DEU0003001MA - - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 30. September 1954 Bekanntgemacht am 23. August 1956

DEUTSCHES PATENTAMT

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zum fermentative« Abbau der 17-Ständigen Seitenkette von 20-Ketopregnanen und 20-Ketoallopregnanen unter Bildung von 17-Ketotestanen (normale Form), 17-Ketoandrostanen und 20-Oxypregnanen.

Der Abbau der Seitenkette in 17-Stellung von Steroidverbindungen mit chemischen Mitteln unter Bildung von 17-Ketosteroiden, insbesondere von 17-KeitoandiOstanen und 17-Ketotestanen, ist wohl bekannt, doch erfordert diese Arbeitsweise in der Regel eine Anzahl von Maßnahmen, wie die Bildung einer 17 (2o)-Ständigen Doppelbindung und Oxydation dieser Doppelbindung. Bei einem solchen oxydativen Abbau wird der Steroidkern oft an anderen Stellungen, insbesondere Doppelbindungen angegriffen, was zu hohen Verlusten führen kann. Um diese Verluste zu vermeiden, werden solche Stellungen oder Gruppen in bekannter Weise geschützt, was wiederum mindestens zwei zusatzliehe Maßnahmen erfordert. So beschreiben z. B. Bergmann und Stevens (Journ. Org. Chem., Bd. 13, 1948, S. 10) die Ozonolyse des 22-Enolacetats des 5, 7-Bisnorchola,dien-3/?-0'l-22-al-3-acetats, das durch eine 5, 8-Ständige Maleinsäureanhydridaddiuktgruppe geschützt ist, wobei man das Maileinsäureanhydridadclukt des 5, 7-Androsta.dien-3 /J-ol-^-on-S-acetats erhält.

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Gemäß vorliegender Erfindung wird ein' 20-Ketopregnan oder 20-Ketoallopregnan durch Einwirkung eines Pilzes der Gattung Penicillium in ein 17-Ketoandrostan oder 17-Ketotestan übergeführt. Die erhaltenen 17-Ketoandrostane und 17-Ketotestane sind wertvolle Arzneimittel oder wertvolle Zwischenprodukte zu deren Herstellung.

Das erfindungsgemäße Verfahren liefert eine Anzahl von wertvollen Produkten, so gibt z. B. Progesteron, wenn man es der Einwirkung von Penicillium lilacinum aussetzt, 4-Androsten-3, 17-dion, das bekanntermaßen androgene Eigenschaften besitzt. 4-Androsten-3, 17-dion kann in Testosteron übergeführt werden (Stavely, USA.-Patentschrift Nr. 2 288 854) und letzteres durch Hydrierung in das therapeutisch wertvolle Dihydrotestosteron (Symposium on Steroids in Experimental and Clinical Practice, The Blakistan Company, New York, 1951, S. 375). In analoger Weise ergibt die Fermentation von ii-Ketoprogesteron das bekannte 4-Androsten-3, 11, 17-tricti (Adrenosteron), das ein wertvolles Ausgangsmaterial für die Herstellung von 11 /J-Oxytestosteron ist.

Die Ausgangsverbindungen für das vorliegende Verfahren sind 20-Ketopregnane und 20-Ketoallopregnane. Der Cyclopentaopolyhydrophenanthrenkern mit einer Seitenkette in 17-Stellung kann in anderen Stellungen auch Keto'- oder Hydroxylgruppen tragen, insbesondere in den Stellungen 3, 6, 7, 8, 11, 12, 14, 17 und 21, und kann in verschiedenen Stellungen, insbesondere in Stellung 4 und 5, Doppelbindungen enthalten.

Typische Ausgangsmaterialien sind folgende: Pregnan - 3 α (oder ß) - öl - 20 - on, 5 - Pregnen - 3a -

.35 (oder/?)-ol-2O-on, Pregnan-3 α (oder/?)-ol-ii, 20-dion, Pregnan-3a, 11 α (oder 3/?, 11/? oder 3/?,, iicr oder 3 a, 11 ß) -diol-20-on, Progesteron, I7a-Oxyprogesteron, ii-Ketoprogesteron, 11 a-Oxyprogesteron, 11 α, I7a-Dioxyprogesteron, ii-Keto-^a-Oxyprogesteron, 11 a-Acetoxyprogesteron, ii/3-Oxyprogesteron, ^a-Oxyprogesteron, 4-P regnen-14 a, 17 a, 2i-triol-3, 20-dion, i4a-Oxy-ii-desoxycorticosteron; 4-Pregnen-i7 a, 2i-diol-3,20-dion (»Reichsteins Verbindung S«), Corticosteron, Cortison, Co'rtisonacetat, Hydroeortison (»Kendalls Verbindung F«) und 4 - Pregnen - 11 α, 17 a, 21 - triol 3, 20-dion (»ii-EpiverbindungF«) Pregnan-3, 11-20-trion, Pregnan-i7a-ol-3, 11, 20-trion, Pregnan-3, 12, 20-trion, Pregnan-i7a-ol-3, 20-dion, AlIo^ pregnan-3, 11-20-trion, Allopregnan-3, 20-dion, 5"Pregnen-3 a-ol-20-on, Allopregnan-3 α (oder ß)-ol-20-011, Pregnan-3 α, 12 α, 2i-trioJ-20-on, Pregnan-3 a, 17 a-diol-20-00, 6 a- und. 6^-Oxy-Progesteron, Pregnan-3, 6) 20-trion.

