DE3004018C2

DE3004018C2 -

Info

Publication number: DE3004018C2
Application number: DE19803004018
Authority: DE
Inventors: Yasuhiko Yokohama Kanagawa Jp Kojima; Seishi Tokio/Tokyo Jp Konno; Takashi Chofu Tokio/Tokyo Jp Hashomoto
Original assignee: KITASATO KENKYUSHO TOKIO/TOKYO JP
Current assignee: KITASATO KENKYUSHO TOKIO/TOKYO JP
Priority date: 1979-02-07
Filing date: 1980-02-05
Publication date: 1987-09-10
Also published as: FR2448350B1; GB2042558B; GB2042558A; FR2448350A1; DE3004018A1

Description

Die Erfindung betrifft einen wasserlöslichen Interferoninduktor mit hohem Molekulargewicht, hergestellt durch wäßriges Extrahieren eines Pflanzengewebes und Fraktionieren des Überstandes, ein Verfahren zur Herstellung dieses Interferoninduktors und eine Verwendung dieses Interferoninduktors.

Bei Interferon, welches nachstehend auch als IF oder virushemmender Faktor bezeichnet wird, handelt es sich um eine Substanz, welche auf tierische Zellen einwirken kann, um das Wachstum eines Virus zu hemmen, und eine von der Zelle durch die Virusinfektion freigesetzte Proteinart ist. Die virozide Aktivität von IF ist bezüglich einer Tierspezies spezifisch, bezüglich einer Virusspezies jedoch unspezifisch und kann unter für ihre Induzierung unterschiedlichen Bedingungen schwanken. Es ist auch bekannt, daß das Wachstum bestimmter tierischer tumorartiger Viren durch IF unter bestimmten Bedingungen stark gehemmt werden kann. Interferon induzierende Substanzen sind daher von Interesse für Vorbeugungsmaßnahmen und die Behandlung verschiedener menschlicher und tierischer Erkrankungen durch Virusinfektion.

Bei einem bekannten Interferoninduktor der eingangs genannten Art (DE-OS 30 00 521) ist von einer Pflanze vom Genus Artemisia ausgegangen worden.

Weiterhin ist es bekannt (JP-OS 32 107/78), eine Interferon induzierende Substanz von welcher angenommen wird, daß es sich um eine Art von heteropolymerem Saccharid handelt, die als Hauptbestandteile Hexose (48%), Protein (5%) und Uronsäure (40%) enthält und ein Molekulargewicht von mehr als 100 000 besitzt, aus der Wurzel von Angellica acutiloba Kitagawa (in Japan als Toki bekannt) mit heißem Wasser zu extrahieren und den Extrakt einer Dialyse zu unterwerfen. Dem entstandenen Rückstand wird Aceton zugesetzt, wobei ein Präzipitat erhalten wird, welches dann gefriergetrocknet wird. Der Extrakt kann auch unter vermindertem Druck konzentriert oder durch Ultrafiltration mit einer semipermeablen Membran und anschließende Dialyse isoliert werden.

Eine andere bekannte, interferon induzierende Substanz (JP-OS 99 313/78) soll ein Molekulargewicht von mehr als 20 000 (in der Hauptsache mehr als 100 000) aufweisen und als Hauptbestandteil eine 1-3 gebundene Glukose (Hexose: mehr als 90%) enthalten. Diese Interferon induzierende Substanz wird dadurch hergestellt, daß die Wurzelrinde eines Maulbeerbaumes, wie beispielsweise Morus alba Linne (in Japan als Maguwa bekannt) oder Morus bombycis Koizdumi (in Japan als Yamaguwa bekannt), mit heißem Wasser extrahiert wird, der extrahierten Lösung ein organisches Lösungsmittel zugesetzt wird, um ein Präzipitat zu erhalten, und diesem Präzipitat eine geringe Wassermenge zugesetzt wird, die Lösung der Dialyse zur Herstellung eines Rückstandes unterworfen wird, und dieser Rückstand dann gefriergetrocknet wird. Auch in diesem Fall kann die Lösung nach der Extraktion und/oder vor der Dialyse durch Konzentration unter vermindertem Druck oder durch Verwendung einer semipermeablen Membran in annehmbaren Mengen gewonnen werden. Diese beiden Interferon induzierenden Substanzen haben eine geringe Giftigkeit und können leicht hergestellt werden. Der billige und reichlich vorhandene Vorrat der Pflanzengewebe, aus denen die Interferon induzierenden Substanzen erhalten werden, könnte jedoch infolge der fortgesetzten Verwendung dieser Pflanzengewebe über viele Jahre hinweg als Quelle einer traditionellen sinoapanischen Droge zur Neige gehen.

