DE102007037579B4

DE102007037579B4 - Neue Benzimidazol-2-yl-alkylamine und ihre Anwendung als mikrobizide Wirkstoffe

Info

Publication number: DE102007037579B4
Application number: DE102007037579A
Authority: DE
Inventors: Karl-Heinz Wiesmüller; Jörg Bauer; Holger Eickhoff; Gerald Kleymann; Steffen Rupp; Doris Finkelmeier; Anke Burger-Kentischer
Original assignee: EMC Microcollections GmbH
Current assignee: EMC Microcollections GmbH
Priority date: 2007-08-09
Filing date: 2007-08-09
Publication date: 2012-05-16
Anticipated expiration: 2027-08-10
Also published as: EP2193123A1; WO2009019014A1; DE102007037579A1

Abstract

Benzimidazol-2-yl-alkylamin-Verbindungen der Formel

wobei
– R1 für H oder unverzweigte unsubstituierte Alkylgruppen, insbesondere die Methylgruppe, steht,
– R2 für verzweigte oder unverzweigte unsubstituierte Alkylgruppen, insbesondere die Methylgruppe oder Isopropylgruppe, steht, und
– R3 für unverzweigte und unsubstituierte Alkylbenzyl- und Halogenbenzylgruppen, insbesondere die 3-Methyl-, 3-Fluor- oder 3-Chlorbenzylgruppe, steht.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Benzimidazol-2-yl-alkylamine, welche antimikrobielle Eigenschaften aufweisen, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen, zur Formulierung als pharmazeutische Mittel und Pflanzenschutzmittel sowie zu ihrer Anwendung als mikrobizide Wirkstoffe respektive Pestizide.
Die Erfindung betrifft insbesondere neue Benzimidazol-2-yl-alkylamine mit Alkylbenzyl-Substituenten in 1-Stellung und ihre Verwendung als Wirkstoffe zur Behandlung von Menschen, Tieren und Pflanzen, die mit schädlichen Mikroorganismen, insbesondere Pilzen, Bakterien, Viren, Algen, Protozoen und anderen Parasiten, befallen sind.
Stand der Technik
Im Laufe der Jahre wurden zahlreiche mikrobizide Wirkstoffe zur Verwendung in Landwirtschaft, Technik, Human- und Veterinärmedizin entwickelt. Neben anorganischen und metallorganischen Wirkstoffen existiert eine sehr heterogen zusammengesetzte, schwer überschaubare Gruppe organischer Wirkstoffe, der verschiedene Substanzklassen mit unterschiedlichen Wirkungsschwerpunkten angehören.
Speziell die antimikrobielle Wirkung von Benzimidazol-Derivaten ist bereits lange bekannt.
In der Pharmazie finden sie unter anderem als Viruzide, Anthelmintika und Antimykotika Verwendung. Zahlreiche pharmazeutisch wichtige Benzimidazol-Derivate sind in den Sammlungen von Negwer/Scharnow1

1: Negwer, M. und Scharnow, H-G. Organic-Chemical Drugs and Their Synonyms, 9. Aufl., Wiley-VCH, Weinheim 2007.

2

2: Elks, J. und Ganellin, C. R. (ed.). Dictionary of Drugs. Chemical Data, Structures, and Bibliographies, Chapman & Hall, London 1990

Im technischen Bereich und im Pflanzenschutz werden Benzimidazol-Derivate als Pestizide, insbesondere als systemische Fungizide eingesetzt. Eine Übersicht der im deutschsprachigen Raum für den Pflanzenschutz zugelassenen mikrobiziden Wirkstoffe, die auch eine Vielzahl von Benzimidazol-Derivaten enthält, veröffentlichten Perkow/Ploss3

3: Perkow, W. und Ploss, H.: Wirksubstanzen der Pflanzenschutz- und Schädlingsbekampfungsmittel, Parey, Stuttgart, Stand 2004.