Zur Durchführung des erfindungsgemaßen Verfahrens wird das gewählte 20-Ketopregnan oder -Allopregnan zweckmäßigerweise in einem Lösungsmittel, wie Aceton, der Kultur eines Pilzes der Gattung Peiiicilliunr ausgesetzt. Die Klassifizierung und Definition von Penicillium, wie sie hier verwendet wird, entspricht derjenigen von K. B. Raper und C. Thorn »Α Manual of the Penicillia«, Williams and Wilkins Company, Baltimore,

1949. Von den Species der Gattung Penicillium, die sich für die Fermentation von Steroiden eignen, seien diejenigen der Unterklassen Monoverticillate, Asymmetrica - divaricata, Asymmetrica - velutina, Asymmetrica - Janata, Asymmetrica - funiculoea, Asymmetrica-fasciculata, Biverticillata-symmetrica und Polyverticillata, z. B. Penicillium adametzi, brevi-compactum, camemberti, canescens, capsulatum, charlesii, citrinum, clavi forme, commune, cyclopium, decumbens, digitatum, duclauxi, etxpansum, frequentans, funiculosum, fascum, gladioli, granulatum, herquei, implicatum janthinellum, lavendulum, levitum, lilacinum, luteum, nigricans, notatum, novae-zeelandiae, ochraceum oixalicum, pallidum, purpurogenum, purpurogenum var. rubrisclero'tium, raistrickii, roqueforti, roseo-, purpureum, rugulosum, terrestre, thomii, urticae und; viridicatum genannt.

Die Kultur der Pilze für die Zwecke der vorliegenden Erfindung erfolgt in oder¹ auf einem Nährboden, der für deren Entwicklung günstig ist. Man kann feste Nährböden verwenden, doch bevorzugt man diejenigen, die eine Massenzucht unter aeroben Bedingungen ermöglichen.

Feuchte, feste, kleinteilige Nährböden, wie Kleie, Cerealienkörner, Cerealiengrieß, Holzschnitzel, Späne, Sägemehl, Maishülsen, Faserstoffe, wie Kopra, Kastanien oder Lupinensamen, können verwendet werden. Man kann sie mit Alkohol, Äther oder anderen organischen Lösungsmitteln extrahieren, um vo-r der Fermentation unerwünschte Verunreinigungen und wachstumshemmende Stoffe zu entfernen. Die Träger können gewünschtenfalls zugesetzte Wachstumsfaktoren und Nährstoffe enthalten und können in Schichten oder Schalen mit oder ohne Hilfsbelüftung, in Türmen, wie bei der Essigherstellung, oder unter Bewegung, z. B. in einer rotierenden Trommel, verwendet werden. Flüssige Nährböden, wie Bierwürze, eignen sich gut für aerobe Schichten und noch besser für aerobe submerse Fermentationsbedingungen. Zweckmäßigerweise sollten die Nährböden Stoffe enthalten, die Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralien zur Verfügung stellen, obschon natürlich auch unter weniger als optimalen Bedingungen ein beträchtliches Wachstum auftreten kann.

Verfügbarer Kohlenstoff kann aus Kohlehydraten, Stärken, gelatinisierten Stärken, Dextrin, Zuckern, Melassen von Rohr-, Rüben- und Sorghumzucker, Glukose, Fructose, Mamoee, Galactose, Maltose, Suerose, Lactose, Pentosen, Aminosäuren, Peptonen oder Proteinen stammen. Kohlensäure, Glycerin, Alkohole, Essigsäure, Natriumacetat, Zitronensäure, Natriumeitrat, niedere Fettsäuren, höhere Fettsäuren oder Fette sind Beispiele für andere Materialien, die assimilierbaren Kohlenstoff für den Energiebedarf der Pilze liefern können. Manchmal sind Mischungen von verschiedenen Kohlenstoffquellen von Vorteil. .·.,

Assimilierbarer Stickstoff kann von löslichen oder unlöslichen pflanzlichen oder . tierischen Proteinen, Sojamehl, Lactalbumin, Casein, Eialbumin, Peptonen, Polypeptiden oder Aminosäuren,

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Harnstoff, Ammonsalzen, an Basenaustauschharze oder Zeolite gebundenem Ammoniak, Ammoniumchlorid, Natriumnitrat, Kaliumnitrat oder Morpholin stammen, Molke, lösliche Rückstände der Brennereien, Maiseinweichwasser oder Hefeextrakt haben sich auch als sehr geeignet erwiesen.