Zwar ist es auch schon bekannt (Hagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis, Band 3, Seiten 725 bis 727; Spinger-Verlag 1972), Extrakte von Carthamus als Stimulans und gegen Tumore einzusetzen. Daß solche Extrakte eine Interferon induzierende Substanz enthalten, ist bisher aber nicht festgestellt worden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, weitere Pflanzen zu finden, die als Ausgangsmaterial für die Gewinnung eines Interferoninduktors dienen können.

Die Erfindung besteht darin, daß eine Pflanze vom Genus Carthamus ausgewählt und mittels Ultrafiltration die Fraktion mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 gewonnen worden ist.

Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß eine Substanz, welche aus dem Gewebe verschiedener Pflanzen isoliert wurde, welche zum Genus Carthamus der Familie Compositae gehören, bei geringer Giftigkeit ausgezeichnete Interferon induzierende Aktivität zeigt. Außerdem kann die aktive Substanz aus Pflanzengewebe leicht und preiswert isoliert werden.

Die erfindungsgemäße Substanz mit Interferon induzierender Aktivität, welche in der Form von amorphem weißlichen Pulver stabil ist, weist in paktisch reiner Form nachstehende physikalisch-chemische Merkmale auf:

1) Elementaranalyse:
H: 6,54±0,3%, C: 41,9±0,3%, N: 2,39±0,3%, P: 0,28±0,03%
2) Molekulargewicht:
Ca. 100 000 bis ca. 3 000 000 (hauptsächlich ca. 500 000 bis ca. 1 000 000)
bestimmt durch Ultrazentrifugieren, Ultrafiltrieren und Gelfiltrieren.
3) Schmelz- oder Zersetzungspunkt:
Schmelzpunkt unbestimmt. Verkohlt bei etwa 220°C.
4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
Siehe Fig. 1 (bestimmt in 0,1N NaOH-Lösung), welches im wesentlichen unverändert ist, wenn in 1N NaOH oder Wasser bestimmt.
Absätze bei etwa 250 und 280 nm.
5) Infrarot-Absorptionsspektrum:
Siehe Fig. 2 (durch KBr-Methode).
6) Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln:
Löslich in Wasser, leicht löslich in wäßrigen Lösungen von Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Ammoniumhydroxid, im wesentlichen unlöslich in Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Aceton, Chloroform und Diäthyläther.
7) Farbreaktion:
Positiv in Ninhydrinreaktion, Phenol/Schwefelsäure-Reaktion, Folin's Reagens und Dittmer-Reaktion. Negativ in Elson-Morgan- Reaktion.
8) Natur:
Sauer.
9) Chemische Hauptbestandteile:
- a) Amminosäuren:
  Oxyprolin15,61% Threonin10,90% Glutaminsäure 3,96% Glycin 9,09% Valin 4,04% Leucin 2,56% Lysin 2,18% Tyrosin 1,94% Ammoniak12,98% Asparaginsäure 5,51% Serin 9,64% Prolin 4,27% Alanin 8,24% Isoleucin 5,59% Phenylalanin 1,32% Arginin 1,24% Histidin 0,93%
- b) Zucker:
  Arabinose 9,38% Glukose64,98% Xylose 1,40% Galaktose20,98% Mannose 3,26%
- Die vorhandenen Aminosäuren wurden durch Hydrolyse mit 6N HCL bei 110°C in einer Zeitspanne von 48 h in vacuo und durch nachfolgende Analyse bestimmt. Die vorhandenen Zucker wurden durch Hydrolyse mit 0,1N Schwefelsäure bei 80°C während einer Zeitspanne von 20 min bzw. mit 1N Schwefelsäure bei 100°C in einer Zeitspanne von 2 h und anschließende Analyse bestimmt.
10) Optisches Drehvermögen:
= +63° bis +69° (+66° im Durchschnitt) (c=0,49% in 0,1N NaOH)

