DE1617940A1

DE1617940A1 - Zellstaemme

Info

Publication number: DE1617940A1
Application number: DE19671617940
Authority: DE
Inventors: Smith Sidney Edwin; O'reilly Kevin Joseph; John Prydie
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1966-02-18
Filing date: 1967-02-20
Publication date: 1970-09-10
Also published as: CY614A; DE1617940C2; GB1177635A; JPS5341230B1; US3520972A; DK119472B; NL6702396A; CH504532A; IL27418A; FR1570435A; IT983058B; BE694243A; ES336810A1

Description

DRS. EULE & BERG DIPL-ING. STAPF

PATENTANWÄLTE Dr. Eule, Dr. Berg, Dipl.-Ing. Stapf, 8 München 2. Hllblettr. 20 *

Be/Be

Anwalta-Akte H 889 '

MÜNCHEN 2, den 2 U, Fet). 1967 HILBUiSTRASSE 20

Telefon 60838 ,

Telegramm-Adr. ■ PATENTEULE München Bankverbindung» Bayerische Vereinsbank Manchen 453100 Postscheck-Konto ι München £5343 Ihr Zeichen Unser Zeichen

The Wellcome Foundation Limited 183 - 193 Euston Road, London N.W.1

"Zellstämme"

Diese Erfindung betrifft Zellatämme, insbesondere einen neuen, von Katzenembryozellen abstammenden Zelltyp, die Züchtung von Viren auf diesem und Vakzine, die solche Viren enthalten.

Es ist bekannt den infektiösen Katzen-Enteritis-(panleucopoenia)-yirus auf einer primären Gewebekultur zu züchten,

A 297 - 2 -

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1617 9AO

die durch Trypsinbehandlung infizierter Katzennierenzellen hergestellt wurde. Dieses Verfahren jedoch hat den "Nachteil, daß die Möglichkeit der Verunreinigung mit anderen, nicht leicht erkennbaren Viren nicht ausgeschlossen werden konnte, während di,e erhältliche Menge einer solchen Gewebekultur auf bestimmte zeit im jähr beschränkt ist und eine heterogene Zellbesiedelung darstellt, welche die Herstellung von Viren für Experimenti erzwecke oder H^er3'^tell^ung von Vakzinen verhindert. Außerdem ist die Modifizierung und Abschwächung von infektiösen Katzen-Enteritis-viren in primären Kulturen aus Nieren junger Katzen undurchführbar wegen der Gefahr der Verunreinigung mit virulenten, infektiösen Katzen-Enteritis-Viren, welche mitunter in den verwendeten, primären Katzengewebekulturen vorhanden sein können.

Es steht im allgemeinen fest, daß das Fehlen von geeigneten verunreinigungsfreien Wirtszellen oder Zellstämmen, die fähig sind die in Frage kommenden pathogenen Viren aufzunehmen, die Bemühungen von Forschung und Entwicklung am stärkst en behindern. Viren zu schaffen, die für die verwendung in Vakzinen zur Bekämpfung menschlicher und tierischer Erkrankungen geeignet sind.

Es wurde nunmehr gefunden, daß ein neuer Zellstamm von Zellen

zur welche von KatζenembryÖlungen herrühren, a«£ Aufnahme, bzw.

zur Ernährung pathogener viren, besonders der infektiösen 00983 7/1997 -3-

1 61 79AO

Kat Zen-Enteritis-Viren, Kätzen-Rhinotracheit is -Viren und Katzen-Picorna-Viren, geeignet sind. Ea wurde ebenso gefunden, daß Zellstämme aus Katzenembryonieren oder -herz oder Gemische derselben oder von Embryohaut, Muskel, Amnion (Placenta), Zunge, Leber oder Darm oder der ganze Embryo oder Embryokadaver in gleicher Weise zur Aufnahme pahtogener Viren geeignet sind. Darüber hinaus ist es möglich geworden, zum Beispiel infektiöse Katzen-Enteritis-Viren mittels Passierenlassen der Viren in Kulturen von Zeil-Stämmen embryonaler Katzen abzuschwächen.

Nach der vorliegenden Erfindung wird (1) ein Zellstamm geschaffen von Zellen, die von Katzenembryos herrühren und geeignet sind pathogene viren aufzunehmen. (2) Ein Verfahren zur Herstellung eines Zellstamms, wie vorausgehend erläutert, in welchem das geeignete Katzenembryogewebe disaggregiert und dann durch Reihenpassagen in einem Nährmedium kultiviert oder weit er (unt er) kultiviert wird.