Auch in der Patentliteratur finden sich zahlreiche Benzimidazol-Derivate für verschiedenste Anwendungen und medizinische Indikationen. Dabei handelt es sich in der Regel um sehr spezifisch substituierte Strukturen, die in den Enzym-Stoffwechsel der Mikroorganismen eingreifen. Eine besondere Rolle spielen hier vor allem die Benzimidazol-2-yl-(alkyl)amide und Benzimidazol-2-yl-(alkyl)carbamate.
Zum Beispiel wurde von SIRTRIS Pharmaceuticals eine Gruppe von Benzimidazol-2-yl-(alkyl)amiden als Sirtuin-Modulatoren zur Verwendung bei zahlreichen medizinischen Indikationen wie Diabetes, neurodegenerativen Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Blutgerinnungsstörungen, Entzündungen, Krebs, aber auch bei Adipositas, Stress und Alterserscheinungen offenbart ( WO 2006/094209 , WO 2006/094235 ). In WO 2005/037272 wird die Anwendung von Benzimidazol-2-yl-(alkyl)amiden zur Bekämpfung von bakteriellen und parasitischen Infektionen beschrieben. Mikrobizide Wirkstoffe mit Benzimidazol-2-yl-(alkyl)amid-Struktur, die vor allem in der Landwirtschaft Anwendung finden, sind in WO 2006/123145 , WO 2007/020936 , US 3,920,680 und US 3,920,682 offengelegt.
Patentschriften zu Benzimidazol-2-yl-(alkyl)aminen wurden nur sehr wenige veröffentlicht, wobei bei den meisten uns bekannt gewordenen Verbindungen die Aminogruppe ein sekundäres oder tertiäres Stickstoffatom enthält.
Sekundäre Benzimidazol-2-yl-alkylamine als pharmazeutische Wirkstoffe zur Behandlung von Krebs sind unter anderem in WO 2006/060737 und US 2006/0084687 veröffentlicht.
In WO 2006/110683 , WO 2005/028447 , WO 2007/030080 und WO 2002/32422 wurden primäre Benzimidazol-2-yl-alkylamine mit definierten Substituenten zur Verwendung als Enzymhemmer sowie entsprechende pharmazeutische Zubereitungen beschrieben, Als Ausgangsstoff für landwirtschaftliche Mikrobizide wurden in JP 08325235 primäre Benzothiazol-2-yl-alkylamine und Benzooxazol-2-yl-alkylamine offenbart.
Die Synthese primärer Benzimidazol-2-yl-alkylamine gilt, vor allem bei Verbindungen mit komplexen Substituenten, allgemein als schwierig ( WO 2001/21634 ).
Aufgabenstellung
Durch Mikroben verursachte Erkrankungen können lokal oder generalisiert vorkommen. Sie treten unter anderem bei Störungen des Immunsystems, zum Beispiel bei Antibiotika- oder Zytostatikatherapien, bei der Verabreichung von Steroiden oder Hormonen, nach Bestrahlungen, bei parenteraler Ernährung, bei malignen Erkrankungen, Endokrinopathien oder Immundefekten auf. Bei systemischen Erkrankungen werden bevorzugt bestimmte Organe befallen. Erkrankungen der Haut werden oft durch bestimmte Pilzarten, insbesondere Dermatophyten und Hefen verursacht. Während Dermatophyten fast ausschließlich Haut, Haare und Nägel befallen, können sich durch Hefen verursachte Mycosen auch auf Schleimhäute und innere Organe ausdehnen.
Pflanzen sind vor allem bei ungünstigen Wachstumsbedingungen wie Klima, Böden, Nährstoffmangel/-überschuss oder Monokultur anfällig gegenüber Mikrobenbefall.
Der Wirkmechanismus der meisten mikrobiziden Wirkstoffe greift im Stoffwechsel der Mikroorganismen an. Aufgrund der hochgradigen Anpassungsfähigkeit vieler Mikroben besteht eine erhebliche Resistenzgefahr. Obwohl zahlreiche antimikrobielle Mittel bekannt sind, ergibt sich daraus ein ständiger Bedarf an neuen, hochwirksamen, aber auch physiologisch verträglichen Substanzen mit möglichst neuartigen Wirkmechanismen sowie breiteren Wirkungsspektren.
Speziell gesucht werden Wirkstoffe, die gegenüber solchen Mikroorganismen aktiv sind, die bereits Resistenzen gegenüber vielen bekannten mikrobiziden Wirkstoffen entwickelt haben. Insbesondere stellen Pilzinfektionen im klinischen Bereich und in der Intensivmedizin ein Problem dar, woraus sich ein ständiger Bedarf an neuen, gut verträglichen Antimykotika ergibt.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, neue pharmazeutisch aktive Mikrobizide, insbesondere fungizid wirksame Verbindungen, zur Verwendung als Antiinfektiva bei Menschen und Tieren sowie als Pestizide im Pflanzenschutz zur Verfügung zu stellen, die die genannten Nachteile der herkömmlichen Mittel beheben.
Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass verschiedene primäre Benzimidazol-2-yl-alkylamine eine überragende antimikrobielle Wirksamkeit besitzen, insbesondere gegenüber Organismen, die bei Menschen, Tieren und Pflanzen Mycosen verursachen können.
Speziell gegenüber verschiedenen Pilzen der Gattung Candida, aus der einige Spezies ein Problem vor allem für mit Antibiotika behandelte HIV-positive Patienten darstellen, konnte eine sehr gute fungizide Wirkung der Substanzen dieser neuen Stoffklasse nachgewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher Verbindungen nach der Formel
sowie deren Verwendung als mikrobizide Wirkstoffe gegen Pilze, Bakterien, Viren, Algen, Protozoen und andere Parasiten.
Dabei steht

– R1 für H oder unverzweigte unsubstituierte Alkylgruppen, insbesondere die Methylgruppe,
– R2 für verzweigte oder unverzweigte unsubstituierte Alkylgruppen, insbesondere die Methylgruppe oder Isopropylgruppe, und
– R3 für unverzweigte und unsubstituierte Alkylbenzyl- und Halogenbenzylgruppen, insbesondere die 3-Methyl-, 3-Fluor- oder 3-Chlorbenzylgruppe.

Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft erfindungsgemäße Benzimidazol-2-yl-alkylamine mit Alkylbenzyl-Substituenten in 1-Stellung entsprechend den folgenden Formeln (II) bis (XIV).
Die antimikrobielle Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen und ihre physiologische Verträglichkeit wurde in einem antimykotischen AS(Activity-Selectivity)-Assay nachgewiesen. Dazu wurde die halbmaximale antimykotische Aktivität (IC₅₀) der Testverbindungen und einer Referenzverbindung an mit Candida albicans infizierten Zellkulturen bestimmt.
Für einige besonders bevorzugte Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen konnte eine vergleichbare antimykotische Aktivität wie für das hochwirksame, üblicherweise als Vergleichsstandard eingesetzte Amphothericin B gefunden werden.
Untersuchungen zur Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen in dreidimensionalen Zellkulturmodellen bestätigten die ausgeprägte antimikrobielle Wirkung. Die Verbindungen zeigten zudem gute Diffusionseigenschaften bei der Durchdringung von Kollagen- und Zellschichten, sodass eine Anwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen als Wirkstoffe für systemische und auch topische Heil- und Pflanzenschutzmittel möglich ist. Negative Einflüsse auf die verwendeten Zellkulturen wurden nicht beobachtet.
In genbasierten in vitro-Untersuchungen zur Wirkungsweise der erfindungsgemäßen Verbindungen wurden neben den bereits bekannten Angriffspunkten in der Ergosterol-Biosynthese auch Einflüsse auf die Zellwandbiogenese von Candida albicans nachgewiesen. Dieser, für ähnliche Verbindungen bisher nicht beobachtete Wirkmechanismus erschließt neue Anwendungsmöglichkeiten für die erfindungsgemäßen Verbindungen als Wirkstoffe.
Toxizitätstests ergaben eine gute Verträglichkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen. Es wurde im relevanten Konzentrationsbereich keine toxische Wirkung auf die untersuchten Zelllinien beobachtet.
Das Wirkspektrum der erfindungsgemäßen Verbindungen umfasst Pilze, Bakterien, Viren, Algen, Protozoen und andere Parasiten, insbesondere Hefen, Dermatophyten, Schimmelpilze, Pityrosporum ovale und biphasische Pilze. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können daher erfolgreich als Wirkstoffe zur Behandlung zahlreicher lokaler und systemischer Infektionen bei Menschen, Tieren und Pflanzen eingesetzt werden. Besonders wirksam sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von Dermatomycosen, die durch Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophyten und andere Trichophytonarten, Microsporum canis, Epidermophyton floccosum sowie Scopulariopsis brevicaulis hervorgerufen werden, sowie zur Behandlung von Candidosen, die durch Candida tropicalis, Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis und weitere Candidaarten verursacht werden.
Typische medizinische Indikationen mikrobieller Infektionen sind beispielsweise Störungen des Immunsystems, HIV-Infektionen (AIDS), Erkrankungen der Haut, Haare und Nägel, Schleimhautinfektionen, Erkrankungen der Atemwege und des Rachenraumes wie Pneumonie, Bronchitis und Pharyngitis sowie entzündliche Erkrankungen der inneren Organe wie Otitis, Pyelonephritis, Cystitis, Endocarditis und Arthritis.
Bei Pflanzen eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen vor allem als Pestizide zur Bekämpfung von Mehltau, Schimmelpilzen und anderen parasitischen Pilzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung der erfindungsgemäßen Benzimidazol-2-yl-alkylamine nach Formel (I), die erfindungsgemäß als mikrobizide Wirkstoffe eingesetzt werden können.
Ein möglicher Weg ist die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen an einer festen Phase ausgehend von einem Nitroanilin (analog zum Schema 1 in Beispiel A). Dazu wird die Ausgangsverbindung an einem polymeren Träger mit aktivierter Kohlensäureester-Gruppe immobilisiert und der resultierende Carbamatstickstoff im basischen Medium alkyliert. Die Nitrogruppe wird anschließend reduziert und die entstehende Aminogruppe mit einem Aminocarbonsäurederivat acyliert. Nach saurer Abspaltung vom polymeren Trägerharz erfolgt die Cyclisierung zum Benzimidazol in essigsaurer Losung. In einer besonders bevorzugten Variante wird die Aminosäure vorher mit einer Amino-Schutzgruppe versehen, die nach der Cyclisierung abgespalten wird.