Biologische Merkmale 1. Interferon induzierende Aktivität

Proben der Interferon induzierenden Substanz der Erfindung wurden verwendet, um Interferon in den Zellen und dem Serum von Testtieren zu induzieren. Die Aktivität des entstandenen Interferon wurde durch die im Versuch 1 beschriebene Methode bestimmt. Die Resultate dieser Bestimmung geben die Tabellen 1 und 2 wieder, welche zeigen, daß die Interferon induzierende Aktivität positiv ist.

Tabelle 1

Tabelle 2

Tabelle 2 zeigt die nach der Methode, welche nachstehend im Versuch 1 beschrieben werden soll, bei zwei Kaninchen erhaltenen Resultate, aus denen sich ergibt, daß die IF-Aktivität ihren Maximalwert zwei Stunden nach Verabreichung erreicht. Durch die im Versuch 1 beschriebene Methode wurde auch bestätigt, daß Interferon im Körper des Testtieres durch die Wirkung der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz induziert wurde.

2. Stabilität der Interferon induzierenden Aktivität

Proben von jeweils 1 mg der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz wurden in Wasser (jeweils 1 ml) gelöst und bei 100°C für eine gegebene Zeitspanne oder bei einer gegebenen Temperatur für 1 h erhitzt. Jede Probe wurde dann in gleicher Weise wie im Versuch 1 beschrieben (in vitro-Methode) behandelt und man erhielt die in den Tabellen 3 und 4 wiedergegebenen Resultate, welche zeigen, daß die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz gegenüber Hitzeeinwirkung sehr stabil ist.

Tabelle 3

Tabelle 4

3. Akute Giftigkeit

Männliche und weibliche Mäuse (ddy-Stamm; 5 Wochen alt; Gewicht 20±1 g; jede Gruppe bestehend aus 10 Mäusen) wurden als Testtiere verwendet. Eine physiologische Lösung von Natriumchlorid, welche die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz enthielt, wurde den Mäusen verabreicht (ip. oder oral), um die LD₅₀-Werte von 1,5 g/kg (ip.) oder 10 g/kg (oral) zu ermitteln. Es ergab sich kein bemerkenswerter Unterschied zwischen den männlichen und weiblichen Mäusen.

4. Anti-Tumor Aktivität

Mäuse (ddy-Stamm; 5 Wochen alt; Gewicht 20±1 g; jede Gruppe bestehend aus 10 Mäusen) wurden als Testtiere verwendet. In der Achselhöhle eines jeden Testtieres wurde eine Probe von S-180 Sarcoma solid tumor (2×2×2 mm) oder Ehrlich ascites tumor (2,5×10⁶ Zellen) geimpft. Nach 24 Stunden wurde die Interferon induzierende Substanz der Erfindung (0,2 mg) in Wasser gelöst jeder Maus oral verabreicht. Die Verabreichung erfolgte einmal täglich und wurde 14 Tage lang durchgeführt. Ein bemerkenswerter Anti-Tumor-Effekt wurde beobachtet.

Aus den vorgenannten Merkmalen wurde festgestellt, daß es sich bei der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz um einen Komplex aus Protein und Zucker handelt, welcher Phosphorsäure enthält und ein Molekulargewicht von etwa 100 000 bis etwa 3 000 000 (hauptsächlich etwa 500 000 bis etwa 1 000 000) besitzt. Diese Substanz entspricht auch der weitgehend anerkannten Definition irgendeiner Interferon induzierenden Substanz, da sie Interferon in tierischen Zellen oder Serum in vivo oder in vitro induziert, welche mit 0,08% Trypsin bei 37°C für 2 h inaktiviert wird, wobei außerdem die Aktivität der induzierenden Substanz in bezug auf tierische Spezies spezifisch ist, jedoch in bezug auf Virus-Spezies unspezifisch ist. Daraus ergibt sich, daß die erfindungsgemäße Substanz nicht nur eine neuartige Interferon induzierende Substanz ist, sondern daß es sich auch um eine neue Substanz an sich handelt, da keine Substanz mit den gleichen physikalisch-chemischen und biologischen Merkmalen wie die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz bisher in der einschlägigen Literatur beschrieben wurde.

