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Verfahren zur Gewinnung eines neuen Wirkstoffes aus menschlichem oder
tierischem Speichel Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnun-, eines neue
n Wirkstoffes aus menschlichem oder tierischemSpeichel. Der -neueStoff bewirkt dieHerabsetzung
des Serumcaliciumspiegels, #die Erhöhung der Anzahl der umlaufenden Leukozyten und
die Förderung des Wachstums von hart-cm Gewebe.
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Es ist bereits eine als Parotin bezeichnete Substanz 1-nit physiologischen
Wirkungen (Herabsetzung des Serumialciumspiegels, Erhöhung der Anzahl der Leukozyten
und Beschleunigung der Verkalkung von Kaninchenschneidezahnbein) aus menschlichem
und Rinderspeichel isoliert worden. Ihre Aktivität je Gewichtseinheit ist
jedoch sehr klein. Nach dem üblichen Gewinnungsverfahren wird Speichel bis zum pH
9,6
bis 10,0 a;1,1.zal,isc!h gemacht, im Eisschrank stehengelassen
und :dann schwach sa.-uer geinacht (etwa PH 5A), oder es wird ein organisches Lösungsmittel,
das mit Wasser mischbar ist, z. B. Alkohol oder Aceton allein oder in manchen Fällen
zusammen mit Äther, zu dem obenerwähnten sauren Speichel ge-
geben und die
aktive Substanz ausgefällt. Dieser Niederschlag wird #dann mit schwach alkalischem
Wasser mit einem pH--Wert von etwa 8,0 extrahiert untd. an--schließend durchWiederholen
dieser Fällung und Extraktion gereinigt, oder es wird ein durch Sättigen der alka.IischenLösung
1-n:i.tKochsalz oderAmmoniumsalfat ausgefallener Niederschlag dialysiert, die bei
dem isoelektrischen Punkt bei pH 5,4 bis 6,2 aus dem Dialysat ausgefällte
Substanz wieder mit Wasser von pH 8,0 extrahiert und der aktive Bestandteil
durch Wiederholen #dieser Ausfällung am isoeIektrischen Punkt und des Extrahierens
gereinigt.
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Es ist jetzt gelungen, eine Substanz mit neuen, starken physiologischen
Aktivitäten abzutrennen, die sich von dem genannten aktiven Speichelbestandteil,
also dem bekannten Parotin, unterscheidet und die Bezeichnung »Speichelparotin«
erhalten hat.
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Die allgemeinen physikalischen und chemischen Eigenschaften und biologischen
Wirkungen,des neuen Wirkstoffes Speichelparotin werden in der folgenden Taffielle
aufgeführt. Beim Vergleich seiner biologischen Wirkungen mit denen des bekannten
Parotins ergibt sich, daß die Aktivität von Speichelparotin
je Gewichtseinheit
sehr stark -ist. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Speichelparotin
unterscheiden sich beträchtlich von denen des Parotin.s. Aus den Ergebnissen von
Polarogrammen und des Verlialtens in der Ultrazentrifuge ist zu schließen, daß Speichelparetin
eine Substanz von weit geringerem Molekulargewicht als Parotin ist.
| Vergleich der Eigenschaften des bekannten Parotins mit denen
des Speichelparotins |
| Parotin Speichelparotin |
| Isoelektrischer Punkt pl, 5,7 pH 7,2 bis 7,4. Fällt
nicht beim iso- |
| elektrischen Punkt. |
| Elektrophorese Homogen (Phosphatpuffer pH 8,0). Fast
homogen (Veronalpuffer 8,6). |
| Wandert außerordentlich langsam in |
| Phosphatlösungen, Borat- und Acetat- |
| puffer. |
| Werte der Elementaranalyse C: 50,840/9; H:
7,31 %; N: 14,53 %; C - 46,62 %; H: 6,99 %;
N: 15,21 %; |
| S: 0,77%; Asche: Keine. S: Keiner; Asche: Keine. |
| Parotin Speichelparotin |
| Polarograiiiiiie Zweite Welle Weder C 0 ++ noch
C 0. . . bewirkt |
| - 1,35 Volt (C 0 Reduktion. |
| - 1.35 Volt (Co... |
| Dritte Welle |
| - 1,57 Volt (CO++) |
| - 1,60 Volt (CO... |
| Wellenlänge bei maximaler 277 ± 0,5 in #t.