Bei einer weiteren Herstellungsvariante wird die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen in Lösung durchgeführt (analog zum Schema 2 in Beispiel B). Hierzu wird ein Fluornitrobenzol mit einem Amin umgesetzt. Die Nitrogruppe wird reduziert und das Produkt mit einem Aminocarbonsäurederivat acyliert. Diese Zwischenstufe wird anschließend in essigsaurer Lösung zum Benzimidazol cyclisiert. In einer besonders bevorzugten Variante wird die Aminosäure vorher mit einer Amino-Schutzgruppe versehen, die nach der Cyclisierung abgespalten wird.
Beide Herstellungsverfahren erlauben sowohl die Synthese von racemischen als auch von enantiomerenreinen Verbindungen.
Die Ausgangsstoffe zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen sind bekannt und können im Fachhandel bezogen oder nach bekannten Vorschriften hergestellt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Benzimidazol-2-yl-alkylamine nach Formel (I) zur Herstellung pharmazeutischer Mittel für die Behandlung von Erkrankungen von Menschen und Tieren, die mit Mikroben in Zusammenhang stehen. Diese Antiinfektiva, enthaltend wenigstens einen erfindungsgemäßen Wirkstoff nach Formel (I), enthalten weiterhin mindestens einen oder keinen nicht-toxischen, inerten, pharmazeutisch geeigneten Träger sowie mindestens einen oder keinen nicht-toxischen, inerten, pharmazeutisch geeigneten Hilfs- und/oder Zusatzstoff.
Pharmazeutisch geeignete Materialien sind die im Bereich der Pharmazie und Lebensmitteltechnologie sowie in angrenzenden Gebieten bekanntermaßen verwendbaren Stoffe, insbesondere die in einschlägigen Arzneibüchern gelisteten, deren Eigenschaften einer physiologischen Anwendung nicht entgegenstehen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel, enthaltend mindestens einen Wirkstoff nach Formel (I), können beispielsweise als Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Granulate, Suppositorien, Injektabilia, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Pasten, Salben, Gele, Cremes, Lotionen, Puder oder Sprays formuliert sein.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen erfolgt in üblicher Weise nach dem Fachmann bekannten Verfahren.
Die Erfindung ermöglicht auch Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen von Menschen und Tieren, die mit Mikroben in Zusammenhang stehen. Hierzu verabreicht man einer Person oder einem Tier, die oder das einer derartigen Behandlung bedarf, eine antimikrobiell wirkende Menge einer erfindungsgemäßen Zubereitung, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung nach Formel (I). Der Wirkstoff oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung kann lokal, oral, parenteral, intraperitoneal und/oder rectal verabreicht werden, vorzugsweise oral oder lokal.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Benzimidazol-2-yl-alkylamine nach Formal (I) zur Herstellung von Pflanzenschutzmitteln für die Behandlung von Erkrankungen, die mit Mikroben in Zusammenhang stehen. Diese Pestizide, enthaltend wenigstens einen erfindungsgemäßen Wirkstoff nach Formel (I), enthalten weiterhin mindestens einen oder keinen nicht-toxischen, inerten, für die Landwirtschaft geeigneten Träger sowie mindestens einen oder keinen nicht-toxischen, inerten, für die Landwirtschaft geeigneten Hilfs- und/oder Zusatzstoff.
Geeignete Materialien sind die im Bereich der Landwirtschaft und Lebensmitteltechnologie sowie in angrenzenden Gebieten bekanntermaßen verwendbaren Stoffe, insbesondere die in den einschlägigen Verzeichnissen zugelassener Verbindungen gelisteten, deren Eigenschaften einer Anwendung in der Landwirtschaft nicht entgegenstehen.
