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Verfahren zur Reinigung von Streptomycin Die Erfindung bezieht sich
auf ein Verfahren zur Reinigung von Streptomycin.
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Es ist bekannt, daß das Antibiotikum Streptomycin eine freie Aldehydgruppe
besitzt. Daher läßt es sich mit primären Monoaminen zu Schiffschen Basen oder mit
Diaminen, die primäre und sekundäre Aminogruppen an benachbarten Kohlenstoffatomen
besitzen, zu Imidazolidinen umsetzen. Einige dieser Streptomycinderivate sind wenig
in Wasser löslich, und man kann daher mit ihrer Hilfe das Streptomycin aus wäßrigen
Flüssigkeiten, die es enthalten, leicht abtrennen (vgl. zum Beispiel die USA.-Patentschriften
2 717 893 und 2 767168).
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Es ist ferner aus der zuletzt genannten Patentschrift bekannt, reines
Streptomycin aus den hergestellten Schiffschen Basen oder Imidazolidinen durch saure
Hydrolyse zu gewinnen.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Reinigung von Streptomycin
wird nun die Hydrolyse der aus Streptomycin oder einem Salz desselben in wäßriger
Lösung mit einem geeigneten Amin, in Anwesenheit von Sulfationen bei einem pH-Wert
über etwa 7 hergestellten Schiffschen Base oder Imidazolidinverbindung mit Hilfe
eines sauren lonenaustauscherharzes, vorzugsweise in der freien Säureform durchgeführt,
wobei das schwerlösliche Ausgangsmaterial mit dem Ionenaustauscher und Wasser gemischt
und nötigenfalls so lange Säure zugegeben wird, bis sich die schwerlösliche Verbindung
auflöst, worauf das Ionenaustauscherharz aus der Reaktionsmischung abgetrennt und
aus der verbleibenden wäßrigen Lösung ein gereinigtes Streptomycinsalz gewonnen
wird.
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Zur Herstellung des Ausgangsmaterials werden vorzugsweise primäre
Monoamine mit einem Molekulargewicht von etwa 100 bis 150, wie 2-Phenyläthylamin
oder Benzylamin, verwendet. Solche Amine liefern Schiffsche Streptomycinbasen, die
relativ unlöslich in Wasser sind, die sich jedoch leicht in Wasser lösen, wenn sie,
gegebenenfalls nach Zugabe von Säure, mit dem Ionenaustauscherharz in Berührung
kommen.
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Die Schiffschen Basen und Imidazolidine können in wäßriger Lösung
gebildet werden, die gegebenenfalls ein organisches Lösungsmittel, wie Methanol
oder Isopropanol, enthält. Etwas höhere Ausbeuten an Schiffscher Base werden z.
B. mit 2-Phenyläthylamin in Anwesenheit dieser Lösungsmittel erzielt.
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Derivate von Streptomycin mit Aminen oder Diaminen höheren Molekulargewichtes,
z. B. Dibenzyläthylendian-in, brauchen länger, bis sie sich lösen, als die Derivate
der obengenannten Amine, wenn sie mit handelsüblich erhältlichen Ionenaustauscherharzen,
wie sie weiter unten definiert werden, behandelt werden.
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Es wurde festgestellt, daß die Anwesenheit von Sulfationen notwendig
ist, bevor eine befriedigende Ausfällung der Schiffschen Base oder des Imidazolidins
stattfindet. Dies erfolgt zweckmäßig durch Zugabe einer geringen Menge an Schwefelsäure
oder an einem löslichen Sulfat zur wäßrigen Lösung, die das Streptomycin und Amin
enthält, falls nicht schon ausreichend Sulfationen in der Reaktionsmischung anwesend
sind.
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Zur befriedigenden Ausfällung der Schiffschen Base oder des Imidazolidins
ist es auch notwendig, die Streptomycinlösung auf einem pH-Wert über etwa 7,0, vorzugsweise
über 9, zu halten. Die Einstellung des pH-Wertes kann durch Zugabe von Alkali, wie
Natriumhydroxyd, oder eines nicht reaktionsfähigen Amins, wie Monomethylamin, oder
eines Ionenaustauscherharzes, wie »Amberlite IR-45« (schwach basisches Ionenaustauscherharz
auf Polystyrolbasis) erfolgen.
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Die gefällte Schiffsche Base oder das Imidazolidin wird aus der Lösung
abgetrennt und vor einer weiteren Behandlung zur Entfernung von nicht umgesetztem
Amin zweckmäßig gründlich gewaschen.
