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Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur gleichzeitigen Immunisierung
von Hunden oder Füchsen gegen die Staupe und Hepatitis contagiosa canis Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines kombinierten Impfstoffes zur Immunisierung
von Hunden oder Füchsen gegen Staupe und Hepatitis contagiosa canis (H.c.c.). Die
Staupe und die H.c.c. sind zwei gefährliche und weitverbreitete Viruserkrankungen
der Hunde. An Staupe erkranken außerdem noch Füchse und Pelztiere der Marderfamilie
(Mustelliden). Das H.c.c.-Virus ist außer für Hunde auch für Füchse (Fuchsencephalitis)
pathogen.
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Man kann Hunde und andere empfängliche Tiere erfolgreich gegen die
Staupe immunisieren. Die zur Zeit geübten Immunisierungsverfahren beruhen auf der
Verabreichung eines Impfstoffes, der ein lebendes, eiadaptiertes, apathogenes Virus
enthält. Daneben wird auch noch die simultane Verabreichung eines pathogenen Virus
in Verbindung mit Immunserum und die Verimpfung eines Impfstoffes mit inaktiviertem
Virus angewendet. Durch die Verwendung obiger Impfstoffe wurde die Hundestaupe wirksam
bekämpft. Diese Impfungen gewähren jedoch keinen Schutz gegen die H.c.c.
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Aus der schweizerischen Patentschrift 200 180 und der USA.-Patentschrift
2 173 440 ist zwar bekannt, daß man Mischvaccinen herstellen kann, indem man Vaccinen,
die verschiedene abgetötete Bakterien bzw. hefeähnliche Pilze enthalten, miteinander
vermischt.
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In der deutschen Auslegeschrift 1 027 367 wird eine Mischvaccine
zur gleichzeitigen Immunisierung von Hunden gegen infektiöse Hepatitis und Staupe
beschrieben, die lebendeH.c.c.-Viren und lebende Staupeviren enthält.
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Die Verwendung zweier lebender Viren gemäß der Auslegeschrift 1 027
367 in einer Vaccine kann nicht unbedenklich erfolgen. Das lebende, modifizierte,
an das Hühnerei adaptierte Staupevirus stellt eine echte Modifizierung dar, d. h.,
die Übertragung des eiadaptierten Staupevirus von Hund zu Hund und die damit verbundenen
Passagen führen zu keiner Rückmodifizierung und dadurch bedingten Wiedererlangung
der Pathogenität. Das lebende, durch Passagen auf Hundenieren oder anderen Hundegeweben
gezüchtete und dadurch apathogen gewordene H.c.c.-Virus stellt dagegen keine echte
Modifizierung dar. Es kann bei ueber tragung auf gesunde, empfängliche Hunde eine
Rückmodifizierung erfahren und wieder pathogen werden.
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Bekanntlich wird das H.c.c.-Virus im Urin ausgeschieden und auf diesem
Wege von anderen Hunden aufgenommen, was zu einer stärkeren Verbreitung der H.c.c.
führt.
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Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur
gleichzeitigen Immunisierung von Hunden oder Füchsen gegen die Staupe und Hepatitis
contagiosa canis (H.c.c.) gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine
Vaccine zur gleichzeiti-
gen Immunisierung von Hunden oder Füchsen gegen die Staupe
und H.c.c. herstellen kann, indem man die zu einer Suspension aufgearbeiteten staupevirushaltigen
Teile des embryonierten Hühnereies mit einem mittels Formaldehyd inaktivierten H.c.c.-Virus,
das aus Hundelebern und/oder Hundemilzen durch Extraktion oder von der Gewebekultur
gewonnen wird und dessen virusschädigender Formaldehydanteil durch Zusatz einer
1,5- bis 2fachen stöchiometrischen Bisulfitlösung abgebunden wurde, mischt und gefriertrocknet.
Hierbei ist es vorteilhaft, wenn das H.c.c.-Antigen durch eineAluminiumhydroxydlösung
adsorbiert wird.
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Vorzugsweise geht man so vor, daß man ein Mischungsverhältnis von
einem Staupeanteil, der aus etwa 500/0 eines modifizierten, staupevirushaltigen
Chorioallantoismaterials, 400/0 Rinderbouillon vom pe 7,6 und 100/0 500/oiger Glukoselösung
besteht, mit einem annähernd gleich großen H.c.c.-Anteil, der aus etwa 750/0 eines
inaktivierten, H.c.c.-virushaltigen Extraktes und 250/0 einer 20/oigen Aluminiumhydroxydlösung
besteht, einhält.
