DE1019301B - Verfahren zur Reinigung von basischen Streptomyces-Antibiotika - Google Patents

Description

DEUTSCHES

BiBUOTHEK

DES DEUTSCHEN

PATENTAMTES

Die vorliegende Erfindung bezieht sich, auf ein, Verfahren, zur Reinigung von basischen. Streptomyces-Antibiotika unter Verwendung von, Ionenaustauschern.

Zur Gewinnung antibiotischer Verbindungen, wurden zahlreiche, meist mehrstufige Verfahren· angewendet. Meistens wurde die wirksame Substanz von: der Vielzahl der in den Gärbrühen auftretenden organischen und anorganischen, Verunreinigungen durch Komplexsalzbildung oder Herstellung· von Salzen mit gewissen sauren Farbstoffen oder anderen organischen Säuren abgetrennt. Bei vielen Verfahren wurden, organische Lösungsmittel zur Extraktion der Antibiotika aus wäßriger Lösung verwendet. Die Extraktionsverfahren mußten in kompliziert gebauten Apparaturen durchgeführt werden.

Es wurden auch, schon, Ionenaustauscher zur Gewinnung basischer Antibiotika von der Art des Streptomycins verwendet. Derartige Verfahren sind z. B. in den USA.-Patentschriften 2 541 420, 2 528 188, 2 528 022 und: 2 667 441 beschrieben;. Teilweise wurden auch schon Carboxylgruppen enthaltende Ionenaustauscher verwendet. Trotz Anwendung¹ von Ionenaustauschern war es bisher zur Herstellung sehr reiner, amorpher oder kristalliner Antibiotika oder ihrer Salze immer noch erforderlich, außerdem weitere Reinigungsstufen, wie selektive fraktionierte Fällung oder Extraktion, mit Lösungsmitteini, durchzuführen,

Es wurde nun gefunden, daß basische Streptomyces-Antibiotika, wie Streptomycin, Viomycin, Dihydrostreptomycin, Oxystreptomycin, Streptothricin, Mannosidostreptomycin und Neomycin, überraschend einfach mit Hilfe von Ionenaustauschern gereinigt werden können.

Die verwendbaren Antibiotika bilden, mit Mineralsäuren einfache Salze, deren p_H-Werte in wäßriger Lösung nahe dem Neutralpunkt liegen. Das erfindungsgemäße Verfahren hat gegenüber den bisher zur Reinigung basischer Streptomyces-Antibiotika. angewandten Verfahren den Vorteil, daß weder organische Lösungsmittel noch komplexsalzbildende organische Säuren, z. B. gewisse Farbstoffe, Pikrinsäure unid Reineckes Säure, zur Erzielung eines hohen, Reinheitsgrades erforderlich sind. Es werden nur verhältnismäßig einfache Anlagen, die für eine beliebige Zahl von basischen Streptomyces-Antibiotika, verwendet werden können, beim erfindungsgemäß em Verfahren benutzt. Für jede Stufe kann ferner die gleiche Anlage verwendet werden. Die erfindungsgemäße Reinigung ist daher besonders einfach und wirtschaftlich durchzuführen.

Ein sehr überraschender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht auch darin, daß die Bildung fiebererregender Stoffe und histaminartiger Verbindungen., die oft bei anderen Gewinnungsver-

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Verfahren zur Reinigung von basischen Streptomyces-Antibiotika

Anmelder:

Chas. Pfizer & Co., Inc., Brooklyn, N. Y. (V. St. A.)

Vertreter: Dr. W. Beil, Rechtsanwalt, Frankfurt/M.-Höchst, Antoniterstr. 36

Beanspruchte Priorität: V, St. v. Amerika vom 3. September 1954 und 23. Februar 1955

Ira Joseph Friedmann, Hicksville, N. Y.,

Edward George Martin, Whitestone, N. Y.,

und Roy Jasper Taylor, Union Turnpike, N. Y. (V. St. A.),

sind als Erfinder genannt worden

fahren beobachtet wird, praktisch vollständig vermieden zu werden scheint. Dieser Vorteil ist wesentlich, da oft die Einschaltung einer getrennten. Verfahrensstufe für die Entfernung von fiebererregenden Stoffen nötig ist.

Vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine verunreinigte Lösung basischer Streptomyces-Antibiotika, z. B. eine filtrierte Gärbrühe, zunächst nach den in den USA.-Patentschriften 2 541 420 und 2 528 188 beschriebenen Verfahren behandelt. Sie wird danach zuerst bei einem leicht sauren bis leicht basischen p_H-Wert (beispielsweise bei- 6,0 bis 9,0) über einen Ionenaustauscher geleitet, der als Austauschergruppen hauptsächlich Carboxylgruppen enthält und durch. Polymerisation, von Methacrylsäure oder vorzugsweise eines Methacrylsäureesters mit-etwa 6 bis etwa 12% einer aromatischen Di vinyl verbindung, wie Divinylbenzol, Divinyltoluol oder Divinylnaphthalin, als Vernetzungskomponente hergestellt wurde. Falls ein Ester zur Bildung des Harzes verwendet wurde, mußten die Estergruppen im Harz selbstverständlich zu Säuregruppen hydrolysiert werden. Derartige Harze sind unter dem Handelsnamen »Amberlite IRC-50« im Handel. Das Harz liegt mindestens teilweise in Salzform vor und wird vorzugsweise mit Alkali (beispielsweise Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd) auf einen p_H-Wert zwischen neutral und schwach basisch (etwa

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7 bis 8) eingestellt, bevor es mit der Lösung des Antibiotikums in Berührung kommt. Das auf dem Harz adsorbierte Antibiotikum wird dann mit einer verdünnten Säure, vorzugsweise einer Mineralsäure, wie verdünnter Salzsäure oder verdünnter Schwefelsäure, aus dem Ionenaustauscher eluiert. Diese und auch die folgenden Verfahrensstufen können besonders glatt nach einem sogenannten »Zweiturm«-Verfahren durchgeführt werden, wie es z. B. in derUSA.-Patentschrift

Ein derartiges Verfahren ist z. B. in der USA.-Patentschrift 2 560 891 beschrieben.

Das Eluat aus dem ersten Harz ist eine nur teilweise gereinigte Lösung. Sie kommt mit dem zweiten Ionenaustauscher vorzugsweise in einer Kolonne in Berührung, und zwar so lange, bis zwischen dem Harz und dem Antibiotikum ein Gleichgewicht erreicht ist. Dies hat zur Folge, daß ein großer Teil der in der Beschickung vorhandenen Kationen die Ko-

2 528 188 beschrieben ist. Die aus dem Harz eluierte io lonne passiert, ohne adsorbiert zu werden. Es ist ver

Flüssigkeit wird am besten sofort auf einen p_H-Wert zwischen neutral und schwach basisch, d. h. zwischen etwa 6,0 und etwa 9,0, vorzugsweise zwischen 7,0 und 8,0, eingestellt. Man kann das Eluat z. B. mit Alkali, wie Natriumsetzen.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nun gleichfalls ein synthetischer Kationenaustauscher verwendet. Er besteht jedoch aus

hältnismäßig einfach. Proben der die Kolonne verlassenden Lösung des Antibiotikums zu untersuchen und festzustellen, wann die Konzentration des Antibiotikums in dieser Lösung ungefähr derjenigen der

oder Kaliumhydroxyd, ver- 15 in die Kolonne eintretenden Lösung entspricht. Zu

diesem Zeitpunkt wird die weitere Zufuhr an erstem Eluat unterbrochen und das Antibiotikum mit verdünnter Mineralsäure eluiert. Falls Schwefelsäure verwendet wird, kann die überschüssige Säure wieder

einem Harz mit großer Porosität, d. h., es ist ein ao durch Ausfällung mit Bariumhydroxyd oder nach den Harz, das eine große Menge organischer Basen mit anderen vorstehend angegebenen Verfahren entfernt verhältnismäßig hohem Molekulargewicht (über etwa werden.

150) zu adsorbieren vermag. Solche Harze sind da- Häufig besitzt das mit dem zweiten Harz erfin-

durch gekennzeichnet, daß beim Zusammenbringen dungsgemäß behandelte Produkt eine solche Reinheit, des trockenen Harzes mit Wasser oder bei der Um- 25 daß es getrocknet und unmittelbar ohne weitere Reiwandlung der Salzform des Harzes in die Säure ein nigung für therapeutische Zwecke verwendet werden verhältnismäßig großer Volumenzuwachs eintritt. kann. Kleinere Mengen an gefärbten Stoffen können Die Harze geringer Porosität zeigen nur eine gering- gewünschtenfalls durch Adsorption an Holzkohle befügige derartige Volumenveränderung. Derartige seitigt werden. Würde ein Harz vom Typ »Amberlite Harze hoher Porosität können durch Mischpolymeri- 30 XE-89« vor dem Harz vom Typ »Amberlite IRC-50«

