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BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 30. September 1954 Beikannitgieniacht am 6. September 1956

DEUTSCHES PATENTAMT

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zum fermentativen Abbau der 17-ständigen Seitenkette von in 20-Stellung Sauerstoff enthaltenden Steroiden der Pregnanreihe, insbesondere von 20-Ketopregnanen oder -allopregnanen, unter Bildung von 17-Ketotestanen (normale Konfiguration) und 17-Ketoandrostanen (allo-Konfiguration).

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß man ein in 20-Stellung Sauerstoff tragendes Pregnan oder Allopregnan, insbesondere ein 20-Ketopregnan oder -allopregnan mit einem Pilz der Gattung Gliocladium in ein 17-Ketotestan oder 17-Ketoandrostan überführt.

Der Abbau der 17-ständigen Seitenkette von Steroid zu 17-Ketosteroiden, insbesondere zu 17-Ketoandrostanen und 17-Ketotestanen mit chemischen Mitteln ist zwar bekannt, doch erfordert dieses Verfahren in der Regel eine Anzahl von Maßnahmen, wie die Bildung einer I7(2o)-ständigen Doppelbindung und die Oxydation dieser Doppelbindung. Bei diesem

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oxydativen Abbau wird der Steroidkern oft in anderen Stellungen angegriffen, insbesondere an Doppelbindungen, was zu großen Verlusten führt. Um diese Verluste zu vermeiden, schützt man solche Stellen 5 oder Gruppen, wozu mindestens zwei zusätzliche Schritte erforderlich sind. So zeigen z. B. Bergmann und Stevens (vgl. Journ. Org. Chem., Bd. 13, 1948, S. 10) die Ozonolyse des 22-Enolacetats des 5,7-Bisnarcholadien-3/?-ol-22-al-3-acetats, . das durch eine 5,8-ständige Maleinsäureanhydridadduktgruppe geschützt ist, zum Maleinsäureanhydridaddukt des 5,7-Androstadien-3_J8-ol-i7-on-3-acetat.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren 17-Ketoandrostane und 17-Ketotestane sind in der Therapie oder als Zwischenprodukt für die Synthese therapeutisch wertvoller Produkte von Nutzen. So ergibt z. B. Progesteron unter der Einwirkung von Gliocladium catenulatum 4-Androsten-3, 17-dion, das bekannte androgene Eigenschaften besitzt, und auch das bekannte 4-Androsten-6/3-ol-3, 17-dion (Balant und Ehrenstein, Journ. Org. Chem., Bd. 17, 1952, S. 1587). Das erhaltene 4-Androsten-3, 17-dion kann nach dem Verfahren der USA.-Patentschrift 2 288 854 in Testosteron und letzteres durch Hydrierung in das therapeutisch verwendbare Dihydrotestosteron (Symposium on Steroids in Experimental and Clinical Practics, The Blakiston Company, New York, 1951, S. 375) übergeführt werden. Das andere Fermentationsprodukt, 4-Androsten-6/3-ol-3, 17-dion, kann mit Chromsäure zu 4"Androsten-3, 6, 17-trion oxydiert werden, das östrogene Wirkung besitzt (Butenandt, Ber. der dtsch. ehem. Ges., Bd. 69, 1936, S. 1163). In analoger Weise kann man andere physiologisch und pharmakologisch aktive 17-Ketotestane und -androstane oder Zwischenprodukte zu deren Synthese erhalten, indem man die Ausgangspregnane bzw. -allopregnane dem erfindungsgemäßen Fermentierungsprözeß unterwirft. Beispielsweise erhält man Androstan-3, 11, 17-trion (männliche Hormonwirkung) durch Fermentation von AlIopregnan-3, 11, 20-trion; Testan-3, 11, 17-trion (allgemeine anästhetische Wirkung) aus Pregnan-3, 11, 20-trion; Testan-3a- (oder ß)- ol-17-on (anästhetische Wirkung) durch Fermentation von Pregnan-3a- (oder ß) -ol-20-on oder aus Pregnan-3, 20-dion durch Seitenkettenfermentation gemäß der Erfindung und anschließende Reduktion mit Natriumborhydrid oder Lithium-Aluminiumhydrid ; Testan-3, 6, 17-trion (das zu 4-Bromtestan-3, 6, 17-trion bromiert und durch Bromwasserstoffabspaltung in das 4-Androsten-3, 6, 17-trion mit östrogener Wirkung übergeführt werden kann) aus Pregnan-3, 6, 20-trion durch Seitenkettenfermentation oder Adrehosteron durch Fermentation von ii-Ketoprogesteron, Cortison oder Cortisonacetat.