277,5 0,5 m#t. |
| Absorption |
| Ultrazentrifugieren 3,43 - 10-13 (Pliusphatpuffer) s20w
1,01 - 10-13 (Phosphatpuffer) |
| Aminnsäurebestandteile, Glyciii, Alanin, Valin, Leuein, Phenyl-
Glycin, Alanin, Valin, Leuciii, Aspa- |
| alanin, Asparaginsäure, Glutamin- raginsäure, Glutaminsäure,
Arginin, |
| säure, Arginin, Lysin, Histidin, Serin, Prolin, Lysin, Try
tophan, |
| , p |
| Cystin, Methionin. Serin, Threonin, Histidin und Tyrosin. (Enthält
1,4eine |
| Prolin, Tryptophan und Tyrosin, schwefellialtigen Aminosäuren.) |
| insgesamt 17. |
| Wärmestabilität Instabil. Wird in einem siedenden Stabil. Wird
in einem siedenden |
| Wasserbad innerhalb 30 Minuten Wasserbad innerhalb
30 Minuten nur |
| inaktiviert. wenig inaktiviert. |
| Stabilität gegen Säure und Wird durch 0,1 n-HCI
(pI, 1,08) Stabil gegen 0,1 n-HCI. Bei Behand- |
| Alkali fast inaktiviert und durch 0,1 in- lung mit
0,1 m-Na.-CO., wird die |
| Na2 C 0, wenig. Aktivität zur Herabsetzung des Cal- |
| ciumspiegels nicht verändert, doch |
| geht die Aktivität zur Erhöhung der |
| Anzahl der Leukozyten verloren. |
| Denaturierung Wird durch Harnstoff und NaN0, Weder die Aktivität
zur Herabsetzung |
| denaturiert, und die Aktivität zur des Serunicalciumspiegels
noch die |
| Herabsetzung des Calciumspiegels zur Erhöhung der Anzahl der
Leuko- |
| geht verloren. zyten wird verändert. |
| Aktivität zur Herabsetzung Die Mindestmenge zur Herabsetzung
0,05 bis 0,1 mg/kg bei intravenöser |
| des Kaninchenserum- des Serunicalciumspiegels auf 151/o Inj
ektion. |
| ealciumspiegels beträgt 1,0 bis 1,5 rng/kg bei
intra- |
| venöser Injektion. |
| Aktivität zur Erhöhung der Erhöhung auf das 2- bis 3fache mit
0,005 bis 0,01 mg/kg bei intravenöser |
| Anzahl der Leukozyten 1 bis 5 mg/k-g bei intravenöser
In- Injektion. |
| jektion. |
| Aktivität zur Beschleuni- Die wirksame Mindestdosis, um die
0,05 nig/kg bei intravenöser Injektion. |
| gung der Verkalkung von Aktivität zur Beschleunigung der |
| Kaninchenschneidezahn- Verkalkung von Schneidezähnen zu |
| k# |
| bein zeigen, beträgt 1,0 mg/kg bei intra- |
| venöser Iniektion. |
Aus obiger Tabelle ist zu entnehmen, diaß beide Substanzen physic>Iogisch fast in
dergleichen Hinsicht wirksam sind, daß sie aber trotzdem doch völl(ig voneinander
verschieden sind, weil Speichelpalotin keine schwefelhaltige Aminosäure als Bestandteil
enthält und auch auf Grund anderer Merkmale und -weil Speichelparotin stärkere physiologische
Aktivitäten hat als Parchtin.
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Fig. 1 der Zeichnung ist eine Mikrofotografie (in 1000facher
Vergrößerung) der neuen Substanz, die nach dein Verfahren der vorliegen-den Erfindung
erhalten und aus einer 2/3geSättigten Ammoniumsulfatlösung abgeschieden wurde; Fig.
2 ist ein gefärbter Schnitt durch einen Schneidezahn, der das Wachstum von Kaninchenschneidezalinhein
und die Aktivität zur Beschletini-,gung der Verkalkung desselben durch die neue
Substanz zeigt; Fig. 3 ist ein Verfahrensschema der vorliegenden Erfindung.
