DE602004009801T2

DE602004009801T2 - Biologisch wirksame neopeltolidverbindungen

Info

Publication number: DE602004009801T2
Application number: DE602004009801T
Authority: DE
Inventors: Amy E. Fort Pierce WRIGHT; Shirley A. Ft Pierce POMPONI; Peter J. Vero Beach McCARTHY
Original assignee: Harbor Branch Oceanographic Institution Inc
Current assignee: Harbor Branch Oceanographic Institute Foundation Inc
Priority date: 2003-06-23
Filing date: 2004-06-22
Publication date: 2008-08-14
Anticipated expiration: 2024-06-23
Also published as: DE602004009801D1; EP1644380B1; ES2295927T3; JP2007521275A; CA2529930A1; ATE377013T1; US20040266847A1; WO2005001778A3; WO2005001778A2; US7179828B2; EP1644380A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft organische Verbindungen und Zusammensetzungen, die brauchbare therapeutische Eigenschaften aufweisen. Insbesondere betrifft die Erfindung neue Makrolid-Verbindungen mit antiproliferativen, Antitumor- und fungiziden Wirkungen; pharmazeutische Zusammensetzungen umfassend diese Verbindungen; und deren Verwendung für therapeutische Zwecke und bei der Bekämpfung des Verderbens von Lebensmitteln, Kosmetika und anderen Konsumartikeln.
Hintergrund der Erfindung
Von großer Bedeutung für die Menschheit ist die Bekämpfung von pathologischer Zellproliferation, wie jene, die im Fall von Krebs auftritt. Beträchtliche Forschungsbemühungen und Mittel sind onkologischen und Antitumormaßnahmen, einschließlich Chemotherapie, gewidmet worden. Obgleich bestimmte Verfahren und chemische Zusammensetzungen entwickelt worden sind, die einen Beitrag bei er Inhibierung, Remission oder Bekämpfung des Wachstums von z. B. Tumoren leisten, besteht ein Bedarf nach neuen Verfahren und chemischen Antitumorzusammensetzungen. Antiproliferative Mittel können auch bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten und Entzündungserkrankungen brauchbar sein.
Der Erfolg der Chemotherapie zur Behandlung von verschiedenen Krebsarten kann über Zellmechanismen, die sich entwickelt haben, so dass neoplastische Zellen die zytotoxischen Wirkungen des Arzneimittels untergraben können, zunichte gemacht werden. Einige Zellen haben Mechanismen entwickelt, die ihnen Beständigkeit gegenüber einer Reihe von strukturell nicht in Beziehung stehenden Arzneimitteln verleihen. Dieses Multidrug-Resistenz (oder MDR)-Phänomen kann sich durch eine Reihe von verschiedenen Mechanismen ergeben.
Von weiterer beträchtlicher Bedeutung für die Menschheit ist die Bekämpfung von Pilzen, die Erkrankungen von Menschen, Tieren und Pflanzen und auch den Verderb von Lebensmitteln und Produkten verursachen können. Beträchtliche Forschungsbemühungen und Mittel sind der Identifizierung von Fungiziden gewidmet worden. Obwohl bestimmte Verfahren und chemische Zusammensetzung entwickelt worden sind, welche die Inhibierung oder Bekämpfung des Wachstums von Pilzen unterstützen, sind neue Verfahren und fungizide Zusammensetzungen erforderlich.
Pilzinfektionen bei Menschen können in oberflächliche, subkutane und tiefe (oder systemische) Mykosen eingeteilt werden. Oberflächliche Pilzinfektionen der Haut, der Haare und der Nägel können chronisch und behandlungsresistent sein, beeinträchtigen aber selten die allgemeine Gesundheit des Patienten. Tiefe Mykosen können andererseits eine systemische Beteiligung ergeben und sind manchmal fatal.
Verluste nach der Ernte während der Lagerung von landwirtschaftlichen Pflanzenprodukten werden u. a. durch Pilz- und Bakterienpathogenen verursacht. Fungizide Verbindungen sind seit langem verwendet worden, um die Erträge zu steigern und die Möglichkeiten der landwirtschaftlichen Produktion in neue Dimensionen zu erstrecken. Sie sind auch außerordentlich wichtige Mittel zur Linderung der jahreszeitlichen Unterschiede im Ertrag und in der Qualität, die durch wetterbedingte Variationen im Befallsdruck verursacht werden.