Als Ausgangsverbindungen für das erfindungsgemäße Verfahren werden die in 20-Stellung Sauerstoff enthaltenden Pregnane und vorzugsweise die 20-Oxy- ;, und 20-Ketopregnane verwendet. Der Cyclopentanopolyhydrophenanthrenrest mit einer i7/?-ständigen Seitenkette kann Keto- oder Hydroxylgruppen in anderen Stellungen besitzen, speziell in 3-, 6-, 7-, 8-, 11-, 12-, 14-, 17- und 21-Stellung, und kann Doppelbindungen in verschiedenen Stellungen, insbesondere in 4- und 5-Stellung aufweisen. Beispiele für solche Ausgangsstoffe sind: Pregnan-3a- (oder ß) -ol-20-on-, 5-Pregnen- (3a- (oder ß) -ol-20-on, Pregnan^a- (oder ^)-ol-ii, 20-dion, Pregnan-3a.ua- oder 3a-, ττβ~; 3ß, na-; oder 3/?-, ii^-diol-20-on, Progesteron, ii-Ketoprogesteron, iia-Oxyprogesteron, na-Acetoxyprogesteron, ii/S-Oxyprogesteron, ^a-Oxyprogesteron, 4-Pregnen-i4a, 17a, 2i-triol-3, 20-dion, 4-Pregnen-14a, 17a, 2i-triol-3, 2O-dion-2i-acetat, na, I7a-Dioxyprogesteron, ^a-Oxy-n-ketoprogesteron, Allopregnan-3/?, 17a, 20-triol (»Reichsteins Verbindung O«); 4-Pregnen-i7a, 2o-diol-3, 20-dion, (»Reichsteins Verbindung S«), Corticosteron, Cortison, Cortisonacetat, Dihydrocortison (»Kendalls Verbindung Fx) und 4-Pregnen-iia, 17a, 2i-triol-3, 20-dion (EpiVerbindung), . Pregnan-3, ^τι> 20-trion, Pregnani7a-ol-3, 11, 20-trion, Pregnan-3, ¹^, 20-trion, Pregnan-3, 20-dion, Pregnan-i7a-ol-3, 20-dion, Allopregnan-3, 11, 20-trion, Allopregnan-3, 20-dion, 5-Pregnen-3a-ol-2O-on, Allopregnan-3a- (oder ß) -ol-20-on, Pregnan-3a, 12a, 2i-triol-2o-on, Pregnan-3a, I7a-diol-20-on, 6a- und 6/3-Oxyprogesteron, Pregnan-3, 6, 20-trion, 21-Methylprogesteron, 21-Äthylprogesteron, 2O-Methylallopregnan-3/3, 20-diol; 2O-Methyl-5-pregnen-3/?, 20-diol, 2O-Methyl-5-pregnen-3^, 20, 21-triol, 2i-Äthyl-5-pregnen-3(S-ol-2O-on oder i7/3-(i, 2, 3-Trioxypropyl)-androstan^/?, I7a-diol.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das gewählte 20-Ketopregnan, zweckmäßigerweise in einem Lösungsmittel, der Einwirkung einer Pilzart der Gattung Gliocladium ausgesetzt. Die Gattung Gliocladium gehört zur Familie der Aspergillaceen der Ordnung Plectascineen von der Klasse der Ascomyceten. Die hier verwendete Klassifizierung und Definition des Gliocladiums entspricht derjenigen von K. B. Raper und C. Thorn »Α Manual of the Penicillia«·, Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1949. Unter den Species der Gattung Gliocladium, die sich für die Fermentation von Steroiden eignen, kann, man die Gliocladium-roseum-Reihe erwähnen, wie Gliocladium roseum, Gliocladium penicilloides, Gliocladium vermoesceni (ATCC 10522); die Gliocladiumcatenulatum-Reihe, wie Gliocladium catenulatum, Gliocladium fimbriatum; die Gliocladium-deliquescens-Reihe, wie Gliocladium deliquescens (ATCC 10097), Gliocladium nigro-virescens (C.B.S. von Beijma, Holland); Gliocladium luteolum, Gliocladium flavum, Gliocladium cibotii und Gliocladium viride. Besonders bevorzugt für die Durchführung der vorliegenden Erfindung werden von diesen Species Gliocladium catenulatum (ATCC 10523), Gliocladium roseum (ATCC 10521), Gliocladium deliquescens (Centraalbureau voor Schimmelcultur, Baarn, Holland) und Gliocladium luteolum (Centraalbureau voor Schimmelcultur, Baarn, Holland).