Als mineralische Bestandteile der Nährböden können von Natur aus vorhandene oder zugesetzte Substanzen dienen, die Aluminium, Calcium,

ίο Chrom, Kobalt, Kupfer, Gallium, Eisen, Magnesium, Molybdän, Kalium, Scandium, Uran und Vanadium liefern. Schwefel kann durch Sulfate, Alkylsulfonate, Suilfocxyate, Sulfamate, Sulfinate, freien Schwefel, Hyposulfite, Persulfat, Thiosulfat, Methionin, Cystin, Cystein, Thiamin oder Biotin geliefert werden. Phosphor, vorzugsweise in fünfwertiger Form, zweckmäßig in Konzentrationen von etwa ο,οοι- bis o,o7molar und vorzugsweise von etwa 0,015- bis o,o2molar, kann als Ortho-, Meta- oder Pyrophosphatsalze oder -ester, P hy tin, Phytinsäure, Phytate, Glycerophosphate, Natriumnucleinate und/oder Maiseinweichwasser, Casein oder Ovovitellin zugegen sein. Es ist erwünscht, Bor, Jod und Selen in Spuren zugegen zu haben. Das Bot wird vorzugsweise in Form von Borsäure oder Natriumborat zugesetzt, insbesondere nach der Keimung und während dem ersten Wachstum des Pilzes.

Je nach Bedarf oder Wunsch kann man noch weitere' zusätzliche Wachstumsfaktoren, Vitamine, Auxine und Wachstumsstimulantien vorsehen.

Obgleich man feste wie flüssige Nährböden verwenden kann, wird ein flüssiger Nährboden bevorzugt, da er das Mycehvachstum begünstigt.

Zur Erleichterung der Fermentation, Belüftung und Filtration kann man Suspendiermittel oder Mycelträger, wie Filtererden, Filterhilfsmittel, feinzerteilte Cellulose, Holzschnitzel, Bentonit, CaI-ciumcarbonat, Magnesiumcarbonat, Kohle, Aktivkohle oder andere suspendierbare feste Stoffe, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Alginate zusetzen. Die gewählte Pilzgattung wird auf einem Nährboden gezogen, der zweckmäßigerweise assimilierbaren Kohlenstoff, z. B. Kohlehydrate, wie Zucker, Stärken, assimilierbaren Stickstoff, z. B. lösliche oder unlösliche Proteine, Peptone oder Aminosäuren, und mineralische Bestandteile, beispielsweise Phosphate und Magnesiumsulfat, sowie andere bekannte erwünschte Zusätze enthält.

Der Nährboden kann zweckmäßig ein p_H von etwa 4 bis 8 oder weniger oder mehr vor der Beimpfung besitzen. Für die Kultur von Penicillium wird ein P₁₁ zwischen etwa 4 und 6 bevorzugt.

Die Beimpfung des Kulturmediums mit dem gewählten Pilz der Gattung Penicillium kann in jeder geeigneten. Weise durchgeführt werden. Penicillium entwickelt sich in einem Temperaturbereich von etwa 20 bis 38⁰, wobei Temperaturen von etwa 25 bis 32⁰ bevorzugt werden.