Die zukünftige Rolle von Fungiziden in der Landwirtschaft wird durch mehrere Faktoren in zunehmendem Maße bedroht, einschließlich der Entwicklung von Schädlingsresistenz und der wachsenden Sorge über die Lebensmittelsicherheit und die Anreicherung von toxischen Verbindungen in der Umwelt. Da ältere Fungizide aufgrund von Änderungen in den Vorschriften aus dem Markt genommen sind, gibt es einen steigenden Bedarf nach neuen wirksamen fungiziden Verbindungen.
Zampella et al., Tetrahedron 53(9): 3243–8 (1997), offenbart zwei zytotoxische Glycosidmakrolide mit dem Namen Callipeltoside B und C, die aus einem Meeresschwamm der Ordnung Lithistida isoliert wurden.
Lafontaine et al., Tetrahedron Letters 40: 4145–4148 (1999), offenbaren die enantioselektive Totalsynthese des Antitumormakrolids Rhizoxin D., das ursprünglich aus der Pilzgruppe Rhizopus chinensis erhalten wurde.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung gibt es neue Verbindungen der Formel I, die als Neopeltolide bezeichnet werden, bevorzugt Formel Ia, eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine solche Verbindung, die Verwendung einer solchen Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Inhibierung von Zellproliferation oder einer Pilzinfektion und ein nicht therapeutisches Verfahren zur Verhinderung des Pilzwachstums, wie in den Ansprüchen definiert.
Verbindungen und Zusammensetzungen der Erfindung können bei der Behandlung eines Krebszellen beherbergenden Tiers/Menschen und zur Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen in einem Säugetierwirt verwendet werden. Insbesondere können die Verbindungen zur Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen, einschließlich Zellen von Brust-, Dickdarm-, ZNS-, Ovarial-, Nieren-, Prostata-, Leber-, Pankreas-, Uterus- oder Lungentumoren bei Menschen und auch bei humanen Leukämie- oder Melanomzellen verwendet werden. Die Mechanismen zur Erzielung der Antikrebsaktivität, die von diesen Verbindungen gezeigt wird, führt einen Fachmann auf dem Gebiet dazu, ihre Anwendbarkeit bei zusätzlichen Krebsarten zu erkennen, wie hier beschrieben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können Krebszellen in einem Wirt inhibiert werden, indem Tumorzellen mit einer wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung kontaktiert werden. Die zu inhibierenden Krebszellen sind jene, die für die neuen Verbindungen oder Zusammensetzungen anfällig sind.
In einer weiteren speziellen Ausführungsform können die Verbindungen bei der Bekämpfung des Pilzwachstums verwendet werden. Aufgrund der biologischen Aktivität dieser Verbindungen können sie zur Behandlung von Pilzinfektionen bei Pflanzen und Tieren/Menschen, zur Verhinderung des Verderbs von organischen Zusammensetzungen, wie Lebensmitteln und Kosmetika, und als Desinfektionsmittel verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Verbindungen zur Inhibierung des Wachstums von Pilzen in einem Säugetierwirt verwendet werden. Wie hier verwendet beinhaltet die Bezugnahme auf "fungizide Aktivität" fungizide und fungistatische Aktivität und auch die Inhibierung von Pilzkeimung oder -wachstum.