Die Kultur der Pilze für die Zwecke der vorliegenden Erfindung erfolgt in oder auf einem für deren Entwicklung günstigen Nährboden. Man kann feste Nährböden verwenden, doch sind die bevorzugten solche, die ein Massenwachstum unter aeroben Bedingungen gestatten. Feuchte, feste, kleinteilige Nährböden, wie Kleie, Cerealienkörner, Cerealiengrieß, Holzschnitzel, Späne, Sägemehl, Maishülsen, Faserstoffe, wie Kopra,

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Kastanien oder Lupinensamen, können verwendet werden. Man kann sie mit Alkohol, Äther oder anderen organischen Lösungsmitteln extrahieren, um vor der Fermentation unerwünschte Verunreinigungen und wachstumshemmende Stoffe zu entfernen.

Die Träger können gewünschtenfalls zugesetzte Wachstumsfaktoren und Nährstoffe enthalten und können in Schichten oder Schalen mit oder ohne Hilfsbelüftung, in Türmen, wie bei der Essigherstellung,

ίο oder unter Bewegung, z. B. in einer rotierenden Trommel, verwendet werden. Flüssige Medien, wie z. B. Bierwürze, eignen sich gut für aerobe Schichten und noch besser für aerobe submerse Fermentationsbedingungen. Zweckmäßigerweise sollten die Nähr- boden Stoffe enthalten, die Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralien zur Verfügung stellen, obschon natürlich auch unter weniger als optimalen Bedingungen ein beträchtliches Wachstum auftreten kann.

Verfügbarer Kohlenstoff kann aus Kohlehydraten, Stärken, gelatinisierten Stärken, Dextrin, Zuckern, Melassen von Rohr-, Rüben- und Sorghumzucker, Glukose, Fructose, Mannose, Galactose, Maltose, Sucrose, Lactose, Pentosen, Aminosäuren, Peptonen oder Proteinen stammen. Kohlensäure, Glycerin, Alkohole, Essigsäure, Natriumacetat, Citronensäure, Natriumeitrat, niedere Fettsäuren, höhere Fettsäuren oder Fette sind Beispiele für andere Materialien, die assimilierbaren Kohlenstoff für den Energiebedarf der Pilze liefern können. Manchmal sind Mischungen von verschiedenen Kohlenstoffquellen von Vorteil.

Assimilierbarer Stickstoff kann von löslichen oder unlöslichen pflanzlichen oder tierischen Proteinen, Sojamehl, Lactalbumin, Casein, Eialbumin, Peptonen, Polypeptiden oder Aminosäuren, Harnstoff, Ammonsalzen, an Basenaustauschharze oder Zeolite gebundenem Ammoniak, Ammoniumchlorid, Natriumnitrat, Kaliumnitrat oder Morpholin stammen; Molke, lösliche Rückstände der Brennereien, Maiseinweichwasser oder Hefeextrakt haben sich auch als sehr geeignet erwiesen.

Als mineralische Bestandteile der Nährböden können von Natur aus vorhandene oder zugesetzte Substanzen dienen, die Aluminium, Calcium, Chrom, Kobalt, Kupfer, Gallium, Eisen, Magnesium, Molybdän, Kalium, Scandium, Uran und Vanadium liefern. Schwefel kann durch Sulfate, Alkylsulfonate, SuIfoxylate, Sulfamate, Sulfinate, freien Schwefel, Hyposulfite, Persulfat, Thiosulfat, Methionin, Cystin, Cystein, Thiamin oder Biotin geliefert werden. Phosphor, vorzugsweise in fünfwertiger Form, zweckmäßig in Konzentrationen von etwa 0,001 bis 0,07 molar und vorzugsweise von etwa 0,015 bis 0,02 molar, kann als Ortho-, Meta- oder Pyrophosphatsalze oder -ester, Phytin, Phytinsäure, Phytate, Glycerophosphate, Natriumnucleinate und/oder Maiseinweichwasser, Casein oder Ovovitellin zugegen sein. Es ist erwünscht, Bor, Jod und Selen in Spuren zugegen zu haben. Das Bor wird vorzugsweise in Form von Borsäure oder Natriumborat zugesetzt, insbesondere nach der Keimung und während des ersten Wachstums des Pilzes. Je nach Bedarf oder Wunsch kann man noch weitere zusätzliche Wachstumsfaktoren, Vitamine, Auxine und Wachstumsstimulantien vorsehen.