Bei den in der einschlägigen Literatur beschriebenen mitogenen Mitteln mit Interferon induzierender Aktivität handelt es sich beispielsweise um Proteintypen mit Molekulargewichten von über 100 000, welche eine sehr schwache Interferon induzierende Aktivität besitzen, welche bei Erwärmung auf 56°C für 5 h inaktiviert werden. Demgegenüber besitzt die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz andersartige chemische Bestandteile, eine hohe Wärmestabilität selbst bei 100°C für mehrere Stunden und ausgezeichnete Interferon induzierende Aktivität. Die aus der Tokiwurzel (Angellica acutiloba Kitagawa) isolierte bekannte Interferon induzierende Substanz hat auch ein hohes Molekulargewicht (mehr als 100 000) und ihre Interferon induzierende Aktivität wird nicht inaktiviert, wenn sie auf 100°C für 1 h erhitzt wird. Ihre chemischen Bestandteile (Hexose: 48%, Uronsäure: 40%, Protein: 5%) und das Infrarot-Absorptionsspektrum unterscheiden sich jedoch von den entsprechenden Werten der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz. Die aus der Maulbeerbaum-Wurzelrinde isolierte bekannte Interferon induzierende Substanz enthält als Hauptbestandteile eine 1-3 gebundene Glukose (Hexose: 96%) und hat ein Molekulargewicht von mehr als 20 000 (hauptsächlich mehr als 60 000) und unterscheidet sich daher auch von der erfindungsgemäßen Substanz. Außerdem ist die mitogene Aktivität, welche in den bekannten Interferon induzierenden Substanzen gefunden wird, welche von bakteriellem Endotoxin und höheren Pflanzen herstammen, in der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz sehr niedrig.

Verschiedene Pflanzen, welche zum Genus Carthamus gehören und als Ausgangsstoff für das Produkt der Erfindung verwendet werden können, enthalten beispielsweise Carthamin, Carthamon, Neocarthamin und dgl., wobei es sich insgesamt um Substanzen mit andersartigen physikalisch- chemischen und biologischen Merkmalen und ohne Interferon induzierende Aktivität handelt.

Die physikalisch-chemischen Merkmale der bekannten Interferon induzierenden Substanzen, welche nicht aus Pflanzen isoliert werden (US-PS 37 73 924 und US-PS 38 84 845, JP-OS 1 21 919/78), entsprechen nicht den Merkmalen der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz.

Die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz ist von potentiellem Interesse als Medikament zur Verhinderung und zur Behandlung verschiedener Krankheiten bei Menschen und Tieren, welche durch Viren verursacht werden, wie beispielsweise tierische tumorartige Viren, da ihre Interferoninduzierende Aktivität im Vergleich mit bekannten, aus Pflanzen isolierten Interferon induzierenden Substanzen ausgezeichnet ist und da sie gegen tierische Tumor-Viren aktiv ist. Außerdem ist ihre Giftigkeit sehr gering, wenn sie oral an Menschen und Tiere verabreicht wird.

In verfahrensmäßiger Hinsicht wird die aktive Substanz aus einer Pflanze des Genus Carthamus der Familie Compositae extrahiert, woraufhin die aktive Substanz aus dem dadurch erhaltenen Extrakt gewonnen wird.

Als Pflanzen für die Herstellung der erfindungsgemäßen Substanz eignen sich Pflanzen, welche in verschiedenen Ländern der Welt unabhängig und im Überfluß wachsen und welche verschiedene Varianten wie Mutanten und Hybriden auf natürliche oder künstliche Weise bilden können. Beispielsweise wurden Carthamus tinctorius Linne und deren Varianten viele Jahre lang wegen ihrer gelben und roten Pigmente gezüchtet und verwendet und werden heutzutage hauptsächlich wegen ihres Öles in verschiedenen Ländern gezüchtet. Auch die Blüten und Kerne wurden lange Zeit in Japan und China als Volksgetränk verwendet, wobei jedoch das Vorhandensein einer Substanz mit IF induzierender Aktivität in ihren Geweben unbekannt war.