Beschreibung der Erfindung
Verbindungen der Erfindung eignen sich zur Inhibierung von pathologischer Zellproliferation. Vorteilhafterweise können die Makrolid-Verbindungen der Erfindung verwendet werden, um unerwünschte Zellproliferation, einschließlich der pathogenen Proliferation von Tumor- und Pilzzellen zu inhibieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform können diese Verbindungen zur Behandlung von Krebs verwendet werden. Insbesondere können die neuen Verbindungen in vorteilhafter Weise zur Inhibierung des Wachstums von Tumoren und von anderen Krebszellen in einem Säugetierwirt verwendet werden. Wie hier beschrieben, besitzen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung Nutzen für die Verwendung bei der Behandlung von Krebs. Insbesondere können die betreffenden Verbindungen zur Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen, einschließlich Zellen von Brust-, Prostata-, Dickdarm-, ZNS-, Ovarial-, Nieren-, Leber-, Pankreas-, Uterus- oder Lungentumoren, und auch humanen Leukämie- oder Melanomzellen verwendet werden. Die Verbindungen weisen auch einen Nutzen bei der Behandlung von Multidrug-resistenten Krebszellen auf.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner neue Zusammensetzungen von biologisch wirksamen Makrolid-Verbindungen, die bei der Bekämpfung von Pilzwachstum brauchbar sind. Aufgrund der biologischen Wirksamkeit dieser Verbindungen können sie zur Behandlung von Pilzinfektionen von Pflanzen und Tieren/Menschen, zur Verhinderung des Verderbs von organischen Zusammensetzungen, wie Lebensmitteln und Kosmetika, und als Desinfektionsmittel verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können die neuen Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise zur Inhibierung des Wachstums von Pilzen in einem Säugetierwirt verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner isolierte enantiomere Verbindungen. Die isolierten enantiomeren Formen der Verbindungen der Erfindung sind im wesentlichen voneinander getrennt (d. h. in einem Enantiomerenüberschuss). Mit anderen Worten, die "R"-Formen der Verbindungen sind im wesentlichen frei von den "S"-Formen der Verbindungen und liegen somit im Enantiomerenüberschuss gegenüber den "S"-Formen vor. Umgekehrt sind die "S"-Formen der Verbindungen im wesentlichen frei von den "R"-Formen der Verbindungen und sind somit im Enantiomerenüberschuss gegenüber den "R"-Formen. In einer Ausführungsform der Erfindung sind die isolierten enantiomeren Verbindungen in einem Enantiomerenüberschuss von mindestens etwa 80%. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Verbindungen in einem Enantiomerenüberschuss von mindestens etwa 90%. In einer bevorzugteren Ausführungsform sind die Verbindungen in einem Enantiomerenüberschuss von mindestens etwa 95%. In einer sogar noch mehr bevorzugten Ausführungsform sind die Verbindungen in einem Enantiomerenüberschuss von mindestens etwa 97,5%. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform sind die Verbindungen in einem Enantiomerenüberschuss von mindestens etwa 99%.
Gemäß der vorliegenden Erfindung beinhalten Verfahren zur Inhibierung von Krebs in einem Wirt die Kontaktierung der Krebszellen mit einer wirksamen Menge der neuen pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung. Die Tumorzellen, die durch die Erfindung inhibiert werden, sind jene, die gegenüber den hier beschriebenen betreffenden Verbindungen oder den Zusammensetzungen, die diese Verbindungen umfassen, empfindlich sind.
Es werden hier auch Verfahren zur Verwendung der neuen Verbindungen und Zusammensetzungen der Erfindung beschrieben, z. B. Verfahren zur Inhibierung von Tumoren und anderen Krebszellen in einem Lebewesen, vorzugsweise einem Säugetier, insbesondere ein Verfahren zur Antitumorbehandlung eines Menschen, der einer solchen Behandlung bedarf, d. h. eines Menschen, der Krebszellen beherbergt, einschließlich Brust-, Dickdarm-, Leber-, Pankreas-, Uterus- oder Lungentumorzellen oder Leukämiezellen, einschließlich Multidrug-resistenten Krebszellen.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind die Verbindungen im wesentlichen rein, d. h. sie enthalten mindestens 95% der Verbindungen gemäß Bestimmung durch etablierte analytische Verfahren.
In weiteren bevorzugten Verfahren der Erfindung werden Salze und Analoga im Rahmen der Erfindung durch Zugabe von Mineralsäuren, z. B. HCl, H₂SO₄, oder starken organischen Säuren, z. B. Ameisensäure, Oxalsäure, in angemessenen Mengen zur Bildung des Säureadditionssalzes der Stammverbindung oder ihres Derivats hergestellt. Es können auch gemäß bekannten Verfahren Synthesereaktionen verwendet werden, um verschiedene Gruppen in den bevorzugten Verbindungen hinzuzufügen oder zu modifizieren, um andere Verbindungen im Rahmen der Erfindung herzustellen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen Prozeduren zur Durchführung der Erfindung. Diese Beispiele sollten nicht als beschränkend aufgefasst werden. Alle Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht und alle Lösungsmittelmischungsanteile auf das Volumen, sofern nicht anders angegeben. Es ist den Fachleuten ersichtlich, dass die Beispiele den Einsatz von Materialien und Reagenzien beinhalten, die aus bekannten Quellen, z. B. Chemiehandelsfirmen, im Handel erhältlich sind, so dass keine sie betreffenden Einzelheiten angegeben werden.