Obgleich man feste wie flüssige Nährböden verwenden kann, wird ein flüssiges Medium bevorzugt, da es das Mycelwachstum begünstigt.

Zur Erleichterung der Fermentation, Belüftung und Filtration kann man Suspendiermittel oder Mycelträger, wie Filtererden, Filterhilfsmittel, feinzerteilte Cellulose, Holzschnitzel, Bentonit, Calciumcarbonat, Magnesiumcarbonat, Kohle, Aktivkohle oder andere suspendierbare feste Stoffe, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Alginate zusetzen.

Die gewählte Pilzgattung wird auf einem Nährboden gezogen, der zweckmäßigerweise assimilierbaren Kohlenstoff nicht steroider Herkunft, z. B. Kohlehydrate, wie Zucker, Stärken, assimilierbaren Stickstoff, z. B. lösliche oder unlösliche Proteine, Peptone oder Aminosäuren und mineralische Bestandteile, beispielsweise Phosphate und Magnesiumsulfat, sowie andere bekannte erwünschte Zusätze enthält. Der Nährboden kann zweckmäßig ein p_H von etwa 4 bis 7 vor der Beimpfung besitzen. Für die Kultur von Gliocladium wird ein p_H zwischen etwa 5 und 6 bevorzugt.

Die Beimpf ung des Kulturmediums mit dem gewählten Pilz der Gattung Gliocladium kann in jeder geeigneten Weise durchgeführt werden. Gliocladium entwickelt sich in einem Temperaturbereich von etwa 20 bis 38⁰, wobei Temperaturen von etwa 25 bis 35° bevorzugt werden. _go

Die Entwicklungsperiode des Pilzwachstums vor dem Zusatz des zu fermentierenden Steroids scheint nicht kritisch zu sein. So kann man beispielsweise das Steroid vor der Sterilisation, die durch Wärmeeinwirkung oder auf anderem Wege erfolgen kann, dem Medium zusetzen, oder im Moment, wo das Medium geimpft wird, oder auch einige Zeit, z. B. 24 oder 48 Stunden, später. Das zu fermentierende Steroid kann in jeder geeigneten Konzentration zugesetzt werden, doch ist aus praktischen Gründen eine Konzentration des Steroidsubstrats von etwa oder bis zu 0,6 g/l oder sogar 0,8 g/l Nährboden befriedigend und 2 g/l sind anwendbar, obschon auch höhere Konzentrationen, je nach dem speziellen Steroid zulässig sind, wenn man eine gewisse Hinderung der Entwicklung des Myceliums in Kauf nehmen will. Der Zusatz des zu fermentierenden Steroidsubstrats kann in irgendeiner beliebigen Weise erfolgen, und zwar insbesondere derart, daß zwischen Steroidsubstrat und Pilz eine möglichst große Berührungsfläche entsteht. Dazu kann man das Steroidsubstrat entweder allein mit einem Dispergiermittel oder in einem organischen Lösungsmittel, gelöst im Pilzmedium, dispergieren oder suspendieren. Man kann sowohl eineOberflächen- als auch eine submerse Kultur anwenden, doch wird letztere bevorzugt. Man kann auch die bei der Kultur des Pilzes gebildeten fermentierenden Enzyme vom Pilz oder vom Nährmedium abtrennen, mit dem Steroid oder einer Lösung oder Dispersion desselbsn vermischen und die Mischung aeroben Bedingungen aussetzen, um die Fermentation des Steroids zu bewirken.

Die Temperatur während der Fermentation des Steroids kann die gleiche sein wie sie sich für die Pilzkultur als geeignet erwies. Sie muß nur in einem solchen Bereich gehalten werden, daß das Leben, das

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aktive Wachstum oder die Enzymaktivität des Pilzes erhalten bleiben.