Alle zum Genus Carthamus gehörenden Pflanzen können für die Zwecke der Erfindung verwendet werden. Lediglich als Beispiele seien genannt:

Carthamus tinctorius Linne; Carthamus lantus Linne; Carthamus arborescens Linne und deren Varianten wie z. B. C. baeticus Nyman.

Die vorgenannten botanischen Namen sind folgenden druckschriftlichen Veröffentlichungen entnommen:
"Yakuyo Shokubutsu Dai Jiten" von Kariyone und Kimura, veröffentlicht von Hirokawa Shoten, Tokyo (1974); "Saishin Yakuyo Shokubutsu" von Kariyone und Kimura, veröffentlich von Hirokawa Shoten, Tokyo (1978); "Flora Europaea", Vol. 4, veröffentlich von Cambridge University Press, London (1976) und "Illustrated Flora of The Pacific States", Vol. IV der Standford University Press, CA. (1965).

Zwecks besserer Konservierung und Extrahierung wird vorzugsweise getrocknetes Material verwendet, wenn es auch möglich ist, frisches Material zu verwenden. Zum Trocknen kann jedes gewünschte Verfahren wie beispielsweise Naturtrocknung, Trocknung mit Heißluft usw. angewendet werden. Erforderlichenfalls kann das Material vor der Verwendung mit Wasser gewaschen werden.

Die Extraktion kann bei irgendeiner passenden Temperatur, beispielsweise zwischen Raumtemperatur bis zum Siedepunkt der Extraktionsmischung, mit Wasser erfolgen. Da die aktive Substanz der Erfindung in Wasser besonders unter alkalischen Bedingungen (z. B. pH 7-10) löslich ist, wird vorzugsweise der pH-Wert des Wassers vor der Verwendung beispielsweise mit einer geeigneten Pufferlösung wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniumhydroxid eingestellt. Die Extraktion kann während einer beliebigen Zeitspanne, gewöhnlich 1-5 Tage bei Raumtemperatur, erfolgen, wobei diese Zeitspanne abgekürzt werden kann, wenn die Temperatur der Extraktion erhöht wird. So kann beispielsweise die Extraktion während einer Zeitspanne von 30 min bis 6 h bei 40-100°C erfolgen. Erfindungsgemäß kann man den Hauptteil der im Ausgangsmaterial enthaltenen aktiven Substanz extrahieren (in einigen Fällen mehr als 90%). Allerdings sollte die Anwendung von übermäßig hohen Temperaturen vermieden werden, da hierdurch die Menge an unerwünschten Verunreinigungen wie Pigmenten, niedermolekularen Substanzen usw., die im Extrakt auftreten, erhöht werden kann. Man kann erforderlichenfalls dem extrahierenden Wasser auch einen geeigneten antiseptischen Wirkstoff zusetzen. Die Extraktion kann kontinuierlich oder intermittierend erfolgen, und es kann jedes zweckmäßig erscheinende Verhältnis zwischen dem extrahierenden Wasser und dem Rohmaterial angewendet werden.

Aus der extrahierten Lösung wird in üblicher Weise der Pflanzenrest entfernt, beispielsweise durch Filtrieren, Pressen, Zentrifugieren und dergleichen. Anschließend werden unerwünschte Verunreinigungen wie Pigmente und niedermolekulare Substanzen von der übrigbleibenden Flüssigkeit entfernt, um die Gewinnung der aktiven Fraktion zu ermöglichen. Für diesen Zweck wird die Flüssigkeit durch Ultrafiltration fraktioniert, mittels einer geeigneten Membrane, um Substanzen zurückzuhalten, welche ein Molekulargewicht von mehr als 100 000 besitzen, da die erfindungsgemäße aktive Substanz, welche in den Fraktionen vorhanden ist, ein Molekulargewicht von etwa 100 000 bis etwa 3 000 000 (hauptsächlich etwa 500 000 bis etwa 1 000 000) besitzt. Die Ultrafiltration kann unter geeignetem Druck von beispielsweise 0,1 bis 5 kg/cm² mittels einer Membrane durchgeführt werden, welche Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 oder 200 000 zurückhalten kann. Die aktiven Fraktionen werden aufgefangen und zusammengefaßt und dann gefriergetrocknet, wobei man braune Pulver erhält.