BEISPIEL 1 – Isolierung und Strukturaufklärung von Neopeltolid (I)
A. Sammlung und Taxonomie des Ursprungsorganismus
Eine Probe eines Schwamms, von dem gezeigt wurde, dass er zur Familie Neopeltidae (Stamm: Porifera, Klasse Demospongiae, Ordnung Lithistida, Familie Neopeltidae) gehört, wurde mit der bemannten Johnson Sea Link, die bei einer Tiefe von 433 m tauchfähig ist, vor der nordjamaikanischen Küste (Breitengrad 18 28,638' N, Längengrad 78 10,996' W) gesammelt. Die Schwammmorphologie ist die einer Platte mit sichtbaren Poren auf der oberen Oberfläche, steinartig in der Konsistenz und weiß in der Farbe. Eine Referenzprobe, die in Ethanol konserviert ist, ist im Harbor Branch Oceanographic Museum (Katalognr. 003:01004, DBMR-Nummer 23-VIII-93-5-010) gelagert und für die taxonomische Bewertung für die Fachleute verfügbar.
B. Isolierung und Strukturaufklärung von Neopeltolid (I)
Einhundertundfünf (105) Gramm des gefrorenen Neopeltidae-Schwamms, 23-VIII-93-5-010, wurden durch Aufquellen mit Ethanol unter Verwendung eines Waring-Mischers gründlich extrahiert (5 × 250 ml). Die vereinten filtrierten Extrakte wurden durch Destillation unter vermindertem Druck konzentriert, um 3,2 g eines unaufbereiteten Rückstands zu ergeben. Der Rückstand wurde zwischen n-Butanol und Wasser aufgeteilt (3 × 50 ml Portionen). Nach der Konzentrierung wurde die n-Butanol-Phase (0,7 g) unter Vakuumsäulenchromatographie-Bedingungen auf einer stationären Phase aus Kieselgel 60 H (EM Science) chromatographiert. Ein 150 ml Büchner-Trichter, der mit einer Glasfrittenscheibe mittlerer Porosität versehen war, wurde als Säule verwendet. Die stationäre Phase wurde auf eine Gesamthöhe von 4 cm gepackt. Die Butanol-Fraktion wurde als Aufschlämmung in einer Mischung von Heptan-Ethylacetat (8:2 Vol./Vol.) auf die Säule gegeben.
Fraktionen wurden unter Verwendung eines 20% Stufengradienten von Ethylacetat in Heptan, gefolgt von einer Reihe von Fraktionen, die ansteigende Mengen von Methanol in Ethylacetat enthielten, eluiert [Fraktion 1: Heptan-Ethylacetat 80:20 Vol./Vol. (150 ml); Fraktion 2: Heptan-Ethylacetat 60:40 Vol./Vol. (150 ml); Fraktion 3: Heptan-Ethylacetat 40:60 Vol./Vol. (150 ml); Fraktion 4: Heptan-Ethylacetat 25:75 Vol./Vol. (150 ml); Fraktion 5: Heptan-Ethylacetat 20:80 Vol./Vol. (150 ml); Fraktion 6: Ethylacetat (150 ml); Fraktion 7: Ethylacetat-Methanol 75:25 Vol./Vol. (150 ml); Fraktion 8: Ethylacetat-Methanol 50:50 Vol./Vol. (150 ml); Fraktion 9: Methanol (150 ml).