Weiterhin wird (3) ein Verfahren zur Züchtung eines Virus geschaffen, in welchem eine Kultur dea Zellstamms, wie vorausgehend beschrieben, mit einem Virus infiziert ^wird, gegenüber welchem der Stamm empfänglich, bzw. ansteckbar ist und der Stamm dann in einem Hährmedium kultiviert wird. Die Erfindung schafft (4) ein antigenes Material, das aus einem, aus einem solchen. Zellstamm gezüchteten Virus erhalten wird«

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ein das antigene Material in anwendbarer Ji'orm und Dosierung darbietendes Vakzin.

In besonderer Hinsicht wird ein abgeschwächter Stamm des infektiösen jxatzen-ünteritisvirus nach einem Verfahren geschaffen, durch Passierenlassen eines virulenten tJtamms des Virus in üulturen von embryonalen Katzenzellstämmen, wie vorausgehend erläutert, bis der virus seine Infizierfähigkeit verliert, aber noch seine Immunogenität beibehält. Die so erhaltenen tjtämme können in der ü'orm eines vakzins zur Immunisierung von Katzen gegen infektiöse Batzen-Enteritis dargeboten werden.

as iot bekannt, daß Zellstämme Teilsysteme sind, die von aus lebenden Organismen entfernten Zellen herrühren und geeignet sind in vitro in einem uährmedium kultiviert zu werden, während sie im wesentlichen mit der unveränderten uhromosomzusammensetzung diploid bleiben. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann irgend eines dem .Fachmann bekanntes Medium, welches die notwendigen physikalischen and chemischen bedingungen und die liährzusaiüinensetzung zur Kultivierung oder ueiterkultivierung, das heißt für das Erhalten, den individuellen Wuchs und das Vervielfachen dieser Zellen, erfüllt, verwendet werden. Es wird jedoch vorgezogen, Eagle's Basal Medium mit etwas Hinderserum, und besonders das gleiche Medium mit xryptosephosphat-

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. _ 5 —

nährbrühe und mit dem Zweifachen der üblichen Menge Aminosäuren und Vitaminen zu verwenden. Der pH-Wert des Mediums wird zwischen 6,8 und 7»8, beispielsweise unter Verwendung eines Iffers, gehalten.

Die erfindungsgemäßen Zellstämme sind Wirtszellen für die Virenzüchtung. Diese zellen sind frei von Virenverunreinigung und stellen im wesentlichen einen konstanten Grad an Virenempfänglichkeit, beziehungsweise -aufnahmefähigkeit dar, Sie sind in praktisch jeder Menge, unabhängig von jahreszeitlichen Schwankungen erhältlich, wobei sie aus unmittelbar von jungen Katzen erhaltenen primären Gewebekulturen hergestellt werden.

Der für die zwecke der vorliegenden Erfindung verwendete Katzenembryo kann vorzugsweise die Größe von ungefähr 1 bis 4,5 cm haben. Der Embryo oder ein Teil desselben wird unter aseptischen Bedingungen entfernt, mechanisch oder mit einer geeigneten Enzymzubereitung in einer gepufferten K©ek£alzlösung disaggregiert. Die sich ergebende Zellsuspension wird dann in die, das Nährmedium enthaltenden Behälter gebracht und bei einer Temperatur im Bereich von 32 bis 39⁰C, vorzugsweise 35 bis 37,5⁰G, unter Kultur genommen. Zur Erleichterung der Weiterkultivierung ist es üblich die verwachsenen Schichten der zellen des Stamms mit Trypsin und einem unschädlichen Chelatbildner zu behandeln, bevor ·

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jeder in ein neue3 Medium übertragen wird.

Das Lungengewebe kann geeigneterweise von einem Katzenembryo bei ungefähr 5 bis 7 woehen Trächtigkeit unter sterilen Bedingungen entfernt* und mechanisch oder mit einer geeigneten Enzymzubereitung in gepufferter S-eekSTalzlösung disaggregiert werden. Die sich ergebende Zellsuspension wird dann in die, das Nährmedium enthaltenden Behälter gebracht und mit einer Temperatur im Bereich von 32 bis 39⁰C, vorzugsweise 35 bis 37j5°G, kultiviert. Zur Erleichterung weiterer Kultivierung ist es üblich die verwachsenen Schichten der Seilen des Stammes mit Trypsin ι><<? -siiier unschädlichen Chelatbildner zu behandeln, bevor jeder in ein neues Medium übertragen wird.

