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DE1800363A1 - Tsushimycin und seine Herstellung - Google Patents

Tsushimycin und seine Herstellung

Info

Publication number
DE1800363A1
DE1800363A1 DE19681800363 DE1800363A DE1800363A1 DE 1800363 A1 DE1800363 A1 DE 1800363A1 DE 19681800363 DE19681800363 DE 19681800363 DE 1800363 A DE1800363 A DE 1800363A DE 1800363 A1 DE1800363 A1 DE 1800363A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
tsushimycin
growth
none
streptomyces
gray
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE19681800363
Other languages
English (en)
Inventor
Haruo Nishimura
Hideo Otsuka
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shionogi and Co Ltd
Original Assignee
Shionogi and Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shionogi and Co Ltd filed Critical Shionogi and Co Ltd
Publication of DE1800363A1 publication Critical patent/DE1800363A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A45HAND OR TRAVELLING ARTICLES
    • A45DHAIRDRESSING OR SHAVING EQUIPMENT; EQUIPMENT FOR COSMETICS OR COSMETIC TREATMENTS, e.g. FOR MANICURING OR PEDICURING
    • A45D44/00Other cosmetic or toiletry articles, e.g. for hairdressers' rooms
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07GCOMPOUNDS OF UNKNOWN CONSTITUTION
    • C07G11/00Antibiotics
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215Microorganisms
    • Y10S435/822Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

DR. W. G. PFEIFFER
PATENTANWÄLTE
MDNCHEN 23
UNGERERSTR. 25 - TEL. 390236
1336
Shionogi & Co0 LtcL, Osaka, Japan Tsushimycin und seine Herstellung
Zusammenfassung
Ein neues Antibioticum, Tsushimycin, mit antibakteriellen Eigenschaften und geringer Toxizitätj sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben durch Züchten eines !Tsushimycin erzeugenden Microorganismus des Genus Streptomyces in einem wässrigen Nährmediura unter aeroben Bedingungen-, Hydriertes Tsushimycin, das durch katalytische Reduktion erhalten wird, und vergleichbare ο antibakterielle Eigenschaften und Toxizität hat.
Die Erfindung betrifft ein neues wertvolles Antibioticum, das als "Tsushimycin" bezeichnet wird, seine fermentative Erzeugung, Verfahren zu seiner Gewinnung und Anreicherung aus Rohlösungen, z.B. Fermentationsmaischen, und Verfahren zu seiner Reinigung. Die Erfindung umfaßt das Antibioticum in ·
909827/1545
• verdünnter Form, in Form von Rohkonzentraten und in Form reiner Kristalle, Diese neuen Produkte eignen sich ssur Be kämpfung pathogerier Mikroorganismen, insbesondere gram-positiver Bakterien. Sie zeichnen sich durch eine niedrige Toxizität aus, die eine hohe Sicherheit bei ihrer medizinischen Anwendung gewährleistet»
£ Es wurde gefunden, daß Streptomyeesstämme, die in der
Sammlung des Shionogi Research laboratory, Shionogi & Co.p Ltd«, Osaka, Japan mit den Xndexnummern Z-237, Z-242 und N-946 gekennzeichnet wurden und bei der American Type Culture Collection unter den Nummern ATCC 21139? 21140 und 21141 erhätlich sindf ein neues Antibioticum, Tsushimycin, bilden. Gegenstand der Erfindung ist daher vor allem ein neues und wertvolles Antibioticum, das gegen eine Reihe verschiedener Mikroorganismen aktiv ist.
" Die Stämme Z-237 und N-946 wurden aus Bodenproben isoliert, die 1961 auf der Insel Tsushima, Präfectur Nagasaki, Japan genommen wurden» Der Stamm Z-242 wurde aus einer bei Nishinomiyashi, Präfektur Hyogo, Japan 1961 genommenen Bodenprobe isoliert» Die morphologischen Wachstums- und physiologischen Eigenschaften dieser drei Stämme wurden untersucht und mit denen bekannter Species verglichen, die in der Literatur als zum Genus Streptomyces gehörig beschrieben sind.
Als Ergebnis dieser Untersuchung wurden die Stämme Z- 237 und Z--242 BU der Species Streptomyces pseudogriseolus gestellt, während der Stamm N- 946 als eine neue Yarietüt von Streptomyees .ps*2udogriaeolus anzusehen ist und als S'creptomyces pseudogriseolus var«. giucoferaentansj var. nov- bezeichnet wurdec
Charakterisierung von Streptomyces Z--257: λ
Morphologische Merkmale
Die Feststellung der morphologischen Merkmale erfolgte nach 14-tägiger Incubation auf Bennett's /igarmeaium bei 280C wnd nach der Agar-Zylinderkultur- Methode Rishiraura et al: Jo Antibiotics (a), Bd. 10,S. 277 (1957)). Die Struktur der Sporencberfläche wurde mit einem Elektronenmikroskop festgestellt,
Ein pulvrig bis samtartig aussehendes Luftmycel wird in
reichlichem Umfang auf Bennett11 ε-.Agar gebildet, -.uf dem Luftmyael sind Sporphoren ausgebildet. Die Art der Verzweigung der sporulierenden Hyphen gehört, nicht zum Typ Verticillus und ihre Form ,Igt d.le von Spiralan« Die Uporen v/erden in Ketten mit mehr nl-i 10 Coniäen gebij.det und haben ovale bis kurscy" indri Boha Gestalt '0,6 bis 0.8/3 dick- 1,0 bis 1,4/i *'- Die Üi^-Tzn -"borflache ist svaoruig. Sj>;.vangium und elai-oi/e1:! rr-5nd Nicht ^n v -<^z:^:har^ <jr> ■ .;" v'.ühs gilt
909827/1545
für Fragmentation und Sclerotia im Substratmycel,
Die Beobachtungen wurden nach 14-tägiger "Incubaktionsseit "bei 280C gemacht» Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle Ϊ aufgeführt*
903827/15 4
Tabelle X
Medium Merkmal Ergebnis gut
Czapek"s Agar Wachstum gut, bräunlich weiß bis hell
.AM bräunlich grau
hell bräunlich grau
SIl keines
SP gut
Glycerin Czapek' Wachstum gut, bräunlich weiß
Agar AM gelblich grau i
SM keines
SP gut bis mittel
Gluoose-Asparagin Wachstum gering, gelblich grau
Agar /.M gelblich grau
SH- keines
SP gut
Slycerin-Asparsgin- Wachstum "gut bis Mittel, bräunlich
weiß
Agar AM hellbräunliöh grau bis blaß
SxM gelblich braun
keines
SP mittel bis gering
Galciummalatagar Wachstum mittelP grau-weiß
AM
Stärkeagar Nähragar
SM SP
Wachstum
AM
SIi
SP
gelblich grau keines
mittel
mittel, hell bräunlich grau
blaß gelblich braun
keines
Wachstum
AM
SM
SP
909827/154
mittel
gering gelblich grau bis bräunlich weiß blaßgelb bis blaß gelblich braun
keines
Medium Merkmal mittel
faittel bio gsriogs, v/oiß
blaß gelhliah. 'bxaun
keines
BlueosQ-Pepton
Agasf
Waohßtum
AM
SM
SP
gut
mittel ρ bräunlich wai.ß
grauBticIiigea gel's?"
