DE2760203C2 - Antibiotisch wirksames Oligosaccharid, Verfahren zu seiner Herstellung sowie dieses enthaltendes Arzneimittel - Google Patents

Description

(a) eine Elementaranalyse von:

C«= 43,84%; H = 6,41%;N = 1,08% und 0 = 49,67% (Rest);

(b) eine spezifische, optische Drehung [a$ + 155° (c = 1 in Wasser);

(c) keine charakteristische Absorptionsspitze im UV-Spektrum;

(d) ein IR-Absorptionsspektrum als Kaliumbromidtablette, das dem in der F i g. Ib der Zeichnung wiedergegebenen Spektrum entspricht, das Bestandteil dieses Anspruches ist;

(e) ein kernmagnetisches Resonanzabsorptionsspektrum (Wasserstoff) in Deuterowasser, das dem in der F i g. 2b der Zeichnung wiedergegebenen Spektrum entspricht, das -Bestandteil dieses Anspruches ist; und

(f) einen einzigen Fleck bei einem R-Raffinose-Wert = 0,57 bei der Papierchromatographie mit Äthylacetat/Pyridin/Wasser (10:4:3) als Entwicklerlösungsmittel und bei einem R-Raffinose-Wert = 033 bei der Papierchromatographie mit n-Butanol/Pyridin/EssigsätireAV-asser (6:4:1 :3) als Entwicklerlösungsmittel, wobei die R-Raffinose-Werte unter der Annahme berechnet wurden, daß Raffinose einen einzigen Fleck bei Rf ». 1,00 bei der gleichen Papierchromatographie ergibt

2. Verfahren zur Herstellt ig des antibiotisch wirksamen Oligosaccharide SF-1130-x₂ gemäß Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces myxogenes ATCC 31305 in einem Kulturmedium züchtet, das Nährstoffqueilen, die durch gewöhnliche Mikroorganismen assimilierbar sind, enthält, die Fermentationsbrühe oder das hieraus erhaltene Filtrat durch eine Säule eines stark sauren Kationenaustauscherharzes in der H+-Form schickt, die Harzsäule mit Wasser wäscht, dann die Harzsäule mit 0,1 N wäßrigem Ammoni-

ak wäscht, das Eluat zur Trockene einengt, den Rückstand in Wasser auflöst, die erhaltene wäßrige Lösung auf pH 3,5 durch Zugabe von Schwefelsäure oder Salzsäure einstellt und dann durch eine Säule von Aktivkohle schickt, die Aktivkohlesäule mit Wasser wäscht und dann mit einer wäßrigen Lösung, weiche 30 bis 35% Äthanol enthält, wäscht, das Eluat zur Trockene konzentriert, den Rückstand in Wasser auflöst, die so erhaltene Lösung durch eine Säule eines Kationenaustauscherharzes in der NH₄+-Form schickt, die Harzsäule mit Wasser wäscht und mit 0,1 N wäßrigen Ammoniak eluiert, das Eluat zur Trockene einengt, den Rückstand in Wasser auflöst, die so erhaltene wäßrige Lösung einer Chromatographie auf einem Kationenaustauscherharz in der Pyridiniumsalzform unter Verwendung eines O₁IM Pyridin-Ameisensäure-Puffers (pH = 3,1) als Entwicklerlösungsmittel unterwirft, das Eluat in Fraktionen auffängt, die antibakteriell aktiven Fraktionen miteinander vereinigt und zur Trockene einengt, das dabei erhaltene farblose Pulver in Wasser aufnimmt, die erhaltene wäßrige Lösung einer Chromatographie in einer Cellulosesäule unter Verwendung eines Mischlösungsmittels aus n-Propanol/Äthylacetat/Wasser (6 :1:3 im Volumen) als Entwicklerlösungsmittel unterzieht, das Eluat in Fraktionen sammelt und solche Fraktionen, die einen einzigen Fleck bei einem R-Raffinose-Wert von 0,57 (berechnet unter der Annahme, daß der Rf-Wert von Raffinose = 1,00 ist) bei der Papierchromatographie unter Entwicklung mit Äthylacetat/Pyridin/Wasser (10 :4 :3 im Volumen) ergibt,

miteinander vereinigt und zur Trockene einengt.

3. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt des Oligosaccharide SF-l130-x₂ als aktivem Inhaltsstoff, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger für den aktiven Inhaltsstoff.

4. Arzneimitel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich wenigstens eine der Substanzen Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose oder Maltoheptaose enthält.

Die Erfindung betrifft den Gegenstand der Patentansprüche.

Es sind bereits Aminoglykosid-Antibiotika, beispielsweise Kanamycine bekannt

Eine Anzahl von brauchbaren Substanzen wurden in der Kulturbrühe von verschiedenen Stämmen der Gattung Streptomyces erzeugt und hieraus isoliert. Es ist bekannt, daß Streptomyces myxogenes, SF-1130, der

% durch die Hinterlegungsnummer FERM-P 676 identifiziert wurde, ein Antibiotikum bildet, das als Substanz

f| SK-1130 bezeichnet wurde, siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 30 393/73. Von der Anmelderin wurden

ig weitere Untersuchungen an der Fermentationsbrühe des Mikroorganismus Streptomyces myxogenes SF-II3C

If durchgeführt, wobei gefunden wurde, daß neue, antibiotische Substanzen, welche gegenüber gram-negativen

Il Bakterien aktiv sind, in der Fermentationsbrühe dieses Mikroorganismus gebildet werden. Es gelang, diese

[•i aktiven Substanzen aus der Brühe zu isolieren, und eine der isolierten Substanzen wurde von der Arunelderin als

ψ. Substanz SF-1130-x₂ bezeichnet.

ύ Weiterhin wurde gefunden, daß diese aktive Substanz eine Aktivität aufweist, durch weiche die bei lebenden

Ψ-. Tieren und bei Menschen automatisch vorhandene Immunität davor geschützt wird, mehr oder weniger als

■ χ Folge der Bildung von Tumoren und/oder als Folge der Applikation von die Immunität unterdrückenden

l·? Antitumormitteln reduziert zu werden, und weiterhin wurde gefunden, daß diese aktive Substanz daher als

ils immuno-potentierende Mittel (Immunopotentiator) zur Förderung des Immunansprechens bei lebenden Tieren

% und beim Menschen vorteilhaft ist

'S Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer neuen, antibiotisch wirksamen Substanz, die als antibakte-

$ rielles Mittel und als Aktivator zur Förderung der Immunität bei lebenden Tieren und beim Menschen vorteil-

|( haft ist Weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieser vorteilhaften Substanz.

|S; Später wurde gefunden, daß diese Substanz SF-1130-X2 die folgende allgemeine Formel besitzt:

CH₂OH OH CH₃ CH₂OH

χ - · · ■ · ° ^0Η

OH OH

I OH OH OH OH

Kulturmedium	Wachstum	Luftmycel	lösliches Pigment
Saccharose-Nitrat-agar	schlechtes Wachstum,	gering, weiß	keines
	farblos
G lucose-Asparagin-agar	braun bis	keines	keines
	gräulich-braun, die
	Rückseite ist matt
	in roter Farbe gefärbt
Clyzerin-	braun	keines	keines
Asparagin-agar
Calciummalat-agar	dünnes Wachstum,	keines	keiner-
	blaß-braun
Glyzerin-	braun	keines	keines
Calciummalat-agar

20 25

D-Glucose

Die Substanz SF-1130-x₂ wird durch Kultivierung eines Stammes der Gattung Streptomyces, der bei der »American Type Culture Collection«, Washington D.C, USA unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31305 hinterlegt wurde, gewonnen. Die Kultivierung erfolgt in üblicher Weise in einem wäßrigen, flüssigen Kulturmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthält, unter aeroben Bedingungen.

Der Stamm SF-1130 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 31305 besitzt die folgenden, mikrobiologischen Eigenschaften:

!.Morphologische Beobachtung

Substratmycelien wachsen gut auf verschiedenen Kulturmedien, während die Bildung von Luftmycelen im allgemeinen schlecht ist. Auf Stärkeagar und auf Stärke-Hefe-Extrakt-agar, wo sich Luftmycele entwickeln, werden kurze, dichte Luftmycele aus dem Substratmycel gebildet. Die Mycele bilden einfüßige Verzweigungen, wobei keine quirlständigen Verzweigungen beobachtet werden.