Es wurde beobachtet, daß die Zellen des Stamms sich mit einer Geschwindigkeit vervielfachen, die einer Verdopplung ihrer Zahl, jeweils nach 2 bis 3 Tagen, entspricht. Der erfindungsgemäße Zellstamm ist fähig eine Anzahl von Viren aufzunehmen, für welche er in dieser Hinsicht empfänglich ist. Beispiele solcher viren sind der infektiöse Katzen-Enteritis virus, Katzen-Rhinotracheitisvirus, Katzen-Picornavirus und der Rinder-Herpesvirus„ Die Picornaviren beinhalten solche Katzenviren, die in den eigenschaften den Enteroviren, Rhinoviren und ebenso anderen Viren mit Zwischeneigenschaften zwischen Entero- und Rhinoviren ähneln.

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Zur Infizierung des Zellstaimns mit dem virus wird der Stamm mit einer Salzsuspensxon des Virus gemischt, die beispielsweise aus dem üxudat eines infizierten Tieres oder von anderen quellen erhalten wurde. Im Falle des infektiösen iiatzen-Enteritisvirus wird es vorgezogen, mit infektiöser Katzen-Enteritis infizierte MIz oder Dünndarm von Katzen zu verwenden und mit denselben Kulturen des embryonalen !».atz enzells tamms zu impfen.

Die Viren schaffen gewöhnlich feststellbare Veränderungen oder /iellabbau in dem btamm« tfenn die Viren in ausreichender Menge vorhanden sind, wird die Kultur hinsichtlich ihrer Imiaunogenen .rotenz und Toxiaität geprüft. Wenn notwendig, wird der virus abgeschwächt oder durch weitere rassagen in den erfindungsgemäßen Sellstämraen abgeschwächt oder unter Verwendung geeigneter chemischer oder physikalischer Mittel inaktiviert. Das so erhaltene antigene naterial wird entweder zur Schaffung von Antikörpern zur passiven Immunisierung oder als Yakzin durch Anwendung bei empfänglichen V/armbluttieren verwendet.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1 .

Lungengewebe wurde von zwei Katzenembryos bei ungefähr 6 rochen .rächtigkeit entfernt. Das Gewebe wurde mit einer 009837/1997

BQ QRfQlNAL ~ ⁸ -

0,25$igen Lösung von Trypsin (Nutritional Bichemicals Go. 1/300) in einer Phosphat gepufferten alzlösung, beschrieben von Dulbecco und anderen, J.Exp.Med. 1954, 99, 167, disaggregiert. -ηίβ sich ergebende Suspension wurde mit 5 χ 10 Zellen in ein 112 ml flaches, medizinisches Gefäß geimpft, welches Eagle^fs Basal Medium (80 Volumteile) (von Eagle H. Science, 1955, 122, 504) enthielt, dahingehend modifiziert, daß es das Zweifache der üblichen Menge Aminosäuren und vitamine enthielt, Tryptosephosphatbrühe (10 Volumteile) und Rinderserum (10 Volumteile) als sterile Lösung.

Die so gebildeten Monoschichtkulturen wurden durch Reihen Passieren lassen des Inhalts von einem Kolben in zwei oder drei Kolben in durchschnittlich 2 Wochen weiterkultiviert. Die Zellen wurden für diesen Zweck mit 0,05$iger Lösung Natriumedetat in einer 0,1$igen Trypsinlösung des obigen Phosphat gepufferten K-ee&salztyps wiedersuspendiert.

Es wurde beobachtet, daß die Zellen typische Fibroblaste waren und im wesentlichen diploid blieben bis zur 40. Passage. Es erfolgte keine morphologische Transformation bis zur 100. Passage, obgleich Chromosomabnormalitäten in zunehmendem Maße auftraten.

