DE1212681B - Verfahren zur Gewinnung reiner, basische Stickstoffgruppen enthaltender Antibiotika,Alkaloide oder Hormone - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. α.:

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag;

C12d

Deutsche Kl.: 30 h -

1212 681
R 31848IV a/30 h
10. Januar 1962
17. Mm 1966

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Reinigen von Antibiotika, Alkaloiden oder Hormonen, welche stickstoffhaltige basisch? Gruppen und höhere. Molekulargewichte besitzen und deren Salze mit niedermolekularen Säuren wasserlöslich, an Carboxylgruppen enthaltenden Kationaustauscherharzen a.dsorbierbar sind.

Das Verfahren vermindert den Gehalt aq anorganischen Salzen in wäßrigen Lösungen dieser Verbindungen und liefert reinere und konzentrierte Lösungen derselben.

Die Anwendung von Kationaustauscherharzen, besonders von Carboxylgruppen enthaltenden, zur Reinigung von pharmazeutischen Verbindungen, wie Streptomycin und ähnlichen Antibiotica, ist bekannt und hat sich in weitestem Umfang eingeführt. Für diese Reinigungsverfahren sind Kationaustauscherharze vom Sulfosäuretyp weniger geeignet, obwohl sie die antibiotische oder sonstige pharmazeutische Verbindung aus seiner verdünnten wäßrigen Lösung adsorbieren. Diese Harze adsorbieren aber die zu reinigenden Verbindungen so hartnäckig, daß zum Abspülen derselben von dem Harz erhebliche Mengen Eluierungsflüssigkeit benötigt werden. In manchen Fällen ergeben sich dabei sogar Eluate, die noch verdünnter als die Ausgangslösung vor der Behandlung mit dem Sulfonsäurekationaustauscherharz sind.

Eines der viel benutzten Verfahren zum Gewinnen und Reinigen pharmazeutischer Verbindungen, wie Streptomycin, besteht darin, daß eine filtrierte Lösung des rohen Antibiotikums oder eine geklärte Fermentationsbrühe mit einem Carboxylgruppen enthaltenden Kationaustauscherharz in Form des Natrium- oder Ammoniumsalzes in Berührung gebracht wird. Diese Arbeitsweise ist im einzelnen in der USA.-Patentschrift 2 541420 beschrieben, und auf die dortigen Angaben wird hierdurch Bezug genommen. Wegen der erheblichen Größe des Moleküls der Antibiotika können jedoch nicht sämtliche Natrium- oder Ammoniumionen am Austauscher durch Moleküle des Antibiotikums ersetzt werden, und so verbleiben die Natrium- oder Ammoniumionen als solche am Austauscher oder werden durch andere anorganische Ionen ersetzt, welche in der Rohlösung vorhanden sind. Das Antibiotikum wird vom Kationaustauscherharz durch Behandlung mit einer verdünnten wäßrigen Lösung einer Mineralsäure, z.B. Chlorwasserstoffsäure, abgelöst. Bei dieser Eluierung des Antibiotikums werden aber auch die noch am Austauscher vor^ handenen anorganischen Kationen, einschließlich der Natrium- und Ammoniumionen, eluiert, und man erhält eine Lösung des Antibiotikums, welche zwar Verfahren zur Gewinnung reiner, basische
Stiekstoffgruppen enthaltender Antibiotika,
Alkaloide oder Hormone

Anmelder:

Rohm & Haas Company, Philadelphia, Pa.

(V. St A=)

Vertreter:

pr.-Ing. Dr. jur. H. Mediger, Patentanwalt,

München 9, Aggensteinstr. 13

Als Erfinder benannt:

Robert Kunin, Yardley, Pa. (V, St. A,)

Beanspruchte Priorität:

V. St. v, Amerika vom 3. Februar 1961 (86 856)

merklich reiner als die Ausgangslösung, aber immer noch mit anorganischen Kationen verunreinigt ist. Um das Antibiotikum in reiner Form zu erhalten, bedarf es daher nach der Adsorption am Kationenaustauscherharz noch weiterer Operationen, beispielsweise einer Umkristallisation als Doppelsalz, einer Behandlung mit besonderen Gemischen von Kationen- und Anionenaustauschern u, dgl. Die Einzelheiten solcher zusätzlicher Reinigungsoperationen sind dem Fachmann geläufig.