Die Luftmycele tragen an ihren Spitzen Spiralen, die meisten hiervon sind vom kompakten, geschlossenen Typ und einige hiervon sind vom nicht-vollständigen oder offenen Typ. Es wird keine Bildung von Sklerotium beobachtet. Die Beobachtung im Elektronenmikroskop zeigt, daß die Oberflächenstruktur der Sporen glatt ist. Die Sporen sind von elliptischer oder zylindrischer Gestalt und besitzen eine Größe von 0,6—0,7 χ 0,9—1,0 Mikron.

2. Kulturmerkmale auf verschiedenen Kulturmedien sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt

Tabelle 1

55 60 65

Fortsetzung

Kulturmedium

Wachstum

Luftmycel

lösliche; Pigment

5	Stärkeagar	blaß-braun bis	pulverförmig.
		braun	gräulich-braun,
			Entwicklung
			hauptsächlich
			an der Peripherie
10			der Kolonie
	Hafermehlagar	gut, blaß-braun	grau
	Nähragar	gutes Wachstum	keines
		mit Falten,
		braun auf der
15		Rückseite
	Stärke- Hefeextrakt-agar	blaß-braun bis	gräulich-braun
		braun	bis grau
	Hefeextrakt-	gut, rötlich-braun	keines
20	Tyrosinagar	dunkelbraun	keines
	Kartoffelstück	hochstehendes	keines
		Wachstum mit
		Falten, braun
25	Karottenstück	gräulich-braunes	keines
		Wachstum mit Falten
	Gelatine (20° C)	cremefarbig	keines
	Magermilch (37° C)	Wachstum am Boden,	keines
30		blaß-braun
	koaguliertes	dunkelgrau	keines
	Löffler-Serum(37°Q
	Ei (37° C)	dunkelgrau	keines
J5		bis dunkelbraun
	Czapek's-Glucoselösung	Wachstum am Boden,	keines
		cremefarbig
	Cellulose	kein Wachstum

keines

keines braun

blaß-braun braun

schwärzlichbraun braun

blaß-braun

dunkelbraun bis schwarz keines

keines

graues" Pigment ander Peripherie des Wachstums keines

Anmerkung: Die Inkubaiionstemperatur betrug 28° C, falls kein anderer Wert angegeben ist.

3. Physiologische Eigenschaften

Verflüssigung von Gelatine positiv

Hydrolyse von Stärke positiv

Bildung von Tyrosinase positiv

Bildung von Schwefelwasserstoff positiv

Farbgebungsvermögen positiv

Abbau von Cellulose negativ

Reduktion von Nitrat negativ

Peptonisierung von Magermilch negativ

Koagulation von Magermilch negativ

Auflösung von koaguiiertem Löffler-Serum negativ

Zusätzlich zu den oben genannten, physiologischen Eigenschaften bildet der Stamm SF-1130 auf Agarmedium und in einem flüssigen Medium Schleim, wobei dies ein wesentliches Merkmal des betreffenden Stammes ist

Auf einem Agarmedium wie einem Stärke-Hefeextrakt-agar, Stärke-agar oder Glucose-Asparagin-agarmedium wurde beobachtet, daß der Schleim massiv auf der Kolonie in etwa 10 Tagen nach der Inkubation gebildet wird Weiterhin wurde beobachtet, daß bei der Schüttelkultiviening des Stammes SF-1130 in einem flüssigen Medium, welches geeignete Kohlenstoffquellen (Glucose, Stärke usw.) und Stickstoffquellen (Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Weizenkeime usw.) enthält, die Kulturbrühe allmählich viskos unter Bildung eines Schleimes wird.

4. Ausnutzung von Kohlenstoffquellen

(1) Ausgenutzt: Xylose, Glucose, Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Raffmose, Dextrin, Stärke, Glyzerin, Inosit, Natriumacetat, Natriumeitrat und Mannose.

(2) zweifelhaft: Arabinose, Fructose und Salicin.

(3) nicht ausgenutzt: Rhamnose, Inulin, Dulcit, Mannit, Sorbit, Natriumsuccinat und Cellulose.

Die zuvor genannten, mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes SF-1130 können wie folgt zusammengefaßt werden:

(1) Das Lufti.iycel bildet geschlossene Spiralen an seiner Spitze und die Oberflächenstruktur der Sporen ist glatt.

(2) Das Luftmycel, das gräulich-braun bis grau gefärbt ist, wird nur sehr gering gebildet.

(3) Das Wachstum auf synthetischen Kulturmedien ist braun bis gräulich-braun in seiner Färbung.
(4 J Auf organischen Kulturmedien wird Farbgebungsvermögen (Chromogenität) beobachtet.

(5) Auf Agarmedium und in flüssigen Medien wird Schleim gebildet.

Im Hinblick auf die zuvor beschriebene mikrobiologischen Eigenschaften können Streptomyces phaeoochromogenes, Streptomyces purpureochromogenes und Streptomyces noboritoensis als bekannte, mit dem Stamm SI-'-1130 verwandte Stämme genannt werden. Jedoch gehört der Stamm SF-1130 nicht zu einem dieser bekannten Stämme, wie im folgenden gezeigt wird:

Streptomyces phaeochromogenes erzeugt große Mengen an Luftmycei und bildet ein braunes, lösliches Pigment auf Czapek-Saccharoseagar und Calciummalat-agar als Kulturmedien, während der Stamm SF-1130 nur eine geringe Bildung von Luftmycel und keine Bildung von löslichem Pigment auf diesen Kulturmedien zeigt.

Obwohl Streptomyces purpureochromogenes orange bis rötlich-orange gefärbtes Wachstum auf Kartoffelstucibcnmcdiurn zeigt, bildet dieser Stamm keinen Schwefelwasserstoff und bewirkt die Koaguiierung von Magermilch, während der Stamm SF-1130 auf dem gleichen Medium ein braunes Wachstum zeigt und die Bildung von Schwefelwasserstoff jedoch keine Koaguiierung von Magermilch hervorruft.

Streptomyces noboritoensis bildet keine Spiralen und erzeugt ein grünes, lösliches Pigment auf Stärkeagarmcdium (die Bildung des grünen, löslichen Pigmentes ist nicht in den früheren Dokumenten erwähnt, jedoch wird sie tatsächlich für diesen Typ von Stamm in nennenswerter Weise beobachtet), während der Stamm SF-1130 Spiralen bildet jedoch kein lösliches Pigment auf Stärke-synthetischen Agar bildet. Darüber hinaus unterscheidct sich der Stamm SF-1130 von Streptomyces noboritoensis auch in der Ausnutzung bzw. Annahme von Mannit und Saccharose.

Daher unterscheidet sich der Stamm SF-1130 deutlich von jedem der bekannten, verwandten Arten der Gattung Sireptomyces. Der Stamm SF-1130 unterscheidet sich weiterhin von irgendwelchen anderen bekannten Specien von Streptomyces dadurch, daß der Stamm SF-1130 die besondere Eigenschaft der Bildung von Schleim, Wn. bereits zuvor beschrieben, zeigt, während die anderen Specien von Streptomyces keinen Schleim entsprechend den früheren Veröffentlichungen bilden.

Hieraus ergibt sich, daß der Stamm SF-1130 als neue Specie der Gattung Streptomyces identifiziert wurde, wobei er als »Streptomyces myxogenes SF-1130« bezeichnet wurde.

Der Stamm SF-1130 besitzt Eigenschaften, die variieren können, wie dies üblicherweise auch bei anderen Specien von Streptomyces beobachtet wird. So kann beispielsweise der Stamm SF-1130 Varianten oder Mutanten bilden, wenn er mit verschiedenen Muiagenen wie UV-Strahlen, Röntgenstrahlen, hochfrequenten elektromagnetischen Wellen, radioaktiver Strahlung und Chemikalien behandelt wird. Jede natürliche oder künstliche Variante oder Mutante des Stammes SF-1130 kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, solange er noch die Fähigkeit zur Bildung der Substanz SF-113O-X2 aufweist ^o

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der eingesetzte Stamm in an sich bekannter Weise in einem Kulturmedium gezüchtet werden, das Nährstoffquellen, die durch gewöhnliche Mikroorganismen assimilierbar sind, enthält. Zu diesem Zweck kann jeder bekannte Nährstoff verwendet werden, der ganz allgemein bei der Kultivierung von bekannten Stämmen von Streptomyces verwendet wurde. Beispiele von anwendbaren Nährstoffquellen umfassen: Glucose, Stärke, Maltosesirup und Melassen als Kohlenstoffquellen und Sojabohnen- « mehl, Weizenkeime, getrocknete Hefe, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Ammoniumsulfat und Natriumnitrat als Stickstoffquellen. Gegebenenfalls können anorganische Salze wie Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphate und dergleichen zugesetzt werden. Zusätzlich können solche organischen und anorganischen Materialien, welche das Wachstum des verwendeten Stammes unterstützen und die Bildung der Substanz SF-II3O-X2 fördern, in das Kulturmedium eingegeben werden.