Die Entwickkmgsperioden des Pilzwachstums vor dem Zusatz des zu fermentierenden Steroids scheint nicht kritisch zu sein. So kann man beispielsweise des Steroid vor der Sterilisation, die durch Wärmeeinwirkung oder auf anderem Wege erfolgen kann, dem Nährboden zusetzen oder im Moment, wo der Nährboden geimpft wird, oder auch einige Zeit, z. B. 24 oder 48 Stunden, später. Das zu fermentierende Steroid kann in jeder geeigneten Konzentration zugesetzt werden, doch ist aus praktischen Gründen eine Konzentration des Steroidsubstrats von etwa oder bis zu 0,6 g/l oder sogar 0,8 g/l Nährboden befriedigend, und 2 g/l sind anwendbar, abschon auch höhere Konzentrationen je nach dem speziellen Steroid zulässig sind, wenn man eine gewisse Hinderung der Entwicklung des Myceliums in Kauf nehmen will. Der Zusatz des zu fermentierenden. Steroidsubstrats kann in irgendeiner beliebigen Weise erfolgen, und zwar insbesondere derart, daß zwischen Steroidsubstrat und Pilz eine möglichst große Berührungsfläche entsteht. Dazu kann man das Steroidsubstrat entweder allein, mit einem Dispergiermittel oder in einem organischen Lösungsmittel gelöst im Pilzmedium dispergieren oder suspendieren. Man kann sowohl eine Oberflächen- als auch eine submerse Kultur anwenden, doch wird letztere bevorzugt. Man kann auch die bei der Kultur des Pilzes gebildeten fermentierenden Enzyme vom Pilz oder vom Nährboden abtrennen, mit dem Steroid oder einer Lösung der Dispersion desselben vermischen und die Mischung aeroben Bedingungen aussetzen, um die Fermentation des Steroids zu bewirken.

Die Temperatur während der Fermentation des Steroids kann die gleiche sein, wie sie sich für die Pilzkultur als geeignet erwies. Sie muß nur in einem solchen Bereich gehalten werden, daß das Leben, das aktive Wachstum oder die Enzymaktivität des Pilzes erhaltenbleibt.

Obgleich jede Form der aeroben Bebrütung für das Wachstum des gewählten Pilzes und die Fermentation des Steroidsubstrats geeignet ist, ist der Wirkungsgrad der Steroidfermentation abhängig von der Belüftung. Deshalb wird die Belüftung in der Regel kontrolliert, sei es durch Schütteln und/ oder Einblasen von Luft in das Fermentationsmedium. Die Belüftung kann durch Oberflächenr kultur oder unter submersen Fermentationsbedingungen erfolgen. Aerobe Bedingungen umfassen nicht nur die Verwendung von Luft zwecks Einführung von Sauerstoff, sondern auch andere Quellen oder Mischungen, die Sauerstoff in, freier oder frei set zbarer Form enthalten. Bei Verwendung von Luft als Belüftungsmedium ergibt sich als geeigneter Belüftungsgrad etwa 4 bis 20 Millimol und vorzugsweise etwa 6 Millimol Sauerstoff je Stunde je Liter, bestimmt nach der Methode von Cooper, Fernstrom und Miller (Ind. Eng. Chem., Bd. 36, 1944, S. 504). Die Belüftung kann durch Anwendung von Über- oder Unterdruck, z. B. 0,7 bis 2,1 kg/cm² abs., eingestellt werden. Die Sauerstoffaufnahme kann durch Anwesenheit verschiedener Stoffe, wie Ascorbinsäure, Glutaminsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Tyrosin oder Tryptophan, erleichtert werden.

Die für die Fermentierung des Steroids erf orderliche Zeit wechselt je nach der Arbeitsweise

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etwas. Wenn das Steroidsubstrat bei der Beimpfung des Nährbodens vorhanden ist, kann sie 8 bis 72 Stunden dauern. Setzt man jedoch das Steroid dem Pilz zu, nachdem er bereits wesentlich gewachsen ist, z. B. nach 16 bis 24 Stunden, bei der günstigsten Temperatur, so beginnt die Umwandlung des Steroidsubstrats sogleich, und man erhält im Laufe von 1 bis 72 Stunden höhe Ausbeuten. In der Regel ist das Ergebnis von 24 Stunden befriedigend.

Nach Beendigung der Steroidfermentation wird das erhaltene fermentierte Steroid aus dem Reaktionsgemisch isoliert. Eine besonders günstige Isolierung s methode besteht in der Extraktion des Fermentationsgemisches einschließlich des Mycels mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für das Steroid, wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenchlorid, Trichloräthylen, Äther, Amylacetat oder Benzol u. dgl. Man kann die Fermentationsflüssigkeit von Mycelium trennen und einzeln mit geeigneten Lösungsmitteln extrahieren. Die Mycelien können entweder mit wasservermischbaren oder wasserunmischbaren Lösungsmitteln extrahiert werden, wobei sieh Aceton als wirksam erwiesen hat. Die vom Mycelium befreite Fermentationsflüssigkeit kann mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden. Man kann die Extrakte entweder vor oder nach dem Waschen mit alkalischen Lösungen, beispielsweise Natriumbicarb on at, vereinigen, in geeigneter Weise z. B. über wasserfreiem Natriumsulfat trocknen und durch Umkristallisieren aus organischen Lösungsmitteln oder Chromatographie das erhaltene gereinigte I7-Ketosteroid von den anderen Fermentierungsprodukten trennen.