braun
keines
Kartoffel Wachstum
AM
SM
SP
gut
gut, hell bräunlich grau
hell bräunlich grau_biB
bräunlich grau
keines
Bennett's Agar Wachstum
AM
SM
SP
mittel
kein Luftmyoel
blaß braun
keineβ
Gelatinemedium Wachstum
AM
SM
SP
gut
gering» bräunlich weiß
blaß braun
keines ·
Milchmedium Waahstum
AM
SM
SP
909827/1545
MllEJLv Fortsetzung)
Msäium Merkmal Ergebnis i
öellulooeagay
V
Wachstum
AH
SM
SP
kein Wachstum bis
spärlich
Wachstum
Ma 280C
" 450C
gut
gut
(i'lueoaeTarUhe Wachoturns» Ringtyp
AM = Iiuftmyoelg SM = SuTjatratmyoelj Sl? « lösliches Pigment,
909827/1545
Phy si ol qgij3Ghe_EiggjftjBcha £ten
Die Beobachtungen wurden nach 14~tägiger Inkubation bei 280C gemacht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II aufgeführt:
Tabelle II
Merkmal „, , ., fffe
Bildung von mslanoidem Pigment«—«—-———-—-—negativ Tyroßinase-Reaktion·—;~"="^«—-—°-- -——.-—-—-Säurebildung aus Glucose ~--~--~-~--~--.----~«=--..-Nitrat -Re duktlon-·——·>'—-—-—«—r——-_--———-poeitiv Stärkehydrolyse—?-«-=·-———-.——«——.——-—.-positiv Gelatinverflüssigung—-———-— -,—.»«,-,——positiv
Der Mikroorganismus wächst unter aeroben Bedingungen und der optimale pH-Bereich fttr das Wachstum ist 7,0 bis 7»2« Die Verwertung von Kohlenstoffquellen auf dem Grundmedium von Pridharn und Gottlieb durch den Mikroorganismus wurde nach 14-tätiger -Inkubation bei 280C beobachtet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III wiedergegeben, worin.die Bezeichnungen "ψ" und Μ+ψ" zunehmende positive Ver~
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180O363
Wertung und die Bezeichnung "-" keine Verwertung bedeuten. Tabelle III Kohlenstoffquelle
Ergebnis
Glycerin- Glucose Xylose- Inosit'— Mannit— Fructose-- Rhamnose "Galactose- Maltose-- Mannose-—
Arabinose— Saccharose
lactose—— Raffinoae Inulin———«- Sorbit—-=·= Dulcit—-:
Salicin«·— gutes Wachstum
■— dto -·=
dto
dto
dto
.--dto
dto
dto
— ++
dto—--»— ++
——dto———— ++
mittleres Wachstum—·— +
'— -dto — —— +
-. -«. -dto—> — +
Wachstum———— -
909827/15Λ5
Charakterisierung von Streptomyces Z-242: Morphologische Merkmals
Die morphologischen Merkmale wurden wie oben beschrieben ermittelt.
Auf Bennett's Agar wird ein pulvriges bis samtartig aussehendes Luftmycel in reichlichem Ausmaß gebildet. Auf dem Luftmycel bilden sich Sporophoren. Die Verzweigungsart der sporulierenden Hyphen gehört nicht zum Typ Vertieillus und ihre Form 1st die von Spiralen. Die Sporen werden in Ketten mit mehr als 10 Conidien gebildet und ihre Gestalt ist oval bis kurz zylindrisch (0,6 bis O9 dick und 1,0 bis 1t3yji lang). Di® Oberfläche der Sporen ist stachelig. Sporangium und Geiselsporen, sowie Fragmentierung und Sclerotia im Substratmyeel sind nicht zu beobachten.
WachBtumseijgenschaften
Die Wachstumaeigenschaften wurden wie oben beschrieben festgestellt und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV aufgeführt.
909827/1545
-.11 2abelle_IV.
Medium. Glycerin Csapek's
Agar
ι
!
Merkmal Ergebnis 5
Csapek's Agar ( Wachstum
AM
gut
gut, bräunlich weiß bis
hell bräunlich grau
SM hell bräunlich grau
Glucose-Asparagin
Agar'
SP keines
Wachstum
AM
gut 1
gut, bräunlich weiß
SM blaß braun
Glycerin-Asparagin SP keines
I
Agar Wachstum
AM
mittel
kein Luftmycel bis spärlich
SM gelblich grau
SP " keines
Caleiummalat Agar Wachstum gut
AM gut bis mittel,bräunlich
weiß j
SM hellbräunlich grau bis blaß *
gelblich braun
Starkesgar SP keines
Wachstum
AM
mittel bis gering
mittel, grau-weiß
SM gelblich grau
SP keines
Wachstum
AM
mittel
mittel, hell bräunlich grau
SM blaß gelblich braun
SP keines
909827/15/
Tabelle IY l JTo r "see τ au ng j Ergebnis ,
mittel
ge ring s bräunlich v?eiß
blaß gelb fels blaß gelblich
braun
. keines
Me ü i um ] [
Merkmal |
mittel
gering,, weiß
blaß gelblich braan
keines'
Haaregar
I
Wachstum
AM
SM
SP
gut
raittel« bräunlich; weiß
grauatiohiges gelbbraun
keines
Gluooee—Pepton
Agsr
Wachstum
AH
SM
SP .
e^t.
gut, hell bräunlich grau
fee11 bräunlich grau bis
. t'SiäuuiXIöh grau -
keines
Kartoffel Wachstum
Ali
SM
SP
kein üuftayoel
Maß ferauß
Bennett's Agar ■Waoh^tuBi
AM
SH '
SP
GeIa tiaemeöIum viaoaotum
AM
SM
S?
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BAD ORIGINAL
'labelle IT (Fortsetzung)
Medium Merkmal Ergebnis
Milchmedium Wachstum
AM
SM
SP
gut
geringe bräunlich weiß
blaß braun
keineβ
Celluloseagar Wachsturn
AM
SM
SP
kein Wachstum bis
bis spärlich
Bennett*s Agar Wachstum
bei 280O
« 370C
» 45°0
gut
gut
gut
Glucosebrühe Wachstumy-
typ
Ringtyp
AM = Luftmycels SM ο Substratmyeelf SP = lösliches Pigment.
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Physiologische Merkmale
','—- - ■ — ι ■ —■ I » Ii ι ■ ■■ Ii ι . ι « ι- im ι
Die physiologischen Merkmale wurden wie oben beschrieben festgestellt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V aufgeführt?
Tabelle V
Merkmal
Bildung von melanoidem Pigment — Tyrosinase-Reaktion— «»-=-»«.--..=-. Säurebildung aus Nitrat-Reduktion-—=»- Stärkehydrolyse«"»——« Gelatinyerfllissigung Milchpeptonisation fc Antibioticumbildung·—
Ergebnis
.negativ
negativ
-^- —positiv -----positiv
positiv
A oylpe pt id
Der Mikroorganismus wächst unter aeroben Bedingungen s wobei der für das Wachstum optimale pH-Bereich bei 7,0 - 7,2 liegt.
Die Koiilenstoffquellsnverwertung wurde wie oben beschrieben ermittelt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI aufgeführt, worin "ψ" und "+·*■" steigende, posi-
tira Verwertung, "-" keine Verwertung und "+" ssweifelhafte
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Verwertung anzeigen.
'■■!"!"''''!»»!!!!!"!IIIÜBIIIipiaiRil'il!1! .»ι; g'ii'gn gig
Tabelle VI
Kohlenstoffquelle Ergebnis
Glycerine-Glucose— Inosit—-Mannit««—·— Rhamnose— Galactose— Arabinose— Xylose—— Mannose—-— Fructose---» -gutes Wachstum«
»mittleres Wachstum—
d to·
-aehr geringes Waohstum~ +
Lactose—-Saccharose· Raffinose— Maltose·— Inulin--— Sorbit-=·— DuIc it— ■-« Salicin—·-·'=--■ kein Wachstum«=-—
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Charakterisierung von Streptomyce3 :N~946.;. Morphologische Merkmale
Die morphologischen Merkmale wurden wie oben beschrieben beobachtet.