Als Züchtungsmethode, die gemäß der Erfindung angewindt werden kann, ist die Flüssigkeitskultivierung, insbesondere unter aeroben Tauchbedingungen bevorzugt, wie sie im allgemeinen bei der Herstellung von Antibiotika angewandt wird. Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen, vorteilhafterweise bei einer Temperatur von 25 bis 38⁰C und besonders häufig bei einer Temperatur in der Nähe von 28° C durchgeführt. Unter diesen Umständen erreicht die Bildung der Substanz SF-1130-X2 in der Kulturbrühe ein Maximum nach einer Schüttelkultivierung oder einer Tankkultivierung während einer Periode von 2 bis 5 Tagen.

Zur Untersuchung der erfindungsgemäßen Substanz SF-1130-x₂ kann die folgende Arbeitsweise angewandt werden: Als Untersuchungskulturmedium wird ein Medium verwendet, welches 04% Pepton, 03% Fleischextrakt und 1,5% Agar, (pH = 6Xbekannt als Mycin-Untersuchungsagarmedium) zusammen mit 0,125% Maltotriose enthält Als Untersuchungsmikroorganismus wird Escherichia coli K-12R verwendet. Die Untersuchung kann üblicherweise nach der konventionellen Papierscheibenmethode durchgeführt werden.

Die Substanz SF-1130-X2 ist ein Oligosaccharid von schwach basischer Natur, das die im folgenden angegebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften besitzt und unter Ausnutzung dieser physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substanz SF-1130-X2 kann sie aus der Kulturbrühe gewonnen und dann gereinigt werden. Beispielsweise kann die Reinigung durch Adsorption auf Kohle, Chromatographie unier Verwendung von wäßrigem Alkohol als Elutionsmittel oder durch Umfällung aus Mischlösungsmittel Wasser/Äthanol erreicht werden.

Beispielsweise kann die Substanz SF-1130-X2 nach der folgenden Arbeitsweise aus der Fermentationsbrühe

gereinigt und isoliert werden: Die die Substanz SF-1130-x₂ enthaltende Fermentationsbrühe wird auf pH = 3 durch Zugabe von z. B. Schwefelsäure oder Salzsäure angesäuert uih! dann unter sauren Bedingungen /ur Entfernung der Mycele und der unlöslichen Stoffe filtriert, und das Brühenfiltrat wird durch eine Säule von Aktivkohle zur Adsorption der aktiven Substanzen durchgeschickt. Die Aktivkohlesäure wird dann mit 50% Aceton/Wasser eluiert, d. h. einem Gemisch von Aceton und Wasser in einem Verhältnis von 1 :1 im Volumen, um die Substanz SF-1130-X2 von der Aktivkohle zu desorbieren. Das Eluat wird zur Trockne konzentriert, und der Rückstand wird in Wasser aufgelöst. Die erhaltene, wäßrige Lösung wird wiederum durch eine Säule von Aktivkohle zur Adsorption durchgeschickt, und die Aktivkohlesäule wird dann aufeinanderfolgend mit wäßrigen Lösungen ehiiert, welche Äthanol in unterschiedlichen Konzentrationen im Bereich von 5 bis 25 Vol.-% enthalten. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, und solche antibakteriellen aktiven Fraktionen, welche die Substanz SF-1130-X2 enthalten, werden miteinander vereinigt und konzentriert. Zu der konzentrierten Lösung wird ein Volumen an Äthanol zugesetzt, um die Substanz SF-1130-x₂ auszufällen, wobei diese leicht als rohes Pulver gewonnen wird. Das in dieser Weise erhaltene, rohe Pulver enthält einen wesentlichen Anteil von neutralen Oligosacchariden und insbesondere Maltodextrin, weiche in der Fermentationsbrühe ebenfalls crzeugt werden. Um ein hochreines Produkt der Substanz SF-1130-X2 zu erhalten, wird es daher mehr bevorzugt, die folgende Arbeitsweise der Gewinnung anzuwenden:

Die Fermentationsbrühe des Stammes SF-1130, welches die Substanz SF-1130-X2 enthält, oder das hieraus erhaltene Brühenfiltrat wird durch eine Säule eines stark sauren Kationenaustauscherharzes in der H+-Form zur Adsorption der Substanz SF-1130-X2 geschickt. Die Harzsäule wird gut mit Wasser gewaschen, um hierauf Spuren der neutralen Oligosaccharide wie Maltodextrin, Maltopentaose und Maltohexaose zu entfernen, die gegebenenfalls an das Harz aus der Fermentationsbrühe gebunden wurden. Nach dem Waschen wird die Harzsäule mit O₁IN wäßrigem Ammoniak zur Desorption der Substanz SF-1130-X₂ gewaschen. Das Eluat wird zur Trockne eingeengt, und der Rückstand wird in Wasser aufgelöst. Die erhaltene, wäßrige Lösung wird auf pH = 3,5 durch Zugabe von Schwefelsäure oder Salzsäure eingestellt und dann durch eine Säule von Aktivkohle zur Adsorption der Substanz SF-1130-X2 durchgeschickt. Die Aktivkohlesäule wird mit Wasser gewaschen und dann mit einer wäßrigen Lösung, welche 30 bis 35% Äthanol enthält, gewaschen. Das Eluat wird zur Trockne konzentriert, der Rückstand wird in Wasser aufgelöst, und die so erhaltene Lösung wird wiederum durch eine Säule eines Kationenaustauscherharzes in der NH.4⁺-Form durchgeschickt. Die Harzsäule wird mit Wasser gewaschen und mit 0,1N wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wird zur Trockne eingeengt, der Rückstand' wird in Wasser aufgelöst, und die so erhaltene, wäßrige Lösung wird einer Chromatographie auf einem Kationenaustauscherharz in der Pyridiniumsalzform unter Verwendung eines 0,1 M Pyridin-Ameisensäure-puffcrs (pH = 3,1) als Entwicklerlösungsmittel unterworfen. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, und die antibakteriell aktiven Fraktionen werden miteinander vereinigt und zur Trockene eingeengt, wobei ein farbloses Pulver erhalten wird, welches die Substanz SF-1130-x₂ in Form eines Gemisches der Substanz SF-1130-x₂ mit einem weiteren Oligosaccharid enthält. Dies rohe Pulver kann als solches zur Durchführung des Tests der Abschätzung der physiologischen Eigenschaften der Substanz SF-1130-X₂ verwendet werden. Für die Isolierung der Substanzen SF-1130-X2, falls erforderlich, wird das zuvor genannte, farblose, das Gemisch dieser Substanzen enthaltende Pulver in Wasser aufgenommen, und die erhaltene, wäßrige Lösung wird dann einer Chromatographie in einer Cellulosesäule unter Verwendung eines Mischlösungsmittels aus n-Propanol/Äthylacetat/Wasser (6 :1 :3 im Volumen) als Entwicklerlösungsmittel unterzogen. Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt, und solche Fraktionen, die einen einzigen Fleck bei einem R-Raffinose-Wert von 0,57 (berechnet unter der Annahme, daß der Rf-Wert von Raffinose = 1,00 ist) bei der Papierchromatographie unter Entwicklung mit Äthylacetat/Pyridin/ Wasser (10 :4 :3 im Volumen) ergeben, werden miteinander vereinigt und zur Trockne unter Lieferung der Substanz SF-1130-x ais farbloses Pulver eingeengt

Die Substanz SF-1130-x₂ weist folgende Merkmale auf:

(a) Bei der Elementaranalyse wurden gefunden:

C «= 43,84%; H = 6,41%; N = 1,08% und O = 49,67% (Rest);

(b) eine spezifische optische Drehung von [a$ = +155°fc= 1 in Wasser);

(c) sie besitzt keine charakteristische Absorptionsspitze im UV-Absorptionsspektrum;

(d) sie besitzt ein IR-Absorptionsspektrum in Form einer Kaliumbromidtablette, das dem in der Fig. Ib der Zeichnung wiedergegebenen Spektrum entspricht;

(e) sie besitzt ein kernmagnetisches Resonanzabsorptionsspektrum auf Wasserstoff in Deuterowasser, das dem in der F i g. 2b der Zeichnung wiedergegebenen Spektrum entspricht; und