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Die verfahrensgemäß erhaltene Staupe-H.c.c.-Vaccine (SH-Vaccine)
stellt eine Verbindung zwischen einem lebenden, eiadaptierten, apathogenen Staupevirus
und einem inaktivierten H.c.c.-Virus dar. Die Herstellung eines solchen Mischimpfstoffes
bringt verschiedene Vorteile mit sich. Im Vergleich zur Herstellung von zwei getrennten
Impfstoffzubereitungen wird verfahrensgemäß nach der Vermischung des Staupe- und
H.c.c.-Vaccineanteils der Material-, Arbeits- und Energieaufwand etwa auf die Hälfte
gesenkt.
Es ergibt sich insbesondere eine Einsparung an Abfüll-
und Verpackungsmaterial und eine wesentliche Minderung der Kosten für die Lyophilisation.
Außerdem stellt die Verabreichung nur einer Vaccine an Stelle von zweien eine Vereinfachung
und Verbilligung des Impfverfahrens dar.
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Der Staupe- und H.c.c.-Anteil der 5 H-Vaccine müssen erfindungsgemäß
in eine besondere Form gebracht werden, damit keine nachteilige Beeinflussung der
beiden Anteile entstehen kann. Namentlich das lebende Staupevirus ist sehr empfindlich
und wird durch chemische, thermische und anders geartete Einflüsse leicht geschädigt
und vernichtet. So würde beispielsweise der im H.c.c.-Vaccineanteil enthaltene Formaldehyd
bei seiner Vermischung mit dem Staupeanteil das modifizierte Staupevirus innerhalb
einer Stunde vernichten. Es ist gelungen, die virusschädigenden Eigenschaften, die
durch den Formaldehyd (CH2O) hervorgerufen werden, durch die Zugabe von Bisulfit
(NaH S O,) zu beseitigen. Dabei verfährt man z. B. in der Art, daß man zunächst
den freien und den gebundenen Formaldehyd quantitativ bestimmt. Hierauf wird der
freie Formaldehyd im H.c.c.-Virusanteil durch Zugabe von 150 bis 200 °/o der stöchiometrischen
Menge an Bisulfit, z. B. Natriumbisulfit, chemisch abgebunden nach der Gleichung
Nun vereinigt man den H.c.c.-Vaccineanteil mit dem Staupeimpfstoffanteil unter Eiskühlung,
füllt ab und lyophilisiert das Impfstoffgemisch.
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An 32 Hunden wurde die verfahrensgemäß erhaltene SH-Vaccine auf ihre
immunisierenden Eigenschaften sowohl gegen Staupe als auch gegen H.c.c. geprüft.
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Von den mit je einer Dosis von 2 ml des kombinierten Impfstoffes subkanten
vaccinierten Hunden widerstanden alle einer künstlichen Infektion mit aktivem Staupe-
und H.c.C.-Virus. Dagegen erkrankten alle der insgesamt 7 nicht geimpften Staupekontrollhunde
an dem für die Virusstaupe typischen Fieberverlauf.
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Ein Teil dieser Staupekontrollhunde wurde auf der Höhe des sogenannten
zweiten Fieberanstieges getötet.
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Dieser Fieberanstieg ist durch die Besiedelung und Vermehrung des
Virus in den Organen gekennzeichnet. Bei der Untersuchung der Organe in der Komplementbindungsreaktion
(KBR) wurde ein für die Staupe positives Ergebnis erhalten. Neun nicht vaccinierte
H.c.c.-Kontrollhunde erkrankten mehr oder weniger heftig an H.c.c., vier davon verendeten
nach einigen Tagen. In der KBR konnte ein Befall der Organe mit dem H.c.c.-Virus
nachgewiesen werden.
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Neben der Prüfung im Tierexperiment wird die erfindungsgemäße SH-Vaccine
auf ihren Staupevirusgehalt am vorbebrütetem Hühnerei geprüft. Außerdem wurden zwölf
weitere Versuchshunde mit je 2 ml der oben beschriebenen SH-Vaccine subkutan geimpft.
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Unmittelbar vor der Impfung und 3 Wochen danach wurden Blutproben
entnommen und das Serum im Virusneutralisationstest am vorbebrüteten Hühnerei geprüft.
Alle zwölf Hunde hatten vor der Impfung keinen, 3 Wochen danach dagegen einen beträchtlichen
Blutserumspiegel an staupevirusneutralisierenden Antikörpern, die ein Vielfaches
einer infektiösen Virusdosis zu neutralisieren imstande sind.
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Der wesentliche Vorteil der erfindungsgemäßen Vaccine besteht darin,
daß bei ausgezeichneter Immuni-
sierung eine Infektion nicht vaccinierter Tiere ausgeschlossen
ist.