Auf Bennett's Agar bildet eich ein reichliches Luftmycel, das pulvrig bis eamtartig aussieht. Auf dem Luftmycel bilden sich Sporophoren. Die Verzweigungeart der sporulierenden Hyphen gehört nicht zum Typ Verticillue und ihre Form ist die von Spiralen. Die Sporen bilden sich in Form von Ketten mit -mehr als 10 Conidien und ihre Geß'talt ist zylindrisch bis oval (0,5 bis 0,7/i dick, 0,8 bia 1,3 u lang). Die Sporenoberfläche ist stachlig. Sporangium und Geiselsporen, sowie Fragmetierung und Sclerotia im Substr.atmyeel sind nicht zu beobachten.
Wachetumseigenschaften
iDie Festetellung der Wöchtumseigenschaften erfolgte in der oben beschriebenen Weise» Die Ergebnisse aind in der folgenden Tabelle VII zusammengestellte
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_ 17 Tabelle YII
Medium Merkmal Ergebnis
Czapek*s Agar Wachstum
AM
SM
SP
gut
gut, hellbräunlich grau
hell bräunlich grau bis
bräunlich grau
keines
Glyoerin-Czapek'β-
Agar
Wachstum
AM
SM
SP
gut
gut, hell bräunlich grau ^
hell bräunlich grau ^
keines
Glucoee-Aeparagin-
Agar
Wachstum
AM
SM
SP
mittel
gut, hell bräunlich grau
hell bräunlich grau bis
bräunlich grau
keines
Glyoerin-Aaparagin-
Agar
Wachstum
AM
SM
SP
gut
gut, bräunlich weiß bis hell
bräunlich grau
hell bräunlich grau bis {
blaß gelblich braun
keines
Caloiummalat Agar Wachstum
AM
SM
SP
gering
gering9bräunlich weiß
farblos bis hell bräunlich
grau
keines . .
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Tabelle YII (Fortsetzung)
Medium Merkmal Ergebnis
Stärkeagar Wachstum
AM
mittel
gut, hell bräunlich <,rau
SM hell bräunlich grau
SP keines
Nähragar Wachstum
AM
mittel
gering, bräunlich weiß
SM blaß gelblich braun
SP keineβ
Gluooee-Pepton-
Agar
Wachstum
AM
mittel
mittel, weiß bis gelblich grau
SM blaß gelblich braun
SP keines
Kartoffel Wachstum
AM
gut
gering, bräunlich weiß
SM dunkelbraun
SP keines
Bennett's Agar Wachstum
AM
gut
gut, bräunlich grau
SM bräunlich grau
SP keines
GeIa tinenied ium Wachstum
AM
mittel
kein Luftmycel
SM blaß braun
SP keines
9098 2 7/1545
- 19 Tabelle YII (Fortsetzung)
Medium Merkmal Ergebnis
Milchaedium Waeheturn
AH
SH
SP
gutρ Überzug
gering, bräunlich weiß
blaß braun
keine 8
Celluloseagar Wacheturn
AH
SH
SP
Icein Wachstum bis epftrlich
i
* "" —■ ' -
Bennett'8 Agar
Wachstum
bei 28°C
" 370C
« 45°c
gut
gut
gut
OluooaebrUhe Wachstümer
typ
Ringtyp
AH
Luftmyceli SH « Substratmycel; SP = lösliches Pigment,
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Physiologisch« Merkmale
Die physiologischen Merkmale wurden wie oben beschrieben festgestellt. Sie Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VIII aufgeführt.
Ί Tabelle VIII
Merkmal Ergebnis
j Bildung von melanoidem Pigment ————-»—.,.,negativ
Tyrosinase-Reaktion—■—— -—-——-._- —-negativ Säurebildung von Glucose—»—■— ——«—positiv Nitrat-Reduktion——«————~——— positiv, stark
j Stärkthydrolyse — .— · positiv
Ge la tinverflUes igung ~ poe i t Iv, β t a rk Milchpeptonisation—— .--- —, --!-positiv
w Antibiotiouiabildung.= .-«—-, .——.-——Acy lpe pt id
Der Mikroorganismus wächst unter aeroben Bedingungen und der für das Wachstum optimale pH-Bereich liegt bei 7,0 bis 7»2o Die Kohlenstoffquellenverwertung wurde wie oben beschrieben ermittelt. Die Ergebniese sind in der folgenden Tabelle IX zusammengestellt, worin "+" und "++" steigende
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poeitiTe Verwertung, "-" keine Verwertung und Μ+_η zweifelhafte Verwertung anteigen.
Tabellt, IX
Kohlenetoffquelle Ergebnis Glycerin—— ——.—.——,.—,« —.«».-gutes Wachetum——— ++
Inosit--—— -— —— *——·—---mittlerea Wachstum—«.—.---- ■§■+ Mannit —»— ~. ... »-«, »«dto—- ·>—- · « + Rhamnoet— ———·— —-«.-»-.»—^-^—gutes Wachstum-«' —— ++ Galactose—-··—— ~ — —mittleres Wachstum——-« + Xylose-—« -—— ———— ———äto—-———--—— + Arabinose — «— eehr geringes Wachstum-—< + Pruoto··- —— "■—dto——»— + Maltose— — *- « ——dto~- «-- + Lactose—--- ~ —-.—.—.-.. ..^tO--— ——— ♦ Saccharose— —-—lcQin Wachstum—· —- - Raffinose —~.—.-.-«—.—-.—-.— ——ato——-— ,—-.—- -
Mannose————^——-«——«- ,-,«,-«——-—- dto-—————*—=—·—- -
JUMM4·JuAt ^^^^ -t~*-~~ ·— -_·-—.—w-~»b^,™«^ —^ _- VW— .
DuIc it«-«-«=·- ·'—»=-·"*=—«,^^^.„.„„^=^«««.^«==. Oca>».»«..c Sorbose«=—-—»--—v——m—.——--.—,„„„«-^-.^--.»--
909827/1545
Aus den oben aufgeführten Ergebnissen ist er .licht lieh, daß diese 3 Stämme zum Genus Streptoniyces zu stellen sind. Ihre Merkmale sind in der Tabelle X zusammengestellt, aus der zu ersehen ist, daß der Stamm Z-237 dem Stamm Z-242 sehr nahe steht, /us diesen Gründen wurden die Merkmale des Stamms Z-237 mit denen des Stamms Z=-242 eingehender verglichen und dabei wurde festgestellt, daß die ^Jerkmale beider Stämme mit Ausnahme der Verwertung einiger Kohlenntoffquellen identisch sind. Biese beiden Stämme, d.h. Z-237 und Z-242, waren daher zu der gleichen Species zu stellen.
Aus dem Vergleich der morphologischen, Wachstums- und physiologischen Charakteristica ergab sich ferner, daQ der Stamm N-946 dem Stamm Z-237 in den meisten Eigenschaften nahe steht, wobei jedoch gewisse Unterschiede «wischen beiden hinsichtlich der folgenden Merkmale auf- ^ fallen:(1) Säurebildung aus Glucose, (2) Parbe des Luft myoels auf synthetischem Agarmedium und Glucose-Asgaraginmedium, (3) Bildung von Luftmycel aus Glucose-Asparaginagarmedium, (4) Farbe des Substratmycele auf Calciummalatagar und (5) Verwertung ron Kohlenstoffquellen, wie Fructose, Maltose, Lactose, Arabinose und Saccharose ο Auo diesen Gründen erschien es angebrauht, die beiden Stämme zu sehr nahe verwandten Species zu stellen.
9Ό9827/1545
Tabelle X
Merkmal
Ergebnis
Stamm Morphologie:
Sporophoren
Sporenoberfläche
Z-237 Z-242 H-946
Wachstumstempera-»
tür: 280C
370C
45°C
Spiralen
stsohlig
Spiralen
StDohlig ,.