Es wurde nun gefunden, daß sich diese mühsamen und zeitraubenden zusätzlichen Reinigungsoperationen verringern oder vollständig vermeiden lassen. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnungreiner, basische Stickstoffgruppen enthaltender Antih biotika, Alkaloide oder Hormone, deren Molekulargewicht sich im allgemeinen in der Größenordnung von 250 bis 2000 bewegen, aus den rohen, verdünnten Lösungen ihrer Salze von niedrigmolekularen Säuren durch Adsorption an ein Carboxylgruppen enthaltendes Kationenaustauscherharz und Elution des Adsorbats mit den genannten Säuren, mit dem Kennzeichen, daß man das Adsorbat vor der Elution mit den genannten niedermolekularen Säuren mit einer wäßrigen Lösung von Kohlendioxyd, vorzugsweise unter erhöhtem Druck, eluiert.

609 538/359

3 4

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt Das Mindestmaß an Basizität, welches die zu

demnach die folgenden Stufen: behandelnde Verbindung besitzen muß, kann ver-

1. Behandeln einer unreinen, wäßrigen Lösung der f^eden sein. Sofern jedoch die Verbindung eine organischen Base mit einem carboxylischen basische stickstoffhaltige Gruppe enthalt, wird sie Kationenaustauscherharz in der Natrium- oder ⁵ von carboxyhschen Kationenaustauschern adsorbiert. Ammoniumform, bis der Austauscher mit der £^ie mmdest erforderhche Basmtat ist auch in gewissem organischen Base gesättigt ist; J^¹¹S ^v°? ^{dem m} Einzelfall benutzten carboxy-

lischen Kationenaustauschern abhangig, denn deren

2. Eluieren der anorganischen Kationen vom Azidität hängt von der jeweiligen Zusammensetzung Kationenaustauscherharz durch Behandlung des- ₁₀ des Austauschers ab. So besitzen beispielsweise die selben mit einer wäßrigen Lösung von Kohlen- _Von der Acrylsäure oder deren Derivaten abgeleiteten dioxyd; carboxylischen Kationenaustauscher höhere Aziditäten

3. Eluieren der organischen Base vom Kationen- ^al^s <ü^e entsprechenden Methacrylate, austauscher mit einer wäßrigen Lösung einer _BMgQ ^^ g^ _{wdche nach dem Ver}f_ahren Mineralsaure, 5 der Erfindung gereinigt werden können, sind beispiels-