verwendet werden, so würden große Mengen an gefärbten Verunreinigungen und höher molekularen Stoffen in der ersten Verfahrensstufe zusammen mit dem Antibiotikum auf dem Harz adsorbiert werden. Die Verwendung von »Amberlite IRC-50« in der zweiten Stufe würde dann keine merkliche Reinigung mehr bewirken. Weiterhin würde die wiederholte Behandlung mit einer einzigen Harzart nicht in so einfacher Weise den gleichen hohen Reinheitsgrad

sation eines Acrylsäureesters mit einer kleineren Menge (etwa 1 bis 15%) einer aromatischen Divinylverbindung, wie Divinylbenzol, hergestellt werden. Es kann aber auch ein Mischpolymeres eines Methacrylsäureesters mit einer geringen Menge (etwa 1 bis 4°/o) einer aromatischen Divinylverbindung verwendet werden. Die Verseifung der erhaltenen Produkte, die in Perlenform hergestellt werden, ergibt poröse Austauscher mit Carbonsäureionen. Besonders

geeignet ist das unter dem Handelsnamen »Amber- 40 ergeben. Auch werden die anorganischen Verunreini-

lite XE-89« bekannte Harz. Es wurde gefunden, daß gungen durch das erfindungsgemäße Verfahren, das

solche Harze bei verhältnismäßig kurzer Berührungs- eine größere Selektivität bei der Gewinnung der

zeit ein basisches Streptomyces-Antibiotikum, wie Antibiotika zeigt, schneller herabgesetzt.

Viomycin, Neomycin oder Streptomycin, bis zu 50% Die Polymeren sowohl des in der bekannten als

oder mehr ihrer theoretischen Kapazität adsorbieren. 45 auch des in der erfindungsgemäßen Verfahrensstufe

Dies ist bei der in der zuerst durchgeführten Ver- verwendeten Typs werden vorzugsweise in Perlenform

fahrensstufe verwendeten Harzart, dem »Amberlite angewandt. Der im erfindungsgemäßen Verfahren an-

IRC-50«, nicht der Fall. Dieses adsorbiert innerhalb gewandte Ionenaustauscher ist infolge seiner Poro-

einer angemessenen Berührungszeit nur bis zu etwa sität besonders zur Adsorption von basischen Strep-

10 bis 20% des Antibiotikums. Bei der erfindungs- 50 tomyces-Antibiotika geeignet. Es wurde gefunden,

gemäßen Verfahrensstufe wird der Ionenaustauscher daß das Antibiotikum in einer Menge adsorbiert

zuerst auch teilweise in ein Alkalisalz, wie ein Na- wird, die der theoretischen Austauschfähigkeit des

triumsalz, umgewandelt, indem man es z. B. mit einer Harzes unter Gleichgewichtsbedingungen nahekommt,

verdünnten wäßrigen Natriumhydroxydlösung wäscht, Dies ist bei dem in der bekannten Verfahrensstufe

bis der pg-Wert zwischen neutral und schwach basisch 55 verwendeten Ionenaustauscher nicht der Fall,

liegt (etwa 6 bis 9). Die aus der ersten Ionenaus- Bei Verwendung einer Streptomycin enthaltenden

tauscherkolonne durch Elution mit verdünnter Mine- Lösung als Ausgangsmaterial für die zwei vorstehend

ralsäure erhaltene Lösung des Antibiotikums wird beschriebenen Verfahrensstufen kann die durch EIu-

neutralisiert und von Salzen befreit; man kann sie tion des zweiten Ionenaustauschers erhaltene Lösung

z. B. mit Bariumhydroxyd behandeln, wenn zum 60 eine Wirksamkeit von bis zu 20 bzw. 30 mg Anti-

Eluieren verdünnte Schwefelsäure verwendet wurde. bioticum (freie Base) pro ecm besitzen und, bezogen

Dabei fällt Bariumsulfat aus, das entfernt wird. Die auf die Trockensubstanz, einen Reinheitsgrad von 70

überschüssige Säure kann aber auch mit einem An- oder mehr Gewichtsprozent. Gewünschtenfalls kann

ionenaustauscher entfernt werden, oder man neutra- ein noch höherer Reinheitsgrad durch Behandlung des

lisiert mit einem organischen Amin, das mit der zum 65 Eluats des zweiten Carbonsäuregruppen enthaltenden

Eluieren des Harzes verwendeten Säure ein in Lö- Harzes mit einem Sulfonsäureionen enthaltenden

sungsmitteln lösliches Salz bildet, und entfernt das Austauscher geringer Porosität, der stark vernetzt ist,

Wasser beispielsweise durch Gefriertrocknung. Die Anwendung eines geeigneten Lösungsmittels ermög-

erzielt werden.