Spiralen
jßtAcfcli3g.aohlig
Czapek's Agar:
Wachstum
AM
CO
to SM
OO
NJ
-a SP
cn
*■*
cn
gut
gut
gut
gut
gut
gut
gut
gut
gut
I
gut
gut, bräunlich weiß
bis hell bräunlich
grau
hell bräunlich grau
keines
gut
gut,bräunlich weiß
bis hell bräunlich
grau
hellbräunlich grau
keines
: 1 M
VjI
gut '
gut, hell bräun
lich grau
hellbbräunlich grau
bis bräunlich grau
keineβ
—».
CX)
O
Tabelle X (Fortsetzung)
Merkmal
Ergebnis
■ · ■■ Stamm. Z-237 Z-242 ff-946 8 ■ gut
&lueose~Asparagin~
Agar
ca Wachstum
gut, bräunlich grau
2 AM
OO
NJ
gut bis mittel mittel mittel bräunlich grau
cn gering; gelblieh grau spärlich gut 9 he11 bräunlich
grau bis bräunlich
grau
keines
(JT SP gelblich grau gelblich grau hellbräunlich grau
bis!bräunlich grau
Bennett's Agar? keines keines keines
Wachstum
AH- gut gut
SM gutshellTbräunlich grau
SP hell bräunlich grau
bis bräunlich grau
keines
gut ,hell bräunlich grau
hellbräunlich grau
bis bräunlich grau
keines
ο ο co σ> co
Tabelle X (Fortsetzung)
Merkmal Stamm Bildung von melanoidea
Pigment
Ergebnis Z-242 H-.946 I
ο Säurebildung aus Glucose
to
Z-237 negativ negativ
f

NJ Tyrosineso-Reaktion
negativ negativ Positiv
^ Nitrat.reduktion negativ negativ negativ
cn
Wachstumstyp auf Glucose-
brühe
negativ positiv positiv
positiv Hingtyp Ringtyp
Ringtyp
AM ^ Luftmyceli SM β Substratmycel;SP » lösliches Pigment·
Vie noon näher erläutert wird, ist das Antibioticum Tauehimyoin «in saure« Aoylpeptid, das der sogenannten "Amphonyoin-Glumamyoin-Gruppe von /ntibiotica" nahesteht. Deshalb wurden Streptomycee Z-237 und Streptomyces N-946 eingehend alt den Antibiotics der Amphomyein-Glumamycin« Gruppe erzeugenden Stämmen, wie Streptomycea griseus rar. tpiralls, Streptoayces violaceue T~319Ot Streptomycin canua, Streptomycea violaoeus I9 Streptomycee 891
und Streptomyoes zaomyceticue, beschrieben In Wakaman und Lechevalier "The AotinoEayoetee", Bd. 3» verglichen. Diese vergleichenden Untersuchungen haben ergeben» daß die Stätte Z-237 und N-946 offeneichtlioh von allen bekannten Species der Antibiotica der Aaphomycin-Gluroamycin-Gruppe erzeugenden Streptomyceten verschieden sind.
Unter den Species von Streptomycea, die in Sergey's"Manual of Determinative Bacteriology", Waksman und Lechevalier .
"Aotinomycetes and Theis AntibioticsH, Wakaman "The · Aotinomycetea" und anderen Literaturstellen beschrieben sind ρ sind Streptomyces Z-237 und Streptomycee N-946 offenbar Streptomyces pseudogriaeolua H-16-C aahr naheatehendo Deshalb v/urden vergleichende Untersuchungen zwischen diesen Organismen durchgeführt? wobei die in der folgenden Tabelle XI aufgeführten Ergebnisse erhalten wurden,
909827/1545
Tabelle XX
Mer&mal Ergebnis
Stamm Streptomycee
' Z-237 Sireptosaycee
11-946
Streptomyces peuGoil
Morphologie*. Sh
Sporeagsstalt
Spiralen stachlig oval-zylindrisch Spiralen
stachlig
oval°zylindrisch
Spiralen stachlig
OYal-zylinörisch
Agars
Wachstum
Wstshstum
gut
gut, bräunlich weiß bis hell bräunlich grau
hell bräunlich grau keines
gut, hell bräunlich
grau
hell bräunlich grau
bia bräunlich grau
keines
gut
gering,bräunlieh weiß bis hsll brS Xich grau
gelblich grau
keines
gut bis mittel gering, gelblich grau
gelblich grau keines mittel
gut ο hell bräunlich
grau
hellbräunlich grau
bis bräunlich grau
keines
keines
bis gelb·= lieh grau
keines
QO O O CO O CO
Tabelle XI (Fortsetzung)
Merkmal Stamm Streptomyces
Z-237
Ergebnis Streptomyces
pseudogriseolus
1800363
Streptomyces
H-946
ö-lyaerin-Asparagin- gut mittel bis gut
AgBTi
Wachstum
gut bis mittels
bräunlich weiB
gering9 bräun
lich weiS
CO
OD
NJ
hellbräunlich grau
bis blaß gelblieh
gut, bräunlich weiß
bis hellbräualiöh
grau
hell bräunlich
grau
^ SH braun hell bräunlieh grau
bis bl*ß gelblish '
cn keines braun keines 8
ro
. w SP keines
»7aloiummgIat-=Agar mittel bis gering gering
'Wachstum mittel, grau-weiß gering keines
AM gelblich grau gsrings, bräunlidi
weiß.·.
farblos bis
gellslish gra«
SM... . ■ keines farblos bis hell
bräun!5,ch grau
keines
■' s?1 ■ . ■■ · . . . . !
keines
f
Tafeelle XI (Fortsetzung)
Merkmal Ergebnis
Stamm Streptomycea
Z-237
Streptömyees N-946
Streptomyees pseudogriseolus 6
Nähragar Wachstum
AM
SM SP mittel
gering, gelblich, grau "bis bräunlich weiß
mittel
gering, bräunlich weiß
blaß gelb bis blaß blaß gelblich braun gelblich braun
keines
keines
gut \ gering, weiß
blaß gelblich braun
keines
Glucose-Pepton Agar
co Wachstum
-J SM
vt SP cn
mittel
mittel bis gering, weiß
blaß gelblich
braun
keines
mittel
mittel, weiß bis gelblich grau
blaß gelblich braun
keines
mittel
keines
gelblich grau keines
CX) O O CO
Tabelle XI (Fortsetzung)
Merkmal
Ergebnis
Stamm Streptomyees
Z-237
Streptomyees
H-946
Streptomyces
peeudogriseolus
Kartoffel:
Wachstum
AM
gut
mittel,, bräunlich
weiß
gut
gering,bräunlich
weiß
gut
gering, weiß
SM grauet? ch^-zss hell
braun
dunkelbraun gräulich gelbbraun
5? keines keines blaß gelblich
braun .