Zellbestände bis zur 20. Passage wurden bei -190⁰C in einem Wuchsmedium mit zugegebenem 1Obigem Dimethylsulfoxid gehal-

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ten. - 9 -

In einem anderen, ähnlichen Versuch wurde ein Medium mit Eagle's Basal Medium (90 Volumteile) und liinders erum (10 Volumteile) verwendet, jedoch wuchsen die wellen nicht so schnell«

Beispiel 2

Embryos (Größe ungefähr 2*5 cm; wurden von trächtigen Katzen entfernt und in feine xeilchen zerkleinert« Das Gewebe wurde mit einer Ü_s25^igen Trypsinlösung ιNutritional .oiochemicals u. 1, 30O) in einer phosphat gepufferten Salz= lösungdisaggregiert. Die sich ergebende ouspension wurde mit 5 x 10 Zellen in ein (112 ml) flaches, medizinisches

äia geimpft, welches ^agle's ~-asal „edium (8ü Volumteile), modifiziert mit dem Zweifachen der üblichen Menge an Aminosätiren und vitammen, Tryptosephosphatnährbrühe (10 iiolumteilej und Rinderserum (10 Volumteile) als sterile Lösung enthielte - .

Die so gebildeten Monoschichten-Kultüren wurden weiterkultiviert durch iieinenpassieren des ^ehalts von einem Kolben in zwei oder drei Kolben mix durcnschnittxicn zwei Wochen, später mit einer vKOche. Die Zellen wurden zu diesem Zweck mit einer Q,05--_/3igen Matrium-edetatlösung in einer 0,1?&igen 'l'rypsinlösung von Phosphat gepufferter Salzlösung des obigen l'yps wiedersuspendiert. ■

wurde beobachtet, daß die Zellen typische Fibroblaste

009837/1997 bad orio.nal . ₁₀ -

waren und im wesentlichen bis zur 48. Passage diploid blieben.

Zellbestände bis zur 20. Passage wurden bei -190^GG in einem Wuchsmedium mit zugegebenem 10bigem Mmethylsulfoxid gehalten.

Ähnliche Versuche wurden mit anderen Kat zenembry os durchgeführt, die in der Größe zwischen ungefähr 1 bis 4,5 om variierten, mit Embryokadaver und mit den nachfolgenden Teilen von Katzenembryo: Niere, Herz, Herz/Lungegemiseii^ Haut, Muskel, Darm, A,mnion (Placenta), Zunge und Leber. Von all diesen Geweben -airden zufriedenstellende Zellstämme erhalten.

Beispiel 3

Verwachsene Schichten des Zellstamms wurden erhalten und mit Natriumedetat, wie in Beispiel 1 oder 2 beschrieben, behandelt und die Zellen in Röhrenkultivierungsgefäßen (150 χ 50 mm) dispensiert, die Abdeckplatten (Hr. 1. 22 χ 10) enthielten. In jedes Kultivierungsgefäß wurden ungefähr 2,0 χ 10 Zellen in 2 ml Medium gegeben und die Behälter bei 37°C mit Neigung bei einem Winkel von ungefähr 10° bebrütet.

Eine zusammengewachsene Schicht von Zellen wurde an den Abdeckplatten 24 und 48 Stunden nach dem Impfen gebildet. Das Medium enthielt 77,5$ Eagle's Basal Medium, modifiziert wie

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in Beispiel 1, 10$ Rinderseruflt, 10$ Tryptosephosphatnährbrühe und 2,5$ einer 4»4$igem Natriumbicarbonatlösung. .

Eine geeignete Verdünnung (0,25 ml) des infektiösen Katzen-Enteritis virus wurde den in dem obigen Medium vorhandenen Zellen zugegeben. Me Röhrenkultivierungsgefäße wurden in einem Winkel von ungefähr 10° bei einer Temperatur von 37⁰G bebrütet.

Der Virus verursachte erkennbare Veränderungen im Zellkern, wenn die Zellen mit Heaematoxylin und Eosin gefärbt wurden. Ungefähr 18 Stunden nach der Infektion nahmen die infizierten Zellkerne (ungefähr 1 bis 2$ der gesamten Zellkerne) mehr Haematoxylin auf als die nicht-infizierten Zellkerne. Danach folgte in den nächsten 6 Stunden eine Erweiterung der uucleoli, homogenes Dunkelwerden der anderen Kerngehalte und die Entwicklung einer klaren Zone um den Nucleolus oder die Hucleoli, wenn mehr als einer vorhanden war, und eine andere klare 2©ⁿe unmittelbar innerhalb der Kernmembrane. Während der nächsten 24 Stunden scheinen die infigierten Zellen zu schrumpfen und färben sich zumeist schwarz, bevor sie schließlich sich von der Abdeckplatte ablösen. Ungefähr 5 bis 10$ von allen Zellkernen zeigten während der ersten zwei Tage nach der infektion die oben angegebenen Veränderungen.