Die folgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren noch näher erläutern.

Beispiel 1

Fermentation von Progesteron und Isolierung von 4-Androsten!-3, 17-dion und 4-Pregne.n-2o/?-ol-3-on Man stellt einen Nährboden her, der 20 g enzymatisch verdautes Lactalbumin (Edamine), 3 g Maiseinweichwasser und 50 g technische Dextrose mit Leitungswasser auf 1 1 verdünnt enthält, und stellt das p_H auf 5,85. 1.2 1 dieses sterilisierten Mediums werden mit Penicillium lilacinum thorn (American Type Culture Collection No>. 10 114) geimpft und 48 Stunden bei 26⁰ bebrütet, wobei man derart belüftet und rührt, daß die Sauerstoffaufnahme 6,3 bis 7 Millimol je Stunde und Liter Na₂ S O₃, bestimmt nach der Methode von C 00per, Fernstrom und Miller (Ind. Eng. Cheim., Bd. 36, 1944, S. 504), beträgt. In diesem Nährboden, der eine 4&stündige Zucht von Penicillium lilacinum thorn enthält, suspendiert man 6 g Progesteron, in. 50 cm³ Aceton gelöst. Nach weiteren 24 Stunden Bebrütung unter den gleichen: Temperatur- und Belüftungsbedingungen werden Flüssigkeit und Mycelium getrennt. Das Mycelium wird abfiltriert, zweimal mit je etwa seinem Volumen

; Aoeton gewaschen und dann zweimal mit je seinem Volumen Methylenchlorid extrahiert. Die Aoeton- und Methylenchloridextrakte enthaltenden Lösungsmittel werden dem Filtrat zugesetzt. Dann extrahiert man die Lösung zweimal mit je ihrem halben Volumen Methylenchlorid und dann zweimal mit je einem Viertel ihres Volumens Methylenchlorid. Die vereinigten Methylenchloridextrakte werden zweimal mit je einem Zehntel ihres Volumens 2%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und hernach zweimal mit je einem Zehntel ihres Volumens Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen, des Methylenchloridextraktes über etwa 3 bis 5 g wasserfreiem Natriumsulfat je Liter Lösungsmittel und Filtrieren wird das Lösungsmittel abdestilliert. Der so erhaltene Rückstand wiegt 5,88 g und wird wieder gelöst und über 150 g Tonerde chromatographiert, wobei man je 600 cm³ Lösungsmittel, wie in Tabelle I angegeben, verwendet.

Tabelle I

Fraktion	Lösungsmittel	Benzol	l9	I	Festes E luat in mg
I	Benzol	X9	I	98,2
2	Benzol—Äther 19 :1	9	I	47,6
0	Benzol—Äther 19:1	9	I	18,8
4	Benzol—Äther 9 :1	I	I	132,8
5	Benzol—Äther 9 :1	I	I	154,2
6	Benzol—Äther 1 :1	I	I	27,5
7	Benzol—Äther 1 :1	I	I	302,7
8	Äther			1267,0
9	Äther	1S	: ι	1160,6
IO	Äther—Chloroform			402,2
II	Äther—Chloroform			97>9
12	Ä t her— Chloroform,			69,4
13	Äther—Chloroform		180,7
14	Ä t h er—-ChI orof orm		.356,1
15	. Äther—Chloroform		101,1
16	Äther—Chloroform		95,3
17	Äther—Chloroform		32,6
18	Chloroform		12,9
19 bis 22	Chloroform—Aceton		34,9
23	Aceton		5,8
24	Methanol		24,6
25	Methanol		210,3
26			7,2

Die Fraktionen 9 bis 11 werden vereinigt und eingedampft. Man erhält 1,66 g Feststoffe, die zweimal mit je 5 cm³ Hexan (bekannt unter dem Handelsnamen »Skellysolve B «) gewaschen werden. Die verbleibenden Kristalle, 1,58 g, F. = 172 bis 175⁰, werden in 10 cm³ heißem Aceton gelöst, die Lösung filtriert und auf 5 cm³ eingeengt. Nach Stehenlassen über Nacht im Kühlschrank erhält man 1,2 g Kristalle vom F. = 175 bis 177⁰. Diese Kristalle werden aus 4 bis 5 cm³ Aceton und 3,5 cm³ »Skellysolve B« umkristallisiert, wobei man 899 mg kristallines 4-Androsten-3, 17-dion vom F. = 175 bis 176,5°; [α] "_D + 194 (c = 0,981 in Chloroform).

Analyse für C₁₉H₂₆O₃

berechnet C, 79,69, H, 9,15;

gefunden C, 79,53, H, 8,94.