Benett 's Agar:
Wachstum
AM
CO
° SM
co
09
gut
gut, hell bräunlich
grau
hell bräunlich grau
bis bräunlich grau
gut
gut, bräunlich grau
bräunlich grau
3
gut °
keines
blaß gelblich
braun bis gelb
lich braun
cn
cn
keines
keines keines
—i
OO
O
O
CO
/-ΓΝ
lEabelle XI (Fortsetzung)
co ο co CX) Ni
Merkmal
Gslatiaeraeäiums
Wachstum
SP
^ilchmediums
Wachstum
AM
SP
Stamm
Streptomycss
Z-237
mittel
keines
blaß braun keines
Ergebnis
gut
geringP bräunlich
weiß
blaß braun keines
Streptomyces
H-946
mittel
keines
blaß braun
keines
gut
geringt bräunlich.
v/eiS
blaß braun
keines
Streptomyces pseudogriseolus H-16~C
gut
keines (gering;, grau-weißs)
gelblich grau keines
gUt I
gering, bräunlich weiß
blaß braun
keines
O O CO
Tabelle XI (Fortsetzung^
Merkmal Stamm Gelluloseagars
Waehstumsteraperatur;
280C
370C
450C
(Bennetts's Agar)
StE?eptomyces
Z-237
Ergebnis Streptomyces
pseudogriseolus
H-26-C
Wachstumstyp aus Glucose-
brühe
kein Wachstum
gut
gut
gut
Streptomyces
N-946
kein Wachstum .
gut kein AM
gut,massiges AM
gut,massiges AH
£
Bildung von melanoidem Pigment
ο Tyrosinase-Reaktion
CO
oo Säurebildung aus Glucose
Si
^ Hitrat-Reduktion
^J Stärkehydrolye
cn Gelatineverfliissigung
Milehpeptonisation
Eingtyp kein Wachstum bis
spärlich
gut
gut
gut
VjJ.
Ringtyps später w
Belag 8
negativ
negativ
negativ
positiv
positiv
positiv
positiv
Hingtyp negativ
negativ
negativ
positiv
positiv
positiv o°
O
positiv O.
cn
negativ
negativ
positiv
positiv
positiv
positiv
positiv
Verwertung von Kohlenstoff-Quellens
Glycerin •fr+ ++
Glucose +-fr ++
Xylose ++ +
Inosit ++ ■ +
Mannit ++ •fr
Fructose ++ t+
Rhamnose ++ ++
Galactose +■fr ψ
Maltose ++ +
Mannose ++
Arabinose + +
Saccharose +
Lactose + ±
Raffinose -
Inulin
Sorbit
Dulcit -
Salicin -
Sorbose
■S-4- +■*■
+•fr
AM = Luftmycel; SM = Substratmyeel; SP s lösliches Figment; +·*· = gutes V/ chstum; -ι- = mittleres Wachstum; + = sehr geringes Wachstum; - = kein Wachstumο
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Wie aus der Tabelle Xl hervorgeht, ist Streptomyces T-237 dem Streptomyces pseudogriseolus H-16-C sehr ähnlich und ea kann der Schluß gezogen werden, daß Streptomyces T-237 als Streptomyces pseudogriseolus bezeichnet werden sollte. Dieser Stamm unterscheidet sich jedoch von Streptomyces pseudogriseolus H-16-C hinsichtlich der Luftmycelbildung auf Calciummalatagar, Bennett's-Agar, Gluaoseasparaginagar.) ^ und Glueosepeptonagar, sowie der Verwertung von Saccharose. Der Mikroorganismus ist deshalb als ein neuer Stamm der Species Streptomyces pseudogriseolus eingeordnet und als Streptomyces pseudogriseolus Z-237 bezeichnet worden. Dies bedeutet ferner, daß.Streptorayces Z-242 gleichfalls ein neuer Stamm der gleichen Species ist, weshalb er die Bezeichnung Streptomyces pseudogriseolus Z-242 erhalten hat,
Zwischen Streptomyces pseudogriseolus H~16-C und Streptomyces N~946 sind zwar beträchtliche Übereinstimmungen hinsichtlich ™ der Formen der sporulierenden Hyphen, der Sporenoberfläche, der Bildung von melanoidem Pigment und der Farben des Luftmyeels und des Substratmycels auf verschiedenen Kulturmedien festzustellen» Doch unterscheidet sich Streptomyces N-946 von Streptomyoes pseudogriseolus hinsichtlich morphologischer Merkmale, z.B. der Bildung von Iaiftmycel auf Glucoseasparaginagar, Glueosepeptonägar und Bennett's-Agar und hinsichtlich physiologischer Merkmale, z»B. der Säurebildung aus Glucose und der Verwertung von Kohlenstoffquellen» Der
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Mikroorganismus wird deshalb als neue Varietät von Streptomyees pseudogriseolus angesehen und als Streptomyces pseudogriseolus var. glucofiermentana, vor. novo bezeichnet.
Es sei darauf hingewiesen, daß für die Erzeugung von Tsushimycin die Erfindung nicht auf die Verwendung von Streptomyces pseudogriselous Z=237, Streptomyces pseudogriseolus Z~242. und Streptomyces pseudogriseolus var. glucofermentans, var. nor= beschränkt isto Vielmehr umfaßt die Erfindung auch die Verwendung von natürlichen oder künstlichen Mutanten oder Varianten, die aus den beschriebenen Organismen erhalten wurden und die gleichfalls das Antibioticum Tsushimycin zu bilden vermögen. Die künstliche Erzeugung von Mutanten oder Varianten kann durch die üblichen Maßnahmen und Mittel, z.B.Röntgenstrahlen, Ultraviolettstrahlen9 Stickstofflosts 4-Nitrochinolin= N~oxyd und andere mutagene Mittel erreicht werden.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird das neue Anti bioticum Tsushimycin während der Züchtung des Mikroorganismus, z.B« Streptomycee pseudoseolus Z=2379 Streptomyces peusogrlseolus Z-242, Stceptomyc.es pseudogriseolus varο glucofermentans j, var. nov. in einem wässrigen Nährmedium bei einer Temperatur von etwa 25 bis 45°C, vorzugsweise 25 bis 300C unter aeroben Bedingungen erzeugt. Die Zusammen^
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. - 36 -
setzung des Nährmediums kann innerhalb weiter Grenzen schwanken« Die wesentlichen Erfordernisse sind eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Spurenelemente» Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Glucose, Saccharose, Xylose« Fructose, Galactose, Innosit, Mannit, Glycerin, Dextrin, Stärke, organische Säuren, Heiasse und dergleichen. Zu für die A Fermentation geeigneten Stickstoffquellen gehören unter anderen Fleischextrakt, Peptone, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Erdnußmehl, Weizengluten, Baumwollsaatmehlp Reisschrat, Casaminosäure (Säurehydrolysat von Casein), NZ-Amine (ensyraatisches Caeeinhydrolysatjp Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumchlorid. Beispiele für geeignete Quellen für anorganische Bestandteile sind Mineralsalze, z.B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und Kaliumphosphat„ Das Nährmedium kann, muß aber nicht vor der Beimpfung mit dem Mikroorganismus auf
einen pH-Wert von 5*0 bis 7,0 eingestellt werden» Während der Fermentation bleibt der pH-Wert in den meisten Fällen innerhalb dieses Bereichs, wenn jedoch Schwankungen auftreten, dann kann dem Medium ein Puffermittel, z*B. Calciumcarbonat zugesetzt werden* Ausserdem kann man, wenn ein übermässiges Schäumen auftritt, dem Fermentationsmedium vor oder während der Fermentation Entschäumer zusetzen, z.B. pflanzliche Öle, Schmalzöl oder Polypropylenglycol. FUr die Produktion im großen Maßstab wird die Fermentation Vorzugs-
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weise unter submers aeroben Bedingungen durchgeführt. Unter optimalen Bedingungen der Temperatur und Belüftung können nach etwa 20 bis 100 Stundenp gewöhnlich etwa 70 Stunden maximale Ausbeuten dee /ntibioticums Tsushimycin erhalten werden.