(f) sie gibt einen einzigen Fleck bei R-Raffinose = 0,57 bei der Papierchromatographie mit Äthylacetat/Pyridin/Wasser (10 :4 :3) als Entwicklerlösungsmittel und bei R-Raffinose = 033 bei der Papierchromatographie mit n-ButanoI/Pyridin/Essigsäure/Wasser (6:4:1 :3) als Entwicklerlösungsmittel, wenn die R-Raffinose-Werte unter der Annahme berechnet werden, daß Raffinose einen einzigen Reck bei Rf = 1,00 bei der gleichen Papierchromatograhie ergibt
eo

Die zuvor genannten und die weiteren physikalisch-chemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Substanzen SF-1130-X₂ sind in der folgenden Tabelle II gezeigt

Tabellen

Eigenschaften

SF-1130-X₂

Aussehen Schmelzpunkt Elementaranalyse (%)

Molgewicht (bestimmt nach der Dampfdruckmethode) spezifische, optische Drehung UV-Absorptionsspektrum I R-Absorptionsspektrum Wasserstoff kern-Absorptionsspektrum Löslichkeit:

löslich in:

weniger löslich in:

unlöslich in: Stabilität:

Farbreaktion: positiv bei:

R-Raffinose-Werte beider Papierchromatographie (unter der Annahme, daß Rf von Raffinose = 1,00 ist)

i) entwickelt mit

Äthylacetat/Pyridin/Wasser

(10:4:3) ii) entwickelt mit n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser (6:4:1:3)

farbloses, geruchloses, amorphes Pulver

195°C(Zers.)

C = 43,84

H = 6,41

N = 1,08

900

[<χψ + 155Vc= 1, Wasser)
keine charakt. Absorptionsspitze
in F i g. 1 b wiedergegeben
in F i g. 2b wiedergegeben

Wasser, Dimethylsulfoxid

Methanol, Äthanol

Aceton, Äthylacetat, Chloroform. Benzol

stabil unter neutralen Bedingungen,

jedoch etwas instabil unter sauren

und alkalischen Bedingungen

Silbernitrat, Tetrazoliumrot, Anthron, Ninhydrin
und Greig-Leaback-Reagenz

0,57

0,33

Im Falle der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Anwendung des zuvor erwähnten Siammes SF-1130 enthält die entstandene Kulturbrühe zusätzlich zu der Substanz SF-1130-x₂ und einem weiteren Oligosaccharid das bekannte Antibiotikum, Substanz SF-1130, siehe japanische Patentveröffentlichung 30 393/73, wie auch Maltopentaose und Maltohexaose, die von dem Stamm SF-1130 erzeugt werden; wegen dieser beiden letztgenannten Substanzen wird auf die am gleichen Tag hinterlegte deutsche Patentanmeldung der Anmelderin entsprechend der japanischen Patentanmeldung 99 756/76 verwiesen.

Die Substanz SF-1130 ist ein neutrales Oligosaccharid, welches in Wasser leicht löslich, in Methanol und Äthanol kaum löslich und in Aceton nicht-löslich ist, während Maltopentaose und Maltohexaose neutrale Oligosaccharide sind, die in Wasser leicht löslich, in Methanol kaum löslich jedoch nicht-löslich in Äthanoi und Aceton sind. Im Gegensatz dazu ist die erfindungsgemäße Substanz SF-1130-x₂ ein Oligosaccharid mit basischer Natur, das leicht in Wasser löslich ist, weniger in Methanol und Äthanol löslich ist, jedoch nicht in Aceton löslich ist. Durch Ausnutzung dieser Unterschiede in den Eigenschaften der zuvor genannten, neuen Substanz und der bekannten Substanzen kann die Substanz SF-1130-x₂ von der Substanz SF-1130 wie auch von Maltopentaose und Maltohexaose abgetrennt werden. Beispielsweise kann die Fermentationsbrühe des Stammes SF-1130 durch Zugabe der geeigneten, anorganischen Säure wie Salzsäure oder Schwefelsäure angesäuert und filtriert werden. Wenn das so erhaltene, angesäuerte Brühenfiltrat durch eine Säule eines stark sauren Kationenaustauscherharzes in der H+-Form geschickt wird, wird die Substanz SF-1130-x₂ und das weitere Oligosaccharid von dem Harz adsorbiert, während die neutralen Oligosaccharide wie Maltopentaose und Maltohexaose durch die Harzsäule ohne Adsorption durch das Harz durchtreten. Wenn das die Substanz SF-1130-x₂ hierauf adsorbiert enthaltende Harz mit 0,1N wäßrigem Ammoniak als Elutionsmittel behandelt wird, wird die Substanz SF-1130-x₂ aus dem Harz eluiert

Die Substanz SF-1130-X2 ist ein Oligosaccharid von schwach basischer Natur in Form eines farblosen Pulvers, das in Wasser und Dimethylsulfoxid löslich ist, weniger löslich in Methanoi und Äthanol ist, jedoch in Aceton, Äthylacetat, Chloroform und Benzol unlöslich ist und wobei die Substanz eine positive Reaktion mit Silbernitrat, Tetrazoliumrot, Anthron, Ninhydrin und Greig-Leaback-Reagenz zeigt und wobei die Substanz mit Säure unter Bildung von Glucose hydrolysierbar ist

In der Zeichnung sind in den Figuren folgende Spektren wiedergegeben:

F i g. 1 b die Kurve des IR-Absorptionsspektrums einer Probe der erfindungsgemäßen Substanz SF-1130-x₂ als Pellet in Kaliumbromid;

Fig.2b die Kurve des kernmagnetischen Resonanzabsorptionsspektrums (Wasserstoff) einer Probe der Substanz SF-1130-x₂, bestimmt in Deuterowasser bei 100 MHz.

Die antibakterielle Aktivität der Substanz SF-1130-x₂ zur Hemmung des Wachstums von verschiedenen Bakterien wurde nach der konventionellen Papierscheiben-Plattenmethode abgeschätzt. Hierzu wurde die

Substanz SF-1130-x₂ in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 1 mg/ml oder 2 mg/ml aufgelöst, und *y

mit den so hergestellten Testlösungen wurden aus Filtrierpapier hergestellte Papierscheiben mit 8 mm Durch- IJ

messer imprägniert, die anschließend an der Luft getrocknet wurden. Diese Papierscheiben wurden auf eine H

obere Plattenschicht des bekannten Mycin-Untersuchungsinkubationsmediums aufgelegt, welches 0,5%Pepton, |3

03% Fleischextrakt und 1,5% Agar (pH = 6) umfaßte, und welches die hierin zu inkubierenden Testmikroorga- f£

nismen enthieJt, wobei dieses über die untere Schicht von Agarmedium in der Untersuchungsschale gelegt ρ

wurde. Die Inkubation wurde bei einer Temperatur von 37° C über Nacht durchgeführt, und anschließend wurde M

der Durchmesser der rings um die Papierschreiben gebildeten Hemmzonen ausgemessen. Die so erhaltenen ||

Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt, hieraus ist ersichtlich, daß die Substanz ti

to SF-1130-X₂ keine antibakterielle Aktivität gegenüber den gram-positiven Bakterien und den säurebeständigen |j

Bakterien besitzt. Diese Tests wurden in der gleichen Weise wie zuvor jedoch unter zusätzlicher Eingabe von W_t 1,25 mg/ml an Makotriose in die obere Plattenschicht des Mycin-Untersuchungsinkubationsmediums wieder- §5

holt Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle III gezeigt, hieraus ist ersichtlich, daß die %

zusätzliche Anwesenheit von Maltotriose die antibakterielle Aktivität der Substanz SF-1130-x₂ verbessert Bei I]

is gleichartigen Tests wurde weiterhin gefunden, daß bei kombinierter Verwendung von Maltose oder einem K

Maltodextrin einschließlich Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose und Maltohexaose mit der Substanz β

SF-1130-x₂ die zuerst genannten Substanzen im allgemeinen die antibakterielle Aktivität der erfindungsgemä- '■/] Ben Substanz SF-1130-x₂ verbessern, mit der Ausnahme, daß eine Verbesserung der antibakteriellen Aktivität i

gegenüber Klebsieila pneumoniae nicht beobachtet wird. Alle Ergebnisse der in diesem Zusammenhang durch- /

geführten Tests sind in der Tabelle III aufgeführt Es ist darauf hinzuweisen, daß Maltotriose und andere :"

Maltodextrine überhaupt keine antibakterielle Aktivität unter den zuvor genannten Testbedingungen zeigen. d

Tabelle IH Ϊ3

^ 7..Λ

Tesunikroorganisimis Durchmesser der Hemmzone (mm) mit der Substanz SF- 1130-xi ?|

keine zusätzL zusätzL '■':._

Anwendung von Maltotriose Anwendung von Maltotriose £ Gehalt an SF-1130-X₂ ϊά

2 mg/ml 1 mg/ml 2 mg/ml 1 mg/ml .·,'

Escherichiacoli IAM1239 0 0 14,8 14,2 '■:

Escherichiacoli K-12 13,0 gering 18,8 153 V

Escherichiacoli 14,5 13,4 23,6 203 ;j

(resistent gegenüber Chloramphenicol) C

Escherichiacoli IAM1264 15,2 123 25,4 23,6 %

Shigellasonnei 13,0 0 193 17,8 γ-

Proteus vuigaris gering Ö 15,4 12,8 '■?.