Obgleich jede Form der aeroben Bebrütung für das Wachstum des gewählten Pilzes und die Fermentation des Steroidsubstrats geeignet ist, ist der Wirkungsgrad der Steroidfermentation abhängig von der Belüftung. Deshalb wird die Belüftung in der Regel kontrolliert, sei es durch Schütteln und/oder Einblasen von Luft in das Fermentationsmedium. Die Belüftung kann durch Oberflächenkultur oder unter submersen Fermentationsbedingungen erfolgen. Aerobe Bedingungen umfassen nicht nur die Verwendung von Luft, zwecks Einführung von Sauerstoff, sondern auch andere Quellen oder Mischungen, die Sauerstoff in freier oder freisetzbarer Form enthalten. Bei Verwendung von Luft als Belüftungsmedium ergibt sich als geeigneter Belüftungsgrad etwa 4 bis 20 Millimol und vorzugsweise etwa 6 Millimol Sauerstoff je Stunde je Liter, bestimmt nach der Methode von Cooper, Fernstrom und Miller (vgl. Ind. Eng. Chem., Bd. 36 [1944], S. 504). Die Belüftung kann durch Anwendung von Über- oder Unterdruck, ζ. B. o,7 bis 2,1 kg/cm² abs. eingestellt werden. Die Sauerstoffaufnahme kann durch Anwesenheit verschiedener Stoff e,wie Ascorbinsäure, Glutaminsäure, Citronensäure, Milchsäure, Tyrosin oder Tryptophan erleichtert werden.

Die für die Fermentierung des Steroids erforderliche Zeit wechselt je nach der Arbeitsweise etwas. Wenn das Steroidsubstrat bei der Beimpfung des Nährbodens vorhanden ist, kann sie 8 bis 72 Stunden dauern. Setzt man jedoch das Steroid dem Pilz zu, nachdem er bereits wesentlich gewachsen ist, z. B. nach 16 bis 24 Stunden bei der günstigsten Temperatur, so beginnt die Umwandlung des Steroidsubstrats sogleich, und man erhält im Laufe von 1 bis 72 Stunden hohe Ausbeuten. In der Regel ist das Ergebnis nach 24 Stunden befriedigend.

Nach Beendigung der Steroidfermentation wird das erhaltene fermentierte Steroid aus dem Reaktionsgemisch isoliert. Eine besonders günstige Isolierungsmethode besteht in der Extraktion des Fermentationsgemisches einschließlich des Mycels mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für das Steroid, wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenchlorid, Trichloräthylen, Äther, Amylacetat oder Benzol. Man kann die Fermentationsflüssigkeit vom Mycelium trennen und einzeln mit geeigneten Lösungsmitteln extrahieren. Die Mycelien können entweder mit wassermischbaren oder wasserunmischbaren Lösungsmitteln extrahiert werden, wobei sich Aceton als wirksam erwiesen hat. Die vom Mycelium befreite Fermentationsfiüssigkeit kann mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden. Man kann die Extrakte entweder vor oder nach dem Waschen mit alkalischen Lösungen, beispielsweise Natriumbicarbonat. vereinigen, in geeigneter Weise, z. B. über wasserfreiem Natriumsulfat, trocknen und durch Umkristallisieren aus organischen Lösungsmitteln oder Chromatographie das erhaltene gereinigte 17-Ketosteroid von den anderen Fermentierungsprodukten trennen.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.

Beispiel 1

Fermentation von Progesteron und Isolierung von 4-Androsten-3, 17-dion und 4-Androsten-6/?-ol-3, 17-dion.