Neopeltolid wurde sauber in die Fraktion 3 eluiert. Fraktion 3 wurde weiter durch HPLC unter Verwendung einer Vydac C-18-Protein- und Peptid-Säule (10 mm × 250 mm, 10 μ Teilchengröße), Durchsatz = 3 ml/min; Elutionsmittel: Wasser: Acetonitril 40:60 Vol./Vol.; Überwachung durch UV bei 230 nm, getrennt. Neopeltolid wurde unter diesen Bedingungen nach etwa dem 6,2-fachen Säulenvolumen eluiert.
Neopeltolid (I): farbloses Öl; MS: m/z beobachtet 591,32692, berechnet 591,32816, Δ = –1,2 mmu für Formel C₃₁H₄₇O₉N₂ (M + H⁺); [α]²⁴D = +23,0 (c 0,0024 g/ml in Methanol). Siehe Tabelle 1 für ¹H- und ¹³C-NMR-Daten. TABELLE 1. NMR-Daten für Neopeltolid (I)

Atom Nr.	¹H (mult. J in Hz)		¹³C (mult.)
1		-	172,5 (s)
2	A	2,66 (dd J = 14,8, 4,3)	43,0 (t)
	B	2,33 (dd J = 14,5, 10,8)
3		4,09 (m)	70,6 (d)
4	A	1,84 (m)	35,9 (t)
	B	1,53 (m)
5		5,21 (m)	68,5 (d)
6	A	1,68 (m)	37,0 (t)
	B	1,54 (m)
7		3,58 (dd J = 10,4, 9,8)	76,6 (d)
8	A	1,40 (m)	44,8 (t)
	B	1,29 (m)
9		1,45 (m)	32,0 (d)
10	A	1,58 (m)	42,9 (t)
	B	1,14 (m)
11		3,63 (m)	76,5 (d)
12	A	1,90 (m)	40,5 (t)
	B	1,39 (m)
13		5,18 (m)	73,8 (d)
14	A	1,75 (m)
	B	1,53 (m)	37,5 (t)
15	AB	1,39 (2H m)	19,6 (t)
16		0,93 (3H t J = 7,3)	14,1 (q)
17		0,99 (3H d J = 8,8)	25,9 (q)
11-OCH3		3,33 (3H s)	56,4 (q)
1'		-	166,4 (s)
2'		5,91 (bd J = 11,3)	121,3 (d)
3'		6,35 (dt J = 11,3, 7,45)	149,8 (d)
4'	AB	3,02 (2H q J = 7,45)	28,4 (t)
5'	AB	2,73 (2H t J = 7,45)	26,0 (t)
6'		-	141,5 (s)
7'		7,55 (bs)	135,3 (d)
8'		-	161,3 (s)
9'		6,26 (bd J = 12,0)	115,8 (d)
10'		6,05 (ddd J = 12,0, 6,0, 6,0)	138,5 (d)
11'	AB	4,31 (2H bd J = 4,9)	40,6 (t)
12'			158,9 (s)
12'-OCH3		3,67 (3H s)	52,4 (q)

BEISPIEL 2 – Antitumorwirkungen von Neopeltolid (I)
A. Wirkungen von Neopeltolid bei der in vitro-Proliferation von Tumorzelllinien
Neopeltolid wurde auf seine Wirkung auf die Proliferation von humanen A549-Lungenadenokarzinom-, humanen NCl-ADR-RES (früher MCF-7/ADR)-Brustkrebs- und murinen P388-Leukämie-Zelllinien untersucht. P388-Zellen wurden von Dr. R. Camalier, National Cancer Institute, Bethesda, MD, erhalten und A549- und NCI-ADR-RES-Zellen wurden von American Type Culture Collection, Rockville, MD, erhalten.
Sämtliche Zelllinien werden im Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-Medium 1640, das mit 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 60 μg/ml L-Glutamin, 18 mm HEPES, 0,05 mg/ml Gentamycin und 10% fötalem Kälberserum ergänzt ist, aufbewahrt. Die Zelllinien werden in Kunststoffgewebekulturkolben kultiviert und in einem Inkubator bei 37°C in befeuchteter Luft mit 5% CO₂ aufbewahrt.