Salmonella typhi 13,4 11,4 19,0 17,6

Klebsieila pneumoniae 13,2 11,5 13,2 11,0

Bacillus subtilis 0 0 0 0 f-.

Staphylococcus aureus 0 0 0 0 f-\

Sarcinalutea 0 0 0 0 B

Mycobacterium smegmatis 607 0 0 0 0 -Ά

Aus den Ergebnissen von weiteren Untersuchungen wurde gefunden, daß die Verbesserung der antibaktericl- Ά len Aktivität der Substanz SF-1130-xj, welche der zusätzlichen oder kombinierten Verwendung von Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose oder Maltohexaose zuzuschreiben ist, signifikant ist, wenn Maltose . oder Makodextrin, wie sie oben genannt wurden, zusätzlich in einem Anteil eingesetzt wird, der von 0,1 bis 20 ■

Gew.-Teilen auf 1 Gew.-Teil der Substanz SF-1130-x₂ beträgt

Zur Abschätzung der akuten Toxizität der Substanz SF-1130-X₂ wurden wäßrige Lösungen der Substanzen SF-1130-x₂ subkutan an Mäusen injiziert, wobei gefunden wurde, daß alle untersuchten Mäuse bei Dosismengen bis zu 400 mg/kg überlebten. Aus den Ergebnissen von weiteren Untersuchungen auf akute Toxizität wurde .";; gefunden, daß die Substanz SF-1130-x₂ einen LDso-Wert von nicht mehr als 500 mg/kg bei der intravenösen ;

Injektion an Mäusen besaß. Hieraus ist ersichtlich, daß die Substanz SF-1130-xj eine sehr geringe Toxiziiät besitzt.

Tests auf Zell-vermittelte Immunität wurden nach der bekannten Technik der verzögerten Hypersensitiviiät unter Anwendung von Mäusen durchgeführt, die mit einem Bauchwassersuchttumor »Sarcoma 180« geimpft waren, und aus den erhaltenen Ergebnissen dieser Untersuchungen wurde gefunden, daß die Substanz SF-1130-x₂ einen immunopotentierenden Effekt bei Tumor aufweisenden Tieren, deren Immunität erniedrigt ist, besitzt Außerdem wurde aus weiteren Tests gefunden, daß die zuvor genannte Aktivität der Substanz SF-1130-xj ebenfalls wirksam ist, um den die Immunität unterdrückenden Effekt eines Antitumormittels wie von Cyclophosphamid (einer Präparation von N,N-Bis-(2-chloräthyl)-tetrahydro-2H-13,2-oxazophophorin-2-amin-2-oxid) umzukehren und vollständig die Immunreaktionsfähigkeit von lebenden Tieren wieder herzustellen. Hieraus ist ersichtlich, daß die Substanz SF-1130-x₂ eine immunomodulierende Aktivität bei lebenden Tieren besitzt Ergebnisse von weiteren, ähnlichen Tests zeigten, daß die zusätzliche Verwendung eines Maltodextrins und insbesondere von Maltopentaose und Maltohexaose, die Aktivität der Substanz SF-I l30-x₂ zur Erhöhung der ImmunreaktiviUt signifikant verbessert.
Die Untersuchungen wurden nach folgender Methode durchgeführt: Gruppen von Mäusen vom Stamm

ICR-JCL (6 männliche Mäuse pro Gruppe, durchschnittliches Körpergewicht 313 ±3 g) wurden mit dem Bauchwassersuchttumor »Sarcoma 180« (10⁶ Zellen) geimpft 24 Stunden nach dem Einimpfen der Tumorzellen wurde jede der zu untersuchenden Arzneimittelproben subkutan appliziert, und ein bekanntes Antitumormittel (Cyclophosphamid) wurde intraperitoneal bei den geimpften Mäusen appliziert 2 Tage nach der Impfung wurde eine äihanolische Lösung von 5% Picrylchlorid auf den Bauch der Mäuse, bei welchen die Haare abrasiert worden waren, zur Herbeiführung einer Sensibilisierung aufgetragea Anschließend wurde jede untersuchte Arzneimittelprobe subkutan einmal am Tag für die nachfolgenden 4 Tage appliziert 4 Tage nach dem Impfen wurde Cyclophosphamid erneut appliziert 9 Tage nach dem Impfen wurde eine Lösung von 1% Picrylchlorid in Olivenöl auf die beiden Seiten von beiden Ohren der Mäuse aufgebracht, um die zweite Sensibilisierung herbeizuführen. 24 Stunden nach der zweiten Sensibilisierung wurde das Ausmaß (%) der Zunahme der Dicke der Ohren bei den Testmäusen berechnet Das Ausmaß des Anschwellens, welches als ein Maß zur Stimulierung der durch Zellen vermittelten, herbeigeführten Immunität dient, kann aus der prozentualen Zunahme der Dicke der Ohren bestimmt werden. Die Probe der bei diesem Test verwendeten Substanz SF-1130-x war ein Gemisch der weiteren Oligosaccharids und der Substanz SF-1130-X2 in einem Gewichtsverhältnis von 1:2. Die erhaltenen Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle TV zusammengestellt

Tabelle IV	Dosis (mg/kg)	Ausmaß der Zunahme	Prozentuale
Applizierte Arzneimittelprobe		der Stärke des	Zunahme
		Ohres(xlO-3cm)
	100	9,2 ± 1,88	119^
SF-1130-x	100 + 75	10,4 ± 4^5	135,1
SF-1130-x + Cyclophosphamid	100 + 200	10,4 ± 3,12	135,2
SF-1130-x + Maltohexaose	100	93 ± 2,03	127,2
SF-1130-X2	75	4,0 ± 2,60	51^
Cyclophosphamid		7,7 ± 2,06	100,0
unbehandelt

Weitere Tests unter Anwendung von festem Tumor von Sarcoma 180 wurden durchgeführt, um zu zeigen, daß die erfindungsgemäße Substanz SF-1130-x₂ zur Förderung des Immunansprechens bei lebenden Tieren aktiv ist Diese Tests wurden nach folgender Methode durchgeführt: Gruppen von Mäusen vom ICR-Stamm (5 männliche Mäuse pro Gruppe; Durchschnittskörpergewicht 20 ±2 g) wurden subkutan in der Flanke mit einer Zellensuspensibn von Sarcoma 180 (7 χ ΙΟ⁶ Zellen/0,05 ml) geimpft 6 Tage und 5 Tage vor dem Einimpfen der Tumorzellen bei diesen Mäusen wurde intraperitoneal ein Gemisch von SF-1130-x₂ und Maltopentaose in einem Gewichtsverhältnis von 1 :9, wie in Beispiel 2 erhalten, appliziert 10 Tage nach dem Einimpfen wurde der gebildete Tumor aus dem Körper der Mäuse entfernt, und die Größe und das Gewicht des primären Subkutantumors wurden bestimmt Die erhaltenen Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle V zusammengestellt; hieraus ist ersichtlich, daß eine Vorbehandlung mit der erfindungsgemäßen Substanz SF-1130-x₂ vor der Einimpfung von Sarcoma 180 eine signifikante Hemmung des Wachstums des festen Tumors bewirkt

In einem getrennten Experiment wurden männliche Mäuse vom ICR-Stamm (jeweils 5 pro Gruppe mit einem Durchschnittskörpergewicht von 20 ±2 g) in der Flanke mit 7 χ 10⁶ lebenden Tumorzellen von Sarcoma 180 in 0,05 ml geimpft Nach 24 Stunden wurde jede Gruppe der Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 0,1 ml von Salzlösung oder in Salzlösung aufgelöster Probe während 5 aufeinanderfolgenden Tagen behandelt 7 Tage nach dem Impfen wurden alle Mäuse getötet und der primäre Subkutantumor herausgeschnitten und ausgewogen. Die Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle V zusammengestellt Die Substanz SF-1130-X₂ in Kombination mit Maltodextrin oder Mitomycin C zeigte einen signifikanten Effekt auf die Hemmung des Wachstums des Tumors.