Man verwendet dafür Harze aus Mischpolymeren

licht dann die Abtrennung des antibiotischen Salzes. 70 sulfonierter Polystyrole und aromatische Divinyl-

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verbindungen, wie Divinylbenzol. Derartige Harze war, wurde mit Natriumhydroxyd fast neutralisiert sind im Handel unter der Bezeichnung »Dowex 50« und in die Ionenaustauschkolonne geleitet. Proben erhältlich. Sie enthalten unterschiedliche Mengen an des aus der Kolonne abfließenden Eluats wurden in Divinylbenzol als Vernetzungsmittel. Der Divinyl- gleichen Zeitabständen untersucht, bis die Konzentrabenzolgehalt kann zwischen etwa 10 bis 25% liegen. 5 tion des Streptomycins in der die Kolonne verlassen-Ein derartiges Harz adsorbiert in saurer Form das den Lösung im wesentlichen gleich derjenigen der in basische Streptomyces-Antibiotikum nur wenig oder die Kolonne eintretenden Lösung war. Die Lösungsüberhaupt nicht aus dessen Lösung. Es hält jedoch zufuhr wurde unterbrochen, und das Harz wurde mit anorganische Kationen und verschiedene organische dem mehrfachen Volumen an Wasser gewaschen. Das Verunreinigungen so weit zurück, daß eine derartige io Antibiotikum wurde dann aus dem Harz mit 0,35 n-Lösung nach verhältnismäßig kurzer Berührungszeit Salzsäure eluiert. Beim Austritt aus der Kolonne mit dem Harz bei einem p_H-Wert von etwa 1,0 bis wurde das Eluat mit Natriumhydroxyd neutralisiert, etwa 2,5 eine sehr hohe Reinheit besitzt. Bei Die Analyse des Eluats auf Streptomycin ergab, daß dieser Verfahrensstufe befindet sich das Harz vor- die Kapazität des Harzes zu etwa 15% für die Adzugsweise in einem Turm. Die in der abfließenden 15 sorption des Antibiotikums ausgenutzt worden war. Lösung enthaltene freie Säure wird dann neutralisiert. Nur geringfügige Mengen an organischen Verunreini-Wie bei der vorhergehenden Verfahrensstufe wird gungen aus der ursprünglich eingesetzten Gärbrühe vorzugsweise Schwefelsäure verwendet; und die über- waren in der Kolonne zurückgehalten worden, jedoch schüssige Säure, die nicht zur Salzbildung mit dem waren in dem 10 mg/ccm Streptomycin enthaltenden basischen Antibiotikum erforderlich ist, wird durch 20 Eluat auch etwa 20 mg/ccm anorganische Salze der Ausfällung mit beispielsweise Bariumhydroxyd ent- Lösung vorhanden (bestimmt durch Verdampfung fernt. Die nach dem Abfiltrieren des ausgefällten einer Probe und Veraschen in Gegenwart von Schwe-Salzes zurückbleibende Lösung ist sehr rein. Sie kann feisäure). Die Lösung enthielt ferner etwa 4 mg/ccm unmittelbar für therapeutische Zwecke angewandt nicht identifizierte farbige, organische Verunreiniwerden. Sie kann beispielsweise auch durch Gefrier- 25 gungen.

