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Verfahren zur Reinigung von Streptomycin Die vorliegende Erfindung
betrifft ein verbessertes Verfahren für die Reinigung von Steptomycin, insbesondere
die Trennung und Aufarbeitung von Streptomycin von verhältnismäßig niedermolekularen
Verunreinigungen und anorganischen Kationen aus Kulturbrühen und teilweise gereinigten
Streptomycinprodukten.
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Streptomycin wurde bisher aus den Stoffwechselprodukten des »streptomyces
griseus« durch Adsorption an Aktivkohle und Elution mit einem sauren Lösungsmittel,
wie verdünnter wäßriger oder methanolischer Säure, gewonnen. Das Streptomvcin kann
zaus der Kulturflüssigkeit oder anderen Lösungen und durch Adsorption an Kationenaustauschharze
vom Typ schwacher Carbonsäuren aufgearbeitet werden. Das so erhaltene Streptomycin
wird aus dem Kationenaustauschharz in Form der Lösung seines sauren Salzes durch
Elution des Harzes mit Säure gewonnen. Derartige Streptornycinlösungen werden zur
Gewinnung des Antibiotikums in Form fester Salze durch Fällung mit geeigneten Lösungsmitteln
oder nach anderen bekannten Verfahren behandelt. Bei diesen Verfahren wird das Streptomycin
zunächst in Form von verhältnismäßig unreinen Produkten erhalten, beispielsweise
als Streptomycintrihydrochlorid von verhältnismäßig geringer Wirksamkeit. Die Wirksamkeit
des Streptomycins wird im allgemeinen nach biologischen Methoden bestimmt und gemessen
an ihrer Fähigkeit, das Wachstum von Mikroorganismen wie »Escherichia coli« und
»Bacillus subtilis« im Vergleich mit einem Standardpräparat zu verhindern (vgl.
j. Biol. Chem., Bd. 153, 1944, S. 249; J. Bact., Bd. 47, 1944, S. 199). Die Wirksamkeit
kann auch chemisch dadurch bestimmt werden, daß die Maltolmenge gemessen wird, die
aus dem biologisch aktiven Anteil des Streptomycinmoleküls bei alkalischer Hydrolyse
gebildet wird oder daß die Guanidinogruppe im Streptidanteil des Moleküls bestimmt
wird.
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Die so erhaltenen rohen Streptomycinsalze können durch Adsorptionschromotographie
aus Methanol oder wäßrigem Methanol auf eine mit Säure ausgewaschene Tonerdesäule
(J. Biol. Chem., Bd. 160. 1945, S. 337) oder aber durch Herstellung und Umkristallisieren
des Reineckats, des Sulfat-Reineckats oder Helianthats weitergereinigter werden.
Das durch nachfolgende Umsetzung dieser Salze in die gewünschten Salze von Mineralsäuren
erhaltene Streptomycin ist dann praktisch rein. Reines Streptomycin wird auch durch
Kristallisation des Streptomycintrihydrochloridcalciumchlorid-Doppelsalzes erhalten
(J. Am. Chem. Soc., Bd.67, 1945, S. 1866).
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Die beschriebenen Verfahren zeigen eine Reihe von Nachteilen. So ist
es beispielsweise schwer oder unmöglich, das gesamte an Aktivkohle adsorbierte Streptoinycin
durch Elution wiederzugewinnen. Ferner geht bei den üblichen Fällungsmethoden bei
der Aufarbeitung des Antibiotikums etwas Streptomycin in den Mutterlaugen verloren,
die entweder zu verdünnt sind oder zu viele Verunreinigungen enthalten, um daraus
die Gewinnung des Antibiotikums auf wirtschaftliche Weise zu gestatten. Bei den
meisten bekannten Aufarbeitungsverfahren für Streptomycin entstehen erhebliche Verluste
an Antibiotikum dadurch, daß eine große Anzahl von physikalischen Operationen erforderlich
ist, bei ständiger Veränderung der Konzentration des Antibiotikums und anderer Verunreinigungen,
die damit verbunden sind.
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Vom wirtschaftlichen Standpunkt aus gestaltet sich ein Aufarbeitu.ngsverfahren
mit zahlreichen Abwandlungen durch die Notwendigkeit besonderer Anlagen und Arbeitsvorgänge
erheblich teurer als ein Aufarbeitungsverfahren, das auf einfacher Basis durchgeführt
werden kann.