Ähnliche Versuche vmrden mit allen anderen Zellstämmen

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durchgeführt, die entsprechend dem letzten Absatz von Beispiel 1 erhalten wurden. Das Viruswachsturn war bei all diesen neuen Stämmen zufriedenstellend.

Beispiel 4

Zusammengewachsene Schichten von zellen, die von ganzen Embryos erhalten wurden, wurden in Test-Kultivierungsröhren wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. Eine Probe von Augen- oder Nasenexudat einer an Katzen-Rhinotracheitis erkrankten Katze wurde mit Phosphat gepufferter alzlösung (2,0 ml), wie in Beispiel 1 angegeben, gemischt, die ebenso 200 Einheiten Penicillin und 100 mg Streptomycin pro Milliliter enthielt.

Das jfährmedium wurde von der Zellstamm-Monoschicht in fünf getrennte Gefäße entfernt, mit dem Exudat-Puffergemisch ersetzt und bei 37°C 2 Stunden bebrütet. Das Exudat-Puffergemisch wurde dann entfernt und die Zellen mit frischer, steriler Pufferlösung gewaschen. Die infizierten Gefäße, die frisches Nährmedium (1,5 ml pro Gefäß) enthielten, wurden dann bei 37⁰C in frischem Nährmedium (1,5 ml) bebrütet.

Es folgte eine tägliche, mikroskopische Prüfung der infizierten Kulturen und der Kontrollkulturen, die mit steriler KeeioSalzlösung, anstelle des Exudat-Puffergemischs, hergestellt wurden.

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Während einiger Tage blieb das mikroskopische Erscheinungsbild der Zellkerne in den Kontrollbehältern normal. Bei den infizierten Gefäßen erschienen Flächen abnormaler Zellen innerhalb von 48 Stunden. Diese Flächen wurden getrennt über die Zellschicht verteilt und bestanden aus gerundeten Zellen, die erhöhte Lichtbrechung aufwiesen. Die Flächen der betroffenen Zellen waren klar etea gegenüber den umgebenden Zellen mit normalem Erscheinungsbild in den frühen Stufen abgegrenzt. Mit fortschreitender Infektion wurden die abnormalen Zellen größer und zahlreicher, bis die gesamte Zellschicht ab 4. bis 6. Tag betroffen war. In den letzten Infektionsstufen lösten sich einige Zellen vom Glas, wobei sie klare Lücken in der Zellschicht zurückließen. Mit dem bloßen Auge zeigte die Zellschicht ein "wolkiges" (cloudy) Aussehen. Verschiedene Untersuchungen, die mit der Flüssigkeit und/oder den Zellen der infizierten Gefäße durchgeführt wurden, zeigten daß das für diese Zellveränderungen verantwortliche Mittel ein Virus war, und weitere Untersuchungen ergaben die Identität des Virus als Katzen-Bhinotracheitisvirus. Andere Untersuchungen zeigten, daß die infizierten Kulturen frei waren von anderen Mikroorganismen. Der Virus konnte in Reihen auf frische ßöhrengefäßkulturen des gleichen Zellstamms übertragen werden, in welchen ähnliche zellgenerative Veränderungen stattfanden. Geeignete Verdünnungsexperimente zeigten weiter, daß die Vermehrung des Virus stattgefunden hatte.

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Beispiel 5

Ein weiterer Versuch wurde nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei jedoch, ein Zellstamm verwendet wurde, der aus Embryolunge erhalten wurde. Es wurde gefunden, daß dieser virus ebenso gut auf solchen Zellstämmen, wächst, und es wurden ähnliche Ergebnisse erhalten, wie sie in Beispiel 4 besehrieben wurden.

Beispiel 6

Zusammengewachsene Schichten von Zellstämmen wurden in HöhrenkultivierungsgefäBen, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten. Eine Probe von Nasen- oder Augenexudat einer Katze, die an "Katzeninfluenza" ericrankt war, wodurch man den Katzen-Picornavirus erhielt, wurde mit der phosphat gepufferten See&Salzlösung (2,0 ml), wie in Beispiel 1 angegeben, gemischt, die ebenso 200 Einheiten Penicillin und 100 ug Streptomycin pro Milliliter enthielt.