Die erfindungsgemäßen Pflanzenschutzmittel, enthaltend mindestens einen Wirkstoff nach Formel (I), können beispielsweise als Granulate, Lösungen, Suspensionen, Puder oder Sprays formuliert sein.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Pflanzenschutzmittel erfolgt in üblicher Weise nach dem Fachmann bekannten Verfahren.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen von Pflanzen oder Pflanzenteilen, die mit Mikroben in Zusammenhang stehen. Hierzu werden die Pflanzen oder landwirtschaftlichen Produkte, die einer derartigen Behandlung bedürfen, mit einer antimikrobiell wirkenden Menge einer erfindungsgemäßen Zubereitung, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung nach Formel (I), bestäubt, besprüht oder der umgebende Boden damit angereichert. Der Wirkstoff oder das erfindungsgemäße Pflanzenschutzmittel kann lokal oder systemisch angewendet werden, vorzugsweise systemisch durch Besprühen der Pflanzen und Pflanzenteile.
Ausführungsbeispiele
Beispiel A – Synthese eines Benzimidazol-2-yl-alkylamins mit chloriertem Alkylbenzyl-Substituenten in 1-Stellung an fester Phase
Schema 1: Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung an fester Phase.
Beladung von p-Nitrophenylcarbonat-Wang-Harz (XV) mit 2-Nitroanilin (XVI) p-Nitrophenylcarbonat-Wang-Harz (2 g; 3 mmol; Beladung 1,5 mmol/g) und 2,5 Equiv. 2-Nitroanilin (7,5 mmol; 1,036 g) wurden zusammen in eine Spritze mit Filterfritte eingewogen. Eine Suspension aus Natriumhydrid (3 Equiv.; 9 mmol; 216 mg der 60%igen Suspension) in 20 ml DMF (trocken über Molsieb) wurde zugegeben und der Ansatz 18 h bei Raumtemperatur geschüttelt.
Die Reaktionslösung wurde abfiltriert und das Harz mit DMF gewaschen, bis die Waschlösung nahezu farblos war. Zum Harz wurden DMF (30 ml) und 25%iger NH₃ in H₂O (3 ml) hinzugefügt und 1 h bei Raumtemperatur geschüttelt.
Nach Abfiltrieren der Reaktionslösung wurde das beladene Harz gewaschen (5 × DMF, je 3 × MeOH, THF, DCM, Et₂O) und im Vakuum getrocknet.
Alkylierung von o-Nitroanilincarbamat-Wang-Harz (XVII)
In einer Spritze mit Filterfritte wurde zu dem o-Nitroanilincarbamat-Wang-Harz (3 mmol) eine Lösung von LiOtBu (12 Equiv.; 2,88 g) in 20 ml einer Mischung aus wasserfreiem THF und wasserfreiem DMSO (1:1) gegeben. 3-Chlorbenzylbromid (5 Equiv.; 205,48 g/mol; 1,964 ml) wurde hinzugefügt und 18 h bei Raumtemperatur geschüttelt.
Nach Abfiltrieren der Reaktionslösung wurde das Harz je dreimal mit DMF, MeOH, THF, DCM und Et₂O gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Reduktion der Nitrogruppe von (XVIII)
Durch 20 ml einer 2 M Lösung von SnCl₂ × 2H₂O in DMF (13,3 Equiv.; 40 mmol; 4,5 g/ml) wurde mehrere Minuten lang Argon geleitet. Diese Lösung wurde zum Harz gegeben und die Reaktionsmischung 18 h bei Raumtemperatur geschüttelt.
Die Reaktionslösung wurde abfiltriert und das Harz gewaschen (5 × DMF, je 3 × MeOH, THF, DCM, Et₂O).
Acylierung von (XIX) mit Fmoc-L-Valin
In eine Spritze mit Filterfritte wurden das Harz (3 mmol), Fmoc-L-Valin (2,5 Equiv.; 7,5 mmol; 2,55 g) und PyBroP (2,5 Equiv.; 3,50 g) eingewogen. Nach Zugabe von 25 ml NMP (trocken über Molsieb) und DIPEA (5 Equiv.; 15 mmol; 1,94 g; 2,57 ml) wurde der Ansatz 18 h bei Raumtemperatur geschüttelt.
Die Reaktionslösung wurde abfiltriert und das Harz gewaschen (5 × DMF, je 3 × MeOH, THF, DCM, Et₂O).
Abspaltung vom Harz und Cyclisierung zum Benzimidazol (XXII)
Die Abspaltung vom polymeren Träger erfolgte mit 25%iger TFA in DCM.
Nach 1 h Schütteln bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung filtriert, das Filtrat aufgefangen und das Harz noch zweimal mit 25%iger TFA in DCM gewaschen. Die Waschlösungen wurden mit der Abspaltlösung vereinigt.
Nach dem Abdampfen der Lösungsmittel und der TFA wurde das Rohprodukt mit Eisessig versetzt und die Cyclisierung über 16 h bei 80°C durchgeführt.
Die Essigsäure wurde am Rotationsverdampfer im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde aus tert.-Butylalkohol/Wasser (4:1) lyophilisiert.
Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe zu (XXIII)
Das Fmoc-geschützte Rohprodukt wurde mit einer Lösung von 25%igem Piperidin in DCM versetzt und 1 h bei Raumtemperatur gerührt.
Die Reaktionslösung wurde am Rotationsverdampfer im Vakuum zur Trockene abgedampft.
Die Aufreinigung des Produktes (XXIII) erfolgte durch Kieselgel-Chromatographie.
Beispiel B – Lösungssynthese eines Benzimidazol-2-yl-alkylamins mit Alkylbenzyl-Substituenten in 1-Stellung in Lösung
Schema 2: Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung in Lösung.
