophoren sind geradlinig bis gekrümmt, und es wurden offene Schlingen teilweise beobachtet.

(Fortsetzung)

Medium Wachstum und Charakteristiken der Bakteriengruppe

Sporenbildung

Oberfläche Schärfe Höhe

I

Glukosepepton-Agar .......... ausgezeichnet pulverförmig, vollkommen knopfartig

konzentrierte in der Mitte

Ringe

Kartoffel-Glukose-Agar ....... ausgezeichnet) pulverförmig vollkommen konvex bis

bis samtartig polsterartig

Löslicher Stärke-Agar . . . . . . . . . gut pulverförmig, vollkommen konvex

konzentrierte

Ringe

Getreidestärke-Agar .......... keine - - -

Glycerol-Asparagin-Agar ...... ausgezeichnet pulverförmig, fimbrig bis konvex

Ringe zerrissen

skopisch.

Wachstumtypus auf Glukosebrühe: Ringtypus, Spuren eines Niederschlages, kein lösliches Pigment.

Physiologische Charakteristiken

1. Farbmerkmale

Medium Aerales Mycelium 1 Substratmycelium Lösliches Pigment

Synthetisches Agar (Czapeks Agar) . . . . . . . . . . . . . weiß hellorange hellorange

Glukose-Asparagin-Agar ... « .................. weiß rotgelb hellgelb

Calciummalat-Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . weiß gelblichorange bis hellgelborange

dunkelorange

Nährstoff Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . gelblichweiß hellgelb bis hell- kein

gelblichbraun

Glukosebouillon .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . weiß stumpfes gelb- kein

orange

Glukose-pepton-Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . weiß dunkelgelb hellgelb bis hell-

gelblichbraun

Kartoffel-Glukose-Agar ....................... weiß dunkelgelb kein

Löslicher Stärke-Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . weiß hellgelb kein

Glycerol-Asparagin-Agar . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . weiß bis rotgelb bis kein

gelblichweiß gelborange

z. Biologische Charakteristiken

Eigenschaft Ergebnis

Säurebildung auf Glukose

(nach 10tägiger Inkuba-

tion bei 28°C) ........ negativ

Nitratreduktion . . . . . . . . . positiv, relativ stark

Tyrosinasereaktion ...... negativ

Gelatineverflüssigung .... negativ

Cellulosereaktion ........ negativ

Stärkehydrolyse ......... positiv in löslicher

Stärke und Kartoffel-

stärke, negativ in

Getreidestärke

Die Benutzung der Kohlenstoff- und Stickstoffquellen durch die Organismen ist aus der folgenden Tabelle zu entnehmen, worin die Zeichen »+« und Wachstum in Funktion der Temperatur: Gutes Wachstum bei 28°C, kleines Wachstum bei 37`C, kein Wachstum bei 45'C. »++« eine ansteigende Benutzung anzeigen und das Zeichen »-« angibt, daß keine Quelle benutzt wurde.

Kohlenstoffquellen

g bnis Stickstoffquellen gebnis

Glycerin . . . . . . . . -@- @- dl-Alanin . . . . . . . -

Glukose ........ -@@- 1-Asparaginsäure .. ++

d-Galactose ..... -- 1-Histidin . . . .

Sucrose ........ - Glycin .......... 4--+

Maltose ........ T- 1-Arginin ........ -')-+

Lactose ........ 1-Prolin ......... + +

Raffinose ....... - dl-Valin . . . . . . . . . . ++

Dextrin . . . . . . . . +-t- 1-Leucin . . . . . . . . . . ++

Inulin .......... - I-Phenylalanin ... .