Nach dem Ende der Fermentation kann dos Antibioticum Tsushimycin noch Üblichen9 bekannten Verfahren aus der Fermentationsmaische gewonnen werden. In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, daß das Antibioticum Tsushimycin eine amphotere Verbindung mit einem isosLektrisehen Funkt bei etwa pH 3,0 darstellt. Aus diesem Grund ist es empfehlenswert8 Lösungsmittelextraktionsverfahren bei einem saurem pH-Wert oder Fällungsverfahren aus einer wässrigen Lösung beim isoelektrischen Funkt anzuwenden« So wird beispielsweise die Fermentationsmaiscteauf einen alkalischen /Wert» z.B. etwa 9,0 bis 10,0 eingestellt und unter Verwendung üblicher Vorrichtungen, z.B. einer Filter« . presse oder eine Zentrifuge vom Myeel abgetrennt. Falls erwünscht, kann man eine Filterhilfe, z. 3. Distomeenerde-(Celite) einsetzen.Das FiItrat wird dann angesäuert und mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, ζ.Β» Butanol extrahiert»Die so erhaltene rohe Wirkstoffkomponente wird weiter gereinigt, beispielsweise durch erneute Fällung oder Chromatographie. Zur Umfällung kann man beispielsweise das Rohmaterial in einem niederen Alkanol lösen und die Lösung mit Äthylacetat versetzen.
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. -38 -
Man kann aber auch den rohen aktiven Bestandteil in basisch gemachten Wasser lösen und anschließend die v/ässrige Lösung auf etwa pH 3 einstellen» Die für die Chromatographie be-Yoraugten Adsorbentien sind Kieselsäuregel, Kieselsäure und $®rgleichen» iusaerdem kann man das Antibioticum Tsushimycin in ein SaIa überführen8 das sich für Reinigungsmaßnahmen eignet, ζ·Β· das AoiraoiiiumsalZg Natriumaalz, Kaliumsalss oder ein Schwer« metallsalze
In Form der freien Säur® ist das Antibioticum Tsushimycin ein farbloses amorphes PulY@r9 das bei 230 - 24O0C unter Zeratt Jing^ sohmilat» Es ist in aogesäuertem und basisch, gemaohtem Wasser stark 158IiCh9 in niederen Alkanolen, ζ.Ββ Methanol und Äthaaol löslich unä in Aceton, Ithylacetat, loroform und Äther MHiäeliofeo lach Trocknen γοη Tsushimycin
bei 1000G im fateoa Tbis zur Gewiehtakönstanz werden bei der Elementaranalyse folgende Werte erhalten % C 53 9 97 $><, H 7,21 $, N 13*78·$? kein Schwefel und kein Halogen. Wenn es mit Feuchtigkeit in Berührung kommt, nimmt es eine bestimmte Menge Wasser bis zur Gewichtskonstanz auf und 'bei der Elementaranalyse dee hydratisieren fsushimycins (im folgenden bezieht sich "Tsushimycin" auf das hydratisierte Tsushimycin,) wenn nichts a nderes angegeben ist) werden folgende Werte erhalten? C 499 98$, H 7,53 #9 N 12,76$, H2O, 7»39 $. Das Molekulargewicht τοη Tsushimycin beträgt etwa .1 400 (osmometrisch in 95 ^-igern Methanol) und das Neutrali=
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' ■' ' ' i" "''" ;l I'111' ''" '"''I ■ "■'"" "'''''"I! !!'!!!!!iirii'l'illlll'PISIllllllillpiPiBJIIIIIlpi!1; i jljHjjlF "H!!3!li!|||!|
sationsäquivalent beträgt 445 (durch Titration in 50 #-igem wässrigen Methanol). Aus diesen Werten wird als Bruttoformel für Tsushimycin CKgHg5O20N1506HgO angenommen. Die spezifische Drehung von Tsushimycin beträgt
&323 ·?■ 12,9°·ί·0!)5ο(ο^0,98ΐ5δ in Methanol) sföl]|29 ^13,20IO9S0
(σ=Ο?925 $> in Äthanol) und &]^2'^ ~6,0±0,5°(c=0f876 $> in 1 m Phosphatpuffer, pH 6,0). Das Ultraviolettabsorptions- * spektrum in Methanol zeichnet sich durch nur eine Absorption bei 207 m aus» Das Infrarotabsorptionsspektrum yon Tsushimycin (Kaliumbromidtablette) zeigt folgende charakteristische Frequenzen: 3300, 3040, 2920, 1725? 1655» 153O9 1450 und 1015 cnT\ (vergleiche Figo 1 der beigefügten Zeichnungen). Die dünnschichtchromatographis«j;he Analyse ergibt einen einzigen Flecken von Rf=O937-0,40 auf Silicagel G mit n-Butanol/Essigsäure/Wasser (3:1:1) und von Rf«O916=-O,19 auf Silicagel S mit Äthanol/14 ^igem wässrigem .Ammoniak (8:2), der sowohl bioautographisch als . * auch mittels Schwefelsäure.^feststellbar ist. Es liefert positive Ninhydrin~8 Dragendorff- und Biuretreaktionen und entfärbt Kaliumpermanganat und Brom0 Eine zweidimensionale Papierchromatographie mit einem Säurehydrolysat von Taushimycin, wobei eine Dimension mit n-Butanol/Essigsäure/Wasser (4:1:2) entwickelt wird, und die Wanderung in der anderen Dimension anschließend durch Elektrophorese bei 300 Volt während 3 Stunden in η-Essigsäure erzielt wird9
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liefert Flecken, die Asparaginsäure, Glycin, Prolin,'Pipecolinsäure einer «abekannten sauren Aminosäure und einer un ~ bekannten basischen Aminosäure entsprechen (mit Ninhydrin und Isatinlösung sichtbar gemacht)« Bei einer automatischen Aminosäureanalyse werden die folgenden /minosäuren ermittelt; Asparaginsäure (35)98 MoI)5, Prolin ""("ΐρ 03 MoI)5, Glycin (2P00 MoI)9 Valin (0998 MoI)9 Pipecolinsäüre (nicht bestimmt) s, eine unbekannt© basische Aminosäure-(nicht ' bsstimmt) und Ammoniak (Op35 Mol). Die Beßtinnmmgder Fett» Säurekomponentendes Antibiotikum Tsushimycin durch einen gaschromatographischen Vergleich mit authentischen Proben in Form der ^thylester ergibt, daß sie aus Isöte-tradecensäure und Isopentadecensäure (etwa 1s1) bestehto Dieses Ergebnis wird durch einen gaschromatographischen Vergleich" der katalytisch hydrierten Fettsäurekomponenten mit authentischen Proben τοη Isotetradecansäure und Isopentadecansäure bestätigt»
Aufgrund der oben angegebenen physikalischen und chemischen Merkmale wird Tsushimycin als neue Substanz angesehen, die sich von allen zum Vergleich aur Verfugung stehenden Antibiotica unterscheidet»
Tsushimycin ist gegen eine Reihe Terschiedener Mikroorganismen wirksam» Die antimikrobielle Aktivität des Antibioticums in vitro wurde durch die AgarstreifenrerdüniiuEgs=· methode und die ReagensglasYerdünnungsmethode ermittelte Die
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Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XII zusammen
gestellt.