Umsetzung von Fluornitrobenzol (XXIV) mit 3-Methylbenzylamin (XXV)
Zu einer Lösung von 1-Fluor-2-nitrobenzol (XXIV) (20 mmol; 2,11 ml) in 50 ml wasserfreiem THF wurde 3-Methylbenzylamin (XXV) (20 mmol; 2,50 ml) gegeben. Die Reaktionslösung wurde mit Triethylamin (40 mmol; 5,57 ml) versetzt und 12 h unter Rückfluss gerührt.
Die abgekühlte Reaktionslösung wurde anschließend im Vakuum eingeengt und das Rohprodukt (HPLC, 214 nm, > 80%) ohne Aufreinigung weiter umgesetzt.
Reduktion der Nitrogruppe von (XXVI)
N-(3-Methylbenzyl)-2-nitroanilin (XXVI) wurde in 100 ml Ethanol/Wasser (1:1, v/v) aufgenommen. Nach Zugabe von Natriumdithionit (80 mmol; 13,9 g) wurde die Reaktionslösung 6 h bei 70°C gerührt.
Die Reaktionslösung wurde dreimal mit je 100 ml DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit 100 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum von Lösungsmitteln befreit.
Das Rohprodukt des N-(3-Methylbenzyl)-o-phenylendiamins (XXVII) wurde säulenchromatographisch über Kieselgel aufgereinigt (Eluent: DCM).
Ausbeute: 3,10 g (73% über zwei Stufen), C₁₄H₁₆N₂, M = 212,3 g/mol
Reinheit (LC/MS, 214 nm): 99%
Acylierung des Phenylendiamins (XXVII)
Zu einer Lösung von N-(3-Methylbenzyl)-o-phenylendiamin (XXVII) (1,5 mmol; 318 mg) in 20 ml wasserfreiem DCM wurden N-α-Boc-L-Valin (1,8 mmol; 391 mg), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethyl-carbodiimid-hydrochlorid (3 mmol; 573 mg) sowie eine katalytische Menge 4-Dimethylaminopyridin (10 mg) gegeben und 12 h bei RT gerührt.
Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung dreimal mit je 50 ml Wasser extrahiert, die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum von Lösungsmitteln befreit.
N¹-{2-[(3-Methylbenzyl)amino]phenyl}-(N-Boc)-valinamid (XXVIII) wurde als bräunlicher Feststoff erhalten.
Ausbeute: 570 mg (92,7%), C₁₄H₁₆N₂, M = 411,6 g/mol
Reinheit (LC/MS, 214 nm): 98%
Cyclisierung zum Benzimidazol (XXIX) und Abspaltung der Schutzgruppe
N¹-{2-[(3-Methylbenzyl)amino]phenyl}-(N-Boc)-valinamid (XXVIII) (1,36 mmol; 560 mg) wurde in 30 ml Eisessig aufgenommen und 8 h bei 80°C gerührt.
Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung im Vakuum von Lösungsmitteln befreit. Man erhielt (1S)-2-Methyl-1-[1-(3-methylbenzyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-(N-Boc)-propylamin (XXIX) in Gestalt eines bräunlichen Feststoffes (C₂₄H₃₁N₃O₂, M = 393,53 g/mol).
Das so erhaltene Rohprodukt wurde in 15 ml TFA/Wasser (2:1) aufgenommen und 3 h bei Raumtemperatur gerührt.
Die Reaktionslösung wurde unter Eiskühlung vorsichtig mit einer 2 M NaOH-Lösung neutralisiert (pH 7–8) und dreimal mit je 100 ml DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit gesättigter NaCl-Lösung und Wasser (je 3 × 100 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum von Lösungsmitteln befreit.
(1S)-2-Methyl-1-[1-(3-methylbenzyl)-1H-benzimidazol-2-yl]propylamin (XXX) wurde als bräunlicher Feststoff erhalten.
Rohausbeute: 379 mg (94,8%), C₁₉H₂₃N₃, M = 293,42 g/mol
Reinheit des Rohproduktes (LC/MS, 214 nm): 81%
Die Reinigung des Rohproduktes erfolgte durch Kristallisation aus EtOH/Wasser.
Beispiel C – Nachweis der fungiziden Wirkung anhand eines antimykotischen AS-Assays
Die antimykotische Aktivität sowie die Verträglichkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen wurden anhand eines antimykotischen AS(Activity-Selectivity)-Assays überprüft. Die Ergebnisse wurden den Werten für Amphothericin B (ein branchenüblicher Vergleichsstandard für fungizide Verbindungen) gegenübergestellt.
Dazu wurden 10.000 HeLa-Zellen pro Well einer Mikrotiterplatte mit je 5–500 (Optimum: 50) CFU (MOI = 0,00025–0,025; Optimum: 0,005) von Candida albicans (SC 5314, sequenzierter Stamm) in einem Gesamtvolumen von 200 μl Medium (z. B. RPMI 1640, 10% FCS, 1% Glutamin) in Anwesenheit/Abwesenheit der verschiedenen zu testenden Wirkstoffe infiziert und 3–5 Tage bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Aus der Anzahl und Vitalität der überlebenden Zellen, die mit einem Fluoreszenz-Farbstoff bestimmt wurden, wurden die IC₅₀- und CC₅₀-Werte ermittelt.
Die Analyse der lebensfähigen Zellen im Assay wurde nach Kleymann/Werling4