trocknung in ein festes Produkt übergeführt werden, Eine zweite Kolonne enthielt 115 ecm des Carbondas sich für pharmazeutische Zwecke sehr gut eignet, säuregruppen enthaltenden Kationenaustauschers vom da es praktisch frei von fiebererregenden Stoffen ist Typ »Amberlite XE-89«. Das Harz wurde mit Na- und nur wenig oder gar keine histaminartigen Stoffe triumhydroxyd auf einen p_H-Wert von 7,8 gebracht enthält. Die Lösung kann in bekannter Weise ent- 30 und das neutralisierte Eluat aus der ersten Kolonne keimt und mit Stabilisatoren versetzt werden. dann eingeführt. In periodischen Abständen wurde Das auf die erfindungsgemäße Weise gereinigte die Streptomycinkonzentration der aus der Kolonne Streptomycin besitzt einen Reinheitsgrad von nahezu ausfließenden Lösung bestimmt. Nachdem insgesamt 95%. Das Verfahren führt nicht zur Abtrennung des 31 der vorgereinigten Streptomycinlösung in die Streptomycins B, welches aber nicht schädlich ist, 35 Kolonne eingeführt worden waren, wurde das Antiiedoch eine geringere Wirksamkeit als Streptomycin biotikum nicht weiter adsorbiert, d.h., die Konzentrabesitzt. Ist dieses Produkt im Endprodukt uner- tionen des eingesetzten und des abfließenden Matewünscht, so müssen entsprechend geeignete Gär- rials waren gleich. Die Zufuhr wurde unterbrochen, brühen als Ausgangsmaterial verwendet werden. Das und das Harz wurde mit Wasser gewaschen. Das erfindungsgemäße. Verfahren entfernt dagegen eine 4° Antibiotikum wurde dann mit 0,36 n-Schwefelsäure andere unerwünschte, normalerweise in handeis- eluiert. Die überschüssige Säure in der Waschflüssigüblichen Streptomycinprodukten enthaltene Ver- keit wurde sofort mit Bariumhydroxydlösung neuunreinigung, nämlich das inaktive Streptidin. tralisiert. Das ausgefällte Bariumsulfat wurde ab-In vielen Fällen ist es möglich, das erfindungs- filtriert, und die wäßrige Lösung wurde auf Strepgemäß gereinigte Streptomyces-Antibiotikum zu kri- 45 tomycin analysiert. Etwa 50% der Gesamtkapazität stallisieren, indem das Eluat aus dem zweiten Harz des Harzes waren für die Adsorption des Streptomyeingeengt und mit einem mit Wasser mischbaren eins ausgenutzt worden. Das Eluat enthielt etwa organischen Lösungsmittel, wie Methanol oder Ätha- 30 mg/ccm Antibiotikum, berechnet als freie Base, nol, versetzt wird. Im allgemeinen haben die sauren und etwa 6 mg/ccm anorganische Salze (bestimmt als vSalze der basischen Streptomyces-Antibiotika in 50 Sulfatasche). Nur etwa ein Drittel der in der Bewäßriger Lösung einen p_H-Wert zwischen etwa 4,0 Schickung der zweiten Kolonne anwesenden farbigen und etwa 6,5. Verunreinigungen blieben im Eluat.

Es ist erwünscht, die Lösungen der Antibiotika nur Eine dritte Kolonne enthielt 30 ecm eines sulfonier-

eine möglichst geringe Zeit bei p_H-Werten unterhalb ten Mischpolymeren von Polystyrol und etwa 16 Ge-

etwa 2,5 zu halten. So sollte nach der Elution des 55 wichtsprozent Divinylbenzol (als »Dowex 50-X 16«

Antibiotikums aus dem Harz der ersten Verfahrens- im Handel). Das Harz wurde zuerst mit verdünnter

stufe die Behandlung mit dem zweiten Harz mit Schwefelsäure behandelt, um es vollständig in die

größtmöglicher Schnelligkeit erfolgen; das aus dem saure Form überzuführen und anschließend mit

zweiten Harz erhaltene Eluat sollte dann sofort auf Wasser zur Entfernung der überschüssigen Säure

einen p_H-Wert von mindestens 4,5 eingestellt werden. 60 gewaschen. Das neutralisierte Eluat aus der zweiten

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung Kolonne wurde der dritten Kolonne mit »Dowex

der Erfindung. 50-X 16« zugeführt, bis der p_H-Wert der aus der

Beispiel 1 Kolonne abfließenden Lösung deutlich gesunken war.

Bis dahin waren etwa 660 ecm Eluat aufgefangen

Eine Säule wurde mit einem Carbonsäuregruppen 65 worden. Es wurde sofort mit Bariumhydroxyd neuenthaltenden Kationenaustauscher vom Typ »Amber- tralisiert und das ausgefällte Bariumsulfat abfiltriert, lite IRC-50« gefüllt. Dieses Harz wurde mit ver- Das Streptomycin wurde praktisch quantitativ aus dünnter Natriumhydroxydlösung auf einen p_H-Wert der Kolonne wiedergewonnen. Die Lösung hatte eine von 7,5 gebracht. Eine Streptomycin enthaltende Gär- Konzentration von 25 mg/ccm Streptomycinbase und brühe, die unter sauren Bedingungen filtriert worden 70 nur 0,62 mg/ccm anorganische Salze (bestimmt als

Sulfatasche). Nach dem Einengen der Lösung im Vakuum, Behandlung mit wenig Aktivkohle und Zusatz mehrerer Volumen Methanol fiel ein Streptomycinsulfat hoher Reinheit aus. Es wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Es enthielt 1,64% Asche; die Wirksamkeit des Produktes, korrigiert für flüchtige Bestandteile, betrug etwa 790 y/mg, verglichen mit der theoretischen Wirksamkeit von Streptomycinsulf at von 798 y/mg.