Tabelle XII
iestorganisnms Minimale inhibierende Konzen
tration 9 mcg/ml
Bacillus anthraeiS"-«-»"==-«=»»»^^«=--"«"--*-^-»·«·"·=*·"- O9 5 Bacillus subtilis, pci-219—-—-—--—---————-"- 0?5 Staphylococcus aureus, 209 P —.—<»——<——.—--.—.—« 1PO Sarcina lutea·-·=·-·=-«---·«----»=-·--·---»———-———=—.~.~~— I9O Diploooccus pneumoniae, I-=.--—«»«=-«.—=-.-<=»—.-«=.—- 1,0 Diplococcusβ pneuraoniae, i-v^«-—"-=——=————— 1,0 Diplococcus pneumoniae, n«=———.—--.—.—.-.-.-.—.——— 0,5 Diplococcus pneumoniae, in-.—.««.-.—.-.—.———-—«- O95
Streptococcus haemolyticua, d=.»=—«.«—«— «-~ 1PO
Streptococcus haemolyticus, HA—"-—·=·—«=—='——-—«--— 1»0 Oorynebacterium diphtherias, s—-«.«-«=»—«,«-»=.^^^««.<— oP5 Corynebacterium diphteriae, T·=--—————■—-——--—-·- 0P5 Shigella dyeenteriae—«—--——.—.——«-———— 7 100 Shigella paradysenteriae, Ohara——-»—·«—«——■——'7100 Salmonella typhi—=~—-.——.-«-.—..——-.—— >1OO Salmonella pafathyphi,A.=»°—»*—»-ί-~-—«—.-.-————. JMOO Escherichia coli, Umezawa———.—.———-.—.—-—>100
Pseudomonas aeruginoaa——--=-« — —- >100
Klebsieila pneumoniae·==·-«-'—— — 7100
Mycobacterium tuberculosis
Tar« hominis, H37Rr—-——-—· 7100
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, -♦Ä.Aus der vorstehenden Tabelle XII ist zu ersehen, daß Tsushimycin gegen gram-positive Bakterien hoehwirksamist liod keine oder nur eins geringe Aktivität gegan gram-negative Bakterien und Kysobakterien hat.
Wegen seiner in Titro nachgewiesenen Aktivität gegen gram-positive Bakterien wurden chemotherapeutische Prüfungen an Mäusen mit experimentell mit Uplococcus pneumonias und SpreptrocoQcus haemolyticus erseugten Infektionen Torgenommen, denen Tsushimycin subcutan verabreicht wurde. Dabei wurden EDcQ-Werte von O962 .mg/kg besv;» 1,3 mg/kg erhalten»
Ferner wurden an Mäusen Untersuchungen der akuten Toxlzität durchgeführt j wobei folgende LD(-Q~Werte ermittelt wurden: 100 bis 200 mg/kg intraperitoneal, 200 bis 300 mg/kg subeutan und 100 bis 200 mg/kg intravenös ο
Das neue Antibioticum Tsushimycin eignet sich als Mittel zum Inhibieren des Wachstums von gram-gositiven pathogenen Mikroorganismen.. Es eignet sich sum Sterilisieren von chirurgischen Instrumenten. Ferner eignet es sich zur Herstellung von Reinkulturen τοη Einseiorganismen, wo ein empfindlicher Organismus von einem resiötenen abgetrennt werden soll.
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Die Erfindung "bezieht sich ferner auf hydriertes Tsushimycin und S1^f Verfahren isur Überführung von Tsushimycin in hydriertes ■'Tsushimycin- Die Hydrierung von Tsushimycin kann nach'herkömmlichen katalanischen Hydrierungsverfahren er» folgeiio Dabei wird das .Antibioticum Tsushimycin in einem geeigneten Lösungsmittelswie Methanols Äthanol„ Propanol oder Butanol in Gegenwart eines Hyörierimg8katalyBators9 a = Bo eines Platinkatalysators, Palladiumkatalysatorß oder Nickel- g katalysators mit Wasserstoff behandelt« Die Reduktion kann bei Zimmertemperaturp d-h« etwa 10 - 300C unter Atmosphärendruck durchgeführt werden bis 1 Mol Äquivalent V/asserstoff aufgenommen ist.
so erhaltene hydrierte Tsushimycin ist eine amphotere Verbindung mit einem isoelektrischen Punkt bei etwa pH 3jO und ist ein farbloses amoprhes Pulper, das bei 233 - 2430C unter Zersetzung schmilzt.Die Löslichkeit ist praktisch die gleiche wie die von Tsushimycin. Die EIementaranalyse des bei 10O0C im Vakkum bis zur Gewichtskonstanz getrockneten hydrierten Tsushimycins liefert folgende Wertes C 54,09 #, H 7,34 #, -H 13,76 #. Bei der Berührung mit Feuchtigkeit nimmt es eine bestimmte Menge Wasser bis zur Gewichtskonstanz auf und bei der Elementaranalyse des hydratisieren hydrierten Tsushimysins (im folgenden bezieht sich die Bezeichnung *i
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driertes Tsushimycin" auf die hydratisierte Form, wenn nichts anderes angegeben iot) werden folgende Werte er halten s C 48,76 fo9 H 7,72 fo9 Ii 12,40 & HgO 9p86#» Die spezifische Drehung von hydriertem Tsushimycin betrqgt
5 + 14»1°± Op5° (c=0,944 f> in Methanol)« Das Ultraabsorptions-
violetfspektrum in Methanol zeichnet sich durch nur eine Absorption bei 207 mu aus. Das Infrartoabsorptionsspektrum von hydriertem Tsushimycin (als Kaliumbromidtablette) zeigt die folgenden charakteristischen Frequenzen? 3310s 3050, 2920, 1720, 1655p 1530, 1450, 1384«, 1235 und 1015 ora~1 (vergleiche Figur 2 der beigefügten Zeichnung)» Die Aminosäurekomponenten des hydrierten Tsushimycins sind mit denen von Tsushimycin identisch und die Fettsäurekompo-Renten wurden mit authentischen Proben von Isotetrade·=· cansäure und Isopentadecansäure durch Gaschromatographie der Methylester identifiziert.
Die Aktivität des hydrierten Tsushimycins gegen Mikroorganismen entspricht der von Tsushimycin. Die in vitro ermittelten
Werte der antimikrofciellen Aktivität sind in der folgenden Tabelle XIII aufgeführt»
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- 45 Tabelle XIII
Testorganiemus Minimale inhibierende
Konzentration mcg/ml
Bacillus anthracis—=~~-™. ._-«—o$5
BacillUB subtilis, pci-219™ 0,5
Staphylococcus aureus, 209 P— — —— -1,0
Sarclna lutea—————— —— —■ «—1,0
Diplococcus pneumoniae»I— «—« -—,-.«— 1,O
Diploooccus pneumoniae, I-V———■ 1,0
Diplococcus pneumoniae, n—»— —- -«-.O95
Diplocoocus pneumoniae, III — ——0,5
Streptocuccus haemolyticus, ])—· .—.-«. —~ »1,0
Streptococcus haemolyticus, HA-- -1,0
Corynebacteriüm diphiteriae, S « ■·——— ~0„5
Gorynebacterium diphtheriae,T >—-— -.— 0,5
Aus der vorstehenden Tabelle XIII ist zu ersehen, daß hydriertes Tsushimycin gegen gram-positive Bakterien hoch aktiv ist und daß sein antibakterielles Spektrum dem von Tsushimycin entspricht. Die LDc0 von hydriertem Tsushimycin bei Mäusen beträgt 200 bis 300 mg/kg» intravenös.
"Die neue Verbindung, hydriertes Tsushimycin, eignet sich demnach.als Mittel zum Inhibieren des Wachstums von gram-positiven pathogeneft Mikroorganismen. Sie eignet sich zum Sterilisieren von Gegenständen! , z»B» van chirurgischen In- .
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strumeniello Ferner eignet sie sich gur Herstellung von Reinkulturen von Sinaelorganismen, νιο es sich um die Abtrennung eines empfindlichen Organismus von einem resistenten handelt.
Die folgenden Beispiele erläutern bevorzugte AusfUhrungaformen der Erfindung.
Beispiel 1
Ein Näh.?me'dium (20 Liter) wird aus folgenden Stoffen hergestellt:
jo (Gew./VoI).
PlsiBohextrakt—--*-———-.——~—-—i—0,5
Na triumohlDrid——————————O 9 5 Calciumcarbonate-"—""--=""""-'-—--^-'—-—0,35 V/asser bis zu dem gewünschten Volumen (20 Liter).