Mannose ....... ---- 1-Glutaminsäure. . . +-t-

d-Mannitol ..... -r+ Natriumnitrat .... ++

dl-Inositol ...... '-+ Ammoniumbi-

phosphat....... + +

(Fortsetzung)

Kohlenstoffquellen Ig bnis I Stickstoffquellen ckstoffquellen Igebnis

Lösliche Stärke . . ++ dl-Methionin ..... +

Kartoffelstärke .. ++ Harnstoff ........ +

d-Xylose ....... + Natriumnitrit ..... -

1-Rhamnose ..... +

1-Arabinose .... . -

d-Fructose...... -

Getreidestärke .. -

Salicin ......... -

Eigenschaften Streptomyces Streptomyces albus Streptomyces albus

sioyaensis n. sp. (ATCC 3004) (ATCC 3351)

Morphologie des aeralen Myceliums . .. . . . . . . . . . Hauptstengel- keine Form keine Form

form

Oberfläche der Gruppe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..... es erscheinen kein kein

klare Tropfen Erscheinen Erscheinen

und typische

konzentrierte

Ringe

Wachstumtypus auf Glucosebrühe . . . . . . . . . . . . . . Ringtypus Ring ->- Pzlli- Ring -r Pelli-

kültypus kültypus

Gelatineverflüssigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... negativ positiv (stark) positiv (stark)

Getreidestärke-Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . kein Wachstum schwaches schwaches

Wachstum Wachstum

Glucose-Asparagin-Agar ..... .. .. .. . ..... . ... . SM rotgelb; SM hellgelb; SM hellolive;

LP hellgelb LP kein LP kein

Czapeks Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . . . . . AM weiß; AM grauweiß; AM gelbgrau;

SM hellorange' SM grauweiß "SM hellgelb

Calciummalat-Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . AM weiß; AM gelblich- AM gelblich-

SM gelborange; weiß; grau;

LP hellgelb- SM gelblichgrau; SM hellgelb;

orange LP kein LP kein

Glucosebouillon-Agar . .. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . .. AM weiß; AM gelblich- AM gelblich-

SM trübes weiß; braun;

gelborange SM hellgelblich- SM hellgelblich-

' braun braun

Glucose-Pepton-Agar . ...... .. ...... ....... ... SM dunkelgelb; SM hellgelb; SM hellgelb;

LP hellgelb bis LP kein LP kein

hellgelbbraun

Bemerkung: SM = Substratummycelium, AM = aerales Mycelium, LP = lösliches Pigment.

Der Mikroorganismus, Streptomyces sioyaensis, kann auch von dem Thiostrepton erzeugenden Stamm, Streptomyces azureus, unterschieden werden, wie die folgende Tabelle zeigt:

Eigenschaften

Streptomyces sioyaensis Streptomyces azureus

Verwendung von Kohlenstoffquellen . . . .. . . . . . .... kleines Wachstum: Xy- Gutes Wachstum: Arabi-

lose, Rhamnose; nose, Rhamnose, Xylose,

kein Wachstum: Arabinose, Fructose;

Fructose, Salicin kleinesWachstum: Saliein

Verwendung von Natriumnitrit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . kein Wachstum gutes Wachstum

Reduktion des Nitrats ...... . ... . .. . . . . . . . . . . . . . . positiv (stark) negativ

Czapek-Dog-Agar ...... . .... . ........ . . ... . . ... Schärfe der Gruppe: Schärfe der Gruppe: voll-

fimbrig bis zerrissen. kommen.

AM braunweiß; ' AM weiß mit rauchgrauen

Rückseite: gelbbraun bis blauen Flecken;

Rückseite: hellolive Haut

mit dunkelgrauen Flecken

Unter den vielen Arten von Streptomyces, beschrieben in Bergeys »Manual of Determinative Bacteriology«, Waksman and Lechevaliers »Actinomycetes and their Antibiotics« und in den anderen Literaturen, scheint Streptomyces albus dem Mikroorganismus Streptomyces sioyaensis n. sp. im weißlichen Aeral-Mycelium ähnlich zu sein. Dagegen kann der Stamm von der Art Streptomyces albus unterschieden werden. Unterscheidende Charakteristiken sind in der folgenden Tabelle aufgenommen und basieren auf wirklichem Vergleich mit zwei Stämmen von Streptomyces albus, ATCC 3004 und ATCC 3351.