Das jyährmedium wurde von der Zellstamm-^onoschicht entfernt und mit dem Exudat/Puffergemiseh ersetzt und bei 37°C 2 Stunden bebrütet. Das Exudat/Puffergemiseh wurde dann entfernt und die ^ellen mit frischer, steriler Pufferlö-

sung gewaschen. Der infizierte Zellstamm wurde dann bei 37⁰C in einem frischen uährmedium (1,5 ml) bebrütet.

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Die tägliche mikroskopische Überprüfung der infizierten Kultur und einer Kontrollkultur, die mit steriler -Salzlösung, anstelle des Exudat/Puffergemischs hergestellt wurde, folgte* Is wurde gefunden, daß die Zelldegenerierung (zytopatischer Effekt), die nach 2.bis*7 Tagen Bebrütung auftrat, der durch Humanpicornaviren, beispielsweise dem Poliomyelitisvirus, hergestellten nicht unähnlich war. Die Viren konnten durch Reihenpassagen in Kulturen der Zellstämme übertragen werden, und geeignete Verdünnungsversuche zeigten, daß die Vermehrung der Viren in dem Zellstamm stattgefunden hatte. Weitere Untersuchungen zeigten, da£ die so durch Eeifeenpassagen erhaltenen Kulturen frei von Verunreinigung durch andere Mikroorganismen waren.

Beispiel 7

Der Virus von infektiöser Katzen-Enteritis wurde sowohl von der »ilz als auch vom Dünndarm von infizierten Katzen am Höhepunkt der Erkrankung entnommen und in Kulturen eines Katzenembryolungen-Zellstamms geimpft. Zur untersuchung von Veränderungen innerhalb des Zellkerns wurden die Kulturen mit Haematoxylin und Eosin gefärbt. Wenn Veränderungen klar erkennbar waren -drei bis fünf Tage nach Infektion der Kulturen- wurden die infizierten Kulturen bei -30⁰C eingefroren.

Der eingefroreneρ bei -30°C gelagerte Virus wurde später

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^ 16 -

aufgetaut und in nicht-infizierte Kulturen von Katzenembryo- /oellstämme geimpft, ivach angemessener oelt, die durch das Vorhandensein von'Veränderungen innerhalb des Kerns beurteilt wurde, wurden die infizierten Kulturen der zjellstämme erneut bei -3O⁰C eingefroren bis zur nächsten massage gelagert.

i Passagen mit dem Virus in jvatzenembryo-z/ellstämmen wurde üblicherweise der virus gleichzeitig mit den Zellen und dem mchsmedium dem Kultivierungsgefäß zugegeben, nie Kultur von embryo-zellstämmen, die den virus inoculum enthielten, wurden bei 37°O bebrütet.

Der Virusstamm, dessen übschwächung für ivatzen beansprucht wird, wurde in iteihenpassagen, wie oben beschrieben, achtmal in ivatzenembryolungen-Zellstämmen und dann fünfmal in otämmen, die aus ganzen Katzenerabryos erhalten wurden, hergestellt. Ein anderer Virusstamm durchlief zwei Massagen, mehr in den von den ganzen ivatzenembryos erhaltenen Stämmen. Eine weitere Probe durchlief jedoch nur eine Passage in einem jvatzen-&esamtembryo-Zellstamm mit nachfolgenden zwei oder drei Massagen in i^atzenembryolungen-Zellstämmen.

Die 8. Passage des abgeschächten ota^ms von infektiösen katzenenteritisvirus wurde auf inschädlichkeit bei zwei 4 Monate alten üatzen geprüft. Jede üatze wurde subkutan mit 1,u ml Virus-iK.fi ziert er ü-ewebekul tür flüssigkeit und Zellen im- 009837/1997

ziert, was 200 Gewebekultur-Anateekungsdosen antsprach. Keine der Katzen zeigte irgendeine klinische Erkrankung, obgleich die Gesamtmenge der umlaufenden leucocyten vom 3. Ms zum 9· Tag herabgesetzt wurde. Den Katzen wurden täglich rectale Abstriche vom 2. bis zum 9. Tag nach der Impfung entnommen. Mit diesen Abstrichen geimpfte Gewebekulturen zeigten kein Auftreten von Viren.