Nach Einstellen des Gemisches auf einen pH~Wert von 7,0 wird das Medium sterilisiert, mit Streptomyces pseudo» griseolus Z=237 inoculiert und 72 Stunden bei 270C mit 20 Liter Luft pro Minute belüftet und einer Geschwindig= keit von 250 Umdrehungen/Minute gerührt. Nach dieser Zeit
90 9 827/154
~ 47 ~
beträgt die !Concentration an Tsushimycin etwa 100 racg/ml.
Etwa 60 nil PermentationsmaiBche werden unter kräftigem Rühren mit ^ercliirmter Hatriucihyäroxydlösung auf pH 9«5 eingestellt t und mit einer Filterhilfe (600 g Diatomeenerde* Gelite) filtriert» Der Myeelrückstand wird mit 15 Liter V/asser, das auf pH 995 eingestellt ist, gewaschen, illtrat und Waschflüssigkeiten werden vereinigt, mit Salzsäure auf pH ™ 2p0 nngesäuert und mit 15 1 n-ButanoI extrahiert. Die n~Bu~ tanollösimg wird zweimal mit je 5 1 auf pH 995 eingestelltem Wasser geschüttelt? die wässrige Schicht wird auf pH 2,0 eingestellt und mit 3 1 n-Butanol extrahiert. Die schließlich erhaltene n-ButantilXösung v/ird unter yermindertem Druck bis zu einem sirupartigen Rückstand eingeengt, der bei Behandlung mit Äthylacetat ein "braunes Pulrer ergibt* Durch Auflösen in einem möglichst geringen Volumen Methanol und Fällen durch Zugabe von Äthylacetat erhält man 6,2 g i rohes Tsushimycin als blaßbraunes Pulver (Aktivität etwa 67 *).
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Bei 8 ρ i el 2
25 g Aktivkohle (Darco Gr°60) werden in Methanol aufgeschlämmt und auf ein Glasfilter aufgebracht, wodurch eine Schicht von etwa 2 cm Dicke erhalten wird. 5 g des nach Beispiel 1 erhaltenen Rohprodukts werden in 50 ml Methanol gelöst und auf die Kohleschicht aufgegeben. Das Eluat und die anschließend, mit Methanol erhaltene WaschflUssigkeiten werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird mit Äthylocetat behandelt und liefert 2,7 g Tsushimycin als farbloses Pulver (Aktivität etwa 86%) a
Beispiel 3
1*5 g des nach Beispiel 2 erhaltenen entfärbten Produkts werden auf eine Kieselsäuregelsäule (Merck, 0,5-0,8 mm, 300 g; Abmessungen 3,2x70 cm) aufgegeben und mit Äthanol/ 1,4 ^-igem wässrigen Ammoniak (4:1) entwickelt» Tsushimycin wird in teilweißer Überlappung mit einer in geringfügiger J^enge vorliegenden Komponenten eluiert» Die Tsushimycin enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt» Die Behandlung des erhaltenen Rückstands mit Äthanol liefert 1,14 g des Ammoniumsalzes von Tsushimycin ale farbloses feinkristallines Pulver (Aktivität etwa 94 $>).
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- 49 - Beispiel 4
500 mg des nach Beispiel 3 erhaltenen Ammoniumsalzes werden in 50 ml Wasser, das mit verdünnter Salzsäure auf pH 2,0 einge stellt ist, suspendiert und mit n-Butanol extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird in Methanol gelöst und mit Äthylacetat gefällt. Man erhält 348 g r ines Tsushimycin in Form der freien Säure als farbloses amorphes Pulver«
Betipiel 5
Die in Beispiel 1 beschriebene Arbeitsweise wird mit Streptomyces pseudogriseolus Z-242 wiederholt. Aus 60 Fermentationsmaiache erhält man 7,1 g rohre8 Tsushimycin (Aktivität etwa 52 #).
Beispiel 6
Die in Beispiel 1 beschriebene Arbeitsweise wird mit Streptomyces pseudogriaeolus var. glucofermentana var, nov. wiederholt. Aus 60 1 Fermentationsmaische erhält' man 993 g rohes Tsushimycin (aktivität etwa 47 fi)°
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Beispiel . 7 '
Bine Lösung von 500 mg iDsuahimycin in 25 ml Methanol wird mit SO mg AdamBkatalysator versetzt nnü einige Stunden bei Zimmertemperatur und Atmosphärendruck hydriert, wobei etwa 10 ml Wasserstoff aufgenommen werden» Hoch Zugabe von 500 ml Aktivkohle wird filtriert. Das FiItrat wird unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand liefert nach Behandlung mit Ithylacetat hydriertes Tsushimycin in einer Ausbeute von 450 mg.
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Claims (1)

  1. - 51 Patentansprüche
    Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticume, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Tsushimycin erzeugenden Stamm von Streptomyces in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen vermehrt und das ,Antibioticum aus der Fermentationsmaische gewinnt. I
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vermehrung des Mikroorganismus bei einer Temperatur γόη etwa 25 bis 450C durchfuhrt.
    35ο Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vermehrung des Mikroorganismus unter siubmers aeroben Bedingungen durchfuhrt.
    4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
    man die Gewinnung des /ntibiotioums durch Hinstellen j
    des pH-Werts der Fermentationsmaische auf einen alkalischen Wert» Abfiltrieren des Mycels, Einstellen des pH-Werts des Filtrate auf einen sauren Wert und Extrahieren des Mitrats mit einem lösungsmittel bewirkt.
    909827/154 5
    5« Verfahren nach Anspruch 1S dadurch gekennzeichnet, daß man als Tsushimycin erzeugenden Stamm von Streptomyoes Streptomycea pseudogriseolus Z°237» ATOO 21139 verwendet.
    Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnete daß man als Tsushimycin erzeugenden Stamm von Streptomyces Streptomyces pseudogriseolus Z-242, ATCO 21H0 verwendete
    7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Tsushimycin erzeugenden Stamm von Streptomyces Streptomyces pseudogriseolus var. glucofermentans, Tar. nov. /TCG 21141 verwendet.
    8, Das Antibioticum Tsushimycin, dadurch gekennzeichnet, daß es des Wachstum von gram-positiven Mikroorganismen ihhi. biert, ein farbloses amphoteres amorphes Pulver mit einem isoglektrischen Funkt bei etwa pH 3*0 darstelltp das bei 230 - 2400C unter Zersetzung schmilzt9die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff
    in praktisch den folgenden Gewichteverhältnissen enthält i
    Kohlenstoff ———————-.———4g 9 98 # Wasserstoff———————— 7,53 $ Stickstoff———————12^76-Sß
    90 9 82 7/15A5
    eine optische Drehung von /et3 ^ +12j,9°+005°(c»Ot981 # in Methanol)ρ ein Molekulargewicht von etwa 1 400 und ein Neutralisationsäquivalent von 445 hat und das in Fig* 1 der beigefügten Zeichnung dargestellte Infrarotabsorptionaspektruin zeigt.
    9ο Hydriertes Tsushimycin, dadurch gekennzeichnet, daß es das Wachstum von gram-positiven Mikroorganismen inhibiert, durch katalytische Reduktion von Tsushimycin erhalten werden kann, ein farbloses amphoteres amorphes Pulver mit einem isoelektrischen Punkt bei etwa pH 3,0 darstellt, das bei 233 - 2430C unter Zersetzung schmilzt, die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff und Stickstoff in praktisch den folgenden Gewichtsverhältnissen enthält:
    Kohlenstoff-=-=—-—-.———......48,76 #
    Wasserstoff——« >— « — 7572 $
    Stickstoff-——-—™ ———12,40 36
    (Wasser)—— -—· ————— 9*86 $
    eine spezifische Drehung vonfl]2' +Uf1oi0f5o (CssOf944 *
    in Methanol) hat und das in Fig. 2 der beigefügten Zeichnung dargestellte Infrarotabsorptionsspektrum zeigt9
    90982771545
    -SH-- Leerseife
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