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Die rohen Streptomycinsalze, die in bekannter Weise aus der Fermentationsbrühe
durch Adsorption und anschließender Elution und Fällung entweder bei der Kohleadsorption
oder dem Kationenaustausch erhalten werden, enthalten Verunreinigungen, die je nach
ihrer Molekülgröße oder ihren physikalischen Eigenschaften chemisch nachgewiesen
werden können. Eine Gruppe dieser Verunreinigungen besteht aus anorganischen Kationen
der Elemente Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium. Die Bestimmungsmethoden
hierfür
sind an sich bekannt. Eine weitere Gruppe von Verunreinigungen besteht aus histaminähnlichen
Stoffen. Diese Verunreinigungen sind stark toxisch. Sie bewirken eine Blutdrucksenkung
und müssen daher bei der Aufarbeitung oder Reinigung so vollständig wie möglich
aus dem Antibiotikum entfernt «-erden. Der Standardtest für die Bestimmung von Histamin
oder histaminähnlichen Verbindungen in Antibioticis besteht darin, daß eine Katze
mit einem Barbiturat narkotisiert wird und das Streptomycin oder eine Streptomycinkomplexverbindung
der Katze mit 3 mg oder 3000 Einheiten Streptomycin pro kg Körpergewicht intravenös
gespritzt wird. Ein Streptomycinpräparat ist für die Humanmedizin geeignet, wenn
sein Gehalt an histaminähnlichen Verbindungen so gering ist, daß bei der Injektion
der genannten Menge im Versuchstier nur eine Blutdrucksenkung erzielt wird, welche
höchstens der Blutdrucksenkung durch 0,1 ; Histaminbase pro kg Körpergewicht des
Versuchstieres entspricht.
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Erfindungsgemäß wird nun ein einfaches Verfahren zur Abtrennung von
Streptomvcin von anorganischen Kationen und engverwandten kationischen Verunreinigungen
von niedrigerem Molekulargewicht als Streptomycin durch Ausnutzung von selektiven
Ionenaustauschreaktionen vorgeschlagen. Ferner ist Gegenstand der Erfindung die
Abtrennung von Streptomycin von Histamin und histaminähnlichen Stoffen durch selektiven
lonenaustausch. Weiterhin werden erfindungsgemäß durch selektiven Ionenaustausch
verschiedene bisher notwendige Reinigungsoperationen beim Aufarbeiten von Streptomycin
unnötig.
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Es wurde gefunden, daß man Streptomycin von anderen Produkten der
Fermentationsbrühe oder von \'erutireinigungen, die während der Aufarbeitung hineinkommen,
dadurch abtrennen kann, daß man Streptomycinsalzlösungen, die solche Verunreinigungen
enthalten, mit einem sulfonsäuregruppenhaltigen Kationenaustauscherharz hoher Dichte
in Mischung mit dem schwach basischen Anionenaustauscher in einer Mischbettsäule
behandelt.
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Vorzugsweise wird vor der Aufgabe auf die Mischbettsäule das Streptomycin
aus der Fermentationsbrühe an einen schwach sauren Kationenaustauscher vom Carbonsäuretyp
adsorbiert und dieser mit einer starken Mineralsäure in üblicher Weise eluiert.
Diese Lösung wird dann über ein hochvernetztes nachsulfoniertes Kationenaustauscherharz,
das mit einem schwach basischen Anionenaustauscher gemischt ist, geleitet. Der Auslauf
dieser Mischbettsäule enthält das Streptomvcin frei von Natrium-, Kalium-, Calcium-und
Magnesiumionen, frei von Histamin und histaminähnlichen Verunreinigungen und auch
frei von überschüssiger Mineralsäure. Die so erhaltene gereinigte Streptomycinlösung
eignet sich zur Injektion ohne irgendwelche weiteren Reinigungsoperationen außer
den üblichen Sterilitätsmaßnahmen.
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Es wurde weiter gefunden, daß gewisse synthetische Kationenaustauscher
mit ringförmig gebundenen Sulfonsäuregruppen, d. h. Harze, die ihre Austauscherwirksamkeit
den Sulfonsäuregruppen verdanken, beispielsweise das im Handel unter der Bezeichnung
»Amberlite IR-120« erhältliche sulfonierte Mischpolymerisat aus Styrol und Divinylbenzol,
eine ungewöhnliche Adsorptionsselektivität gegenüber kleinen organischen Kationen
von Histamin und histaminähnlichen Verbindungen zeigen. Solche Harze sind zwar in
ihrer Natriumform in der Lage, Histamin aus Streptomycinlösungen vollständig zu
entfernen, ohne das Streptomycin zu adsorbieren,jedoch erhöhen sie den Gehalt an
anorganischen Salzen in der Streptomycinlösung.
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Daher wird erfindungsgemäß das Harz »Amberlite IR-120« durch Behandeln
mit einem 10%igen Überschuß an verdünnter Schwefelsäure in die Wasserstofform übergeführt.