Zur Bestimmung der antiproliferativen Wirkungen von Mitteln gegen die verschiedenen Zelllinien werden 100 μm Kulturen (Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen, Nunc, Dänemark) zuerst mit 3 × 10⁴ Zellen/ml für anhaftende Linien (A549, NCI ADR-RES) und mit 1 × 10⁵ für nicht anhaftende Linien (P388) in Gewebekulturmedium bereitgestellt und 24 h bei 37°C in 10% CO₂ in Luft inkubiert, damit die Zellen anhaften. Ein Volumen von 100 μl Medium wird von jeder Testvertiefung entnommen und 100 μl Medium, das der Reihe nach Zweifach-Verdünnungen des Testmittels enthält, werden zu jeder Tumorzellen enthaltenden Vertiefung gegeben. Medium ohne Arzneimittel wird ebenfalls zu Tumorzellen enthaltenden Vertiefungen gegeben, die als Kontrollen ohne Arzneimittel dienen. Positive Arzneimittelkontrollen werden aufgenommen, um die Arzneimittelempfindlichkeit aller Zelllinien zu überwachen. Diese beinhalten verschiedene Verdünnungen von 5-Fluoruracil, Doxorubicin.
Nach 72-stündiger Einwirkung (anhaftende Zelllinien) oder 48-stündiger Einwirkung (nicht anhaftende Zelllinien) werden Tumorzellen unter Verwendung von 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (M. C. Alley et al., Cancer Res. 48: 589; 1988) wie folgt ausgezählt:
Ein Volumen von 75 μl warmem Wachstumsmedium enthaltend 5 mg/ml MTT wird zu jeder Vertiefung gegeben, die Kulturen in den Inkubator zurückgestellt und 3 h ungestört gelassen. Zur spektralphotometrisch quantitativen Bildung von reduziertem Formazan werden die Platten zentrifugiert (900 × g, 5 min), Kulturfluide durch Absaugen entfernt und 200 μl angesäuertes Isopropanol (2 ml konzentrierte HCl/Liter Isopropanol) pro Vertiefung zugegeben. Die Extinktion der sich ergebenden Lösungen wird bei 570 nm mit einem Plattenablesegerät (Spectra II Tecan Laboratories) gemessen.
Die Extinktion der Testvertiefungen wird durch die Extinktion von arzneimittelfreien Vertiefungen dividiert und die Konzentration des Mittels, die 50% der Extinktion der unbehandelten Kulturen ergibt (IC₅₀), wird durch lineare Regression Logit-transformierter Daten (D. J. Finney, Statistical Method in Biological Assay, 3. Aufl., S. 316–348, Charles Griffin Co., London, 1978) bestimmt. Eine lineare Beziehung zwischen der Tumorzellenzahl und der Formazan-Bildung ist routinemäßig über den Bereich der Zelldichten, die in diesen Experimenten beobachtet wurden, beobachtet worden.
Die beiden Standardarzneimittelkontrollen (oben angegeben) werden in jedem Assay aufgenommen, um die Arzneimittelempfindlichkeit aller Zelllinien zu überwachen, und IC₅₀-Werte werden für jede Kombination Arzneimittel-Zellen bestimmt.
Eine Zusammenfassung der Ergebnisse in diesen Untersuchungen für Neopelotid I kann in Tabelle 2 gefunden werden.

TABELLE 2. Zytotoxizitätsergebnisse für Neopeltolid

A549 IC₅₀ NCIADR-RES IC₅₀ P388 IC₅₀

Neopeltolid (I) 1,17 nM 5,1 nM 0,56 nM
BEISPIEL 3. – Fungizidaktivität von Neopeltolid (I)
A. Wirkungen von Neopeltolid auf das in vitro-Wachstum von Candida albicans
Die fungizide Wirkung von Neopeltolid gegen Candida albicans (American Type Culture Collection-Stamm 44506) wurde durch den Einsatz von Agardiffusions- und Bouillonverdünnungsuntersuchungen bestimmt.
Agardiffusionsuntersuchungen wurden unter Verwendung von Sabouraud Dextrose-Agarplatten durchgeführt, die mit den Testmikroben mit 10⁵/ml geimpft waren. Scheiben (6,35 mm, Schliecher und Schuell) wurden mit 25 μg Neopeltolid imprägniert, trocknen gelassen und dann auf die Agar-Oberfläche gebracht. Nach einer Inkubation bei 37°C über 24 h wurden die Zonen der Wachstumsinhibierung bestimmt. Ein Kontrollscheibe mit 100 IU Nystatin wurde auf der gleichen Platte wie Neopeltolid untersucht: die Zone der Inhibierung betrug 28 mm.