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In Fig. 2 der Zeichnung ist A Zahnbein und B die Zahnpulpa;
das Zahnwachstum verläuft in der durch den Pfeil angezeigten Richtung. a ist ein
Teil, der über Nacht gewachsen ist, b ist ein Teil, der am Tage gewachsen,
ist (a und b zeigen a:Iso zusammen, das Wach.gttim an einem ganzen Tag).
c ist eine Linie, die auftrat, als Bleiacetat gegelyen wurde. d zeigt die
Zeit, zu der Speichelparotin injiziert wurde. Erfinidungsgemäß wird einVerfahren
zurGewinnung eines neuen Wirkstoffes aus menschlichem oder tierischem Speichel vorgeschlagen,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den nach Zusatz von Aceton bei einer Acetonkonzentration
der Lösung von 70 bis 80% anfallenden Niederschlag trocknet, diesen mit der 15fachen
Menge Eisessig extrahiert, aus dem Extrakt den aktivenBestan#dteil inGegenwart von
etwa 0,2Volumprozent gesättigter Kochsalzlösung mit einer dem Extraktvolumen entsprechenden
Menge Äther ansfällt, den Niederschlag bei pi etwa 10 in Wasser löst, die
Lösung bei pl, 7,0 gegen Wasser bei einer Temperatur unter 5' C so
lange ialysiert, bis die Wirkstofflösung einen pli-Wert von 5,6 bis
5,8 besitzt, den entstehenden Niederschlag entfernt, die gekühlte Lösung
mit einer gesättigten Ainftioniumsulfatlösung
bis zu einer Konzentration
von 28%Ammoniumsulfat versetzt, den Niederschlag in Wasser löst, gegen Wasser dialysiert
und trocknet. Dabei wird die Extraktion mit Eisessig unter Erwärmen OrzuoSweise
' v bei 60 bis 70'C durchgeführt. Als Extraktionslösung
kann auch ein Gemisch aus 40Volumprozent Eisessig und 60 Volumprozent Methanol
verwendet werden.
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Im einzelnen wird nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ein
getrockneter Niederschlag, der durch Behandeln von menschlichem oder tierischemSpeichel
mit einem organischenLösungsmittel erhalten wird, als Aus 'gangsmaterial verwendet.
Am Ahend des Tages, an dem Speichel (pl, 6,8 bis 7,2) gesammelt worden
ist, wird Aceton unter Rühren in den Speichel getropft, bis die Konzentration an
Aceton 70 bis 8011/o beträgt. Wenn die Konzentration des Acetons kleiner
als 70% ist, ist die Ausfällung des wirksamen Bestandteils unvollständig. je mehr
Zeit nach dem Auffangen des Speichels vergeht, desto kleiner ist diedurch Aceton
ausgefällte Menge. Wenn eine große Menge Aceton ohne Rühren auf einmal zugesetzt
wird, ist,die Fällung unvollständig. Wenn die Lösung mit 70 bis 801)/o Aceton
über Nacht stehengelassen Nvorden ist, damit der Niederschlag vollständig ausfällt,
wird der Niederschlag 1 durch Entfernen der klaren überstehenden Flüssigkeit
mittels eines Saughebers erhalten. Dieser Niederschlag wird zentrifugiert, mit reinem
Aceton oder Äther gewaschen und im Vakuum im Exslikkator über Phosphorpentoxydgetrocknet.
je frischerderSpeichel ist, desto größer ist die Ausbeute an diesem Acetonniederschlag
1 und desto höher ist die Wirksamkeit je Gewichtseinheit. Die Ausbeute
an diesem Acetonniederschlag beträgt im Durchschnitt 200 m,-/100 ccm Speichel, ist
aber von Fall zu Fall verschieden.
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Der wirksame Bestandteil bzw. das Speichelparotin kann in guter Ausbeute
aus dem Niederschlag 1 mit Eisessig oder einem Gemisch von Eisessig und Methanol
(40:60Volumprozent) extrahiert werden. Das vollständig , 'getrocknete Pulver
des Niederschlags 1
wird mitdern 15fachen seines Gewichtes an Eisessig unter
2stündigem Rühren bei 60 bis 700 C behandelt. -Nach zwei- bis dreimaliger
Wiederholung dieser Behandlung ist fast der gesamte wirksame Bestandteil extrahiert;
d.h., etwa 73% des wirksamen Bestand,-teiles werden bei der erst-en, etwa 20 % bei
der zweiten und etwa 71/o bei der dritten Extraktion, extrahiert. (Im Tierversuch
zeigte der Rückstand wenig Aktivität an Speichelparotin.) Die Gegenwart von Was4ger
bei diesem Extraktionsverfahren, bewirkt wah-rscheinlich, daß unreines Protein.
eluiert und dier wirksame Bestandteil hydrolytisch gespalten wird; Wasser solltedeshalb
nicht züi- n sein. Der wirksame Bestandteil e' e ge kann auch bei Raumtemperatur
extrahiiert werden. Es Z, Clibt jedoch so viele Keime im Speichel, daß es vorzuziehen
ist, den Speichel zu erwärmen, um ihn vollständig zu sterilisieren.