(Fortsetzung)

Eigenschaften

Streptomyces sioyaensis Streptomyces azureus

I

Nährstoff-Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rückseite: hellgelb bis LP braun;

hellgelblichbraun; Rückseite: hautbraun

LP kein

Sabouraud-Agar . .......... . . ...... .. . . ..... . . . . Rückseite: dunkelgelb- Rückseite: ockergelb-

orange; braun bis marchbraun;

' LP hellgelblichbraun LP braun

Sojabohne-Infusions-Agar ....................... Schärfe der Kolonie: Schärfe der Kolonie:

fimbrig bis zerrissen. vollkommen.

AM weiß; AM weiß bis hellgrau;

Rückseite: dunkel- LP kein;

gelborange; Rückseite: hellolive Haut

LP stumpfgelb

Henricis Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Schärfe der Gruppe: Schärfe der Gruppe:

fimbrig. vollkommen.

AM weiß; AM weiß bis stumpfgrau;

Rückseite: hellgelb Rückseite: schwarzbraun

Bierhefe-Agar .................................. gutes Wachstum; leichtes Wachstum;

Rückseite: hellgelb Rückseite: avellaneous

Bemerkung: AM = aerales Mycelium, LP = lösliches Pigment.

Als Ergebnis der oben angeführten Beobachtungen, wurde der Mikroorganismus einer neuen Art zugeordnet und mit Streptomyces sioyaensis n. sp. benannt.

Es soll bemerkt werden, daß die Herstellung von Siomycin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht an die Verwendung von Streptomyces sioyaensis n. sp. begrenzt ist. Es ist insbesondere erwünscht und beabsichtigt, die Verwendung von Siomycin produzierenden Varianten mit einzuschließen, welche Varianten aus dem beschriebenen Organismus mit Hilfe verschiedener Mittel, wie Röntgenstrahlen, Ultraviolettstrahlen und Stickstoffsenfgas, hergestellt werden.
In Obereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wird das neue Antibiotikum Siomycin während der Züchtung des Mikroorganismus Streptomyces sioyaensis n. sp. in einem wäßrigen Nährmedium bei einer Temperatur von etwa 25 bis 30°C, vorteilhafterweise um 27°C, unter aeroben Bedingungen hergestellt.
Die Zusammensetzung dieses Nährmediums kann innerhalb weiter Grenzen variieren. Im wesentlichen sind eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Spuren von anorganischen Elementen erforderlich. Beispiele geeigneter Kohlenstoffquellen sind Stärke, Glucose, Glycerin, Dextrin, Maltose, Fructose, Sucrose, Lactose und Melasse. Geeignete Stickstoffquellen für den Fermentationsprozeß umfassen Fleischextrakte Pepton, Getreidequellwasser, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Weizenkleber, Baumwollsamenmehl und Hefeextrakte. Beispiele geeigneter Quellen von anorganischen Elementen sind Mineralsalze, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und Kaliumphosphat. Im folgenden wird als Beispiel eine Zusammensetzung eines geeigneten Nährmediums angef ührt.
Glycerin ....................... 5 g/1 Kartoffelstärke . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 g/1 Getreidequellwasser . . . . . . . . . . . . . 5 g/1 Sojabohnenmehl . . . . . . . . . . . .. . . 3 g/1 Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 g/1 Calciumcarbonat ............... 3,51 Das Nährstoffmedium wird auf etwa pH 7 vor dem Einimpfen des Mikroorganismus eingestellt. Falls ein übermäßiges Schäumen während der Fermentation eintritt, können Antischaummittel, wie pflanzliche Öle, dem Fermentationsmedium hinzugesetzt werden. Das PH neigt während der Fermentation eher konstant zu bleiben, falls aber Änderungen des PH eintreten, kann ein Puffer, wie Calciumcarbonat, dem Medium hinzugefügt werden. Die maximalen Ausbeuten des Antibiotikums Siomycin können innerhalb von 72 bis 120 Stunden Fermentationsdauer unter optimalen Temperatur- und Belichtungsbedingungen erhalten werden; in der so erhaltenen Fermentationsbrühe ist das Antibiotikum in einer Menge von etwa 40 mg/ml enthalten.
Nach erfolgter Züchtung des Mikroorganismus kann das Myzell aus der Fermentationsbrühe unter Benutzung von üblichen Hilfsmitteln, wie Filterpressen und Zentrifugen, entfernt werden, worauf dann das Antibiotikum Siomycin aus dem Filtrat mit Hilfe eines Lösungsmittel-Extraktionsverfahrens gewonnen werden kann. Da das Antibiotikum Siomycin durch das Myzell in größeren Mengen zurückbehalten wird, wird vorteilhafterweise ein Lösungsmittel-Extraktionsverfahren, zwecks Gewinnung des Antibiotikums aus dem Myzell oder aus der rohen Brühe ohne Entfernen des Myzells angewendet. Geeignete Extraktionslösungsmittel umfassen Dioxan, Chloroform, N,N-Dimethylacetamid und Eisessigsäure. Für die Extraktion des Antibiotikums aus größeren Brühevolumen ist dagegen ein Adsorptionsverfahren einem gewöhnlichen Lösungsmittel-Extraktionsverfahren vorzuziehen. Die ganze Brühe kann z. B. nach Hinzugabe eines Adsorptionsmittels, wie Kieselgur der Handelsmarke »Hyflo Super-Cela, filtriert und der resultierende Kuchen des Adsorptionsmittels und des Myzells mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Chloroform und Dioxan, zwecks Extraktion des Antibiotikums eluiert werden. Der Extrakt kann konzentriert werden, worauf zu diesem Konzentrat ein geeignetes organisches Lösungsmittel, wie Petroläther und Hexan, zwecks Ausfällung der rohen aktiven Komponente hinzugegeben wird.
Die so erhaltene rohe aktive Komponente wird weiter mittels geeigneter Operationen, wie Rekristallisieren, Chromatographieren u. ä., gereinigt. Beispiele geeigneter Rekristallisationslösungsmittel sind Dioxan, Chloroform, Methanol, Äthanol, Butanol usf. Die bevorzugten Adsorbentien zur Durchführung der Chromatographie sind Tonerde, Silicagel, Kieselsäure u. ä.
Das Antibiotikum Siomycin ist ein gelblichweißer oder weißer kristalliner Feststoff, welcher bei etwa 200°C dunkel wird und unter Zersetzen bei etwa 255 bis 260°C schmilzt. Er ist in Dioxan, Chloroform, N,N-Dimethylacetamid und Eisessigsäure löslich, in Methanol, Äthanol, Butanol und Propylenglycol leicht löslich und in Äthern, Aceton, Benzol, Hexan und Petroläther unlöslich.