Es ist möglich, den Hauptteil der im Ausgangsmaterial enthaltenen aktiven Substanz zu gewinnen, und zwar in einigen Fällen über 90%. Dabei ist die Menge an Verunreinigungen sehr gering, so daß jegliche bemerkenswerte Nebenwirkung vermieden werden kann, selbst wenn eine große Menge des erhaltenen Rohpulvers oral an Menschen und Tiere verabreicht wird. Also kann dieses Rohpulver für orale Verabreichung ohne weitere Reinigung verwendet weden. Zu diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, daß z. B. Carthamus tinctorius L. lange Jahre in Japan und China als Volksdroge und als Rohstoff für rote Öle und Speiseöl verwendet wurde.

Falls gewünscht, kann das auf diese Weise erhaltene Rohpulver noch weiter gereinigt werden, und zwar beispielsweise durch Säulenchromatographie unter Verwendung eines geeigneten Wirkstoffes für die Gel-Filterung oder eines Ionentauschers. Im erstgenannten Fall kann die Elution mit Wasser durchgeführt werden, wenn es auch möglich ist, eine geeignete Pufferlösung zu verwenden. Im letztgenannten Fall kann die Elution mit einer geeigneten Pufferlösung durchgeführt werden. Für die Reinigung kann man auch eine geeignete Anionen- oder Kationenaustauschzellulose verwenden. Das auf diese Weise erhaltene Produkt kann bestimmte Verunreinigungen enthalten, obwohl seine Interferon induzierende Aktivität für praktische Zwecke aussreicht. Falls gewünscht, lassen sich die Mengen an Verunreinigungen durch Kombinationen der vorgenannten Behandlung weiter herabsetzen.

Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Komposition ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktiven Bestandteil eine erfindungsgemäße Substanz der vorbeschriebenen Art zusammen mit einem pharmazeutischen Träger oder Exzipienten enthält. Die Zusammensetzung oder Mischung kann in geeigneter Form für orale, rektale oder parenterale Verabreichung dargeboten werden. So kann beispielsweise die Zusammensetzung oder Mischung für orale Verabreichung fest oder flüssig sein und die Form von Körpern, Tabletten, überzogenen Tabletten, Kapseln, Sirup, Emulsionen, Suspensionen oder Tropfen haben und Träger oder Exzipienten aufweisen, wie sie allgemein in der pharmazeutischen Technik verwendet werden. So können beispielsweise geeignete Tablettier-Exzipienten aus Laktose, Kartoffel- und löslichen Stärken und Magnesiumstearat bestehen.

Für die parenterale Verabreichung kann der Träger aus einer sterilen parenteral verträglichen Flüssigkeit wie beispielsweise sterilem Wasser oder einem parenteral verträglichen Öl wie beispielsweise Arachis-Öl in Ampullen bestehen. Für die Rektal-Verabreichung eignen sich Zäpfchen, wobei der Träger aus einem dafür geeigneten Grundstoff besteht.

Zweckmäßigerweise wird die Zusammensetzung oder Mischung in Einsatzmengen formuliert, von denen jede eine feststehende Dosis des aktiven Bestandteils liefern kann. Tabletten, beschichtete Tabletten, Kapseln, Suppositorien und Ampullen sind Beispiele geeigneter Formen von Einsatzmengen.

Schließlich schafft die Erfindung noch eine Interferon induzierende Substanz der vorstehend beschriebenen Art in ihrer Verwendung als Medikament.

Die beiliegenden Fig. 1 und 2 zeigen das Ultraviolett-Absorptionsspektrum bzw. das Infrarot-Absorptionsspektrum der aktiven Substanz der Erfindung.

Die Erfindung wird nachstehend anhand einiger Ausführungsbeispiele des weiteren beschrieben, wobei diese Beispiele keinerlei Einschränkung der Erfindung bedeuten.