Am 21. Tag wurden diese beiden patzen, zusammen mit zwei nicht-geimpften Kontrollkatzen gleichen Alters oral mit 1,0 ml einer !Obigen Suspension von Leber und Milz in 1OfS Pferdeserum-Nährbrühe provoziert. Leber und Milz wurden von einem typisch tödlichen Fall von Katzen-Enteritis befallen. Die geimpften Katzen blieben während der gesamten Provokationszeit klinisch normal. Die nicht-geimpften Kontrollkatzen bekamen Jedoch am 5. Tag nach der Provokation Fieber, verloren an Körperkondition, wurden matt und ausgesprochen leukopenisch.

Geometrisches Mittel der Leucocytenzählungen (x 10 )

Tage . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 nach Impfen 8,8 11,2 9,7 6,8 4,5 6,0 6,1 5,8 6,7 10,1 nach Provokation

geimpfte

Katzen 19,3 10,1 10,7 9,3 8,2 8,4 12,3 8,4 12,1

nicht-ge-

impft.Kat- 10,6 11,7 4,9 6,6 4,6 3,8 4,3 5,3 6,5

. - 18 -

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τ- 18 -

•Den Katzen wurde vor der Impfung und vor und nach der rrovokation .ulut entnommen und das oerum hinsichtlich neutralisierender Antikörper geprüft.

■üereua neutralisierender Antikörper .vorimpfung .Vorprovokation Hachprovokation

640 640

640 2560

2 640

geimpft	<2^Χ·
233	<2
234
nichtgeimpft	]fl^lXX
235	IT
236

^x entsprechend der aerumverciünming ^xx nicht geprüft

Die 15· rassage dieses abgeschwächten utamms von inro..<tiösem Katzen-Enteritisvirus wurde bei ^atzen hinsichtlich Unschädlichkeit und antigener Wirkung und Infektionswir-kung bei nicht-geimpften xn-Kontakt~Katzen geprüft. Der. Virus wurde in dem jyatzenembryozellstamm gezüchtet und die Katzen subkutan mit 1,υ ml Vakzin geimpft» Der Versuch wurde in zwei i'eilen, A und B, durchgeführt.

A. zuerst wurde eine 4 uonate alte Katze mit 1,6 χ iu^J Gewebekultur infektiösen Dosis des virus vakziniert. u±e Katze blieb gesund und es trat keine Erscheinungsform von

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BAD ORIGINAL

Leukopenie oder Pyrexie auf, und es wurde in den Faeces während der ersten 15 Tage des Versuchs kein yirU3 gefunden. Zwei vier Monate alte Katzen und vier drei Monate alte Katzen wurden mit den vakzinierten Katzen in Kontakt gebracht. Keine dieser Katzen zeigte irgendein Anzeichen von Krankheit, Leukopenie oder Pyrexie.

B.Im zweiten Teil des Versuchs wurden sechs 6 bis 7 Monate alte Katzen mit einer 1,6 χ ICr Gewebekultur infektiösen Dosis des Virus vakziniert. Diese Katzen blieben ebenso gesund,

Den, in den obigen Versuchen verwendeten Tieren wurde unmittelbar vor der Vakzinierung und drei Wochen später Blut entnommen. Die Seren wurden hinsichtlich neutralisierender Antikörper geprüft.

Serum neutralisierenderAntikörper

Katzen irorvalrzinipren ^{drei Wochen} Nummer vorvakzinieren Nachvakzinieren

A. geimpft_

238 <10 1 000

nicht-geimpft
in Kontakt

237 OO <5

239 <10 <5

240 «00 <5

241 <10 <5

243 <10 ^5

244 <10 <5

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(Fortsetzung der Tabelle)

8. geimpft	<5
223	<5
224	<5
225	Cb
226	K 5
228	<5
229	<5
230

100 1000 1000 1000 1000 1000 10000

Bei einem anderen Versuch wurden drei 3 Monate alte Katzen subcutan vakziniert mit 1,0 ml Virus der 18. Passage bei Züchtung in einem Katzenembryolungen-Zellstamm. Diese Virusmenge entspricht einer 1,6 χ 10 Gewebekultur infektiösen Dosis. Diese Katzen blieben,zusammen mit zwei nichtgeimpften in Kontakt befindlichen Katzen des gleichen Alters, gesund und zeigten kein Auftreten von Leukopenie oder Pyrexie.