Tubelle V	Dosierung	Tumorgewicht	Tumorgröße	Ausmaß (%) der
Appliziertes Arzneimittel	(mg/kg)	(g)	(cm1)	Hemmung des
				Wachstums des
				Tumors
	200	0,07	0,141	533
SF-1130-x2 +	(Vordosierung)
Multopentaose	100	0,06	0,167	60,0
SF-1130-x2 +	(Vordosierung)
Maltopentaose	20	0,08	0,151	46,8
SF-1130-x	(Vordosierung)
	0	0,15	0,326	—
Kontrolle,
keine Behandlung	200	0,26		66
S F-1130-X2 +
Maltopentaose	100	0,28		64
SF-1130-xj +
Maltopentaose

Fortsetzung

Appliziertes Arzneimittel	Dosierung	Tumorgewicht	Turaorgroße	Ausmaß (%) der
	(mg/kg)	(g)	(cm3)	Hemmung des
				Wachstums des
				Tumors

SF-1130-X₂ + Maltopentaose + Mitomycin C Mitomycin C Kontrolle, keine Behandlung

100+2

0,43 0,78

In der obigen Tabelle wurde das Ausmaß (%) der f-iemmisng des Wachstums des Tumors nach folgender Gleichung berechnet:

Hemmung = ι 1 —

Gewicht des behandelten Tumors^ Gewicht des Kontrolltumors J

xlOO.

Bei weiteren Untersuchungen wurden die Mäuse des ICR-Stammes intraperitoneal mit Sarcoma 180 geimpft, um Bauchwassersuchttumor zu entwickeln. Nach der Entwicklung des Tumors wurde die Substanz SF-1130-x intraperitoneal bei den von dem Tumor befallenen Mäusen appliziert, wobei gefunden wurde, daß die Substanz SF-1130-x überhaupt keinen günstigen Einfluß bei der Heilbehandlung des Tumors Sarcoma 180 zeigte. Dies legt keine signifikante abtötende Aktivität der Substanz SF-1130-x gegenüber Tumorzellen nahe. Daher wurde geschlossen, daß die Substanz SF-1130-x in der Lage ist, die Immunresistenz des Wirtes gegenüber dem Tumor Sarcoma 180 zu aktivieren oder zu fördern, so daß ein offensichtlicher, therapeutischer Effekt der Substanz SF-1130-x gegenüber dem Tumor nur dem immunopotentierenden Effekt zuzuschreiben ist

In neuerer Zeit wurde gefunden, daß durch Protozoan infizierte Patienten und Tumore aufweisende Patienten ein beträchtlich reduziertes Immunansprechen im Vergleich zu normalen Personen besitzen, welche weder an einer Protozoan-Infektion noch an einem Angriff von Tumoren leiden, und daß die Immunotherapie bei der klinischen Praxis in einer solchen Weise begonnen werden muß, daß die Wiederherstellung des nicht-beeinträchtigten, immunologische,", Ansp"chens den therapeutischen Effekt eines applizierten Arzneimittels begünstigen kann. Für diese Anwendung ist der Einsatz solcher Immunaktivatoren wie der bakteriellen Zellen von BCG-Vaccine wie auch von verschiedener Polysacchariden, die alle ein hohes Molekulargewicht besitzen, bekannt. Da kein Bericht hierüber erfolgte, war es überraschend, daß die Substanz SF-1130-x, welche ein Gemisch von Cügosacchariden mit relativ niedrigem Molekulargewicht ist, zur Aktivierung des immunologischen Systems wirksam ist Es ist klar, daß die Anwendung von Oligosacchariden von relativ niedrigen Molekulargewichten bei der Praxis günstiger ist als die Verwendung der Polysaccharide, weil die Oligosaccharide normalerweise leichter von lebenden Tieren (lebenden Korpern) absorbiert und hieraus wieder ausgeschieden werden und weniger die Ursache von nicht-erwünschten, allergischen Reaktionen sind und die Gefahr einer Tuberkulose nicht gegeben ist

Noch weitere Untersuchungen zeigten, daß die Substanz SF-1130-x eine Aktivität zur Verhütung von bakteriellen Infektionen bei Tieren besitzt Diese Tests wurden wie folgt durchgeführt: Die in Beispiel 1 erhaltene Substanz SF-1130-x (d.h. ein Gemisch der Substanz SF-1130-X2 und des weiteren Oligosaccharids in einem Gewichtsverhältnis von 2:1) wurde in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (pH = 7,2) in einer Konzentration von 0,1 oder 0,5%, bezogen auf die Substanz SF-1130-x, aufgelöst, und die erhaltene Lösung der Substanz SF-1130-x wurde intraperitoneal bei den Testmäusen in einer Dosis von 50 mg/kg/Tag 0,2 ml oder 10 mg/kg/ Tag/0,2 ml dreimal in einem Zeitintervall von 48 Stunden appliziert. Die verwendeten Testmäuse waren Mäuse vom Stamm JCL : ICR (8 männliche Mäuse pro Gruppe, durchschnittliches Körpergewicht 20 g). 72 Stunden nach der abschließenden Applikation wurden die Mäuse intraperitoneal mit 0,5 ml/Maus einer Zellsuspension von Staphylococcus aureus, Stamm Smith-S-424, geimpft, welche durch Verdünnung der inkubierten Kultur dieses Stammes mit physiologischer Salzlösung und anschließende Zugabe von 5% Mycin hergestellt worden war. Die Anzahl der überlebenden Mäuse wurde für 5 Tage nach dem Impfen bestimmt, und die LD50- Werte der Bakterienzellen, welche 50% der Wirtstiere töteten, wurde in jedem Fall berechnet Kontrolltests wurden ebenfalls durchgeführt, bei denen die Behandlung mit der Substanz SF-1130-x ausgelassen wurde.

Die hierbei erhaltenen Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI zusammengestellt, hieraus ist ersichtlich, daß die Applikation der Substanz SF-1130-x zu einer Erhöhung des LD50-Wertes der Bakterienzellen um annähernd das 11,4-fach bei einer Dosis von 50 mg/kg und um annähernd das 8,1-fach bei einer Dosis von 10 mg/kg der Substanz SF-1130-x im Vergleich zu den Kontrolltests bewirkt, was zeigt, daß die Substanz SF-1130-x einen Präventiveffekt gegenüber bakterieller Infektion trotz der Tatsache besitzt, daß die Substanz SF-1130-x selbst keine antibakterielle Aktivität gegenüber Staphylococcus aureus, wie in der Tabelle IM zuvor gezeigt, aufweist.

10

Tabelle VI Dosis der Substanz Oberlebende Mause bei verschiedenen Dosen . SF-1130-x von eingeimpften Bakterien (Zellen/Maus) Bakterienzellen

9,3 χ 10⁷ 13 χ 10⁷ 3,7 χ ΙΟ⁶ 7,4 χ ΙΟ⁵

50 mg/kg 1/8 5/8 7/8 8/8 2,4 χ ΙΟ⁷

10 mg/kg 1/8 3/8 7/8 7/8 1,7 χ ΙΟ⁷

Kontrolle - 0/8 2/8 8/8 2,1 χ ΙΟ⁶

Es ist bekannt, daß einige Immunaktivatoren manchmal bei einer Behandlung einer Krankheit als Folge einer Autoimmunisierung wirksam sind, z.B. bei.Rheumatismus. Aus den folgenden Tests ist ersichtlich, daß die Substanz SF-1130-x zur Verhinderung der Entwicklung von experimenteller Arthritis signifikant wirksam ist, wobei angenommen wurde, daß diese in gewisser Beziehung mit Rheumatismus steht Die Tests wurden in folgender Weise durchgeführt: Eine 5,8 mg/ml an Mycobacteriumbutyricum enthaltende Zellensuspension in physiologischer Salzlösung wurden in die Sohle des rechten Beines von Ratten vom SD-Stamm (10 weibliche Ratten pro Gruppe; durchschnittliches Körpergewicht 180 g) zur Entwicklung der Entzündung injiziert Einen Tag nach der Injektion der Bakterien wurde eine Lösung von 27 mg/ml der Substanz SF-1130-x (ein Gemisch ία der Substanzen SF-II3O-X2 und das weitere Oligosaccharid in einem Gewichtsverhältnis von 2:1) in mit