Beispiel 2

Eine filtrierte, Viomycin enthaltende Gärbrühe wurde auf einen p_H-Wert von 7,5 eingestellt. Die

dieser Lösung wurden in eine Kolonne gegeben, die 1 1 eines Carbonsäuregruppen enthaltenden Austauschers »Amberlite IRC-50« enthielt, der mit verdünnter Natriumhydroxydlösung fast neutralisiert worden war. Das Antibiotikum wurde fast quantitativ adsorbiert. Das Harz wurde mit Wasser gewaschen und dann mit l°/oiger Schwefelsäure eluiert. Das Eluat wurde sofort mit Bariumhydroxyd neutralisiert und das ausgefällte Bariumsulfat abfiltriert. Die filtrierte ίο Lösung wurde analysiert und enthielt 10 mg/ccm Neomycin (als freie Base) und etwa 8 mg/ccm Sulfatasche.

Ein Teil der neutralisierten, vorgereinigten Neomycinlösung wurde in eine Kolonne mit »Amberlite

Analyse ergab, daß sie 0,3 mg/ccm des Antibiotikums 15 XE-89« gegeben, die mit verdünnter Natriumhydroin Lösung enthielt. Dieses Material wurde in eine xydlösung auf einen p_H-Wert von etwa 7,0 gebracht Kolonne mit »Amberlite IRC-50« eingeführt, das auf worden war. Die Lösung wurde der Kolonne so lange einen p_H-Wert von 7,5 mit verdünnter Natrium- zugeführt, bis merkliche Mengen des Antibiotikums hydroxydlösung gebracht worden war. Die Lösung am abfließenden Material festgestellt werden konnten, des Antibiotikums wurde in die Kolonne eingeführt, 20 Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen und dann bis die Konzentration in dem abfließenden Material mit l°/oiger Schwefelsäure eluiert. Die überschüssige derjenigen in der zugeführten Lösung sehr nahe kam. Säure im Eluat wurde mit Bariumhydroxyd neutrali-Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen und das siert und das ausgefallene Bariumsulfat abfiltriert. Antibiotikum mit 0,35 η-Schwefelsäure aus dem Harz Das Eluat enthielt etwa 20 mg/ccm Neomycin und eluiert. Das Eluat wurde sofort mit Bariumhydroxyd 25 5 mg/ccm Sulfatasche. Es wurde durch eine Kolonne neutralisiert und das ausgefallene Bariumsulfat ab- geleitet, die das Harz »Dowex 50-X 16« in saurer filtriert. Das neutralisierte Eluat enthielt etwa Form enthielt. Es wurde praktisch der gesamte Gehalt 8 mg/ccm Viomycin als Base und 7 mg/ccm Sulfat- an anorganischen Verunreinigungen bei geringem oder asche. Etwa 12% der Gesamtkapazität des Harzes ohne Verlust an Neomycin aus dem Produkt entfernt, waren für die Adsorption des Antibiotikums ausge- 30 Das Eluat wurde mit Bariumhydroxyd neutralisiert, nutzt worden. Der Niederschlag wurde abfiltriert, und der restliche

Ein Teil des Eluats aus der ersten Kolonne (190 1) Farbstoff wurde mit wenig Aktivkohle entfernt. Die wurde bei einem p_H-Wert von 7,5 in eine Kolonne ein- gereinigte Lösung wurde in ein mehrfaches Volumen geführt, die 3750 ecm eines Harzes vom Typ »Amber- an Methanol gegossen und das ausgefällte Neomycin lite XE-89« enthielt, das zuvor mit verdünnter Na- 35 abfiltriert. Das Produkt enthielt 1°/» Sulfatasche und triumhydroxydlösung auf einen p_H-Wert von 7,5 ge- 3,2% flüchtige Substanzen. Unter Berücksichtigung bracht worden war. Das Harz adsorbierte das Viomy- der flüchtigen Bestandteile erhielt man einen Anacin bis zu etwa 80 % seiner gesamten Austauschkapa- lysenwert von etwa 650 y/mg gegenüber 670 y/mg zität. Die Zufuhr der vorgereinigten Viomycinlösung für reines Neomycinsulfat. Es wurde gefunden, daß wurde fortgesetzt, bis das aus der Kolonne abfließende 40 das nach diesem verhältnismäßig einfachen Verfahren Material etwa den gleichen Gehalt an Antibiotikum erhaltene Produkt für die therapeutische Verwendung