Beispiel 1

Zunächst wurden getrocknete Blüten von Charthamus tinctorius Linne in einer Menge von 2 kg mit Wasser gewaschen und in 40 l Wasser bei Raumtemperatur 3 Tage lang stehengelassen, um die Extraktion durchzuführen. Anschließend wurde das Ganze mit 6000 U/min 20 min lang zentrifugiert, um den Rückstand zu entfernen, welcher zweimal mit Wasser gewaschen wurde, wobei jeweils 10 l Wasser verwendet wurden. Die Waschflüssigkeit wurde mit der überstehenden Flüssigkeit zusammengeschüttet. Der gesamte Feststoffgehalt der kombinierten Lösung betrug 562.037 g (Trockenbasis). Die kombinierte Lösung wurde durch Ultrafiltration mittels eines Ultrafilters fraktioniert, um Substanzen mit einem Molekulargewicht von über 200 000 bei einem Druck von 3 kg/cm² festzuhalten, wobei sich ein Rückstand ergab, welcher dann nach Gefriertrocknung ein braunes Pulver, und zwar 89,46 g, ergab. Zu Vergleichszwecken wurde die gleiche Behandlung mit einem anderen Ultrafilter durchgeführt, um Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 zurückzuhalten, wobei sich 93,50 g an braunem Pulver ergaben.

In der zweiten Stufe der Reinigung, wurden 2 g des braunen Pulvers in 5 ml Wasser gelöst und in eine Säule (4,5×70 cm) übergeleitet, welche mit Sephadex® G-200 angefüllt war. Die Elution wurde mit 600 ml Wasser durchgeführt und die ausfließende Flüssigkeit wurde in Fraktionen von jeweils 3 ml aufgeteilt. Die Fraktionen 25-55 wurden aufgefangen und zusammengeschüttet und das Ganze dann gefriergetrocknet, wobei ein weißliches Pulver (155,04 mg) entstand.

In der dritten Stufe (weitere Reinigung) wurde dieses Pulver (100 mg) in einer 0,1M tris-HCl-Pufferlösung (5 ml; pH 7,0) gelöst und in eine Säule (2,5×70 cm) gefüllt, welche mit DEAE-Sephadex® A-50 angefüllt war. Eine 0,1M tris-HCl-Pufferlösung (300 ml; pH 9,0, welche 0,5M NaCl enthielt) wurde für die Elution verwendet und die ausfließende Flüssigkeit in Fraktionen von jeweils 3 ml aufgeteilt. Die Fraktionen 16 bis 27 wurden aufgefangen und zusammengeschüttet und das ganze dann gefriergetrocknet, wobei man ein weißliches amorphes Pulver (72,3 mg) erhielt, welches geringere Mengen an Verunreinigungen enthielt und im wesentlichen die gleiche Interferon induzierende Aktivität besaß wie das zuerst erhaltene weißliche Pulver. Das Endprodukt hatte die vorbeschriebenen physikalisch-chemischen Merkmale und sein hoher Reinheitsgrad wurde durch Ultrazentrifugieren und Elektrophorese bestätigt.

Zu Vergleichszwecken wurden die Interferon induzierenden Aktivitäten der in den einzelnen Stufen dieses Beispiels erhaltenen Substanz in gleicher Weise bestimmt, wie im nachstehend erläuterten Vesuch 1 (in vitro-Methode), wobei sich nachstehende Resultate ergaben.

Tabelle 5

Beispiel 2

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 1 vorgegangen, wobei jedoch Carthamus lanatus Linne dadurch extrahiert wurde, daß man die Blüten bei Raumtemperatur 2 h lang in Wasser stehen ließ und dann bei 100°C weitere 2 h lang nochmals extrahierte. Die physikalisch-chemischen Merkmale des Endproduktes (70,3 mg) waren im wesentlichen die gleichen wie bei dem Endprodukt, welches im Beispiel 1 erhalten wurde.

Versuch 1

Bestimmung der IF-Induktion mit IF-induzierender Substanz und IF-Bestimmung; (Bezugsquelle: Y. Kojima's Bericht in Kitasato Arch. Exp. Med., 43:35 [1970]).

a) IF-Induktion (in vitro)

Ein Kaninchen (Gewicht etwa 1 Kg; Neuseeland Weiß; SPF) wurde durch Herzpunktur getötet und Milz, Knochenmark und Lymphknotenzellen entnommen und zu einer Zellsuspension kombiniert, welche die vermischten Zellen (10⁷ Zellen) enthielt. Die Masse wurde dann in Proben von jeweils 1 ml aufgeteilt. Vier Proben wurden unabhängig voneinander mit 10, 1,0, 0,1 oder 0,01 µg/ml eines Endproduktes versetzt, welches in gleicher Weise wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden war. Die Proben wurden dann 24 h lang bei 25°C gezüchtet und anschließend zentrifugiert. Die entstehenden überstehenden Flüssigkeiten wurden jeweils als Probe verwendet, um die Interferon-Aktivität zu bestimmen.

b) IF-Induktion (in vivo)

Das Endprodukt vom Beispiel 1 wurde in einer Menge von 1 mg in 2 ml Wasser gelöst und in die Ohrvene eines Kaninchens (Gewicht etwa 1 kg; Neuseeland Weiß; SPF) injiziert. 1, 2, 4 und 6 h nach der Injektion wurde eine Blutprobe von jeweils 2 ml dem Testtier entnommen und das Serum einer jeden Probe wurde vom Blut isoliert und als Probe zur Bestimmung der Aktivität des induzierten Interferon verwendet.

c) Bestimmung der IF-Aktivität

In beiden Methoden (a) und (b) wurde Vesicular-stomatitis-Virus als bedrohlicher Virus eingesetzt, um die Aktivität des induzierten Interferon auf nachstehende Weise zu bestimmen. Eine Einschicht-Kultur der belegten Zellen (lined cells) RK-13 von Kaninchen wurde in eine Flachschale gefüllt und derselben eine vorgegebene Menge der Probe der durch die vorgenannten Methoden (a) oder (b) erhaltenen Lösung zugesetzt. Die Kultur wurde bei 37°C über Nacht unter Zusatz von Vesicular stomatitis Viren als Krankheitsviren bebrütet. Die Interferon-Aktivität wurde aufgrund des Reduktionsverhältnisses von Platten (plaques) bestimmt. Die Einheit der Interferon-Aktivität wird durch eine reziproke Zahl der höchsten Verdünnung der Probe ausgedrückt, welche zur Reduzierung der Zahl von Platten auf 50% erforderlich ist.

Versuch 2 Definition der Interferon induzierenden Substanz

Es wurde bestätigt, daß die nach den Methoden (a) und (b) hergestellten Proben das Wachstum von Vesicular stomatitis- und Vaccinia- Viren in den RK-13 Zellen von Kaninchen der gleichen Tierspezies hemmen, jedoch nicht das Wachstum Vaccinia-Viren in L-Zellen von Mäusen unterschiedlicher Tierspezies. Außerdem wurde ihre IF-Aktivität nach einer 2stündigen Behandlung mit 0,08% Trypsin bei 37°C inaktiviert. Diese Tatsachen zeigen, daß die aktive Substanz der Erfindung eine Substanz mit IF induzierender Aktivität darstellt.

Versuch 3

Im Beispiel 1 wurde die Elektrophorese bei 4°C in herkömmlicher Weise durchgeführt, wobei eine im Handel erhältliche Einrichtung (Model AE-2, Handelsprodukt der Toyo Kagaku Sangyo K.K., Tokyo), eine Polyacrylamid-Gel-Platte (Dicke 3 mm) und ein 0,3M Borsäure-Puffer (pH 8,4) verwendet wurden. Das entstehende Einzelband zeigte, daß die Testprobe einen hohen Reinheitsgrad hatte.

Claims

1. Wasserlöslicher Interferoninduktor mit hohem Molekulargewicht, hergestellt durch wäßriges Extrahieren eines Pflanzengewebes und Fraktionieren des Überstandes, dadurch gekennzeichnet, daß eine Pflanze vom Genus Carthamus ausgewählt und mittels Ultrafiltration die Fraktion mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 gewonnen worden ist.

2. Interferoninduktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze aus der Gruppe

Carthamus arborescens Linne
Carthamus baeticus Nyman
Carthamus lanatus Linne
Carthamus tinctorius Linne

ausgewählt worden ist.

3. Verfahren zum Gewinnen eines Interferoninduktors nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert von 7 bis 10 extrahiert.

4. Verwendung des Interferoninduktors nach Anspruch 1 oder 2 als aktiver Wirkstoff eines Arzneimittels.