4. Wiedergewinnen der praktisch reinen organischen weise:

Base aus der wäßrigen Lösung der Mineralsäure; Molekulargewicht

5. Überführen des Kationenaustauschers in die ^L Antibiotika

Natrium- oder Ammoniumf orm durch Behändem 20 Streptomycin 581,6

desselben mit einer wäßrigen Lösung eines alka- Neomycin

lischen Natrium- oder Ammoniumsalzes oder Kanamycin 484,5

von Natrium- oder Ammoniumhydroxyd. Tetracyclin 444,4

.-■■-- Oxytetracyclin

Alkalische Salze des Kaliums, Lithiums oder 25 Terramycin 496,5

Caesiums oder die entsprechenden Hydroxyde eignen Oleandomycin 529

sich ebenfalls zur Umwandlung der WasserstofForm Erythromycin 733,9

des carboxylischen Kationenaustauschers im Ver- Bacitracin etwa 1400

fahren der vorliegenden Erfindung, aber aus wirtschaft- Polymyxine .- etwa 1500

liehen Gründen sind die Salze oder Hydroxyde von 30

Natrium oder Ammonium vorzuziehen. Am Ionen- Alkoide

austauscher bekannte geeignete Spülungsoperationen 1. Opium-Gruppe

werden angewendet, wie entsprechend beschrieben. a) Morphin 285

Die bevorzugten Klassen von schwach sauren b) Codein 299

Kationenaustauschern für das Verfahren der Erfindung 35 c) Noscapin 413

sind diejenigen, bei denen die Kationenaustauscher- d) Papaverin 339

aktivität auf im Molekül vorhandenen Carboxyl- e) Thebain 311

gruppen beruht. Harze dieser Art sind allgemein _o Ta_an„^„„„„„_m^^_Q

ti* j- TT j 1 1 .-1^T 1 n. TT z. 11 2. JBellaaonnagruppe

bekannt und im Handel erhaltlich. Ihre Herstellung ■> Atrooin 289

ist im einzelnen in den USA.-Patentschriften 2 319 359, 40 Λ q„„_.„i "j' i_m

2 333 754, 2 340 110 und 2 340 111 beschrieben. Auf ^b) ^P⁰¹³·™¹¹ · · ■; *»

die dortigen Angaben wird Bezug genommen. Ein 3. Verschiedene Alkoide

besonders günstiges Carboxylharz wird hergestellt, a) Ergotamin 582

indem man in Suspension ein Mischpolymerisat aus t>) Chinin 324

Methacrylsäure und etwa 3 bis 10% Divinylbenzol 45 ^c) Procain 236

herstellt. Ein anderer empfehlenswerter carboxylischer d) Reserpin 609

Austauscher wird durch Mischpolymerisation von τττ _nnmini;_o w .ti 1 j χ ^ ι ι j. -^ τν· · π. 1 j JU-L Hormone Methyl- oder Athylacrylat mit Divinylbenzol und anschließender Hydrolyse des Mischpolymerisats zur 1· Relaxin 1500

Bildung von Carboxylgruppen erhalten. 50

Die Stoffe, welche nach dem Verfahren der vor- Man sieht, daß eine große Zahl von chemisch

liegenden Erfindung gereinigt werden können, besitzen recht verschiedenen Verbindungen dem Verfahren mehrere gemeinsame Kennzeichen. Sie enthalten der Erfindung zugänglich sind, sämtlich mindestens eine basische stickstoffhaltige Wäßrige Lösungen von Kohlendioxyd für das

Gruppe und zeichnen sich durch verhältnismäßig 55 vorliegende Verfahren lassen sich herstellen, indem hohe Molekulargewichte aus. Weiterhin sind ihre man Kohlensäuregas in destilliertes oder entionisiertes Salze mit Säuren, und zwar insbesondere mit Säuren Wasser einleitet. Man kann aber auch feste Kohlenniederer Molekulargewichte, wie Chlorwasserstoff- säure mit solchem Wasser mischen, säure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure, Die Temperatur, bei welcher die Eluierung mit

Salpetersäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Zitronen- 60 der wäßrigen Lösung von Kohlendioxyd ausgeführt säure, Milchsäure, Weinsäure und Essigsäure, wasser- wird, ist nicht unbedingt kritisch. Da jedoch die löslich. Löslichkeit von CO₂ in Wasser mit steigender Tempe-

Die Molekulargewichte der für das Reinigungs- ratur abnimmt, empfehlen sich für die Eluierung verfahren der Erfindung geeigneten Verbindungen Temperaturen von 15 bis 35, insbesondere 20 bis können je nach der chemischen Zusammensetzung 65 30⁰C, d.h. sogenannte Raumtemperaturen, und der molekularen Konfiguration der einzelnen Man kann die wäßrigen Lösungen von CO₂ bei

Verbindungen verschieden sein. Im allgemeinen be- Normaldruck anwenden und erzielt eine befriediwegen sie sich zwischen 250 und 2000. gende Eluierung der anorganischen Kationen.

