DE1027367B - Verfahren zur Herstellung einer Mischvaccine fuer Hunde - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung einer Mischvaccine für Hunde Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Mi.schvaccine für Hunde gegen Staupe und infektiöse Hepatitis, welches darin besteht, daß man den ei-modifizierten lebenden Hundestaupevirus auf einen lebenden, in einer Gewebekultur modifizierten Virus der infektiösen Hepatitis einwirken läßt.
• Die Staupe und die infektiöse Hepatitis sind zwei Viruserkrankungen, die hei Hunden sehr häufig auftreten. In vielen Fällen befallen beide Krankheiten gleichzeitig denselben Hund, und dann ist das Sterblichkeitsverhältnis anscheinend viel größer als bei jeder der beiden Erkrankungen für sich allein.
• In den letzten Jahren sind ei-modifizierte Stämme des Staupevirus zulr Herstellung vonVaccinen, die den lebenden Virus enthalten, benutzt worden. Diese Vaccine schützen Hunde gegen Staupe und rufen nicht die üblichen Symptome der Staupe bei den dnniit behandelten Hunden hervor. Der modifizierte Hundestaupevirus immunisiert also Hunde in befriedigender NVeise gegen die Staupe, aber die Hunde bleiben empfänglicl1 gegen die infektiöse Hepatitis.
• Fieldsteel und Emery (Proceedings of The Society for Experilmental I3foiogy and Ätedicine, 1954, Bd. 86, S. 819 bis 823) haben kürzlich ein Gewebekulturverfahren zur Züchtung und Umwandlung des Virus der infektiösen Hundehepatitis beschrieben. Der Virus der ansteckenden Lebererkrankung der Hunde wird modifiziert, indem man ihn nacheinander 51mal oder öfter durch Gewebekulturen von Hundenieren, Hundemilz, Hundeuterus oder Hundetesticeln schickt.
• Dabei wird der Virus so weit verändert, daß ein empfänglicher Hund nach Impfung mit dem lebenden Virus nicht die üblichen Symptome der infektiösen Hepatitis entwickelt, sondern gegen eine spätere Einwirkung des virulenten Hundevirus der infektiösen Hepatitis geschützt ist.
• Es ist nun gefunden worden, daß man unter geeigneten Bedingungen den lebenden, ei-modifizierten Virus der Hundestaupe zusammen mit dem Eimaterial auf das flüssige Material der Gewebekultur, welche den lebenden, modifizierten Virus der infektiösen Hundehepatitis enthält, in Gegenwart eines geeigneten Stabilisierungsmittels einwirken lassen, dann das flüssige Material bei niedriger Temperatur rasch einfrieren und im gefrorenen Zustand trocknen lassen kann. Man erhält auf diese Weise ein trockenes, stabiles Präparat, welches beide Virusarten enthält.
• Das getrocknete Viruspräparat kann später mit destilliertem Wasser oder einem anderen geeigneten Mittel verdünnt und als Vaccine für die Immunisierung empfänglicher Hunde sowohl gegen Staupe als auch gegen infektiöse Hepatitis der Hunde benu.tzt werden.
• Es ist leicht einzusehen, daß sich aus der Vereinigung der beiden lebenden, modifizierten Virusarten in einem einzigen Produkt in solcher Weise, daß beide Komponenten im Hervorrufen der Immunität gegeniiber der Erkrauknug, gegen welche sie bestimmt sind, ebenso wirksam bleiben, wie wenn man sie gesondert verwenden würde, viele Vorteile ergeben. Die Suspendierung der beiden Stoffe vor der Kältetrocknung in dem gleichen flüssigen Medium schaltet die Notwendigkeit der Verwendung von zwei Behältern aus, wie es der Fall sein würde, wenn die Vaccine getrennt hergestellt werden. Weiter werden erhehliche Ersparnisse dadurch erzielt, daß nur eine einzige Gefriertrocknung und bloß eine einmalige Verpackung und Handhabung erforderlich sind. Die neue Vaccine bringt manche Fortschritte in medizinischer Hinsicht mit sich. Beispielsweise ist nur eine Injektion erforderlich, um einen empfänglichen Hund gegen beide Krankheiten zu schützen. Dies entbindet von der Notwendigkeit mehrfacher Injektionen, wie es bei Verwendung getrennter Vaccine der Fall sein würde.
• Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung wird der lebende, nach der Methode von Fieldsteel und Emery modifizierte Virus der infektiösen Hepatitis in Kolben mit Gewebekulturpräparaten eingetragen und bei einer geeigneten Temperatur etwa 4 Tage lang bebrütet. Nachher wird die Flüssigkeit geerntet Zu etwa der gleichen Zeit, zu der die Präparate der infektiösen Hepatitis auf den Gewebekulturen ausgesät werden, impft man angebrütete, befruchtete Eier mit dem lebenden, modifizierten Hundestaupevirus. Nach einer angemessenen Inkubationszeit von etwa 5 Tagen werden die infizierten Membranen der Eier geerntet und mit einer Saccharoseglutamatlösung zu einer gleichförmigen Suspension verarbeitet, so daß je 2 ml davon ungefähr 1 g des infizierten Gewebes enthalten. Man, fügt nun zu je 2 ml der mit dem Staupevirus infizierten, homogenen Tasse 2 ml der flüssigen Gewebekultur, welche den Virus der infektiösen Hepatitis enthält. Die entstandene Lösung wird dann in geeignet abgemesslene Mengen. in sterile Behälter abgefüllt. Die Flüssigkeit in den Behältern läßt man rasch einfrieren und trocknet sie im gefrorenen Zustand im Vakuum ein. Dabei wird eine trockene Vaccine erhalten, die beide lebenden Viren in stabiler Form enthält.
• Herstellung der lebenden, modifizierten Hundestaupe-Komponente Hühnereier, diel 7 bis 8 Tage lang bebrütet worden waren, werden für die Kultivierung des Hundestaupevirus benutzt. Die Eier werden durchleuchtet, und nur lebende Embryonen werden beimpft. In die Schale des bebrüteten. Eies wird oberhalb des Luftsackes ein kleines Loch gebohrt, und 1 ml einer 10- bis 20fachen Verdünnung einer rekonstitu ierten Suspension von chorio-allantischer Membran aus mit dem modifizierten Hundestaupevirus infizierten Eiern werden auf der Membran aufgetragen. Das Loch im Ei wird dann verschlossen und das Ei bei 370 C 5 bis 7 Tage lang bebrütet. Naohher werden die infizierten Membranen unter sterilen Bedingungen geerntet. Die geernteten Membranen werden anschließend mit einer sterilen Saccharoseglutamatlösung zu einer gleichförmigen, homogenen Suspension verarbeitet, so daß je 2 ml etwa 1 g des infizierten Gewebes enthalten. Die verwendete Lösung von Saccharoseglutaminat hat folgende Zusammensetzung: 75 g Saccharose, 0,99 g Monokaliumphosphat, 2,38 g Dinatriumphosphat, 0,96 g Monokalium -1 - glutamat - monohydrat, aufgefüllt mit Wasser zu 1000 ml. pl-Endsvert = 7,2 bis 7,4.
• Herstellung der modifizierten, infektiösen Hundehepatitis-Virusko,mponente F,ine mit Trypsin versetzte Kultur von Hundenieren in einem Nährmedium, das aus 8 Teilen Earlescher Lösung (Earles ausgeglichene Salzlösung enthält 6,8 g Natriumchlorid, 0,40 g Kaliumchlorid, 0,20 g Calciuinchlorid, 0,20 g Magnesiumsulfat, 0,125 g saures Natriumphosphat, 1,00 g Glukose und 2,20 g Natriumbicarbonat, aufgefüllt mit Wasser zu 1000 ml), 1 Teil S0loigem Lactalbumin-Hydrolysat und 1 Teil inaktiviertem Pferdeseram oder einer Kultur, die suspendierte Reste einer Hundeniere enthält, zusammengesetzt ist, wird mit 0,2 ml einer unverdünnten, flüssigen, vorher mit Trypsin versehenen Kultur aus Hundenierengewebe, die einen modifizierten ICH-Virus enthält, der aufeinanderfolgend mindestens 51mal, vorzugsweise 100 und mehr Male hindurch geschickt worden war, beimpft. Der pu-Wert des Mediums wird auf 7,6 bis 7,8 eingestellt und die Inkubation der Kulturen bei 350 C ausgeführt. Nach viertägiger Inkubation wird die flüssige Masse, die eine hohe Konzentration an lebendem, geschwächtem ICH-Virus enthält, unter sterilen Bedingungen geerntet.
• Ähnliclie Herstellungsmethoden können unter Verwendung von Schweinenieren an Stelle von Hundenieren ausgeführt werden. Ebenso kann man für die Herstellung der Nierengewebekulturen andere Lösungen benutzen als das Medium 199.