Serumproben wurden von vakzinierten Katzen, unmittelbar vor dem Impfen und elf und 20 Tage später erhalten. Den nicht-geimpft en -in Kontakt befindlichen Katzen wurde zur gleichen Zeit Blut entnommen. Die gesamten Seren wurden hinsichtlich neutralisierender Antikörper geprüft.

yorvakzinierung Hachvakzin. (Tage)

	< 10	11	22
vakzinierte Katzen	< 10
247	<10	100	>10000
250		10000	>10000
252		>10000	>10000
nicht-geimpfte in	<10
Kontakt-Kat zen	<10
251	10	<10
254	10	<10

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Daraus ist zu schließen, daß dieser Stamm von infektiöser Katzen-lnteritis (Panleueopoenia)-Virus, gezüchtet und nach Passagen in Katzenembryo-Zellst aminen, antigen ist, in Katzen die Bildung homologer, neutralisierender Antikörper stimuliert und nicht von vakzinierten Katzen auf mit diesen in Kontakt stehenden empfängliche Katzen übertragen wird.

Beispiel 8

Eouxbehälter, die jeder mit 12 bis 15 χ 10 Zellen in 100 ml Wuchsmedien, wie in Beispiel 7 beschrieben, wurden bei 37⁰C 24 Stunden bebrütet. Die zusammengewachsenen Zellschichten wurden einmal mit Phosphat gepufferter, auf 37⁰C vorgewärmter K-eefeüalzlösung gewaschen und mit 10 ml unverdünnter infektiöser Katzen-Enteritisvirus-Suspension geimpft, die von der 15. bis 18. Gewebekultur-Passagenstufe, wie in Beispiel 7 beschrieben, erhalten wurde und eine 1,6 χ 10 Gewebekultur infektiösen Dosis (TCID) des Virus entsprach.

10 ml des Mediums S.M.199 (of. Morgan und andere, Proc.Soc. Exp.Biol.Med. 1950, 73, auf Seite 6), das ebenso 0,5 ml einer 4,5#igen Lösung von Natriumbiearbonat mit den üblichen Penicillin- und Streptomycinmengen enthielt, wurde der Kultur zugegeben und das Gemisch bei 37⁰C 72 Stunden bebrütet.

Kultur wurde dann schnell gefroren und dreimal aufge-

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taut und, wie in Beispiel 7 beschrieben, verwendet und geprüft. Es wurden zufriedenstellende Ergebnisse erhalten.

Wenn notwendig, wurde wurde die Gefrier-Auftau-Zubereitung erneut gefroren und bei -65⁰C gelagert.

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Claims

- 23 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines als Trägermaterial für pathogene Viren geeigneten Zellstamms dadurch gekennzeichnet, daß Katzenembryogewebe disaggregiert, dann durch Reihenpassagen in einem Nährmedium kultiviert oder weiterkultiviert wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß Niere, Herz, Haut, Muskel, Amnion (Placenta), Zunge, Leber oder Darm des Embryos, der ganze Embryo oder Embryokadaver, insbesondere Embryolungenzellen, verwendet werden.

3. Verfahren sur Züchtung eines Virus dadurch gekennzeichnet, daß eine Kultur des Zellstamms, gemäß Anspruch 1 oder 2 mit einem Virus infiziert wird, gegenüber dem der Stamm empfänglich ist und der Stamm dann in einem Nährmedium kultiviert wird.

4. Verfahren gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium Eagle's Basal Medium und Rinderserum enthält und einen pH von ungefähr 6,8 bis 7f8 hat.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, da3

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das Medina ebenso Trjptosephosphatnäliper-üixe mit dem Zweifachen der üblichen Menge Aminosäuren w&ä Yitaminen enthält <.

6. Verfahren zur Züchtung eines Virus gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet. daß der Virus ein infektiöser Katzen-Enteritisvirus oder Katzen-fihinotracheitisvirus oder ein Katzen-Picornavirus ist.

7. Verfahren zur Herstellung eines abgeschwächten Stamms des infektiösen Katzen-Enteritisvirus, gekennzeichnet durch Passierenlassen eines virulenten Stamms des Virus in Kulturen von Katzenembryozellstämmen, Ms der Virus seine AnsteGkungsfähigkeit verliert, aber noch seine Immunogenität beibehält.

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