Die Elementaranalyse für Siomycin ist die folgende: Gefunden: C 49,26 °/o, H 5,40 °/o, N 14,610/" S 8,35 °/o, O 22,38 °/a (durch Differenz). Die spezifische Rotation von Siomycin ist [x]D3 --- -90,9-- 2° (c = 1,017°/o in Dioxan). Das Ultraviolettabsorptionsspektrum in Methanol zeigt kein Maximum (s. die F i g. 1). Das Infrarotabsorptionsspektrum in einem Nujolmull zeigt die folgenden Frequenzen: 3,05, 5,75, 6,02, 6,12, 6,31, 6,35, 6,60, 6,74, 7,07, 7,24, 7,31, 7,41, 7,58, 7,73, 7,83,

Eigenschaften 1 Siomycin 1 Thiostrepton

Schmelzpunkt (Zersetzung) . . .. . . ..... . ......... .. dunkler bei etwa 200°C dunkler bei etwa 200°C

und schmilzt unter Zer- und schmilzt unter Zer-

setzung bei etwa 255 bis setzung bei etwa 246 bis

260°C 255°C

Elementaranalyse ............................... C 49,26; H 5,40 C 49,56; H 5,61

N 14,61; S 8,35 N 14,63; S 8,38

Spezifische Rotation . . . . . . .. ..... . ...... ...... .. [a]D = -90,9 +2° [a]D = -60,2 -I-4°

(c = 1,017 % in Dioxan) (c = 0,548 °/o in Dioxan)

Aminosäurezusammensetzung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Valin, Alanin, Threonin, Leucin (oder Isoleucin),

Cystin Alanin, Threonin, Cystin

Rf-Wert für ein Gemisch von Methanol-Essigsäure- 0,12 bis 0,14 0,38 bis 0,40

Wasser (25:3:72) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (einzelner Fleck) (einzelner Fleck)

Das erfindungsgemäß hergestellte Siomycin zeigt eine Aktivität gegenüber einer Vielfalt von Mikroorganismen; die folgende Tabelle veranschaulicht das antibiotische Spektrum von Siomycin, im Vergleich mit dem des Thiostreptons, an Hand von durchgeführten Testen gegenüber einer Vielfalt solcher Mikroorganismen.