In dieser abgewandelten Form erhält man ebenfalls eine völlige Entfernung des Histamins
und histaminähnlicher Verunreinigungen. wobei gleichzeitig jedoch der Gehalt an
anorganischen Salzen in den Streptomycinlösungen zurückgeht. Andererseits zeigen
die Ausläufe bei Verwendung dieses Harzes die Anwesenheit von freier Säure mit pH-Werten
zwischen 1,0 und 1,5. Um das Entstehen weiterer Salze zu verhindern, wird die Neutralisation
des Auslaufs durch schwach basische Anionenaustauscherharze, wie beispielweise das
unter dem Warenzeichen »Amberlite IR-45« im Handel befindliche, durchgeführt. Man
mischt also einen sulfonierten Kationenaustauscher von der Art des »Amberlite IR-120«
in der `'Wasserstofform mit einem schwach basischen Anionenaustauscher, wie es unter
dem Warenzeichen »Amberlite IR-45« in der Form der freien Base im Handel ist. Die
Mischung der Harze wird im Mischbettverfahren angewendet.
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Gleiche Gewichtsteile des Kationenaustauschers »Amberlite IR-120«
in der Wasserstofform und »Amberlite IR-45« in der Form der freien Base werden in
eine Glassäule oder ein anderes geeignetes Gefäß eingebracht und mit etwa 20 bis
30 cm entsalzenem Wasser bedeckt. Am unteren Ende der Säule wird mit einer Geschwindigkeit
von 15,2 ccm pro Sekunde und pro qcm des Querschnitts der Säule Druckluft eingelassen.
Für die Mischung der beiden Harze werden etwa 15 bis 20 Minuten benötigt. Die Druckluft
wird abgestellt. Die vermischten Harze läßt man absitzen, wobei das Wasser langsam
auf die Höhe der Harze in der Säule abgelassen wird. Zweckmäßig ist die Schichthöhe
nicht niedriger als 61 ccm. Die Verweilzeit der Streptomycinlösung im Austauscher
muß durch geeignete Einstellung der Durchflußgeschwindigkeit klein gehalten werden,
um eine möglichst geringe Adsorption von Streptomycin zu gewährleisten. Betrieblich
bleibt der Verlust an Streptomycin durch Adsorption unter 5% bei gleichzeitig vollständiger
Entfernung der Verunreinigungen, wenn die Verweilzeit unter 10 Minuten liegt.
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Eine Streptomycinlösung von ungefähr 80 000 Einheiten Streptomycin
pro ccm, die eine Histaminsenkung von mehr als 26 mm Hg erzeugt, wird durch die
Säule gelassen und am Abflußende gesammelt. Die Lösung enthält mehr als 97% der
ursprünglichen Streptomycinwirksamkeit. Die Entfernung von Histamin und histaminähnlichen
Verunreinigungen sowie von anorganischen Salzen ist praktisch vollständig.
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Die gemischten Harze werden zunächst mit 3,785 1 einer 4gewichtsprozentigen
Kalilauge pro 450 g der Harzmischung mit einer Geschwindigkeit von 0,24 bis 0,28
1 pro Stunde und qcm des Bettes gewaschen. Dann wird das Harz zur Entfernung von
überschüssiger Kalilauge mit Wasser gewaschen. Die Harze werden dann durch 10 bis
10 Minuten langes Rückspülen mit Wasser bei einer Geschwindigkeit von 0,61 bis 0,65
1 pro Stunde und qcm Filterbett getrennt. Dann wird etwa in der Höhe der Trennschicht
zwischen den beiden Harzen eine Sprühplatte eingeführt und der Zufluß von Wasser
allmählich verringert, bis die Harze sich gesetzt haben. Da das regenerierte Anionenaustauscherharz
leichter ist, setzt es sich im oberen Teil der Säule oberhalb der Sprühplatte ab
und
kann daraus entnommen oder zur Wiederverwendung nach Regenerieren
des Kationenaustauschers belassen werden.
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Während von oben Wasser durch die Harze geleitet wird, wird in der
Höhe der Sprühplatte eine lOgewichtsprozentige verdünnte Schwefelsäure eingeführt
und am unteren Ende zusammen mit dem Wasser abgezogen. Die Zufuhr von Wasser und
Schwefelsäure wird etwa zu 0,61 1 pro Stunde und qcm gleichgehalten. Zur Regenerierung
von 1 kg Kationenaustauscher sind jeweils ungefähr 1,11 10%ige Schwefelsäure erforderlich.
Nach dein Auswaschen zur Entfernung überschüssiger Säure werden die Harze durch
Einleiten von Luft wieder vermischt und können so wieder verwendet werden.