Man stellt einen Nährboden her, der 20 g enzymatisch verdautes Lactalbumin (Edamine), 3 g Maiseinweichwasser und 50 g technische Dextrose mit Leitungswasser auf 1 1 verdünnt enthält, und stellt das p_H auf 5, 85 ein. 12 1 dieses sterilisierten Nährbodens werden mit Gliocladium catenulatum (ATCC 10 523) geimpft und 48 Stunden bei 26⁰ bebrütet, wobei man derart belüftet und rührt, daß die Sauerstoff aufnahme 6,3 bis 7 Millimol je Stunde und Liter Na₃SO₃ (bestimmt nach der Methode von Cooper, Fernstrom und Miller, Ind. Eng. Chem., Bd. 36 [1944], S. 504) beträgt. In diesem Nährboden, der eine 48stündige Zucht von Gliocladium catenulatum enthält, suspendiert man eine Lösung aus 3 g Progesteron in 50 cm³ Aceton. Nach weiterer 24stündiger Bebrütung unter den gleichen Temperatur- und Belüftungsbedingungen werden Flüssigkeit und Mycelium getrennt. Das Mycelium wird abfütriert, zwei- mal mit je etwa seinem Volumen Aceton gewaschen und dann zweimal mit je seinem Volumen Methylenchlorid extrahiert. Die Aceton- und Methylenchloridextrakte enthaltenden Lösungsmittel werden dem Filtrat zugesetzt. Dann extrahiert man die Lösung zweimal mit je ihrem halben Volumen Methylenchlorid und dann zweimal mit je einem Viertel ihres ' ■ Volumens Methylenchlorid. Die vereinigten Methylenchloridextrakte werden zweimal mit je ¹Z₁₀ ihres Volumens 2°/_oiger wäßriger Natriumbikarbonatlösung und hernach zweimal mit je ¹Z₁₀ ihres Volumens Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen des Methylenchloridextraktes über etwa 3 bis 5 g wasserfreiem Natriumsulfat je Liter Lösungsmittel und Filtrieren wird das Lösungsmittel abdestilliert. Der so erhaltene Rückstand wiegt 8 g und wird wieder gelöst und über 150 g Tonerde chromatographiert, wobei man je 300 cm³ Lösungsmittel, wie in Tabelle I angegeben, verwendet.

Tabelle I

Fraktion	Lösungsmittel	-Äther 19:1	....	Festes Eluat mg
I	Benzol .	-Äther 19:1	....	2S7
2	Benzol .	- Äther 9:1		O I 48
3	Benzol —	- Äther 9:1		144
4	Benzol —	- Äther ι: 1	....	67
5	Benzol —	- Äther ι: 1		0
6	Benzol —			53
7	Benzol —		19:1	175
8	Benzol —	Chloroform	19:1	993
Q	Äther ..	Chloroform	9:1	I7Q4
y IO	Äther ..	Chloroform	9:1	/ y\ 712
II	Äther —	Chloroform	1:1	/ 268
12	Äther —	Chloroform	1:1	I3I
13	Äther —	Chloroform	67 ,
14	Äther —		56
15	Äther —		73
l6	Äther —		73

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Fraktion	Lösungsmittel	Festes Eluat mg
17 i8 19 20 21 22 23 24 25 26	Äther — Chloroform 1:1 Äther — Chloroform 1:1 Chloroform	49 22 IO 2 3 2 4 16 103 9
Chloroform
Chloroform
Chloroform
Chloroform—aceton 19:1 . Aceton
Methanol
Methanol

Die Fraktion 7 wird eingedampft und die so erhaltenen Kristalle zweimal aus 1 cm³ Methanol umkristallisiert, wobei man 102 mg 4-Androsten-3, 17-dion erhält, F. = 160 bis 171⁰.

Analyse für C₁₉H₂₀O₂:

Berechnet: C 79,68; H 9,15;
. gefunden: C 79,53; H 8,84.

Die Fraktionen 8 und 9 (254,9 ^mS) werden nochmals über 12 g Tonerde chromatographiert, wobei man je 25 cm³ Lösungsmittelportionen, wie in Tabelle II angegeben, verwendet.

Tabelle II

Fraktion	Lösungsmittel	Festes Eluat
		mg
I	Benzol — Äther 1:1	0,0
2	Benzol — Äther 1:1	50,8
3	Äther	124 7
4	Äther	17 6
5	Äther — Chloroform 9:1..	3,2
6	Äther —■■ Chloroform 9:1..	0,7
7 — 18	Äther-Chloroform-
	Mischungen
	Chloroform; Aceton ....	o,5
!9	Methanol	3,4