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Beispiel a) Herstellung des Staupeanteils der SH-Vaccine Bei der
Herstellung des lebendes, eiadaptiertes, apathogenes Staupevirus enthaltenden Staupeanteils
wird wie folgt verfahren.
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8 Tage vorbebrütete Hühnereier werden durchleuchtet, und die Lage
des Embryos wird markiert. An der bezeichneten Stelle wird die Eischale angebohrt,
so daß eine Öffnung entsteht, durch welche die Chorioallantoishaut mit 0,2ml einer
40/oigen Suspension infiziert wird. Diese Suspension enthält modifiziertes, vom
Ei gewonnenes Staupevirus in Aqua dest., dem 104/o einer 1/15 molaren Phosphatpufferlösung
vom PEE 7,6 zugegeben wurde. Die Impföffnung wird mit paraffingetränktem japanischem
Seidenpapier verschlossen. Die so behandelten Eier werden 5 Tage bei 370 C nachbebrütet
und anschließend geöffnet. Die mit Staupevirus bewachsenen Eihäute werden geerntet,
gesammelt, im Homogenisator unter Eiskühlung fein zerkleinert und mit einer Stabilisatorlösung
wie folgt zu einer Suspension aufgearbeitet. Es wird beispielsweise zu 500 ml des
zerkleinerten Chorioallantoismaterials eine Stabilisatorlösung zugegeben, die sich
aus 400 ml Rinderbouillon vom p 7,6 und 100 ml einer 500/obigen Glukoselösung zusammensetzt.
Der Staupeanteil der SH-Vaccine besteht demnach aus 500/0 virushaltigem Chorioallantoismaterial,
400/0 Rinderbouillon vom pH 7,6 und 10% einer 500/oigen Glukoselösung. b) Herstellung
des H.c.c.-Anteils der SH-Vaccine Bei der Herstellung des H.c.c.-Anteils der SH-Vaccine
wird wie folgt vorgegangen.
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350 g der H.c.c.-virushaltigen Leber und Milz eines Hundes werden
unter Eiskühlung im Homogenisator fein zerkleinert, und das Material wird unter
Zugabe von 700 ml Aqua dest. zu einer Suspension aufgearbeitet. Die Suspension wird
in einer Flasche gesammelt, mit 0,50/0, das sind 5,25 ml 350/obige Formaldehydlösung,
versetzt und 1 Stunde im Schüttelapparat kräftig geschüttelt. Die Suspension wird
in der Folge dreimal eingefroren und wieder aufgetaut und 1 Woche bei Kühlschranktemperatur
(etwa 40 C) aufbewahrt.
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Die so behandelte Suspension wird anschließend 30 Minuten bei 3000
U/min zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Zu 750 ml des gewonnenen Extraktes
werden 250 ml einer 2%eigen Aluminiumhydroxydlösung zugesetzt. Man erhält somit
1000ml des inaktivierten H.c.c.-virushaltigen Vaccineanteils, der sich aus 75°/o
H.c.c.-virushaltigem Exrakt und 250/0 einer 20/obigen Aluminiumhydroxydlösung zusammensetzt.
Vom H.c.c.-Vaccineanteil wird eine Probe zur Bestimmung des freien und des gebundenen
Formaldehydgehaltes entnommen.
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Der freie Formaldehyd wird durch Zugabe der 1,Sfachen stöchiometrischen
Menge an Bisulfit abgebunden. Beträgt beispielsweise der freie Formaldehydgehalt
100 mg0/o, so werden zu 11 H.c.c.-Vaccineanteil 26,9 ml einer 200/oigen Bisulfitlösung
zugesetzt. c) Herstellung des H.c.c.-Anteils der SH-Vaccine durch ein von der Gewebekultur
gewonnenes H.c.c.-Virus Von einer frischen Hundeniere wird unter möglichst sterilen
Verhältnissen die Nierenrinde gewonnen. Diese wird in einer Petrischale gesammelt
und zu 4 bis 5 mm
großen Stückchen zerkleinert. Diese Gewebestückchen
werden mit einer Phosphatpufferlösung (PH 7,5) nach R. Dulbecco und M. Vogt (J.
of Exp. Med., 99, S. 167, 1954) gewaschen. Im Anschluß daran erfolgt dieTrypsinierung
der Nierenrindenstückchen mit einer 0,250/oigen Trypsinlösung im Wasserbad bei 370
C.