•ig Phosphat gepufferter Salzlösung 6pH = 7,2) subkutan in einer Dosis von 150 mg/kg/Tag während der nachfol-

ff gcnden 11 Tage injiziert 14 Tage nach der Impfung mit den Bakterien wurden die EntzüP.'-jngssymptome,

sj weiche sich in den Beinen, den Ohren, der Nase, den Augen und der Taille der behandelten Rat« entwickelt

ψϊ hatten, abgeschätzt und mit Zahlen bezeichnet: 0,1,2 und 3, und die Durchschnittszahlenwerte wurden bestimmt

fil Weiterhin wurde das Volumen der Sohle des linken Beines bestimmt, um die Antiinflammationsaktivität der

H Substanz SF-1130-x abzuschätzen. Zum Vergleich wurde Phenylbutazon anstelle der Substanz SF-1130-x oral in

gg einer Dosierung von 20 mg/kg/Tag während der nachfolgenden 11 Tage appliziert Weiterhin wurden Kontroll-

H tests in der gleichen Weise wie zuvor durchgeführt, wobei die Applikation der Substanz SF-1130-x bzw. des

;&: Phenylbutazons weggelassen wurde. Die erhaltenen Testergebnisse zeigen, daß die Substanz SF-1130-x zur

|| Verhinderung der experimentellen bzw. künstlich verursachten Arthritis signifikant wirksam ist

|f Die erfindungsgemäße Substanz SF-1130-:;₂ kann zu injizierbaren Lösungen durch Auflösen einsr geeigneten

ψ Menge in einer physiologischen Salzlösung oder einem anderen konventionellen, pharmazeutisch annehmbaren,

f| flüssigen Träger wie wäßrigen Trägern, z. B. Ringer'scher Injektionslösung, Dextroseinjektionslösung, raffinier-

f| ten ölen pflanzlichen Ursprungs oder synthetischen Mono- und Diglyceriden in Form von Fettemulsionen

"; formuliert werden, oder durch Mischen mit einem pharmazeutisch annehmbaren, festen Träger wie Supposito-

;■.'; ricnkakao oder in einen porösen Äthylenschlauch formuliert werden. Für die Applikation der Substanz SF-

/> 1130-X₂ kann die so hergestellte Injektionslösung als intravenöser Tropf als lokale Injektion, als intramuskuläre

£= Injektion, als intrap!eura!e Injektion oder als intraperitoneale Injektion oder als Suppositorium gegeben werden.

Il Als Immunpotentiator kann die Substanz SF-1130-x₂ in einer Dosis von annähernd 10 bis 400 mg/kg/Tag und

f| vorzugsweise von etwa 50 bis 100 mg/kg/Tag jeden Tag oder zwei- oder dreimal pro Woche alieine ode/ in

|.S Mischung oder in Kombination mit antibakteriellen Mitteln, Antitumormitteln oder anderen die Immunität

ig stimulierenden Mitteln gegeben werden. Als antibakterielle Mittel ist eine sehr hohe Dosis von über 400 mg/kg/

tis Tag erforderlich.

^i Die Erfindung betrifft daher weiterhin ehien Stimulator für die Wirtsabwehr, d. h. ein Mittel, um hauptsächlich

■;::; das Immunansprechen bei lebenden Tieren und Menschen zu fördern, wobei dieser Stimulator ah> aktiven

Κ? Bestandteil die Substanz SF-1130-x₂ in Kombination mit einem bekannten, pharmazeutisch annehmbaren,

ü wäßrigen oder nicht-wäßrigen Träger für den aktiven Inhaltsstoff umfaßt Wäßrige Träger umfassen Rin-

p ger'sche Injektionslösung und injizierbare Nährlösungen wie Dextroseinjektionslösungen und Natriumchlorid-

IiJ injektionslösungen, und nicht-wäßrige Träger umfassen Wasser-in-Öl-Emulsionen, die aus 65% Sesamöl, 5%

;; eines grenzflächenaktiven Mittels und 30% wäßriger Lösung von SF-1130-x bestehen, öl-in-Wasser-Emulsio-

s| nen, die aus 30% Sesamöl, 65% wäßriger Lösung von SF-1130-x und 5% grenzflächenaktivem Mittel bestehen

Sf und Wasser-in-Öl-Emulsionen, weiche aus 9%iger wäßriger Lösung von SF-1130-x, 19,5% Sesamöl, 1,5%

?i grenzflächenaktivem Mittel, 65% destilliertem Wasser und 5% nichtionogenen Polyätherglykole bestehen. Das

ύ erfindungsgemäße Arzneimittel kann in wirksamer Weise zur Verhinderung einer Reduzierung der Immunresi- ■■ stenz verwendet werden, die normalerweise durch Entwickh'-ng :m\ Bildung von Tumor oder durch Applikation

* von die Immunität unterdrückenden Antitumormitteln bedingt sein könnte, wobei das erfindungsgemäße Arz-

': neimittel zusätzlich wenigstens eine der Substanzen Maltose, Maltotriose, M&itotetraose, Maltopentaoae, MaI-

tohexaose und Maltoheptaose in einer ausreichenden Menge enthalten kann, um die Aktivität der Substanz .:,; SF-1130-x₂ zu verbessern.

j| Der Anteil von zugegebener Maltose, Maltotriose oder den zugegebenen, anderen Maltodextrin beträgt 0,1

;■}? bis 20 und vorzugsweise 0,5 bis 10 Gew.-Teile auf 1 Gew.-Teil der Substanz SF-1130-x₂.

s Der erfindungsgemäße Stimulator für die Wirtsabwehr kann gegebenenfalls wenigstens eines der bekannten

anlibakteriellen Mittel, Antitumormitte! und der anderen die Immunität potentirenden Mittel zusammen mit oder ohne einem Maltodextrin zusätzlich zu der Substanz SF-1130-x₂ enthalten. Aus den zuvor gemachten Ausführungen wird deutlich, daß die Substanz SF-1130-x₂ für die prophylaktische Anwendung gegenüber Bakterieninfektionen, gegen Tumore und bei rheumatischen Erkrankungen dieren kann.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Eine Impfkultur von Streptomyces myxog;enes SF-1130 ■= ATCC 31305 wurde in 200 I eines flüssigen Kulturmediums eingeimpft, welches 5,01 Stärkesirup, 2,5% Sojabohnenmehl, 1,0% Weizenkeime und 0,25% Natriumchorid enthielt Das beimpfte Medium wurde in einem Behälterfermentator unter Belüftung und Rühren bei 28"C während 64 Stunden inkubiert.

Am Ende dieser Inkubation wurde die erhaltene Kulturbrühe auf pH - 3 durch Zugabe von Salzsäure eingestellt und dann unter sauren Bedingungen filtriert, wobei 1401 Brühenfiltrat erhalten wurden. Dieses Filtrat wurde durch eine Säule von 201 eines stark sauren Kationenaustauscherharzes in der H + -Form zur Adsorption to der Substanzen SF-1130-xi und -x? durch das Harz geschickt Mach dem gründlichen Waschen mit Wasser wurde die Harzsäule mit einer Gesamtmenge von 80 I 0,1 N wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen aufgefangen, und solche Fraktionen, welche antibakterielle Aktivität gegenüber Escherichia coli K-I2R zeigten, wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei 250 g eines braun gefärbten Pulvers erhallen wurden.

is Die austretende Flüssigkeit (150 I), welche direkt aus der zuvor genannten Harzsäule beim Durchschicken des hierauf aufgegebenen Brühenfiltrates austrat, wurde auf pH — 3,0 mit Salzsäure angesäuert und dann in eine Säule von 20 I eines Kationenaustauscherharzes in der H +-Form zur Adsorption der zurückbleibenden, aktiven Substanzen gegeben. Die Harzsäule wurde gründlich mit Wasser gewaschen und dann mit einer Gesamtmenge von 801 0.1 N wäßrigem Ammoniak eiuisrt Das Eluat wurde wiederum in Fraktionen aufgesammelt, und die gegenüber E coli K-I2R aktiven Fraktionen wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei 51 g eines braun gefärbten Pulvers als zweite Teilmenge erhalten wurden.