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Die schwerlösliche Streptomycinverbindung _ wird dann erfindungsgemäß
mit Wasser gemischt, zweckmäßig durch Aufschlämmen, und das Ionenaustauscherharz
zugegeben.
Werden Schiffsche Basen der bevorzugten Amine verwendet, so hat sich eine Harzmenge
im Bereich von 1 bis 2 Äquivalenten als ausreichend erwiesen; werden jedoch höhermolekulare
Amine verwendet, so können größere Harzmengen erforderlich sein.
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Die erfindungsgemäß verwendeten Harze sind sauer, zweckmäßig stark
sauer, z. B. Harze mit Sulfonsäuregruppen. Dabei haben sich die unter den Handelsnamen
»Zeo-Karb-225«, »Amberlite IR-120« und »IR-124« bekannten Ionenaustauscher als zweckmäßig
erwiesen. Diese Harze erhalten ihre Austauschkapazität von den Sulfonsäuregruppen
eines sulfonierten Styrol - Divinylbenzol - Mischpolymerisates. Mischpolymerisate,
die höchstens etwa 25% Divinylbenzol enthalten, haben sich im erfindungsgemäßen
Verfahren als zweckmäßig erwiesen, obgleich es bevorzugt wird, Harze mit etwa 9
bis 16% Divinylbenzol zu verwenden.
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Im erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Ionenaustauscherharze geeignet,
die ihre Austauschkapazität von Carboxylgruppen erhalten, wie sie z. B. unter den
Handelsnamen »Amberlite IRC 50«, »Zeo-Karb-226« und »Dowex 50« bekannt sind. Diese
Harze sind Mischpolymerisate aus Divinylbenzol und Methacrylsäure.
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Wird die Schiffsche Base oder das Imidazolidin mit dem Ionenaustauschharz
gemischt, so kann die Zugabe einer geringen Menge an Säure, vorzugsweise Schwefelsäure,
die Lösungsgeschwindigkeit des Streptomycinderivates erhöhen. Ob die Zugabe der
Säure notwendig ist oder nicht, scheint von der Reinheit der Schiffschen Base oder
des Imidazolidins abzuhängen. Streptomycingärlösungen scheinen gewöhnlich genügend
anorganische Kationen oder Salze zu enthalten, um eine Lösung des daraus hergestellten
Derivates ohne Zugabe von Säure zu ermöglichen. Reinere Derivate können jedoch die
Zugabe einer geringen Säuremenge erfordern.
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Nach Auflösung des Streptomycinderivates wird die Mischung einige
Zeit gerührt und das Harz aus der Mischung, vorzugsweise durch Abfiltrieren oder
Zentrifugieren, abgetrennt. Das Harz wird dann mit Wasser gewaschen und die Waschwässer
zu der Flüssigkeit zugegeben, aus welcher das Harz abgetrennt worden ist.
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Die so hergestellte wäßrige Lösung des gereinigten Streptomycinsulfates
kann durch Mischung mit weiterem Ionenaustauscherharz derselben Art, wie bekannt,
noch weiter gereinigt werden, um noch in der Lösung vorhandene Spuren von Amin zu
entfernen. Dies kann ansatzweise erfolgen oder indem die Lösung über eine Kolonne
des Harzes geleitet wird.
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Es ist zweckmäßig, daß das aus der gereinigten Lösung durch Ausfällung
oder Lyophilisieren gewonnene Streptomycinsalz, z. B. das Sulfat, einen solchen
pH-Wert besitzt, der seine Anordnung in injizierbaren Präparaten ermöglicht. Dies
erfolgt, indem der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von Schwefelsäure oder mit Hilfe
eines Anionenaustauscherharzes auf 6,0 bis 7,0 eingestellt wird.
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Um eine gute Farbe und hohe Reinheit des Endproduktes zu gewährleisten,
kann es notwendig sein, die Lösung vor der endgültigen Gewinnung des Streptomycins
mit einem geringen Anteil an Aktivkohle zu behandeln.
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Die Gewinnung eines Streptomycinsalzes aus der Lösung kann in irgendeiner
üblichen Weise erfolgen; z. B. kann das Salz durch Zugabe eines nicht lösenden Materials,
wie Methanol, ausgefällt oder es kann lyophilisiert oder in eine Calciumchloridkomplexverbindung
übergeführt werden; weiterhin kann es durch Hydrierung in ein reines Dihydrostreptomycinsalz,
z. B. das Sulfat, übergeführt werden.
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Das durch das Harz absorbierte Amin kann z. B. durch Eluieren mit
Alkali und einem organischen Lösungsmittel, wie Butanol oder Isopropanol, und Destillation
gewonnen und erneut zur Herstellung der Ausgangsverbindung verwendet werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann ansatzweise oder als kontinuierliches
Verfahren unter Verwendung von Kolonnen des Ionenaustauscherharzes durchgeführt
werden.