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Die Fraktionen; 13 und 14, die 537 mg feste Substanz enthalten, werden vereinigt, in 50 cm³ Benzol gelöst und nochmals über 25 g Tonerde chromatographiert. Man fängt Fraktionen von 50 cm³, wie in Tabelle II gezeigt, auf.

Tabelle II

Fraktion	Lösungsmittel	l9	I	Festes Eluat in mg
I	Benzol—Äther 1 :1	l9	I	7,0
2	Benzol—Äther 1 :1	9	I	5.2
3	Äther	9	1	2,1
4	Äther	I	ι ·	24,8
5	Äther—Chloroform	I	I	48,1
6	Äther—Chloroform	I	I	8O,3
7	Äther—Chloroform		87,6 komb.
8	Äther—Chloroform		7O,4
9	Äther—Chloroform		51,0
IO	Äther—Chloroform	19:1	37.5
II	Äther—Chloroform		!9.7
12	Chloroform .		9>T
13	Chloroform		24,8
14	Chloroform	5,o
15	Chloroform—Aceton	4,8
16	Aceton	4,0
17 und 18	Methanol	13,3

Die Fraktionen 4 bis 11 werden vereinigt und zweimal aus 3 cm³ Methylenchlorid und 1 cm³ »SkellysolveB« umkristallisiert, wobei man 114mg Kristalle vom F. = 151 bis 152⁰ erhält, die durch Infrarot- und Mikroanalyse als 4-Pregnen-2o a-ol-3-on identifiziert werden.

B e i s ρ i e 1 2

Fermentation von ii-Desoxycorticosteronacetat

Aus 0,5% Pepton, 2% Dextrose, 0,5% Sojamehl, 0,5% einbasischem Kaliumphosphat, 0,5%

Natriumchlorid und 0,3% Hefeextrakt stellt man durch Verdünnen mit Leitungswasser auf 1 1 einen Nährboden her, dessen p_H nach dem Sterilisieren auf 5,9 gestellt wird. 3 1 dieses Nährbodens werden mit Penicillium canescens (ATCC Nr. 10419) be-

impft und 24 Stunden bei 28⁰ bebrütet, wobei man mit einer Geschwindigkeit von 7 Millimol je Liter Na₂SO₃ und Stunde, bestimmt nach der Methode von Fernstrom und Miller (Ind. Eng. Chem., Bd. 36, 1944, S. 504), belüftet. In diesem Nährboden, der eine 24 Stunden alte Kultur von Penicillium canescens enthält, suspendiert man 1 g ii-Desoxycorticosteronacetat, in 20cm³ absolutem Äthanol gelöst. Nach weiteren 24 Stunden Bebrütung unter den gleichen Temperatur- und Belüftungsbedingungen werden die Lösung und das Mycelium extrahiert und wie im Beispiel 1 chromatographiert, wobei man 4-Androsten-3, 17-dion und 4-Pregnen-20 α, 2i-diol-3-on erhält.

Beispiel 3

Fermentation von I4ct-Oxyprogesteron Man stellt einen Nährboden her, indem man 20 g Maiseinweichflüssigkeit, 20 g Dextrose, 1 g ein-

basisches Kaliumphosphat, 2 g Natriumnitrat, 0,5 g Magnesiumsulfat, 0,2 g Kaliumchlorid, 0,01 g Ferrosulfat und 2 g Natriumacetat mit Leitungswasser auf ι 1 verdünnt. Nach dem Sterilisieren werden 2 1 dieses Nährbodens in je 100 cm³ betragenden Anteilen in 20 Schüttelflaschen verteilt und mit Penicillium lilacinum beimpft. Zu einer 24stündigen Kultur dieses Pilzes bei 26⁰ gibt man in jede Flasche 10 mg I4ct-Oxyprogesteron, hergestellt nach dem Verfahren der Patentanmeldung U 2024 IVb/120. Nach 48stündiger Bebrütung unter Schütteln mit der umgebenden Luft bei 26⁰ wird der Inhalt der Flaschen vereinigt und mit Methylendichlorid extrahiert; die Extrakte werden eingedampft, wobei man 785 mg festen Rückstand erhält. Dieser wird in 35 cm³ Benzol·gelöst und über 40 g Tonerde chromatographiert. Die Fraktion 24 (Chloroform) wiegt 103 mg und enthält 22% 4-Androsten-i4a-ol-3, 17-dion. Fraktion 25 (Aceton) wiegt 116,5 mg und enthält 16% 4-Androsten-i4a-ol-3, 17-dion. Diese Fraktion wird in ι cm³ Äthylacetat gelöst und bei Zimmertemperatur verdampfen gelassen. Nach mehrmaliger Wiederholung dieses Vorgangs' tritt Kristallisation ein. Die Fraktion wird dann mit 2 cm³ Äther und weni- - ·. gen Tropfen Aceton verrieben, wobei man 10 mg 4-Androsten-i4a¹ol-3, 17-dion vom F. = 252 bis 258⁰ erhält.