Die Fraktionen 2, 3 und 4 werden eingedampft, und man erhält 193,1 mg Kristalle, deren Infrarotspektrum und papierchromatographische Untersuchung anzeigen, daß sie 4-Androsten-6/3-ol-3, 17-dion enthalten. Zur Isolierung des 4-Androsten-6/?-ol-3, 17-dions werden die vereinigten Fraktionen 2 bis 4 in 5 cm³ Aceton gelöst, filtriert und auf 2 cm³ eingeengt. Nach Zugabe von 3 cm³ Hexanen (bekannt unter der Handelsbezeichnung »Skellysolve B«) gewinnt man 38 mg Kristalle (A) vom F. = 184 bis 290°. Die zweite Kristallfraktion (B), 50 mg, und eine dritte Kristallfraktion (C), werden aus den Mutterlaugen durch Kühlen über Nacht erhalten. Die Kristalle (B) und (C) werden vereinigt, in 4 cm³ Äthylacetat gelöst, filtriert und auf ΐ cm³ eingeengt.

Nach Zusatz von 2,5 cm³ »Skellysolve B« und Kühlen über Nacht erhält man 42,8 mg Kristalle (D) vom F. = 176 bis 185⁰. Dieses Produkt (D) wird wie oben aus Äthylacetat und »Skellysolve B«· umkristallisiert, wobei 30,4 mg Kristalle (E) anfallen;

F. = 186 bis i88°. Die 38 mg Kristalle (A) und die 30,4 mg Kristalle (E) werden in 4 cm³ Äthylacetat gelöst, vereinigt und auf 1 cm³ eingeengt. Nach Zugabe von fünf Tropfen »Skellysolve B« bilden sich Kristalle. Nach 45 Minuten bei Zimmertemperatur und anschließender Filtration erhält man 43,6 mg 4-Androsten-6/3-ol-3, 17-dion.

Analyse für C₁₉ H₂₀ O₃:

Berechnet: C 75,46; H 8,67;
gefunden: C 75,39; H 8,47.

Beispiel 2

Fermentation von ii-Desoxycorticosteron. Ausgehend von Gliocladium catenulatum (ATCC 10523) und ii-Desoxycorticosteron erhält man in gleicher Weise wie im Beispiel 1 das 4-Androsten-3, 17-dion und 4-Androsten-6/?-ol-3, 17-dion.

Beispiel 3

In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man unter Verwendung von Gliocladium roseum (ATCC 10 521) und n-Desoxycorticosteronacetat 4-Androsten-3, 17-dion und 4-Androsten-6/?-ol-3, 17-dion. In gleicher Weise ergeben auch andere Ester des ii-Desoxycorticosterons, wie das Propionat, Butyrat, Isobutyrat, Valerat, Hexaonat, Benzoat und Phenylacetat 4-Androsten-3, 17-dion und 4-Androsten-6/?-ol-3, 17-dion, , wenn man sie mit einem Pilz der Gattung Gliocladium behandelt.

Beispiel 4

Fermentation von n-Desoxycorticosteronacetat. In gleicher Weise wie im Beispiel 1 angegeben erhält man unter Verwendung von Gliocladium deliquescens (Centraalbureau voor Schimmelcultur, Baarn, Holland) und 11-Desoxycorticosteronacetat 4-Androsten-3, 17-dion und 4-Androsten-6/?-ol-3, 17-dion.

In gleicher Weise geben andere Ester, wie das Propionat, Butyrat, Isobutyrat, Valerat, Hexanoät, Benzoat und Phenylacetat, 4-Androsten-3,17-dion und 4-Androsten-6/9-ol-3, 17-dion, wenn man sie mit Gliocladium deliquescens behandelt.

Beispiel 5

Fermentation von ii-Desoxycorticosteronacetat. In gleicher Weise wie im Beispiel 1 angegeben erhält man unter Verwendung von Gliocladium luteolum (Centraalbureau voor Schimmelcultur, Baarn, Holland) und 11-Desoxycorticosteronpropionat das 4-Androsten-3, 17-dion und 4-Androsten-6ß-ol-3, 17-dion. In gleicher Weise ergeben andere Ester des Ii-Desoxycorticosterons, z. B. das Acetat, Butyrat, Isobutyrat, Valeriat, Hexanoät, Benzoat und Phenylacetat bei Behandlung mit Gliocladium luteolum 4-Androsten-3, 17-dion und 4-Androsten-6jS-ol-3, 17-dion.

Beispiel 6

Fermentation von 11-Ketoprogesteron. In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man unter Verwendung

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von Gliocladium catenulatum (ATCC io 5²3) ^un(i ii-Ketoprogesteron das 4-Androsten-3, ii, 17-trion (Adrenosteron).