Bouillonverdünnungsuntersuchungen wurden als herkömmliche Mikrotiterassays mit 96 Vertiefungen in einem Gesamtvolumen von 50 μl mit einer Impfungsdichte von 10³ Zellen/ml durchgeführt. Der Konzentrationsbereich für Neopeltolid lag im Bereich von 5 bis 0,4 μg/ml als Zweifachverdünnungen. Die Platten wurden bei 37°C für 24 h inkubiert, wonach die minimale Inhibitionskonzentration (MIC) als die niedrigste Konzentration im Testbereich bestimmt, die das Wachstum von C. albicans vollständig inhibierte. 5-Fluorcytosin wurde als Fungizidkontrolle für die Untersuchung verwendet: die MIC für 5-Fluorcytosin betrug 0,62 μg/ml.
Ergebnisse: Neopeltolid I zeigt eine Wachstumsinhibitionszone von 17 mm bei Prüfung mit einer Konzentration von 25 μg/Scheibe im C. albicans in der Scheibendiffusionsuntersuchung. Die minimale Inhibitionskonzentration (MIC) von Neopeltolid gegen C. albicans beträgt 0,625 μg/ml.
BEISPIEL 4 – Formulierung und Verabreichung
Die Verbindungen der Erfindung eignen sich für verschiedene nicht therapeutische und therapeutische Zwecke. Es ist aus der Prüfung ersichtlich, dass die Verbindungen der Erfindung zur Inhibierung des Zellwachstums wirksam sind. Aufgrund der antiproliferativen Eigenschaften der Verbindungen eignen sie sich zur Verhinderung von unerwünschtem Zellwachstum in einer breiten Vielfalt von Situationen, einschließlich in vitro-Verwendungen. Sie eignen sich auch als Standards und für Lehrdemonstrationen. Wie hier offenbart, eignen sie sich auch prophylaktisch und therapeutisch zur Behandlung von Krebszellen in Tieren und Menschen.
Die therapeutische Anwendung der neuen Verbindungen und Zusammensetzungen, die diese enthalten, können durch jedes geeignete therapeutische Verfahren und jede geeignete therapeutische Technik, die derzeit oder voraussichtlich den Fachleuten bekannt ist, bewerkstelligt werden. Die Verbindungen der Erfindung weisen ferner eine Verwendung als Ausgangsmaterialien oder Zwischenprodukte für die Herstellung von anderen geeigneten Verbindungen und Zusammensetzungen auf.
Die zu verabreichende Dosierung an einen Wirt in den oben angegebenen Indikationen hängt von der Identität der Krebszellen, der Art des beteiligten Wirts, seines Alters, Gewichts, seiner Gesundheit, der Art der gleichzeitigen Behandlung, falls vorliegend, der Häufigkeit der Behandlung und der kleinsten therapeutischen Dosis ab.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können gemäß den bekannten Verfahren zur Herstellung von pharmazeutisch brauchbaren Zusammensetzungen formuliert werden. Formulierungen werden ausführlich in einer Reihe von Quellen beschrieben, die wohlbekannt sind und den Fachleuten ohne weiteres verfügbar sind. Zum Beispiel beschreibt Remington's Pharmaceutical Science von E. W. Martin Formulierungen, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung so formuliert, dass eine wirksame Menge der biowirksamen Verbindung(en) mit einem geeigneten Träger kombiniert werden, um die wirksame Verabreichung der Zusammensetzung zu erleichtern.
Gemäß der Erfindung umfassen pharmazeutische Zusammensetzungen als einen Wirkstoff eine wirksame Menge von einer oder mehreren der neuen Verbindungen und einen bzw. ein oder mehrere nicht toxische, pharmazeutisch verträgliche Träger oder Verdünnungsmittel. Beispiele für solche Träger zur Verwendung in der Erfindung beinhalten Ethanol, Dimethylsulfoxid, Glycerin, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Stärke und äquivalente Träger und Verdünnungsmittel.