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Die drei Extrakte werden vereinigt und das Gem,isch filtriert, worauf
es mit einem Zehntel bis einem Fünftel einer gesättigten wäßrigen Kochsalzlösung
je
100ccm des durchsichtigen Filtrats versetzt wird. Eine dein Filtrat entsprechende
Menge Äther wird. in kleinen Portionen unter Schütteln zugesetzt. Die Lösung wird
über Nacht im Eisschraii,-k stehengelassen, um die Abscheidung des Niederschlages
zu vervollständigen. Der Niederschlag2 wird durch Filtrieren mittels eines Glasfilters
oder durch Zentrifugieren erhalten. Der -Niederschlag wird mit Aceton und/oder Äther
gewaschen, die Essigsäure entfernt und der Niederschlag im Vakuum getrocknet. Die
Ausbeute an Niederschlag2 beträgt etwa 15% von der des Niederschlags 1.
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Der Niederschlag 2 wird in ungefähr dem 80fachen 5 seiner Menge
an Natronlauge bi s zu einem pH-Wer-t von 10,0 bis 11,0 gelöst. Der
ungelöste Rückstand wird zentrifugiert. Die reine überstehende Flüssigkeit wird
mit 1 n-HCI auf einen; pH-Wert von etwa 7,0
ein-gestellt und
5 bis 6 Tage lang mit etwa 2 1 destilliertern Wasser, das jeden
Tag erneuert wird, bei tiefer Temperatur - am besten unter 5' C -
unter Verwendung eines Cellophanbeutels dialyslert. Wenn die Lösung mehr als
5 Stunden stark alkalisch gelassen wird, sinkt die Aktivität. Deshalb sollte
die 5 Lösung in diesem Dialysebeutel so bald wie möglich neutraHsiert werden.
Wenn das plIder Lösung in dem Beutel bei dieser Dialyse,dern der Außenlösung gleich
wird, d. li. etwa 5,6 bis 5,8 erreicht (Methylrot), werden
die Verunreinigungen ausgefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert. Das Filtrat
wird dann durch Ausfrieren getrocknet (Ausbeute 70 bis 75% des Niederschlags 2)
und anschließend in destilliertem Wasser gelöst. Oder aber das Filtrat wird, ohne
getrocknet zu werden, unverändert mit destilliertem Wasser ver-5 dünnt, bis es eine
Konzentration von etwa 1 % erreicht. Wenn eine gesättigte Ammorviumsulfatlösung
bei pH 5,6 bis 5,8 unter Rühren und Kühlen mit Eis in diese Lösung
getropft wird, beginnt bei einer Konzentration von etwa 151/o Ammoniumsulfat ein
Nie-3, derschlag3 auszufallen. Die Ammoniumsulfatlösun-, wird zugesetzt, bis eine
Konzentration von 28% Ammoniumsulfat erreicht ist. Wenn die Lösung über Nacht im
Eisschrank stehengelassen wird, w#ird der aktive Bestandteil in Form bräunlichgelber
Körnchen 5 ausgeschieden.
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Dieser Niederschlag 3 wird durch Zentrifugieren abgetrennt,
in einer kleinen Menge Wasser gelöst und 5 bis 6 Tage mit etwa 2
1 destilliertem Wasser, das j eden Tag erneuert wird, und unter Verwendung
eines j Cellophanbeutels zur vollständigen Entfernung des Ammoniu#msulf ats dialysiert.
Der dabei in kleiner Menge entstandene Niederschlag wird abfiltriert. Das Filtrat
wird durch Ausfrieren getrocknet. Die Ausbeute an diesem getrockneten Produkt 4
beträgt etwa 5 35 % des Niederschlags 2 und liegt bei 7 bis
10 mg je 100 ccm Speichel. Dieses getrocknete Produkt 4 ist
Speichelparotin.
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Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung in Verbindung mit Filg.
3 der Zeichnung.
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Beispiel In 4,5 1 Speichel wurde die 4fach#e Menge Aceton unter
Rühren eingetropft, um eine 801/oi,-e Konzentration an Aceton zu erzielen. Das Gemisch
wurde 5 über Nacht stehengelassen. Die reine überstehende Flüssigkeit wurde
abgehebert. Der Niederschlag wurdedurch Zentriftigieren,gesammelt, mehrmals mit
100ccm Aceton, und Äther gewaschen und im Vakutimexsikkator über Phosphorpentoxyd
getrocknet. Die Ausbeute an Niederschlag aus dem 801/oigen Aceton betrug etwa lOg.
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lOg dieses getrockneten Pulvers wurden unter Zusatz von
150 ccm Eisessig verrührt und extrahiert, während alles auf einem Wasserbad
2 Stunden bei 5 60' C gehalten wurde. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur
wurde der Extrakt durch ein Glasfilter filtriert. Der Rückstand wurde zweimal mit
150 ccm Eisessig wie oben extrahiert. Er wurde dann mit 50 ccm Eisessig
gewaschen. Beim Vereinigen der drei Filtrate wurden 500 ccm Extrakt erhalten.
Wenn zu
iliesem Extrakt 1 ceni einer gesättigten -wäßrigen
Kochsalzlösung - eben wurde, wurde die Lösung Z, zeg trübe. Wenn ferner
500 ecin Äther in mehreren Anteilen zu der Lösung gegeben wurden, scliied
sich ein weißer Niederschlag ans. _Nach Stehen über -Nacht irn Ei-,schrank wurde
der Niederschlag durch Zentrifugieren isoliert. Der Niederschlag wurde zweimal mit
30 ccm Aceton und mehrmals mit 30 ccm Äther gewaschun. iiiii die Essigsätire
zu entfernen. Der Niederschlag wurde dann im \'akuumexsikkator Über Phosphorpentoxydgetrocknet.
DieAusbeutebetrug1,558g. Dieser Ätherniederschlag wurde in 100 cem Wasser
von etwa 1),1 10,0 gelöst, und die unlöslichen Bestan#dteile wurden durch
Zeiitrifti-ieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde init 1 n-H
CI auf pH 7,0
gebracht und mit 2 1 düstIiierteni Wasser unter Verwendung
eines Cellophanbeutels unter 5' C dialvsiert. Die äußere Flüsszigkeit bei
der Dialyse wurde täglich erneuert und die Dialyse 6 Tage lang ausgeführt.
Es hatte sieh dann üin Niederschlag in dein Dialvsebeutel #ebilidet. Der p11-Wert
betrug 5,6 bis 5,8 (-\l#tli-,71 rot) .
Wenn der Niederschlag
mit seinem Filtripapier filtriert wurde. wurde die durchsichtige bräunlrichge-Ibe
Lösung erhalten. Die Konzentration an Protein in dieser Lösung betrug etwa
1 %. Die Menge dieser Löz#ung betru - etwa 111 ccm. Wenn 222
ccin einer geen z#I -ziittigteil wäßrigen Amrnonitimsulfatlösuilg unter Rühren in
die Lösung eingetropft wurden, während die Lösun- mit Eis gekühlt wurde, und die
Konzentration auf 28% gebracht wurde, fiel der aktive BestancIteil in Forrn von
bräunlichgelben Körnchen aus (s. Fig. 1). Nach Stehen über Nacht im Eisschrank
wurde der Niederschlag durch Zentrifugiereil abgetrennt. DerNiederschlag hatte zu
dieserZeit dieForm eines bräunlichgelben Harzes. Wenn dieser Nieder-,chla- in 30ccin
destilliertem Wasser -elöst und b
6 Tage lang in 2 1 destilliertem
Wasser, das täglich Z, C, erneuert wurde, unter Verwendung eines Cel-lophanbentels
dialysiert wurde, wurde eine geringe Menge eines Niederschlags ausgeschieden. Der
Niederschlag wurde mit feinem Filtripapier filtriert. Das so erlialtene durchsichtige
Filtrat wurde durch Ausfrieren getrocknet. Die Ausbeute betrug 341,5 rng.