Testierte Organismen Minimale Inhibitorkonzentration (mcg/ml)

Siomycin I Thiostrepton

1. Staphylococcus aureus, 209 P ....... . ......... 0,05 0,1

z. Bacillus subtilis, PCI-219 ... . .... . ... ......... 0,05 0,1

3. Sartinalutea .......................... . ..... 0,05 0,05

4. Bacillus anthracis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 j 0,2

5. Diplococcus pneumoniae, Typus 1 . . . . . . . . . . . . . 0,005 0,01

6. Diplococcus pneumoniae, V-Typus 1 . . . . . . . . . . . 0,005 0,01

7. Diplococcus pneumoniae, Typus 11 . . . . . . . . . . . . 0,005 0,01

B. Diplococcus pneumoniae, Typus III . . . . . . . . . . . 0,005 0,005

9. Stroptococcus hemolyticus, D . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,01 0,02

10. Streptococcus hemolyticus, HA . . . . . . . . . . . . . . . 0,01 0,02

11. Corynebacterium diphtheriae, Tront . . . . . . . . . . . 0,005 I 0,01

8,09, 8,29, 8,54, 8,67, 8,80, 8,96, 9,12, 9,44, 9,67, 9,77, 10,19, 10,35, 10,51, 10,71, 10,97, 11,27, 11,72, 12,36, 12,85, 12,93, 13,14, 13,51 und 13,64. #t (s. F i g. 2).

Das erfindungsgemäß hergestellte Antibiotikum gibt negative Molisch- und positive Biuret- und Fehlingteste. Die Säurehydrolysate geben einen starken Ninhydrintest.
Die Papierchromatographieanalyse von Siomycin, welches mit 6 n-Chlorwasserstoffsäure während 24 Stunden bei 100°C hydrolysiert wurde, zeigt die Gegenwart von einigen ninhydrinpositiven Komponenten an; folgende dieser Komponenten sind identifiziert worden: Alanin, Valin, Threonin und Cystin.
Ein Papiergrammbioautograph von Siomycin in einem Gemisch von Methanol-Essigsäure-Wasser im Verhältnis von 25:3:72 zeigt einen Rf-Wert von 0,12 bis 0,14.

Die für Siomycin beobachteten physikalischen und chemischen Eigenschaften, verglichen mit jenen der anderen Antibiotica, lassen die Existenz von sehr ähnlichen Merkmalen des Thiostreptons erkennen. Es wurde dagegen gefunden, daß die Substanzen des Siomycins im Vergleich mit Thiostrepton nicht identisch sind. Die folgende Tabelle gibt die beobachteten Eigenschaften des Siomycins im Vergleich mit jenen des Thiostreptons an.

(Fortsetzung)

Testierte Organismen Minimale [nhibitorkonzentration (mcg ml)

Siomycin Thiostrepton

12. Corynebacterium diphtheriae, S . . . . . . . . . . . . . . . 0,005 0,01

13. Mvcobacterium tuberculosis var. hominis ...... 2,0 5,0

14. Mycobacterium smegmatis, H 37 RV . . . . . . . . . . . 2,0 2,0

15. Mycobacterium phlei ........... « ............ 2,0 2,0

16. Mycobacterium avium . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .... 20,0 > 20,0

17. Mycobacterium 607 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0 > 20,0

18. Candida albicans ............................ > 20,0 > 20,0

19. Escherichia coli, Umezawa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . > 20,(l > 20.0

20. Salmonella typhosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . > 20,0 > 2(l,0

21. Salmonella paratyphi A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . > 20,0 > 20,0

22. Shigella dysenteriae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . > 20,0 > 20,0

23. Shigella paradysetiteriae, Ohara . . . . . . . . . . . . . . > 20,0 > 20,0

Kulturmedium .-1 bis 4 und 19 bis 23 Rindfleischextrakt; 5 bis 12 Rindfleischextrakt - 10°/o Kaninchenblut; 13 Kirchner - 10°/o menschliches Plasma; 14 bis 18 Rindfleischextrakt - Glycerin.