Zur Verabreichung solcher Dosierungen für die gewünschte therapeutische Behandlung umfassen die neuen pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung vorteilhafterweise zwischen etwa 0,1 Gew.-% und 45 Gew.-% und insbesondere 1 und 15 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtheit, von einer oder mehreren der neuen Verbindungen auf Basis des Gewichts der Gesamtzusammensetzung einschließlich Träger oder Verdünnungsmittel. Veranschaulichende Dosierungskonzentrationen des verabreichten Wirkbestandteils können sein: intravenös 0,01 bis etwa 20 mg/kg; intraperitoneal 0,01 bis etwa 100 mg/kg; subkutan 0,01 bis etwa 100 mg/kg; intramuskulär 0,01 bis etwa 100 mg/kg; oral 0,01 bis etwa 200 mg/kg und bevorzugt etwa 1 bis 100 mg/kg; intranasale Einflössung 0,01 bis etwa 20 mg/kg; und Aerosol 0,01 bis etwa 20 mg/kg Gewicht des Tieres/Menschen.

Claims

Verbindung mit der folgenden Strukturformel:
oder ein Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1 mit der folgenden Formel
Verbindung nach Anspruch 1 mit den folgenden spektroskopischen Eigenschaften: Atom Nr. ¹H (mult. J in Hz) ¹³C (mult.) 1 - 172,5 (s) 2 A 2,66 (dd J = 14,8, 4,3) 43,0 (t) B 2,33 (dd J = 14,5, 10,8) 3 4,09 (m) 70,6 (d) 4 A 1,84 (m) 35,9 (t) B 1,53 (m) 5 5,21 (m) 68,5 (d) 6 A 1,68 (m) 37,0 (t) B 1,54 (m) 7 3,58 (dd J = 10,4, 9,8) 76,6 (d) 8 A 1,40 (m) 44,8 (t) B 1,29 (m) 9 1,45 (m) 32,0 (d) 10 A 1,58 (m) 42,9 (t) B 1,14 (m) 11 3,63 (m) 76,5 (d) 12 A 1,90 (m) 40,5 (t) B 1,39 (m) 13 5,18 (m) 73,8 (d) 14 A 1,75 (m) B 1,53 (m) 37,5 (t) 15 AB 1,39 (2H m) 19,6 (t) 16 0,93 (3H t J = 7,3) 14,1 (q) 17 0,99 (3H d J = 8,8) 25,9 (q) 11-OCH3 3,33 (3H s) 56,4 (q) 1' - 166,4 (s) 2' 5,91 (bd J = 11,3) 121,3 (d) 3' 6,35 (dt J = 11,3, 7,45) 149,8 (d) 4' AB 3,02 (2H q J = 7,45) 28,4 (t) 5' AB 2,73 (2H t J = 7,45) 26,0 (t) 6' - 141,5 (s) 7' 7,55 (bs) 135,3 (d) 8' - 161,3 (s) 9' 6,26 (bd J = 12,0) 115,8 (d) 10' 6,05 (ddd J = 12,0, 6,0, 6,0) 138,5 (d) 11' AB 4,31 (2H bd J = 4,9) 40,6 (t) 12' 158,9 (s) 12'-OCH3 3,67 (3H s) 52,4 (q)
Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 zur therapeutischen Verwendung bei der Inhibierung von Zellproliferation.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Verwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Inhibierung von Zellproliferation.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Zellproliferation mit einem Zustand assoziiert ist, der aus Autoimmunstörungen, Entzündung, Tumoren und Krebs ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der Krebs ausgewählt ist aus Brustkrebs, Dickdarmkrebs, ZNS-Krebs, Leberkrebs, Lungenkrebs, Leukämie, Melanom, Overialkrebs, Uteruskrebs, Nierenkrebs, Pankreaskrebs und Prostatakrebs.
Verwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Inhibierung von Pilzinfektion.
Nicht-therapeutisches Verfahren zur Inhibierung des Pilzwachstums, welches umfasst das Anwenden einer Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 bei einem Pilz.
Verfahren nach Anspruch 10, das zur Hemmung des Verderbens von Lebensmitteln oder Kosmetika verwendet wird.