hatte wie die zugeführte Lösung. Die Lösungszufuhr wurde dann unterbrochen und die Kolonne mit Wasser gewaschen. Das Antibiotikum wurde mit 0,35 n-Schwefelsäure eluiert und das Eluat sofort mit Bariumhydroxyd neutralisiert. Das ausgefällte Bariumsulfat wurde abfiltriert und das Eluat im Vakuum bei einer mäßig erhöhten Temperatur auf ein Volumen von 11 1 eingeengt. Die Analyse einer Probe

gut geeignet ist.

Beispiel 4

Eine filtrierte, Streptomycin enthaltende Gärbrühe, die eine antibiotische Wirksamkeit von 0,8 mg/ccm enthielt, wurde in eine Kolonne geleitet, die ein Harz vom Typ »Amberlite IRC-50« bei einem p_H-Wert von

zeigte, daß das Konzentrat 102 mg/ccm Viomycin (als 50 7,5 enthielt. Das Antibiotikum wurde aus dem Harz freie Base) und nur 5 mg/ccm Sulfatasche enthielt. mit 0,35 η-Salzsäure eluiert, und das Eluat wurde mit Die Behandlung des Eluats mit Aktivkohle entfernte Natriumhydroxyd neutralisiert. Zur Adsorption des die geringe Menge restlicher Farbstoffe. Die Zugabe Antibiotikums waren etwa 15% der Kapazität des der zweifachen Volumens an Methylalkohol zur Harzes ausgenutzt worden. Das Eluat enthielt etwa wäßrigen Lösung bewirkte das Auskristallisieren von 55 7 mg/ccm Antibiotikum und, bezogen auf das Anti-Viomycinsulfat. Das Produkt wog nach dem Trocknen biotikum, etwa 10 Gewichtsprozent anorganische Subin Vakuum 1275 g. Es enthielt 1 % Asche und 9,3 % stanzen. Ein Teil dieser Lösung wurde durch eine Koflüchtige Bestandteile. Unter Berücksichtigung von lonne geleitet, die 100 ecm Harz vom Typ »Ambervorhandenem flüchtigem Material betrug die Wirk- lite XE-89« bei einem p_H-Wert von 7,5 enthielt. Das samkeit etwa 805 y/mg. Die theoretische Wirksamkeit 60 Antibiotikum wurde aus dem Harz mit verdünnter von reinem Viomycinsulfat beträgt 820 y/mg. Nach Schwefelsäure eluiert. Das Eluat enthielt etwa 18 g

dem vorstehend beschriebenen, einfachen Verfahren wird also ein außerordentlich hoher Reinheitsgrad erreicht.

Beispiel 3

Eine Neomycin enthaltende Gärbrühe wurde angesäuert, filtriert und dann neutralisiert. Dieses Ma-

Streptomycin und etwa 2 g anorganische Bestandteile. Etwa 50% der Gesamtkapazität des Harzes waren bei der Adsorption des Antibiotikums ausgenutzt worden. Das Eluat wurde mit Natriumhydroxyd neutralisiert und dann durch eine Kolonne geleitet, die ecm eines Harzes vom Typ »Dowex 50-X 16« in saurer Form enthielt. Das aus der Kolonne abfließende Produkt wurde sofort mit Bariumhydroxydlösung

terial enthielt etwa 0,73 mg/ccm Neomycin. 1401 70 neutralisiert. Der Niederschlag von Bariumsulfat

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wurde abfiltriert, das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und mit Aktivkohle entfärbt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde einem mehrfachen Volumen an Methanol zugesetzt. Das ausgefallene Streptomycinsulfat wurde nitriert und getrocknet; es hatte einen Gehalt von 775 y/ccm und enthielt nur 0,7 °/o Asche. Ein großer Teil des Antibiotikums aus der ursprünglich eingesetzten Lösung wurde also gereinigt wiedergewonnen.