Das braun-gefärbte Pulver (47 g), das als erste Teilmenge erhatten worden war, wurde in 250 ml Wasser aufgelöst anschließend wurde auf pH = 3,0 durch Zugabe von Salzsäure eingestellt Die so erhaltene, saure Lösung wurde durch eine Säule (53 x 26 cm) von 600 ml Aktivkohle zur Adsorption der aktiven Substanzen

geschickt. Die Aktivkohlesäule wurde mit Wasser gewaschen und mit einer wäßrigen Lösung von 30% Äthanol und dann mit einer wäßrigen Lösung von 35% Äthanol eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen aufgefangen, und die aktiven Fraktionen, welche antibakterielle Aktivität gegenüber E. coli K-12R zeigten, wurden miteinander vereinigt (4 I) und zur Trockne eingeengt, wobei 5,6 g eines gelblic'·. braunen Pulvers erhalten wurden.

Dieses Pulver wurde wiederum in 100 ml Wasser aufgenommen, anschließend wurde auf pH = 3 durch Zugabe von Salzsäure eingestellt. Die so erhaltene, saure Lösung wurde durch eine Säule von 600 ml Kationenaustauscherharz in der NH4+-Form zur Adsorption der aktiven Substanzen durchgeschickt. Diese Harzsäule wurde gut mit Wasser gewaschen und dann mit 0,1 N wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen aufgefangen und die gegenüber E coli K12-R aktiven Fraktionen wurden miteinander vereinigt und zur Trockene eingeengt wobei 1,5 g eines gelblich-braunen Pulvers erhalten wurden.

Ein Teil (1 g) dieses Pulvers wurde in 70 ml einer Pufferlösung (0,1 M Pyridin/Ameisensäure-lösung, pH = 3.1) aufgelöst, und die erhaltene Lösung wurde in eine Säule (3,5 χ 60 cm) von 50 ml Ionenaustauschern: in der Pyridiniumform, Korngröße 0,074—0.037 mm zur Adsorption der aktiven Substanzen gegeben. Die Harzsäule wurde dann mit der gleichen Pufferlösung wie zuvor eluiert und das Eluat wurde in 10-ml-Fraktionen aufgefangen. Die antibakteriell aktiven Fraktionen 63—79, die jeweils einen einzigen durch das Silbernitratreagenz gefärbten Fleck bei einem R-Alanin-Weri: von 0,53 (berechnet unter der Annahme, daß der Rf-Wert von Alanin = 1,00 beträgt) bei einer Hochspannungsfilterpapier-Elektrophorese ergaben, wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt wobei 380 mg eines farblosen Pulvers erhalten wurde, das die Substanz SF-1130-x als ein Gemisch der Substanz SF-1130-xj mit dem weiteren Oligosaccharid enthielt Dieses farblose Pulver wurde in einem kleinen Wasservoluimen aufgelöst und die erhaltene, wäßrige Lösung wurde mit einem Mischlösungsmittel aus n-Propanol/Äthylacetat/Wasser (6 :1 :3 im Volumen) zusammengegeben. Diese Mischung wurde durch eine Säule (3 χ 30 am) von 200 ml Cellulose zur Adsorption der aktiven Substanzen durchgeschickt und die Ceilulosesäule wurde mit dem gleichen Mischlösungsmittel wie zuvor eluiert. Das Eluat wurde in 7-ml-Fraktionen aufgefangen, und jede Fraktion wurde mittels Papierchromatographie unter Verwendung eines Mischlösungsmittels aus Äthylacetat/Pyridin/Wasser (10 :4 :3 im Volumen) als Entwicklerlösungsmittel untersucht Die antibakteriell aktiven Fraktionen 351 —445, die jeweils einen einzigen, durch das Silbe-nitratreagenz gefärbten Fleck bei einem R-Raffinose-Wert von 0,57 (berechnet unter der Annahme, daß der Rf-Wert von Raffinose = 1,00 beträgt) bei der zuvor genannten Papierchromatographie ergaben, wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt wobei 150 mg eines farblosen Pulvers erhalten wurden, welches die Substanz SF-1130-x₂ enthielt

Weiterhin wurden die antibakteriell aktiven Fraktionen 503—550, die jeweils einen einzigen durch das Silbernitratreagenz gefärbten Fleck bei eineim R-Raffinose-Wert von 039 — entsprechend der zuvor gegebenen Definition — bei der gleichen Papierchromatographie ergaben, miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt wobei 70 mg eines farblosen Pulvers erhalten wurden, welches das weitere Oligosaccharid enthielt

Das die Substanz SF-1130-x₂ enthaltende,.farblose Pulver (150 mg) wurde in 6 ml Wasser aufgelöst und die erhaltene, wäßrige Lösung wurde in eine Säule (2 χ 5,5 cm) von 15 ml Aktivkohle zur Adsorption der aktiven Substanz gegeben. Die Aktivkohlesäule wurde mit Wasser gewaschen und dann mit einer wäßrigen Lösung von 30% Äthanol und anschließend mit einer wäßrigen Lösung von 35% Äthanol eluiert Das Eluat wurde in 3-mI-Fraktionen aufgefangen- Die antibakteriell aktiven Fraktionen 30—42 wurden miteinander vereinigt und zur Trockne konzentriert wobei ein reines Produkt der Substanz SF-1130-X2 als farbloses Pulver mit einem Schmelzpunkt von F. = 195° C (unter Zersetzung) erhalten wurde. Die Ausbeute betrag 120 mg.

Das braune Pulver (51 g), das als zuvor erwähnte zweite Teilmenge aus dem Eluat erhalten wurde, welches direkt aus der zweiten Säule des Ionenaustauscherharzes in der H⁺-Form eluiert mit 0,1 N wäßrigem Ammoniak erhalten worden war, wurde denselben Reinigungsbedingungen und Isolierungsarbeitsweisen wie zuvor unter-

worfen, wobei 520 mg eines reinen Produktes der Substanz SF-1130-x₂ erhalten wurden.

Beispiel 2

liinc Impfkultur von Streptomyces myxogenes SF-1130 (identifiziert als FERM-P 676 oder ATCC. 31305) wurde in 201 des flüssigen Kulturmediums mit der gleichen Zusammensetzung, wie es in Beispiel 1 verwendet wurde, eingeimpft. Die Inkubation wurde in einem Behälterfermentator bei 28⁰C während 66 Stunden unter BclüHung und Rühren durchgeführt.

Am Ende der Inkubation wurde die Fermentationsbrühe auf pH = 3,0 durch Zugabe von Salzsäure eingestellt und unter den sauren Bedingungen unter Bildung von 15 I Brühenfiltrat filtriert. Dieses Filtrat wurde durch eine Säule (6 χ 36 cm) von 1 1 Aktivkohle zur Adsorption der aktiven Substanzen geschickt. Die Aktivkohlesäule wurde gründlich mit Wasser gewaschen und dann mit 5 I einer wäßrigen Lösung von 50% Aceton bei pH = 8 eluiert, und die gegenüber E. coli K-12R aktiven Fraktionen (150 ml) wurden herausgenommen, miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei 67,5 g eines gelblich-braunen Pulvers erhalten wurden.

Eine Teilmenge (45 g) dieses Pulvers wurde in 200 ml Wasser aufgenommen und die erhaltene, wäßrige Lösung wurde in eine Säule (5,6 χ 42 cm) von t I Aktivkohle zur Adsorption der aktiven Substanzen gegeben. Die Aktivkohlesäule wurde mit Wasser gewaschen und dann aufeinander folgend mit wäßrigen Lösungen eluiert, welche 5%, 10%, 15%, 20% und 25% Äthanol enthielten. Das Eluat wurde in 15-ml-Fraktionen aufgefangen. Die antibakteriell aktiven Fraktionen 366—510 wurden miteinander vereinigt und zur Trockene eingeengt, wobei 5,7 g eines farblosen Pulvers erhalten wurden.

Dieses farblose Pulver (5 g) wurde in 15 ml Wasser aufgelöst und die so erhaltene Lösung wurde filtriert. Zu dem Filtrai wurden langsam 180 ml Äthanol zur Herbeiführung der Wiederausfällung hinzugegeben.

Der Niederschlag wurde durch Filtration entfernt und im Vakuum getrocknet, wobei 4,6 g eines farblosen Pulvers erhalten wurden, welches ein Gemisch von 10 Gew.-% der Substanz SF-1130-X2 und 90 Gew.-% an Maltopentaose enthielt.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Antibiotisch wirksames Oligosaccharid mit der Bezeichnung SF-1130-x₂ der folgenden (nachgereichten) allgemeinen Formel:

Η—(

OH

[ OH
/ CH₃ > 0 CH₂OH — O] D-Glucose \
OH /
OH \
OH /\
OH 4 )— OH

wobei das Oligosaccharid SF-1130-x₂ die weiteren Merkmale aufweist: