DE1072774B

DE1072774B - Process for separating and purifying compounds with novobiocin activity

Info

Publication number: DE1072774B
Application number: DENDAT1072774D
Authority: DE
Inventors: Westfie'M 1N. J. Frank James Wolf (V. St. A.)
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Publication date: 1960-01-07

Description

DEUTSCHESGERMAN

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen, Reinigen und Konzentrieren von Novobiocin, Dihydronovobiocin und anderen Novobiocinanalogen aus diese enthaltenden Lösungen oder Suspensionen, z. B. Gärmedien, in welchen Novobiocin oder seine Analogen entwickelt sind und welche außerdem Mikroorganismenmyzel und Nährstoffe enthalten.The invention relates to a method for separating, cleaning and concentrating novobiocin, Dihydronovobiocin and other novobiocin analogs from solutions or suspensions containing them, z. B. fermentation media in which novobiocin or its analogs are developed and which also Contain microorganism mycelium and nutrients.

Bisher wurde Novobiocin aus Gärmedien, in welchen dieses Antibiotikum gewachsen war, durch zeitraubende Maßnahmen, einschließlich wiederholter Lösungsmittelextraktion und Umkristallisieren, isoliert und getrennt.So far, Novobiocin was made from fermentation media in which this antibiotic had grown time consuming operations, including repeated solvent extraction and recrystallization, isolated and separated.

Es wurde nun gefunden, daß Novobiocin und Novobiocinanalogen, die in folgendem als novobiocinaktive Verbindungen bezeichnet werden, aus diese enthaltenden Lösungen oder Suspensionen, z. B. Gärmedien, Rohkonzentraten, Extrakten, abgetrennt und gereinigt werden, wenn man diese Lösungen oder Suspensionen mit einem stark basischen Anionenaustauschharz behandelt und aus diesem die novobiocinaktive Verbindung eluiert.It has now been found that novobiocin and novobiocin analogues, which are described below as novobiocin-active Compounds are designated, from these containing solutions or suspensions, e.g. B. fermentation media, Raw concentrates, extracts, can be separated and purified if you use these solutions or Suspensions treated with a strongly basic anion exchange resin and from this the novobiocinactive Compound eluted.

Vorliegende Arbeitsweise hat gegenüber den bekannten Verfahren zur Gewinnung von Novobiocinaktivität durch Lösungsmittelextraktion oder -verteilung den Vorteil, daß die Raummengen der zu behandelnden Flüssigkeit bei der neuen Arbeitsweise vergleichsweise klein sind und daher die Betriebsanlage und Laboratoriumseinrichtungen zu ihrer Durchführung äußerst klein gehalten werden können.The present procedure has compared to the known processes for obtaining novobiocin activity by solvent extraction or distribution the advantage that the amount of space to treated liquid are comparatively small in the new way of working and therefore the plant and laboratory facilities to their Implementation can be kept extremely small.

Ein weiterer Vorteil der neuen Arbeitsweise liegt darin, daß die Novobiocinaktivität, verglichen mit der nur teilweisen Gewinnung der Novobiocinaktivität nach anderen Verfahren wie Lösungsmittelextraktion, praktisch vollständig bei Verwendung von Anionenaustauschharzen unter optimalen Bedingungen gewonnen wird.Another advantage of the new procedure is that the novobiocin activity, compared to the only partial recovery of the novobiocin activity by other methods such as solvent extraction, obtained practically completely when using anion exchange resins under optimal conditions will.

Bei der erfmdungsgemäßen Arbeitsweise wird die Novobiocin enthaltende Flüssigkeit mit einem stark basischen, polymeren, organischen, stickstoffhaltigen Anionenaustauschharz behandelt; hierbei wird die Novobiocinaktivität an dem Harz adsorbiert und danach durch Abtrennung des Harzes aus der Lösung und Eluieren der novobiocinaktiven Verbindungen gewonnen.In the procedure according to the invention, the liquid containing novobiocin becomes strong with a treated with basic, polymeric, organic, nitrogen-containing anion exchange resin; here the Novobiocin activity adsorbed on the resin and thereafter by separating the resin from the solution and eluting the novobiocin-active compounds.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einer geeigneten Säule oder durch Behandlung von Ansätzen eines novobiocinaktiven Stoffes in Behältern durchgeführt werden. Im ersteren Falle wird das Harz in einer senkrechten Säule gepackt und die novobiocinaktive Lösung durch das Harzbett geleitet. Die aus der Säule abströmende Flüssigkeit wird fortlaufend geprüft, ob ihre Novobiocinaktivität ein willkürlich angenommenes Minimum überschreitet. Wenn der Mindestwert erreicht ist, wird die Zufuhr derThe method according to the invention can be carried out in a suitable column or by treating batches of a novobiocinactive substance can be carried out in containers. In the former case it will Resin packed in a vertical column and the novobiocin-active solution passed through the resin bed. The liquid flowing out of the column is continuously checked whether its novobiocin activity is an arbitrary one exceeds the assumed minimum. When the minimum value is reached, the

Verfahren zum Abtrennen und ReinigenMethods of separation and cleaning

von Verbindungen mit Novobiocinaktivitätof compounds with novobiocin activity

Anmelder: Merck & Co., Inc., Rahway, N.J. (V. St. A.)Applicant: Merck & Co., Inc., Rahway, N.J. (V. St. A.)

Vertreter: E. Maemecke, Berlin-Lichterfelde West,Representative: E. Maemecke, Berlin-Lichterfelde West,

und Dr. W. Kühl, Hamburg 36, Esplanade 36 a,and Dr. W. Kühl, Hamburg 36, Esplanade 36 a,

PatentanwältePatent attorneys

Beanspruchte Priorität: V. St v. Amerika vom 21. Mai 1957Claimed priority: V. St v. America May 21, 1957

Frank James Wolf, Westfield, N. J. (V. St. Α.), ist als Erfinder genannt wordenFrank James Wolf, Westfield, N.J. (V. St. Α.), Has been named as the inventor

Frischlösung unterbrochen und die adsorbierte novobiocinaktive Verbindung aus dem Harz mittels einer durchfließenden geeigneten Lösung eluiert.Fresh solution interrupted and the adsorbed novobiocin-active compound from the resin by means of a suitable solution flowing through.

Das abgestreifte Harz wird dann mittels einer geeigneten Lösung regeneriert und gegebenenfalls unter Zusatz von frischem Harz dem Adsorptionsverfahren wieder zugeführt.The stripped resin is then regenerated by means of a suitable solution and, if necessary fed back to the adsorption process with the addition of fresh resin.

Bei absatzweiser Durchführung des Verfahrens wird das Anionenaustauschharz in einem geeigneten Behälter mit der novobiocinaktiven Lösung bewegt; die' Mengenverhältnisse von Harz und Lösung werden empirisch aufeinander eingestellt. Wenn die Konzentration der Novobiocinaktivität in der Lösung auf den gewünschten Wert gesunken ist, wird die Lösung z. B. durch Abgießen von dem Harz getrennt. Sodann wird die novobiocinaktive Verbindung aus dem Harz gegebenenfalls in einer Säule eluiert.If the process is carried out in batches, the anion exchange resin is in a suitable one Moving container with novobiocinactive solution; the 'proportions of resin and solution are empirically adjusted to one another. When the concentration of novobiocin activity in the solution on the desired value has decreased, the solution is z. B. separated from the resin by casting. Then If necessary, the novobiocin-active compound is eluted from the resin in a column.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden novobiocinaktive Verbindungen an dem Ionenaustauschharz aus dem ganzen Gärmedium, welches außer den novobiocinaktiven Verbindungen Mikroorganismenmyzel, Nährstoffe und verschiedene Nebenprodukte der Gärung enthält, adsorbiert. In diesem Fall setzt man das Harz dem Gärmedium nach der Ernte zu, läßt die novobiocinaktive Verbindung in dem Gärmedium durch das Harz adsorbieren und trennt das nunmehr bela'dene Harz z. B. durch Filtrieren, Absieben, mittels Frü'ssigkeitszyklonen, Riffeltischen, Sichtern usw. ab. Siebe, deren Maschenweite das Harz zurückhalten und das Myzel passierenIn a preferred embodiment of the invention, novobiocin-active compounds are used the ion exchange resin from the entire fermentation medium, which apart from the novobiocin-active compounds Containing microorganism mycelium, nutrients and various by-products of fermentation, adsorbed. In In this case, the resin is added to the fermentation medium after harvesting and the novobiocin-active compound is left in adsorb the fermentation medium through the resin and separates the now loaded resin z. B. by filtering, Sieving, using fruit cyclones, corrugated tables, Classifiers etc. Sieves whose mesh size hold back the resin and pass through the mycelium

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lassen, mit normalerweise etwa 4 bis 80 Maschen/cm sind hierfür besonders geeignet, weil die Siebe nicht durch Myzel oder Gärmedium verstopft werden. Die Abtrennung wird durch Verwendung von Schüttelsieben erleichtert.with normally about 4 to 80 meshes / cm are particularly suitable for this because the sieves are not become clogged by mycelium or fermentation medium. The separation is carried out using shaking sieves relieved.

Für das vorliegende Verfahren geeignete Ionenaustäuschharze sind besonders stark basische, polymere, stickstoffhaltige Anionenaustauschharze, namentlich solche mit quaternären Ammonium- oder Aminogruppen an einem Styrol-Divinylbenzolgerüst als Matrix. Die »Dowex«-Harze, z. B. »Dowex 1-X2«, »Dowex 1-X4« und »Dowex 2-X4«; die »Amberlite«- Harze, z.B. »AmberliteIRA-400«, »Amberlite IRA-401«, »Amberlite IRA-411« und »Amberlite XE-98«; die »Duolite«, z.B. »DuoliteA-40«, »DuoliteA-IOl« und »Duolite A-102«, sind Beispiele für diesen Harztypus. Diese Handelsnamen sind geschützte Warenzeichen. Aber auch andere Ionenaustauschharze mit stark basischem Charakter können benutzt werden.Ion exchange resins suitable for the present process are particularly strongly basic, polymeric, nitrogen-containing anion exchange resins, namely those with quaternary ammonium or amino groups on a styrene-divinylbenzene structure as Matrix. The "Dowex" resins, e.g. B. "Dowex 1-X2", "Dowex 1-X4" and "Dowex 2-X4"; the »Amberlite« - Resins, e.g. "Amberlite IRA-400", "Amberlite IRA-401", "Amberlite IRA-411" and "Amberlite XE-98"; the »Duolite«, e.g. »DuoliteA-40«, »DuoliteA-IOl« and "Duolite A-102" are examples of this type of resin. These trade names are registered trademarks. However, other ion exchange resins with a strongly basic character can also be used.

Die Teilchengröße des Harzes ist nicht entscheidend; jedoch erweisen sich solche mit 4 bis 80 Maschen/cm, vorzugsweise mit 14 bis 40 Maschen/cm, als für die Adsorption besonders geeignet.The particle size of the resin is not critical; however, those with 4 to turn out to be 80 mesh / cm, preferably 14 to 40 mesh / cm, as especially for adsorption suitable.

Um die adsorbierte Novobiocinaktivität aus dem Ionenaustauschharz zu eluieren, bedient man sich einer wäßrigen elektrolythaltigen Eluierungslösung, am besten in einem organischen Lösungsmittel für das Antibiotikum. Wäßrige saure Lösungen, welche ein organisches Lösungsmittel für die novobiocinaktive Verbindung enthalten, erweisen sich als besonders wirksam. Zu nennen sind hier z. B. wäßrige Lösungen von Salzsäure oder Essigsäure zusammen mit einem geeigneten mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. einem Alkohol oder Keton, Die Konzentration der sauren Verbindung in der Elutionslösung beträgt vorzugsweise etwa 1 bis 10 Gewichtsteile je 100 Volumteile Lösung. Die organische Phase kann aus etwa 70 bis 98% organischem Lösungsmittel und etwa 30 bis 2 % Wasser bestehen.In order to elute the adsorbed novobiocin activity from the ion exchange resin, one makes use of an aqueous eluting solution containing electrolytes, preferably in an organic solvent for the Antibiotic. Aqueous acidic solutions, which are an organic solvent for novobiocinactive Compound contain prove to be particularly effective. To be mentioned here are z. B. aqueous solutions of hydrochloric acid or acetic acid together with a suitable water-miscible organic Solvents, e.g. B. an alcohol or ketone, The concentration of the acidic compound in the elution solution is preferably about 1 to 10 parts by weight per 100 parts by volume of solution. The organic phase may consist of about 70 to 98% organic solvent and about 30 to 2% water.

Die Eluierung kann säulen- oder absatzweise durchgeführt werden. Wegen der geringeren Raummengen und der relativen Leichtigkeit der periodischen Analyse des Eluates und dessen Aufteilung in Fraktionen wird der säulenweise Betrieb bevorzugt.Elution can be columnar or batchwise be performed. Because of the smaller amounts of space and the relative ease of the periodic For analysis of the eluate and its division into fractions, column-wise operation is preferred.

Das Eluat kann z. B. zur weiteren Reinigung anschließend behandelt werden, z. B. unter Durchleiten durch eine chromatographische Säule, etwa aus Aluminiumoxyd, welches mit verdünnter Schwefelsäure und Wasser gewaschen war, und Behandlung des gereinigten und entfärbten Eluates mit einer sauren Lösung, z. B. Methanol-Essigsäure-Lösung, um die Novobiocinsäure auszukristallisieren. Die Kristalle werden nitriert, mit Wasser-Methanol-Lösung od. dgl. gewaschen, filtriert und getrocknet. Die Novobiocinsäure kann durch entsprechende Neutralisation in verschiedene Novobiocinsalze übergeführt werden. Eluate, welche Novobiocinanalogen wie Dihydronovobiocin enthalten, können in ähnlicher Weise aufgearbeitet werden.The eluate can e.g. B. for further cleaning afterwards treated, e.g. B. while passing through a chromatographic column, for example Aluminum oxide washed with dilute sulfuric acid and water, and treatment the purified and decolorized eluate with an acidic solution, e.g. B. methanol-acetic acid solution to to crystallize out the novobiocinic acid. The crystals are nitrated, or the like with water-methanol solution. washed, filtered and dried. The Novobiocinsäure can through appropriate neutralization in different Novobiocin salts are transferred. Eluate containing novobiocin analogs such as dihydronovobiocin can be worked up in a similar way.

Der weiteren Erläuterung der Erfindung dienen nachstehende Beispiele. Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht an in den Beispielen enthaltende Werte gebunden.The following examples serve to further explain the invention. The inventive method is not bound to values contained in the examples.

example 1

25 ecm filtriertes Gärmedium, welches durch Kultivierung eines Novobiocin erzeugenden Stammes von Streptomyces spheroides in einem geeigneten Nährstoff erhalten war und etwa 7200000 Einheiten Novobiocinaktivität enthielt, wurde durch eine Säule geleitet, welche mit 500 ecm Ionenaustauschharz »Amberlite IRA-411« beschickt war. Das Harz wurde in seiner Chloridphase verwendet. Die Berührungszeit von Lösung und Harz in der Säule betrug etwa 10 Minuten. Die ablaufende Flüssigkeit enthielt keine meßbare Novobiocinaktivität. Das Harz wurde nacli Berührung mit der Lösung zur Entfernung der Verunreinigungen mit 95%igem Methanol gewaschen. Novobiocin wurde dann mittels einer Lösung, welche 16% konz. Salzsäure und 85% Methanol enthielt, eluiert. Die Novobiocinaktivität des Eluates betrug 4500000 Einheiten. Das Eluat hatte ein Gesamtvolumen von weniger als 3 1 und enthielt etwa 62% der Novobiocinaktivität der behandelten Kulturflüssigkeit. 25 ecm filtered fermentation medium, which by cultivation of a novobiocin producing strain of Streptomyces spheroides in a suitable nutrient and approximately 7,200,000 units of novobiocin activity was passed through a column filled with 500 ecm ion exchange resin "Amberlite IRA-411" was sent. The resin was used in its chloride phase. The contact time solution and resin in the column took about 10 minutes. The draining liquid did not contain any measurable novobiocin activity. The resin was after contact with the solution to remove the impurities washed with 95% methanol. Novobiocin was then using a solution which 16% conc. Hydrochloric acid and 85% methanol, eluted. The novobiocin activity of the eluate was 4,500,000 units. The eluate had a total volume of less than 3 liters and contained about 62% the novobiocin activity of the treated culture fluid.