In gleicher Weise wie im Beispiel 3 erhält man durch Fermentation von i4a-Oxy-n-desoxycorticosteron oder 4- Pregnen- 14 a, 17 a, 21-triol-3, 20-dien mit Penici'llium lilacinum 4-AndiOsten-140-01-3, 17-dion (gonadal aktiv).

B e i s ρ i e 1 4 Fermentation von n-Desoxycorticosteronacetat

mit Penicillium nigricans

In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man bei Verwendung von Penicillium nigricans (ATCC Nr. 10115) und ii-Desoxycorticosteronacetat als Ausgangssteroid 4-Androstan-3, 17-dion und 4-Pregnen-20 α, 2i-diol-3-on.

Beispiel 5 Fermentation von ii-Desoxycorticosteronacetat

mit Penicillium charlesii

In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man bei Verwendung von Penicillium charlesii (ATCC Nr. 8730) und ii-Desoxycorticosteronacetat 4-Androsten-3,17-dion und 4-Pregnen-20a, 2i-diol-3-on. - -; In gleicher Weise geben die 21-Acyloxyester des ii-Desoxycorticosterons, z. B. das Propionat, Butyrat, Isobutyrat, Valeriat, Hexanoat, Benzoat, Phenylacetat und andere Ester des ii-Desoxycorticosterons bei Behandlung mit einem Pilz der Gattung Penicillium 4-Androsten-3, 17-dion und das entsprechende 4~Pregnen-20 et, 2i-diol-3-on.

Beispielo

Fermentation von Progesteron mit Penicillium brevi compactum In gleicher Weise "wie im Beispiele erhält man unter Verwendung von Penicillium brevi compactum

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(ATCC Nr. 9056) aus Progesteron das 4-Androsten-3, 17-dion und 4"Pregnen-2Oa, 21-diol-3-o.11.

Beispiel 7

Fermentation von 11-Desoxycorticosteronacetat mit Penicillium lividum

In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man bei Verwendung von Penicillium lividum (ATCC Nr. 10102) und 11-Desoxycorticosteronacetat, 4-Androsten-3,17-dion und 4-Pregnen-2Oa, 21-diol-3-on. In analoger Weise ergeben andere 21-Ester des ii-Desoxycorticosterons, wie das Propionat, Butyrat, Isobutyrat, Valeriat, Hexanoat, Benzoat oder Phenylacetat, bei Behandlung mit einem Pilz der Gattung Penicillium 4~Androsten-3, 17-dion und das entsprechende4-Pregnen-2o a, 21 -diol-3-on-21-acylat.

Beispiele

Fermentation von ii-Ketoprogesteron
mit Penicillium expansum

Nach der gleichen Arbeitsweise wie im Beispiel 1 erhält man bei Verwendung von Penicillium expansum (ATCC Nr. 7861) und n-Ketoprogesteron das 4-Androsten-3, 11, 17-trion (Adrenosteron).

Beispiel 9

Fermentation von Progesteron

Man arbeitet gleich wie im Beispiel 2 unter Verwendung von Penicillium frequentans (ATCC Nr. 10444) und Progesteron und erhält 4-Androsten-3, 17-dion.

Beispiel 10
Fermentation von i7a-Oxyprogesteron

Man arbeitet gleich wie im Beispiel 1 unter Verwendung von Penicillium lilacinum (ATCC Nr. 10114) und I7a-Oxyprogesteron und erhält 4-Androsten-3, 17-dion.

Beispiel 11

Fermentation von 11 α, I7<x-Dioxyprogesteron

Man arbeitet gleich wie im Beispiel 2 unter Ver- -₀ Wendung von Penicillium thomii (ATCC Nr. 10 506) und na, I7a-Dioxyprogesteron und erhält 4-Androsten-ii 01-0I-3, 17-dion.

Beispiel 12
Fermentation von Pregnan-3, 6, 20-trion

Man arbeitet wie im Beispiel 2 unter Verwendung von Penicillium novae zeelandiae (ATCC Nr. 10473) und Pregnan-3, 6, 20-trion und erhält Testan-3,6,17-trion. Testan-3,6,17-trion gibt beim Bromieren 4-Bromtestan-3, 6, 17-trion, das durch Bromwasserstoffabspaltung in das 4-Androsten-3, 6, 17-trion mit oestrogener Wirkung übergeht (Butenandt, Ber. d. dtsch. ehem. Ges., Bd. 69, 1936, S. 1163).