4: Kleymann, G. und Werling, H.-O.: A generally applicable, high-throughput screening-compatible assay to identify, evaluate and optimise antimicrobial agents for drug therapy, Journal of Biomolecular Screening (JBS) 2004, 9(7), 578–587.

Die relativen Fluoreszenzintensitäten der Proben und einer unbehandelten Vergleichsprobe wurden in Relation gesetzt. Dieser Quotient

ist ein Maß für die antimikrobielle Aktivität der getesteten Verbindungen. Tabelle 1: Relative antimykotische Aktivität diverser erfindungsgemäßer Verbindungen im Vergleich zur Referenzverbindung Amphothericin B; halbmaximale antimykotische Aktivität in Zellkultur gegenüber Candida albicans.

Test-Verbindung	Molekulargewicht [g/mol]	IC₅₀ [μM]
Referenz Amphothericin B	924,09	0,2–0,5
(IX)	313,80	0,25
(VI)	293,42	2
(VII)	313,83	2
(V)	327,86	4
(VIII)	299,81	5
(II)	311,41	30

Beispiel D – Nachweis der fungiziden Wirkung im Zellmodell
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindung (IX) gegenüber Candida albicans wurde in dreidimensionalen Zellkulturmodellen eines Vaginalmodells untersucht, welches aus einer Kollagenmatrix und einer darauf aufwachsenden Zellschicht aufgebaut ist ( DE 1006 2626 B4 ).
Der Test wurde entsprechend einer Publikation von Dieterich et al.5

5: Dieterich, C.; Schandar, M., Noll, M.; Johannes, F.-J.; Brunner, H.; Graeve, T. und Rupp, S.: In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion, Microbiology 2002, 148, 497–506.

In werden die Zellkulturen für die Kontrollprobe ohne Wirkstoff und in die Zellkulturen für eine mit der Testverbindung (IX) versetzte Probe nach 20 h Inkubationszeit dargestellt.
Die Wirksamkeit der Substanz konnte bestätigt werden. Negative Einflüsse auf das Vaginalmodell waren im relevanten Konzentrationsbereich nicht zu beobachten.
Beispiel E – Untersuchung der Wirkungsweise
Die Wirkungsweise der erfindungsgemäßen Verbindung (IX) wurde in vitro mittels genomweiter DNA-Chips an Candida albicans untersucht.
Die Arbeiten wurden wie bei Sohn et al.6

6: Sohn, K.; Senyürek, I.; Fertey, J.; Königsdoefer, A.; Joffroy, C.; Hauser, N.; Zelt, G.; Brunner, H. und Rupp, S.: An in vitro-assay to study the transcriptional response during adherence of Candida albicans to different human epithelia, FEMS Yeast Research 2006, 6, 1085–93.

Aus diesen Untersuchungen wurde geschlossen, dass die Ergosterol-Biosynthese ein wesentliches Target der erfindungsgemäßen Verbindungen darstellt. Neben der Ergosterol-Biosynthese sind ungewöhnlich viele Zellwandgene induziert, was bisher bei Azolen üblicherweise nur begrenzt beobachtet wurde.

Das bedeutet, dass die untersuchte erfindungsgemäße Verbindung (IX) auch nach Auswirkungen auf die Zellwandbiogenese, insbesondere auf die β-1,3-; β-1,6-Glucan Biosynthese, hat. Dies lässt auf neue, für ähnliche Verbindungen bisher nicht bekannte Wirkmechanismen und Anwendungspotentiale schließen. Tabelle 2: Unter Anwesenheit von (IX) mit Hilfe genomweiter Microarrays als induziert gefundene Gene.