Beispiel 7

Fermentation von 21-Methylprogesteron. In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man unter Verwendung von Gliocladium catenulatum (ATCC 10 523) und 21-Methylprogesteron das 4-Androstan-3, 17-dion. 10

Beispiel 8

Fermentation von »Reichsteins Substanz O« (AlIopregnan-3/3,. 17a, 20-triol). In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man unter Verwendung von Gliocladium roseum (ATCC 10 521) und Allopregnan-3/?, 17a, 20-triol das Androstan-3-ol-i7"On.

Beispiel 9

Fermentation von 2O-Methyl-5-pregnen-3/?, 20-diol. In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man mit Gliocladium catenulatum (ATCC 10 523) und 20-Methyl"5-pregnen-3/3,20-diol dasS-Androsten^/J-ol-^-on.

Beispiel 10

Fermentation von Pregnan-3, 6, 20-trion. In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man mit Gliocladium catenulatum (ATCC 10 523) und Pregnan-3, 6, 20-trion das Testan-3, 6» 17-trion.

Beispiel 11

Fermentation von 6/?-Oxyprogesteron. In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man mit Gliocladium catenulatum (ATCC 10 523) und 6/?-Oxyprogesteron das 4"Androsten-6/S-ol-3, 17-dion.

Beispiel 12

Fermentation von Pregnan-3, 20-dion. In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man mit Gliocladium catenulatum (ATCC 10 523) und Pregnan-3, 20-dion das Testan-3, 17-dion.

Beispiel 13

Fermentation von Allopregnan-3, ^ττ> 20-trion. In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man mit Gliocladium catenulatum (ATCC 10 523) und Allopregnen-3, 11, 20-trion das Androstan-3, 11, 17-trion.

Beispiel 14

Fermentation von »Reichsteins Substanz S« (4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, 20-dion). In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man mit Gliocladium catenulatum (ATCC 10 523) und »Reichsteins Verbindung S« das 4-Androsten-3, 17-dion und 4-Androsten-6/?-ol-3, 20-dion.

Beispiel 15

Fermentation von Cortison. In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man mit Gliocladium catenulatum (ATCC 10 523) und Cortison das 4-Androsten-3, 11, 17-trion (Adrenosteron).

Beispiel 16

Fermentation von Cortisonacetat. In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man mit Gliocladium catenulatum (ATCC 10 523) und Cortisonacetat das 4-Androsten-3, 11, 17-trion.

Beispiel 17

Fermentation von 4-Pregnen-iia, 17a, 2i-trio!-3, 20-trion. In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man mit Gliocladium catinulatum (ATCC 10 523) und 4-Pregnen-iia, 17a, 2i-triol-3, 20-dion das 4-Androsten-iia-ol-3, 17-dion.

Beispiel 18

Fermentation von 2i-Äthyl-5-pregnen-3/?-ol-2O-on. In gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhält man mit Gliocladium catenulatum (ATCC 10 523) und 21-Äthyl-5-pregnen-3(3-ol-2O-on das 5-Androsten-3/?-ol-17-on.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von 17-Ketotestanen und 17-Ketoandrostanen aus den entsprechenden 20-Oxy- oder 20-Ketopregnanen oder -allopregnanen durch Abbau der 17-ständigen Seitenkette, dadurch gekennzeichnet, daß man den Seitenkettenabbau auf biochemischem Wege durch Bebrütung mit der Kultur eines Pilzes der Gattung Gliocladium in einer Nährlösung unter aeroben Bedingungen durchführt und das Reaktionsprodukt in bekannter Weise, insbesondere durch Extraktion, abtrennt. ■

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährlösung assimilierbaren, nicht dem Ausgangssteroid entstammenden Kohlenstoff sowie außerdem assimilierbaren Stickstoff und Phosphor enthält und während der Bebrütung bewegt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bebrütung unter submersen Bedingungen durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein in 4-Stellung ungesättigtes 3-Ketopregnan oder 3, 20-Diketopregnan, insbesondere Progesteron, 11-Desoxycorticosteron oder dessen 21-Acylate, ferner 20-Keto- oder 20-Oxy-allopregnane, insbesondere Allopregnan-3, 11, 17-trion, ~ als Ausgangsverbindungen verwendet.