Man arbeitet jedoch schneller und wirksamer, wenn die CO₂-Lösung unter einem positiven Druck von CO₂-GaS gehalten wird. CO₂-Drücke von mehr als 10 at bieten aber keine besonderen Vorteile mehr.

Das Verfahren der Erfindung kann ansatzweise oder halbkontinuierlich ausgeführt werden, wobei das letztere bevorzugt ist.

In diesem Fall wird eine Säule mit carboxylischem Kationenaustauscherharz beschickt und mit Wasser oder verdünnter Mineralsäure rückgespüj.t, um Staub und andere unerwünschte Verunreinigungen zu beseitigen; dann führt man das Harz in die Natriumoder Ammoniumform über, indem man es mit einer verdünnten wäßrigen Lösung eines alkalischen Natrium- oder Ammoniumsalzes oder von Natriumoder Ammoniumhydroxyd regeneriert. Alle anhaftenden Reste von Regenerierungsmittel werden mit entionisiertem Wasser weggespült. Die zu reinigende Lösung der organischen Verbindung wird dann der Kolonne von oben nach unten oder von unten nach oben zugeführt und der Durchbruch der organischen Verbindungen in gewissen Abständen durch Probeentnahme aus dem Ablauf beobachtet. Etwaige noch in der Säule verbleibende Reste der organischen Verbindung werden mit entionisiertem Wasser fortgespült, und dann leitet man eine wäßrige Lösung von CO₂ von oben nach unten oder von unten nach oben durch das Harzbett. Sobald alle anorganischen Ionen eluiert sind, wird das Harzbett mit entionisiertem Wasser gespült, und man leitet eine verdünnte Lösung von ChlorwasserstofFsäure hindurch, um die organische Verbindung zu eluieren. Nach einer Spülung wird der Austauscher durch Behandlung mit verdünnter Natriumlauge oder Ammoniumhydroxydlösung in die Natrium- bzw. Ammoniumform rückgeführt.

Noch höher konzentrierte Lösungen der organischen Verbindungen werden erhalten, indem man zwei oder mehrere carboxylische Austauscherbetten in Reihe anwendet. Mit einem solchem System läßt sich die erste Säule bis zur Sättigung und nicht nur gerade bis zum Durchbruch mit der organischen Verbindung beladen. Was an organischer Verbindung nach dem Durchbruch und vor der Sättigung des ersten Bettes abfließt, wird von dem zweiten Bett vom carboxylischen Kationenaustausch^ adsorbiert. Die Regenerierungs- und Spüloperationen sind die gleichen wie beim Arbeiten mit einer einzigen Kolonne.

ίο Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen Ausführungsformen der Erfindung, die sich jedoch im Rahmen des Erfindungsprinzips in viele Richtungen variieren lassen.
Soweit nicht anders angegeben, sind die Teile Gewichtsteile und die Temperaturen Celsiusgrade.

Beispiel I

Man beschickt eine graduierte 50-ccm-Bürette mit 25 ecm AMBERLITE IRC-50® in der Natriumform,

ao feucht, und führt eine 4 g/l enthaltende Lösung des Antibiotikums oder Alkaloids mit einer Geschwindigkeit von 7,571/27000 ecm in der Minute zu. Die Beladung des Harzes ist vollständig, sobald zwei Tropfen des Ablaufes mit einem Tropfen einer Lösung von 0,2 g Phosphorwolframsäure in 10 ecm einen Niederschlag ergeben. Nun wird das Harzbett mit dem Doppelten seines Volumens an entionisiertem Wasser gespült, um überschüssiges Salz zu entfernen. Dann leitet man mit der oben angegebenen Geschwindigkeit das Fünfundzwanzigfache des Harzvolumens an CO₂-Wasser, hergestellt durch Auflösen von fester Kohlensäure in entionisiertem Wasser, durch und prüft nach jedem einzelnen Volumen auf Alkalität und Durchbruch der organischen Verbindung. Nach einer weiteren Wasserspülung eluiert man das Harzbett mit 4%iger Salzsäure zur Entfernung des Antibiotikums. Nach einer Spülung führt man das Harz durch Behandlung mit einer 4%igen Natronlauge in die Natriumform über. Das Ergebnis zeigt die nachstehende Tabelle:

Organisches Salz

Am Harz
adsorbierte

organische
Verbindung

Menge Na,
eluiert mit
CO₂-Wasser

Organische

Verbindung

mit CO₂

eluiert

Aschegehalt des Eluats

ohne
CO,-Elution

mit
CO₂-Elution

Streptomycinsulfat
Neomycinsulfat ..
Chininsulfat

5,6
2,2
2,2

0,51
0,64
0,61

0,0 0,0 0,0

8,4
22,5
21,5

Dies beweist, daß keine der geprüften organischen Verbindungen während der Behandlung mit der CO₂-Lösung irgendwie eluiert wird, während ausweislich der Werte für den Aschegehalt die CO₂-Eluierung die Asche höchst wirksam beseitigt.

Beispiel II

Zwei Säulen, von denen jede mit 20 g AMBER-LITE IRC-50® beschickt sind, werden durch Durchleiten von 500 ecm 8%ig^er wäßriger Natriumlauge für jede Säule und anschließendes Spülen mit 1000 ecm Wasser in die Natriumform übergeführt. Dann leitet man durch jede Säule 251 einer geklärten und neutralisierten Fermentationsbrühe von Streptomycin. Die eine Säule A wird mit 500 ecm Wasser und dann mit 1000 ecm eines mit CO₂ unter einem Druck von 5 at gesättigten Wassers gespült. Die andere Säule B wird nur mit 500 ecm Wasser gespült. Anschließend eluiert man beide Säulen, indem man jeweils 400 ecm einer wäßrigen 1 η-Salzsäure durchleitet. Das Eluat jeder Säule wird im Vakuum bei 25° C zur Trockne verdampft und analysiert. Der Streptomycinrückstand von der Säule A hat eine Reinheit von 99 %> derjenige von Säule B nur eine solche von 80%·

g B e i s ρ i e 1 III

Man arbeitet nach der Methode von Beispiel II unter Anwendung eines hydrolysierten Mischpolymerisats aus Methylacrylat und 6% Divinylbenzol

als Katiqnenaustauscher und erhält vergleichbare Resultate.

Claims (4)

Patentanspruch.? r

1. Verfahren zur Gewinnung reiner, basische Stickstoffgruppen enthaltender Antibiotika, Alkaloide oder Hormpne mit Molekulargewichten in der Orößenqrdnung von 250 bis 2Ö00 aus den rohen, verdünnten Lösungen ihrer Salze von. niedrigmolekularen Säuren durch Adsorptiop an ein Carboxylgruppen enthaltendes Kationenaus,-tauschharz und Elution des Adsprbats mit den genannten Säuren, dadurch gekennzeichnet, daß man das Adsprbät vor der Elutjon mit den genannten medermolekularen Säuren mit einer wäßrigen Lösung von Kohlendioxyd, vorzugsweise unter erhöhtem Druck, eluiert.

2. Verfahren nac.h Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß, die Lösung vpn Kohle.ndiQxyd unter einem CQ₂-DrUCk Y°ft 1 t>i§ !Oat gehalten wif d.

3. Verfahren naph Anspriiph 1 oder 2, da4urch gekenjizgichnet, daß zur s3äure,eluierung Chlprwasserstoffsäure, Schwefej[§äure, §alpetsr§äurg oder Phosphorsäure, genutzt wird,

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis % dadyr^h gekennzeichflgt, #j? ^s cartjoxyliscber· Katipn.enäustäuscher ejn Mischpplymeris'at aus Methac.ryigäure u|}d 3 bjs iOVp-DiYiriylijenzol, vorzugsweise in dej |S[atru}in.- o.d.gr A^momumform, vejrwen.(le.t j

In Betracht gezogene Druckschriften:
ySA,-Patentgehrif1: Nr, 2 54142Q.