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Durch die Trypsinierung werden aus den Organstückchen einzelne Zellen
abgespalten. Die Aufschwemmung dieser losgelösten Zellen wird gesammelt und die
Trypsinierung durch Unterkühlung im Eiswasserbad unterbrochen. Durch Zentrifugieren
zunächst bei 1000 und nach zweimaligem Waschen mit Phosphatpufferlösung (PH 7,5)
bei 600 U/min werden die Trypsinlösung und die in der Aufschwemmung enthaltenen
Blutkörperchen entfernt. 1 ml gewaschene Nierenzellen werden jetzt z. B. in einer
Mischung von 95 ml Kulturmedium 199 nach J. F. Morgan, A. J.
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Morton und R.C.Parker (Proc. Soc. Exp. Biol.
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Med., V. 73, S. 1, 1950) und 5 ml Kälberserum aufgeschwemmt. Zu 100ml
dieser Zellsuspension wird ein Antibiotikagemisch, bestehend aus 20000 I. E. Penicillin,
20 000 y Streptomycin und 20 000 y Neomycin, zugesetzt und mit einer 2,80/obigen
Natriumbikarbonatlösung, die einen Zusatz von 0,0020/0 Phenolrot enthält, ein pB-Wert
von 6,8 eingestellt. Mit dieser Zellsuspension werden sterile Kulturgefäße, z.B.
Fernbachkolben, Erlenmeyerkölbchen oder Rollrandröhrchen, mit etwa 8 °/o ihres Fassungsvermögens
beschickt. Etwa 4 bis 6 Tage nach dem Ansatz müssen die zu dem Epithelrasen auswachsenden
Nierenzellen durch Ersatz der Nährlösung gefüttert werden und gegebenenfalls in
den nachfolgenden Tagen der p-Wert mit einer Natriumbikarbonatlösung nachgestellt
werden. Sobald der Zellrasen voll ausgebildet ist, wird er mit einer Suspension,
die ein aus Hundeleber herausgezüchtetes und durch einige Passagen an die Gewebekultur
adaptiertes H.c.c.-Virus enthält, beimpft. Das H.c.c.-Virus wird nach etwa 6 bis
7 Tagen, nachdem sich ein vollständiger cytopathogener Effekt ausgebildet hat und
eine Loslösung der abgestorbenen Epithelzellen erfolgt ist, durch Abgießen der Zellsuspension
geerntet. Der H.c.c.-Virusgehalt bzw. die Antigenität der Suspension wird durch
Beimpfen von Kulturröhrchen in verschiedenen Verdünnungen (Virustitration) oder
durch Untersuchung in der Komplementbindungsreaktion (KBR) geprüft. Die von der
Gewebekultur gewonnene H.c.c.-virushaltige Zellsuspension wird mit 0,1 bis 0,20/0
350/oiger Formaldehydlösung versetzt und zur Inaktivierung 1 Woche lang bei Kühlschranktemperatur
(etwa 40 C) aufbe-
wahrt. Danach werden zu 750 ml der Suspension 250 ml einer 20/oigen
Aluminiumhydroxydlösung zugesetzt.
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Der freie Formaldehyd wird bestimmt und vor der Vermischung mit dem
Staupeanteil durch die Zugabe der 1,Sfachen stöchiometrischen Menge Bisulfit abgebunden.
d) Mischung des Staupe- und H.c.c.-Anteils der SH-Vaccine 1000 ml des Staupeanteils
werden mit 1000 ml des mit Bisulfit behandelten H.c.c.-Anteils unter Eiskühlung
gemischt und zu je 2 ml in Fläschchen abgefüllt.
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Die so erhaltene Staupe-H.c.c.-Vaccine-Mischung wird im Stehen bei
einer Temperatur von - 400 C eingefroren und in der Gefriertrocknungsanlage lyophilisiert.
Dadurch wird der Impfstoff in eine haltbare und lagerfähige Form übergeführt.
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PATENTANSPRbCHE: 1. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur
gleichzeitigen Immunisierung von Hunden oder Füchsen gegen die Staupe und Hepatitis
contagiosa canis (H.c.c.), dadurch gekennzeichnet, daß man ein aus Hundelebern und/oder
-milzen durch Extraktion oder von der Gewebekultur gewonnenes H.c.c.-virushaltiges
Material in an sich bekannter Weise mittels Formaldehyd inaktiviert, hierauf den
freien Formaldehydanteil durch Zusatz einer Lösung, die die 1,5- bis 2fach stöchiometrische
Menge an sauren Salzen der schwefligen Säure, insbesondere Natriumbisulfit, enthält,
abbindet und das so gewonnene Produkt mit einer aus dem embryonierten Hühnerei in
an sich bekannter Weise gewonnenen staupevirushaltigen Suspension mischt und die
Mischung gefriertrocknet.