Beispiel 13 Fermentation von 6 /J-Oxyprogesteron

In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man bei Verwendung von Penicillium citrinum (ATCC Nr. 10105) ^und 6/J-Oxyprogesteron das 4-Androsten-6/?-ol-3, 17-dion.

B e i s ρ i e 1 14

Fermentation von Pregnan-3, 20-dion

Man arbeitet gleich wie im Beispiel 2 unter Verwendung von Penicillium canescens (ATCC Nr. 10 419) und Pregnan-3,20-dion und erhält Testan-3, 17-dion, das durch Reduktion mit Natrium-Borhydrid in Testan-3 α (oder ß) -öl übergeht, das anästhetische Wirkung besitzt.

Beispiel 15 Beispiel 16

Beispiel 17 Fermentation von Cortison

Fermentation von Allopregnan-3, 11, 20-trion

Man arbeitet wie im Beispiel 1 unter Verwendung von Penicillium lilacinum thorn und AlIopregnan-3, ^τι> 20-trion und erhält Androstan-3, 11, 17-trion (männliche Hormonwirksamkeit).

Fermentation von Reichsteins Substanz'S (4-Pregnen-i7a, 2i-diol-4-3, 20-diotii)

Man arbeitet wie im Beispiel 1 unter Verwendung von Penicillium lilacinum (ATCC Nr. 10114) und Reichsteins Substanz S und erhält 4-Androsten-3, 17-dion und 4-Pregnen-i7<x, 20a, 21-triol-3-on.

In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man durch Einwirkung von Penicillium lilacinum (ATCC Nr. 10114) auf Cortison das 4-Androsten-3, 11, 17-trion (Adrenosteron).

Beispiel 18 Fermentation von Cortisonacetat

Man arbeitet gleich wie im Beispiel 1 und erhält durch Einwirkung von Penicillium lilacinum (ATCC Nr. 10114) auf Cortisonacetat 4-Androsten~3, 11, 17-trion.

B e i s ρ i e 1 19

Fermentation von 4-Pregnen-iia, 17a, 2i-triol-3, 20-dion

Man arbeitet wie im Beispiel 1 und erhält durch Einwirkung von Penicillium lilacinum (ATCC

580/487

U 3001 IVb/12 ο

Nr. ίο 114) ^urL<i 4-Pregmem.-11 a, 17a, 21-triol-3,20-dion das 4-Androstan-11 a-ol-3, 17-dion.

Beispiel 20
Fermentation von Pregnan-3 «. ^{1 x} «> 17 a-triol-20-on

Man arbeitet wie im Beispiel i und erhält durch Einwirkung von Penicillium lilacinum (ATCC Nr. ΙΟΓ14) auf Pregnan-3 α, 11 α, 17 a-triol-20-on das Testan-3a, 11 a-diol-17-on.

Beispiel 21

Fermentation von Pregnan-3, ^I2> 20-trion

Man arbeitet wie im Beispiel 1 und erhält durch Einwirkung von Penicillium lilacinum (ATCC Nr. 10 114) auf Pregnan-3, 12, 20-trion dasTestan-3, 12, 17-trion.

Claims (4)

1. Patentansprüche:

   i. Verfahren zur Herstellung von 17-Keto-

   testanen, 17-Ketoandrostanen und 20-Oxypregnanen durch Bebrütung von 20-Ketopregnanen oder -Allopregnanen mit der Kultur eines niederen Pilzes in einer Nährlösung unter aeroben Bedingungen unter Abtrennung des Reaktionsproduktes, insbesondere durch Extraktion, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bebrütung mit der Kultur eines Pilzes der Gattung Penicillium durchführt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Bebrütung angewandte Kulturlösung assimilierbaren, nicht dem Ausgangssteroid entstammenden Kohlenstoff, insbesondere in Form von Kohlehydraten, sowie außerdem assimilierbaren Stickstoff und Phosphor enthält und die Kultur bewegt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch' gekennzeichnet, daß man ein in 4-Stellung ungesättigtes 20-Ketopregnan oder 3, 20-Diketopregnan, insbesondere Progesteron, ii-Desoxycorticosteron oder dessen 21-Acylate, sowie I4a-Oxyprogesteron, ein Allopregnan-3, 11, 20-trion oder ein 20-Ketopregnan, insbesondere Pregnan-3, 20-dion oder Pregnan-3, 6, 17-trion, als Ausgangsverbindungen verwendet.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bebrütung mit einer Kultur von Penicillium lilacinum, Penicillium canescens oder Penicillium novae zeelandiae durchführt.