Beispiel 5

Eine filtrierte Gärbrühe mit einer Neomycin-Wirksamkeit von etwa 0,5 mg/ccm wurde bei einem p_H~Wert von 7,5 in eine Kolonne geleitet, die 33 1 des Harzes »Amberlite IR.C-50« enthielt, das zuvor auf einen p_H-Wert von 7,5 mit Natriumhydroxydlösung ■ eingestellt worden war. Als das Harz kein weiteres Neomycin mehr adsorbierte, wurde die Zufuhr unterbrochen, die Kolonne mit Wasser gewaschen und anschließend mit l°/oiger Schwefelsäure eluiert. Als Hauptfraktion wurden etwa 1701 Eluat vom p_H-Wert 2,1 aufgefangen. Sie enthielt Neomycin in einer Konzentration von 12,0 mg/ccm, insgesamt 31 mg/ccm Feststoffe und 7 mg/ccm Sulfatasche. Das bedeutet, verglichen mit der Gärbrühe, einen bemerkenswerten Reinigungsgrad. Die Lösung des Antibiotikums wurde mit Bariumhydroxyd neutralisiert, das Bariumsulfat wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde in eine Kolonne geleitet, die »Amberlite XE-89« enthielt, das zuvor mit Xatriumhydroxyd auf einen p_H-Wert von 7,5 gebracht worden war. Nachdem die Kolonne mit Neomycin gesättigt war, wurde sie mit l°/oiger Schwefelsäure eluiert, und die überschüssige Säure wurde mit Bariumhydroxyd neutralisiert. Das Eluat enthielt 19,5 mg/ccm Neomycin, insgesamt 40 mg/ccm Feststoffe und 7 mg/ccm Sulfatasche. Diese Lösung wurde bei einem sauren p_H-Wert über das Harz »Dowex 50-X 16« geleitet. Die aus der Kolonne abfließende Lösung wurde mit Natriumhydroxyd neutralisiert. Sie enthielt 15 mg/ccm Neomycin, insgesamt 23 mg/ccm Feststoffe und 0,1 mg/ccm Sulfatasche. Die wäßrige Lösung wurde im Vakuum bei einer niedrigen Temperatur sorgfältig eingeengt, und Neomycinsulfat wurde mit Äthanol ausgefällt. Das getrocknete Produkt besaß eine Wirksamkeit von 660 y/mg und einen Aschegehalt von 1,0%. Es handelt sich hierbei also um ein Produkt hoher Reinheit, das für pharmazeutische Verwendungszwecke sehr gut geeignet ist.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Reinigung von basischen Streptomyces-Antibiotika, wobei eine wäßrige Lösung des Antibiotikums mit einem Carboxylgruppen enthaltenden Ionenaustauscher, der aus Mischpolymerisaten aus Acryl- oder Methacrylsäure und bis zu 10% und darüber aus Divinylbenzol besteht, oder mit einem Sulfonsäureharz in Berührung gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß man das mit einem Carboxylgruppen enthaltenden Ionenaustauscher begrenzter Porosität, der aus einem Mischpolymerisat aus Methacrylsäure und etwa 6 bis etwa 12 Gewichtsprozent einer aromatischen Divinylverbindung besteht, bei einem p_H-Wert von etwa 6 bis etwa 9 behandelte, anschließend mit einer verdünnten Mineralsäure aus dem Harz eluierte und neutralisierte Antibiotikum im Eluat mit einem Carboxylgruppen enthaltenden Ionenaustauscher hoher Porosität, der aus einem Mischpolymerisat aus Acrylsäure und etwa 1 bis etwa 15 Gewichtsprozent einer aromatischen Divinylverbindung oder einem Mischpolymerisat aus Methacrylsäure und etwa 1 bis etwa 4 Gewichtsprozent einer aromatischen Divinylverbindung besteht, bei einem p_H-Wert von etwa 6 bis 9 behandelt, das Antibiotikum in üblicher Weise mit einer verdünnten Mineralsäure aus diesem Harz eluiert und gewünschtenfalls das erhaltene Eluat aus dem zweiten Harz mit einem Sulfonsäure-Ionenaustauscher behandelt, das aus einem Mischpolymerisat aus einer Polystyrolsulfonsäure und etwa 10 bis etwa 20 Gewichtsprozent einer aromatischen Divinylverbindung besteht und in Säureform vorliegt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als basisches Streptomyces-Antibiotikum Streptomycin, Neomycin oder Viomycin verwendet.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Britische Patentschrift Nr. 687 476;
USA.-Patentschriften Nr. 2 541420, 2 528188; Chem. Zentralblatt, 1952, S. 5137.

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