• Herstellung der kombinierten Vaccine Zu je 2 ml des mit dem Staupevirus infizierten Eierembryohomogenats werden 0,2 ml der flüssigen Gewebeikulltur hinzugefügt, welche den lebenden Virus der infektiösen Hepatitis enthält, und die Massen werden gründlich miteinander gemischt. Je 2 ml der gemischten Flüssigkeiten werden dann unter steilen Bedingungen in Glasbehälter abgefüllt. Die Flüssigkeit in den Behältern wird anschließend rasch bei einer Temperatur von etwa -500 C einfrieren gelassen und im gefrorenen Zustand im Vakuum unter Aufrechterhaltung einer tiefen Temperatur eingetrocknet. Für die Verwendung zur Immunisierung von Hunden wird die getrocknete, eingefrorene Vaccine mit destilliertem Wasser oder einer Normal-Kochsalzlösung wieder zu 2 ml rekonstituiert.
• Die in den vorstehenden Beispielen verwendeten Verhältnisse der Viruskomponenten stellen bevorzugte Mengenverhältuisse dar. Man kann aber auch andere Verhältnisse benutzen und erhält immer noch eine wirksame Vaccine. Immerhin ist es notwendig, daß jede Viruskomponente in solcher Menge vorhanden ist, daß sie infizierend wirkt, und jeder Virus muß lebend bleiben. Die Lebensfähigkeit der kombinierten Viren scheint etwas von dem verwendeten Saccharoseglutamatpuffer abhängig zu sein. Es ist vorteilhaft, wenn der Puffer in dem angegebenen Betrag vorhanden ist. Man kann aber auch größere Mengen mit befriedigendem Erfolg anwenden.
• Die Wirksamkeit der kombinierten Vaccine als Iminunisierungsmittel für Hunde ergibt sich aus den nachstehenden Versuchen.
• 48 Hunde wurden subkutan mit je 2 ml der kombinierten Vaccine, die tvie oben beschrieben hergestellt war und den modifizierten infekflösen Hundehepatitisvirus und den modifizierten Hundestaupevirus enthielt, geimpft. Von diesen Hunden wurden zur Zeit der Impfung Serumproben, gezogen, und diese Maßnahme wurde drei oder mehr Wochen später wiederholt. Mit diesen Serumproben wurden Neutralisationsprüfungen vorgenommen, wobei man als Test den infektiösen Hundehep atiti.svirus in der Gewebekultur und den Hundestaupevirus in bebriiteten Eiern benutzte. In Ergänzung der Prüfung der Serumproben auf die Bildung von Antikörpern wurden 31 der Hunde mit einem virulenten, krankheitserregenden Stamm von Hundestaupe und einem virulenten, krankheitserregenden Stamm von infektiöser Hepatitis behandelt. In allen Fällen waren die Serumproben der Hunde, die zur Zeit der Impfung gezogen wurden, frei von Antikörpern. Nach der Impfung entwiclmelten alle Hunde einen beträchtlichen Anstieg der Ablvehrbereitschaft gegen den Hundestaupevirus und den Virus der infektiösen Hepatitis. Alle 31 Hunde, die mit den krankheitserregenden Viren behandelt worden waren, widerstanden erfolgreich diesem Angriff.

Claims (5)

1. PATENTANSPrR INCrTE 1. Verfahren zur Herstellung einer Mischvaccine zur gleichzeitigen Immunisierung von Hunden gegen infektiöse Hepatitis und Staupe, dadurch gekennzeichnet, daß man Eigewebe, welches mit modifiziertem Hundestaupevirus infiziert ist, mit einer Gewebekulturflüssigkeit mischt, die den lebenden, modifizierten Virus der infektiösen Hundehepatitis enthält und die flüssige Mischung einer Gefriertrocknung unterwirft.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Eigewebe aus Geflügel-Einbryonalgewebe besteht.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man 10 Teile des embryonalen Eigewebes auf 1 Teil der Flüssigkeit aus der Hundegewebekultur anwendet.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das embryonale Eigewebe vor dem Zusatz zu der Gewebekulturflüssigkeit mit einem Saccharoseglutamatpuffer mischt.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ungefähr ein Verhältnis der einzelnen Stoffe von 1 Teil des embryonalen Eigewebes zu 2 Teilen Saccharoseglutaminat und 0,1 Teil der Gewebekulturflüssigkeit einhält.