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Die selektive Adsorption von Metallionen sowie von Histamin oder histaminähnlichen
Stoffen und von Streptomycin ist besonders überraschend, da alle diese Stoffe Kationen
sind. Die selektive Adsorptionsfähigkeit der Harze für die Verunreinigungen aus
Streptomycin muß offenbar den besonderen Eigenschaften der hochvernetzten sulfonierten
Austauschei zugeschrieben werden. Bei der Untersuchung von Kationenaustauschern,
die durch Sulfonierung von Mischpolymerisaten von Styrol und Divinylbenzol hergestellt
sind, wurde festgestellt, daß bei der Einwirkung von Streptomycinlösungen auf verschiedene
Harze, die 2. 4, 6 oder 8% Divinylbenzol enthalten, die Adsorptionsgeschwindigkeit
des Streptomycins an die Harze mit dem Vernetzungsgrad zunimmt. Harze, die 2% Divinylbenzol
enthalten, adsorbieren Streptomycin sehr schnell und würden in weniger als 10 Minuten
gesättigt sein. Harze, die größere Mengen Divinylbenzol enthalten, adsorbieren Streptomycin
langsamer. Die Adsorptionsgeschwindigkeit für Streptomycin nimmt ab, bis das Harz
etwa 801o Divinylbenzol enthält, wobei weniger als 10% der Austauschstellen des
Harzes mit Streptomycin gesättigt sind. Hochvernetzte Sulfonsäureharze werden mit
Streptomycin erst nach sehr langer Zeit, z. B. 16 bis 24 Stunden, gesättigt, sättigen
sich jedoch innerhalb weniger Minuten sehr viel schneller mit kleineren organischen
Molekülen wie Histamin oder anorganischen Metallionen. Demnach werden also nur hochvernetzte
Austauscherharze erfindungsgemäß verwendet, besonders solche, die 6% Divinylbenzol
enthalten, jedoch sind solche mit 8% und mehr Divinylbenzol besser geeignet.
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Es ist bekannt, sulfonsäuregruppenhaltige Kationenaustauscher zur
Reinigung von Streptomycin zu verwenden. Es ist schon vorgeschlagen worden, Streptomycinlösungen
mit Hilfe sulfonierter Kationenaustauscher in der Weise zu reinigen, daß das Streptomycin
in Lösung bleibt und die Verunreinigungen, insbesondere anorganische Kationen- und
histaminartige Stoffe, adsorbiert werden.
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Nach dem früheren Vorschlag wird zunächst vor der Reinigung mit dem
sulfonsäuregruppenhaltigen Kationenaustauscher eine Reinigung mit einem carboxylgruppenhaltigen
Ionenaus.tauscher durchgeführt. Alsdann wird das Antibiotikum mit verdünnter Mineralsäure
aus dein Harz eluiert, neutralisiert und erneut über einen Carboxylgruppen enthaltenden
Ionenaustauscher geleitet, erneut eluiert und dann das Eluat aus dem zweiten Harz
mit einem sulfonsäuregruppenhaltigen Ionenaustauscher behandelt, welcher in der
Säureform vorliegt.
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Nach dein erfindungsgemäßen Verfahren wird demgegenüber durch die
Anwendung eines Mischbettes eine wesentlich einfachere betriebliche Arbeitsweise
vorgeschlagen, die überraschenderweise einen noch höheren Reinigungseffekt erzielt.
Beispiel 300 ccin einer wäßrigen Streptomycinsulfatlösung mit einem Gehalt von 57,6
g Streptomycinbase von der Reinheit 576 y pro mg, die pro mg einen Sulfataschengehalt
der Metalle Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium von 10 mg pro ccm hat und die
so viel Histamin oder histaminähnliche Verbindungen enthält, daß im Test ein Blutdruckabfall
erfolgt, der fünfmal über dem höchstzulässigen liegt, werden durch eine Glassäule
vom Durchmesser 1,58 cm und von der Höhe von 76,2 cm gegeben, die eine Mischung
von 60 g des Kationenaustauscherharzes Stryrol-Divinylbenzol 90:10 nachsulfiert
in der Säureform und 60 g des Anionenaustauscherharzes Styrol-Divinylbenzol-Polyamin
in Form der freien Base enthält. Die Durchflußgeschwindigkeit beträgt 8 ccm pro
Minute und die Einwirkungszeit des Harzes auf die Streptomycinlösung 7 Minuten.
Die Streptomycinlösung wird mit 200 ccm Wasser gespült, und 400 ccm der Ausflußlösung
vom pH-Wert 6 werden gesammelt. Die erhaltene Streptomycinlösung erwies sich als
frei von Histamin und histaminähnlichen Verbindungen sowie frei von anorganischen
Metallionen. Sie hat eine Wirksamkeit von 728 y pro mg. Die Ausbeute an Streptomycinsulfat
beträgt 94,9%.