Example 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde mit 33 1 filtriertem novobiocinhaltigem Gärmedium, welches eine Aktivität von 270 Einheiten Novobiocin/ccm zeigte, und mit 300 ecm Harz in der Chloridphase bei einer Berührungszeit von etwa 25 Minuten wiederholt. Das Eluat betrug etwas mehr als 3 1 und enthielt etwa 82 % der gesamten in der ursprünglichen Lösung vorhandenen Novobiocinaktivität.The procedure of example 1 was carried out with 33 l of filtered novobiocin-containing fermentation medium, which exhibited an activity of 270 units of novobiocin / ccm, and with 300 ecm of resin in the chloride phase repeated contact time of about 25 minutes. The eluate was slightly more than 3 liters and contained approximately 82% of the total novobiocin activity present in the original solution.

Example 3

Zwei Portionen zu 30 ecm »Dowex 1-X2«-Harz (20 bis 40 Maschen/cm) in der Chloridphase wurden in 300 ecm eines !infiltrierten novobiocinhaltigen Gärmediums einer Aktivität von 510000 Einheiten eingetragen. Jede Harzportion wurde aus der verbrauchten Gärflüssigkeit mittels eines 28-Maschen-Siebes gesiebt, nach einer Berührungszeit von 10 Minuten in eine Kolonne (2,5 cm Durchmesser) eingebracht und dort mit einer Lösung eluiert, welche 16% konz. Salzsäure und 84% Methanol enthielt. Das Eluat zeigte eine Aktivität von 202 000 Einheiten.Two portions of 30 ecm "Dowex 1-X2" resin (20 to 40 meshes / cm) in the chloride phase were in 300 ecm of an infiltrated fermentation medium containing novobiocin an activity of 510,000 units. Each portion of resin was made from the consumed Fermentation liquid sieved through a 28-mesh sieve, after a contact time of 10 minutes in introduced a column (2.5 cm diameter) and eluted there with a solution which contains 16% conc. Hydrochloric acid and 84% methanol. The eluate showed an activity of 202,000 units.

Example 4

5 g Natriumdihydronovobiocin wurden in 500 ecm Wasser gelöst; danach wurden 50 ecm »Dowex 1-X2«- Harz in der Chloridphase eingetragen. Die Lösung blieb sodann 3 Stunden stehen. Das Harz wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. 17 ecm Harz wurden in einer Kolonne mit einer Lösung eluiert, welche 16 ecm konz. Salzsäure und 84 ecm Methanol enthielt. Das Eluat zeigte 95% der Dihydronovobiocinaktivität der Beschickung.5 g of sodium dihydronovobiocin were dissolved in 500 ecm of water; then 50 ecm »Dowex 1-X2« - Resin entered in the chloride phase. The solution then stood for 3 hours. The resin was filtered off and washed with water. 17 ecm of resin were eluted in a column with a solution, which 16 ecm conc. Hydrochloric acid and 84 ecm of methanol. The eluate showed 95% of the dihydronovobiocin activity the loading.

Claims

Patent claims:

1. Process for separating and purifying compounds having novobiocin activity therefrom containing solutions or suspensions, characterized in that these solutions or Treated suspensions with a strongly basic anion exchange resin and from this the novobiocinactive compound eluted.

2. The method according to claim 1, characterized in that the novobiocin-active compound from the ion exchange resin by means of an acidic, e.g. B. hydrochloric acid solution, which is expediently an organic Solvent, such as methanol, for which novobiocin-active compound contains, is eluted.