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Es ist zwar bekannt, daß man Streptomycin mit Aminen umsetzen und
die erhaltenen Umsetzungsprodukte zur Regenerierung und Reinigung von Streptomycin
wieder hydrolysieren kann. Die für die Hydrolyse bis jetzt bekannten Bedingungen
sind jedoch verhältnismäßig scharf, so daß nicht angenommen werden konnte, daß mittels
der an sich nur verhältnismäßig mild wirkenden Ionenaustauscher überhaupt eine befriedigende
Hydrolyse erzielt werden könnte. Es war daher sehr überraschend, daß eine solche
Hydrolyse bereits in wenigen Stunden bei Zimmertemperatur mit ausgezeichneten Ergebnissen
ohne Eintreten unerwünschter Nebenreaktionen durchgeführt werden konnte.
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Die Tatsache, daß man Streptomycin zwecks Reinigung bereits mit Ionenaustauschern
behandelt hat, ergab noch keinen Hinweis dafür, daß eine Hydrolyse der Reaktionsprodukte
aus Streptomycinen mit Aminen durchführbar ist. Ebenso konnte aus der Tatsache,
daß man bereits Eiweißstoffe mittels Ionenaustauschern mit nicht sehr befriedigenden
Ergebnissen hydrolysieren konnte, nicht der Schluß gezogen werden, daß die genannten
Reaktionsprodukte aus Streptomycin und Aminen ohne weiteres mittels solcher Ionenaustauscher
hydrolysiert werden könnten.
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Die folgenden Beispiele veranschaulichen besondere Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung. Für die Herstellung der schwerlöslichen Ausgangsverbindung
aus Streptomycin und einem primären Monoamin oder Diamin wird Schutz innerhalb der
vorliegenden Erfindung jedoch nicht beansprucht. Beispiel 1 Eine Streptomycin enthaltende
Gärlösung wurde mit dem Ionenaustauscherharz »Amberlite IRC 50« in Berührung gebracht,
von dem ein Teil in Form des Natriumsalzes vorlag.
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Das Harz wurde dann mit verdünnter Schwefelsäure gewaschen, bis ein
Gleichgewichts-pH-Wert von 5,0 bis 6,5 erreicht war, wodurch die Alkalimetallionen
entfernt wurden. Dann wurde das Streptomycin mit verdünnter Schwefelsäure bei einem
Gleichgewichts-PH-Wert von 1,8 bis 2,2 aus dem Harz eluiert.
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Dieses Eluat wurde durch Berührung mit einem Anionenaustauscherharz
neutralisiert, mit Aktivkohle entfärbt und so lange konzentriert, bis es 125 Millionen
Einheiten Streptomycin in 380 ccm Lösung enthielt.
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Der p11-Wert des Konzentrates wurde dann auf 8,5 mit Monomethylamin
eingestellt und zur Bildung der Schiffschen Base ein leichter Überschuß an 2-Phenyläthylamin
zugegeben.
Dann wurde filtriert und der Niederschlag mit 200 ccm »Amberlite IR-120« in Form
der freien Säure und 800 ccm Wasser gemischt und nach Einstellen des pH-Wertes auf
8,0 mit Schwefelsäure 2 Stunden gerührt. Das Harz wurde abfiltriert und das Filtrat
mit weiteren 50 ccm frischem Harz gemischt und erneut gerührt. Auch dieses Harz
wurde abfiltriert, die Harze wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen und die Waschwasser
zum Filtrat zugegeben. Das Streptomycinsulfat wurde aus dem Filtrat durch Ausfällung
mit Methanol gewonnen, gewaschen, getrocknet und gewogen.
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Die Gesamtausbeute an Streptomycinsulfat aus dem Eluat von »Amberlite
IRC-50«-Harz betrug 740/0. Das nach der zweiten Behandlung mit »Amberlite IR-120«
verbleibende Amin betrug 0,006%" bezogen auf das Gewicht des Streptomycinsulfates.
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Beispiel 2 Das Verfahren von Beispel 1 wurde wiederholt, wobei an
Stelle von »Amberlite IR-120« das Ionenaustauscherharz »Amberlite IR-124« verwendet
wurde. Die Gesamtausbeute aus dem Eluat von »Amberlite IRC-50«-Harz betrug 80 0/0.
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Das nach der zweiten Behandlung mit »Amberlite IR-124« verbleibende
Amin betrug 0,016 0/0, bezogen auf das Gewicht des Streptomycinsulfates.