ERG pathway		Zellwand		Membran
+5,87	ERG25	+6,54	PGA23	+7,33	RTA2, keto, caspo
+4,88	ERG251	+5,92	PHR2	+3,64	RTA3, keto, caspo
+4,30	ERG6	+4,60	PGA45	+3,17	FTH1
+4,29	ERG11	+3,18	CRH11, caspo	+2,77	hypothetical, ciclo
+3,41	ERG5	+2,87	PGA7	+2,86	PHO87
+2,88	ERG1	+2,55	PGA52, flu	+2,36	FRP1
+2,52	ERG24	+2,21	PGA10, keto, ciclo	+2,28	CDR1
+2,47	ERG27	+2,20	CSH1, flu
+2,44	ERG10	+2,11	HYR1
+2,37	ERG26	+2,05	KRE1
+2,05	UPC2	+1,91	RBT5
+1,93	ERG7
+1,90	ERG3

Sc5314, YPD, 30°C, 3 h Induktion mit/ohne Verbindung (IX), (IC₅₀)
Arrays: Fraunhofer IGB
Datenanalyse: M-Chips

Beispiel F – Untersuchung der Toxizität
Die Toxizität der erfindungsgemäßen Verbindung (IX) wurde an 3 Zelllinien getestet.
Dabei wurde ein Gradientenscreening mit den Zelllinien CHO-K1 (Chinese hamster ovary cells [ATCC Cat. No. CCL-61]), A549 (Human lung carcinoma [ATCC Cat. No. CCL-185]) und HeLa (Human cervix carcinoma [ATCC Cat. No. CCL-2]) durchgeführt.
Es wurde keine toxische Wirkung auf die verwendeten Zelllinien beobachtet.
Die halbmaximale Toxizität (CC₅₀) für die untersuchte Verbindung (IX) liegt bei ca. 100–150 μM.

Claims

Benzimidazol-2-yl-alkylamin-Verbindungen der Formel
wobei – R1 für H oder unverzweigte unsubstituierte Alkylgruppen, insbesondere die Methylgruppe, steht, – R2 für verzweigte oder unverzweigte unsubstituierte Alkylgruppen, insbesondere die Methylgruppe oder Isopropylgruppe, steht, und – R3 für unverzweigte und unsubstituierte Alkylbenzyl- und Halogenbenzylgruppen, insbesondere die 3-Methyl-, 3-Fluor- oder 3-Chlorbenzylgruppe, steht.
Verbindung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Formel
Verbindung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Formel
Verbindung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Formel
Verbindung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Formel
Verbindung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Formel
Verbindung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Formel
Verbindung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Formel
Verbindung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Formel
Ein Verfahren zur Herstellung der Benzimidazol-2-yl-alkylamin-Verbindungen nach einem der Ansprüche 1–9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Nitroanilin an einem polymeren Träger immobilisiert, dann alkyliert oder aryliert, nachfolgend die Nitrogruppe reduziert, mit einer D- oder L-Aminosäure oder einem Aminocarbonsäurederivat acyliert und die Zwischenstufe nach Abspaltung vom polymeren Träger zum Benzimidazol cyclisiert wird.
Ein Verfahren zur Herstellung der Benzimidazol-2-yl-alkylamin-Verbindungen nach einem der Ansprüche 1–9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Fluornitrobenzol in Lösung mit einem Amin umgesetzt, die Nitrogruppe redisziert, mit einer D- oder L-Aminosäure oder einem Aminocarbonsäurederivat acyliert und die Zwischenstufe zum Benzimidazol cyclisiert wird.
Verwendung der Benzimidazol-2-yl-alkylamin-Verbindungen nach einem der Ansprüche 1–9 zur Herstellung eines antimikrobiellen Mittels zur Bekämpfung von Mikroben bei der Behandlung von Menschen, Tieren und Pflanzen.
Antimikrobielles Mittel, enthaltend mindestens eine Benzimidazol-2-yl-alkylamin-Verbindung nach einem der Ansprüche 1–9.
Antimikrobielles Mittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Trägersubstanz und/oder mindestens einen Hilfs- und/oder Zusatzstoff enthält.
Antimikrobielles Mittel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es als Trägermaterialien, Hilfs- und Zusatzstoffe nicht-toxische, inerte und pharmazeutisch geeignete Materialien aus dem Bereich der Pharmazie, der Lebensmitteltechnologie oder der Landwirtschaft enthält.
Antimikrobielles Mittel nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Pflanzenschutzmittel handelt.
Verfahren zur Herstellung von antimikrobiellen Mitteln nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens eine Benzimidazol-2-yl-alkylamin-Verbindung nach einem der Ansprüche 1–9 mit mindestens einem der anderen Bestandteile vermischt und/oder in Lösung bringt.
Verfahren zur systemischen und lokalen Behandlung von Erkrankungen von Pflanzen, die mit Mikroben in Zusammenhang stehen, dadurch gekennzeichnet, dass man Pflanzen oder Pflanzenteile, die einer derartigen Behandlung bedürfen, mit einer mikrobizid wirkenden Menge eines antimikrobiellen Mittels nach einem der Ansprüche 13 bis 16 bestäubt, besprüht oder den umgebenden Boden damit anreichert.