Testmethoden 1 bis 12 und 14 bis 23 Agarstreifenlösungsmethode; 13 unter Oberflächenkultur. Beobachteter Endpunkt: 1 bis 12 und 19 bis 23 kein Wachstum nach 24 Stunden bei 37`C; 13 kein Wachstum nach 3 Wochen bei 37 c C; 14 bis 17 kein Wachstum nach 48 Stunden bei 37`C; 18 kein Wachstum nach 72 Stunden bei 27'C.
Aus der oben angeführten Tabelle ist ersichtlich, daß Siomycin hochaktiv gegenüber grammpositiven Bakterien und Mikrobakterien mit kleiner oder mit keiner Aktivität gegenüber grammnegativen Bakterien oder Candida species ist. Das antibakterielle Spektrum von Siomycin ist ganz identisch mit jenem des Thiostreptons. Dagegen wurde ein quantitativer Unterschied beobachtet; mit den empfindlichen Mikroorganismen wurde nämlich festgestellt, daß Siomycin ungefähr die zweifache Aktivität des Thiostreptons besitzt.

Wegen seiner Aktivität in vitro gegenüber grammpositiven Bakterien wurde ein chemotherapeutischer Test an Mäusen mit einer experimentellen Infektion mit Diplococcus pneumoniae angesetzt. Zu diesem Zwecke wurden Gruppen von zehn Mäusen vom Gewicht von 10 bis 18 g durch intraperitonale Injektion von 100 MLD (minimale todbringende Dosis) von Diplococcus pneumoiae, Typ I, infiziert. Die Mäuse wurden 3, 24, 48, 72 und 96 Stunden nach der Infektion behandelt und die infizierten Mäuse, welche noch 10 Tage nach der Infektion, das ist bei Beendigung des Experiments, überlebten, wurden registriert. Eine wäßrige Lösung von Siomycin wurde wie folgt hergestellt: Das Antibiotikum wurde in N,N-dimethylacetamid gelöst und auf die gewünschte Konzentration mit sterilem destilliertem Wasser verdünnt. Die Ergebnisse der Teste sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Anzahl Mittlere

Dosis über- tuale Prozen- effektive

Einführung lebend Wirk- Dosis

mg, kg Tag Anzahl samke-t ED6°

testiert mg!kg

0,5 8/10 80

Subcutan .. 1,0 8/10 80 <0,5

2,0 10/10 100

0,5 810 80

Intravenös 1,0 10/10 100 <0,5

2,0 1011,10 100

Es ist ersichtlich, daß das Siomycin auf intravenösem Wege bei einer Dosis von I mg/kg, bei welcher ein 100°/oiger Schutz für die infizierten Tiere erhalten wird, wirksam ist. Bei subcutaner Verabreichung wird ein 100°/oiger Schutz mit einer Dosis von 2 mg pro Kilogramm Körpergewicht erhalten.