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Beispiel 3 Eine Streptomycinlösung mit einer Konzentration von 300
000 Einheiten je Kubikzentimeter wurde mit 1,3 Äquivalenten Benzylamin in wäßriger
Lösung in Anwesenheit von Sulfationen bei einem p11-Wert von 8,5 gemischt und die
Mischung über Nacht stehengelassen. Die ausgefallene Schiffsche Base wurde abfiltriert
und getrocknet.
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20 g der Schiffschen Base wurde mit 20 ccm »Amberlite IR-120« in Form
der freien Säure in 100 ccm Wasser verrührt, nachdem der p11-Wert mit Schwefelsäure
auf 8,0 eingestellt worden war.
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Die Schiffsche Base löste sich schnell. Nach 2stündigem Rühren wurde
das Harz abfiltriert und durch 10 ccm frisches Harz ersetzt. Das Gemisch wurde weitergerührt.
Das Harz wurde erneut abfiltriert und gewaschen und die Waschwässer zum Filtrat
zugegeben.
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Die nach Entfernung des Harzes in der Lösung zurückgelassene Menge
an Amin war sehr gering. Die Streptomycinausbeute betrug etwa 80 0/0.
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Beispiel 4 450 ccm Streptomycinsulfatlösung mit einer Konzentration
von 330 000 Einheiten je Kubikzentimeter wurde unter Verwendung von 25%iger (Gewicht/
Volumen) Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und mit 150
ccm Isopropanol versetzt. Die Mischung wurde auf 40° C erwärmt, und unter fortgesetztem
Rühren wurden 0,4 Äquivalente 2-Phenyläthylamin auf einmal zugegeben. Unter Rühren
wurden zum Animpfen 0,25 % Kristalle der Schiffschen Base sowie weitere 0,9 Äquivalente
2-Phenyläthylamin langsam innerhalb einer Stunde zugefügt. Dann wurde die Mischung
innerhalb einer Stunde auf eine Temperatur von 20 bis 25° C abgekühlt. Der pH-Wert
wurde untersucht und unter Verwendung von 25%iger (GewichtiVolumen) Natriumhydroxydlösung
auf 9,6 eingestellt. Nachdem das Gemisch eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur
gerührt worden war, wurde die Mischung über Nacht im Kühlschrank bei 5° C stehengelassen.
Die ausgefallene Schiffsche Base wurde abfiltriert, mit 25%igem (Volumen/Volumen)
wäßrigem Isopropanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Sie wog 202 g und besaß
laut Untersuchung 677 Einheiten je Milligramm. Die Ausbeute an Schiffscher Base
betrug somit 92 0/0.
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Anteile von je 60 g dieser Schiffschen Base wurden unter Verwendung
dreier verschiedener Harze, nämlich »Amberlite IR-124«, »Zeo-Karb 225« mit 120/0
Divinylbenzol und »Zeo-Karb 225«, mit 16 % Divinylbenzol erneut in Streptomycinsulfatumgewandelt.
In jedem Versuch wurde die Schiffsche Base mit 65 ccm Harz in freier Säureform,
die in 240 ccm Wasser suspendiert waren, gerührt, und in jedem Fall wurde der pH-Wert
unter Verwendung von Schwefelsäure auf 8,0 eingestellt. Nach 6stündigem Rühren wurde
das Harz abfiltriert und durch 16 ccm frisches Harz ersetzt, wobei die Mischung
weitere 6 Stunden gerührt wurde. Nach endgültigem Abfiltrieren und Waschen des Harzes
wurden die erhaltenen Lösungen auf Streptomycin und verbliebenes 2-Phenyläthylamin
untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben:
| Verbliebenes |
| Streptomycin 2-Phenyläthyl- |
| aus der arm, bezogen |
| Verwendetes Harz auf das Gewicht |
| Schiffschen Base von Strepto- |
| mycinsulfat |
| °/o °% |
| »Amberlite IR-124« 93,5 - (keines) |
| (12 % Divinylbenzol) |
| »Zeo-Karb 225« 91,0 - (keines) |
| (120/a Divinylbenzol) |
| »Zeo-Karb 225« 99,0 0,002 |
| (16 % Divinylbenzol) |
Beispiel 5 Das Verfahren von Beispiel 4 wurde wiederholt, wobei das Ionenaustauscherharz
»Zeo-Karb225« verwendet wurde, das 4,5, 2 bzw. 1'% Divinylbenzol enthielt.
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Die erhaltenen Ergebnisse entsprechen etwa denen des Beispiels 4.