Zur Bestimmung der akuten Giftigkeit (Toxizität) von Siomycin in Säuren wurde eine 40°/oige Lösung des Antibiotikums in N,N-Dimethylacetamin (1:20) mit destilliertem Wasser verdünnt und der Maus vom Gewicht 15 bis 16 g intravenös verabreicht, wonach die Maus 10 Tage beobachtet wurde. Die akute LDso für Mäuse wurde mit 100 mg/kg befunden. Das Siomycin ist somit bemerkenswert weniger giftig als das Thiostrepton, dessen akute LDso für Mäuse etwa 41,7 mg/kg festgestellt wurde (s. Patent 1 007 955).
Demnach ist das neue Antibiotikum Siomycin als Medikament zur Verhinderung des Wachstums von grammpositiven pathogenen Mikroorganismen, wie Streptococalen, Staphylococcalen und Pneumococcalen-Infektionen bei Menschen, nützlich. Es ist auch nützlich zur Sterilisierung von Ausrüstungen, z. B. von chirurgischen Instrumenten, und zum Zwecke der Klassifizierung von Organismen. Das neue Antibiotikum kann man auch mit Vorteil anwenden zur Erzielung von reinen Kulturen des einzelnen Organismus, wobei ein empfindlicher Organismus von einem Resistenten separiert werden kann. Beispiel 201 eines Nährmediums wird aus den folgenden Materialien hergestellt: Glycerin ....................... 5 g/1 Kartoffelstärke . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 g/1 Getreidequellwasser . . . . . . . . . . . . . 5 g/1 Sojabohnenmehl . . . . . . . . . . . . . . . 3 g/1 Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 g/1 Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . 3,5 g/1 Nach Einstellen des Gemisches auf ein pH von 7 wird Dampf durch das Gemisch zwecks Sterilisierung durchgelassen. Dann wird das Nährmedium mit Streptomyces sioyaensis n. sp. geimpft und unter Belüftung 72 bis 120 Stunden bei 27°C unter Schütteln bis zur Erzielung einer Konzentration an Siomycin von 40 mg/ml gezüchtet. Die antibiotische Konzentration in der Fermentationsbrühe wird mit Hilfe der Papierscheiben- oder Tassenmethode (s. E d w i n et al., J. Bacteriology, 50, p. 459 [1945]; N i s h i m u r a et a1., Annual Report of Shionogi Research Laboratory, 11, p. 145 [1961]) unter Benutzung von Staphylococcus aureus, Terashima oder Bacillus subtilis, PCI219, festgestellt.
Ein Gewichtsprozent an Kieselgur der Handelsmarke »Hyflo Super-Cel«c wird zu der das Myzell enthaltenden Fermentationsbrühe hinzugesetzt und das Gemisch auf ein pH von 5,0 mit Chlorwasserstoff= säure eingestellt. Nach 30minutigem Rühren wird das Gemisch unter Saugen filtriert. Der filtrierte, aus dem Hyflo Super-Cel und dem Myzell bestehende Kuchen wird mit Wasser gewaschen, und der gewaschene Kuchen wird dreimal mit Chloroform unter kräftigem Rühren eluiert. Dabei wird jedesmal ein Volumen an Lösungsmittel, welches Volumen etwa einem Zehntel des Volumens der Brühe entspricht, verwendet. Die Chloroformextrakte werden vereinigt und in Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert. Ein rohes Präparat wird durch Ausfällen des konzentrierten Chloroformextraktes mit 5 Volumen Petroläther oder Hexan erhalten. Der Niederschlag wird mit Petroläther gewaschen. Nach Trocknen dieses Niederschlags in einem Vakuum-Desiccator erhält man 1500 mg des gelblichbraunen Pulvers. Dieses getrocknete Pulver von Siomycin wird dann in einer großen Menge pro Form gelöst und filtriert. Das Filtrat wird anschließend in Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert. Dieses Konzentrat wird dann in eine Glaskolonne geschüttet, welche Kolonne chromatographische Tonerde enthielt und durch welche vorher Methanol durchlaufen gelassen wurde. Die Kolonne wird dann mit Chloroform entwickelt. Die aktiven Chloroformfraktionen werden vereinigt und in Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert. Durch die Zugabe von Methanol zur konzentrierten Chloroformfraktion fällt das Siomycin in Form von Kristallen aus. 150 ml des so erhaltenen kristallinen Niederschlags werden durch Auflösen in Dioxan und durch Hingabe von Methanol zu der so erhaltenen Lösung rekristallisiert. Auf diesem Wege erhält man weiße oder leicht gelblichweiße Kristalle von Siomycin.

Claims

Patentanspruch: Die Verwendung von Streptomyces sioyaensis ATCC 13 989 zur Herstellung des Antibiotikums Siomycin auf üblichem biologischem Wege, Gewinnung des Antibiotikums aus dem Kulturfiltrat und Reindarstellung. In Betracht gezogene Druckschriften: Deutsche Auslegeschrift Nr. 1007 955.