DE1055179B

DE1055179B - Process for obtaining a new active ingredient from human or animal saliva

Info

Publication number: DE1055179B
Application number: DET13922A
Authority: DE
Inventors: Yosoji Ito; Sashichi Okabe
Original assignee: Teikoku Hormone Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Aska Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1957-04-02
Filing date: 1957-07-26
Publication date: 1959-04-16

Description

Verfahren zur Gewinnung eines neuen Wirkstoffes aus menschlichem oder tierischem Speichel Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnun-, eines neue n Wirkstoffes aus menschlichem oder tierischemSpeichel. Der -neueStoff bewirkt dieHerabsetzung des Serumcaliciumspiegels, #die Erhöhung der Anzahl der umlaufenden Leukozyten und die Förderung des Wachstums von hart-cm Gewebe.Process for obtaining a new active ingredient from human or animal saliva The invention relates to a method for obtaining, a new n Active substance from human or animal saliva. The -new substance causes the reduction the serum calcium level, the increase in the number of circulating leukocytes and promoting the growth of hard-cm tissue.

Es ist bereits eine als Parotin bezeichnete Substanz 1-nit physiologischen Wirkungen (Herabsetzung des Serumialciumspiegels, Erhöhung der Anzahl der Leukozyten und Beschleunigung der Verkalkung von Kaninchenschneidezahnbein) aus menschlichem und Rinderspeichel isoliert worden. Ihre Aktivität je Gewichtseinheit ist jedoch sehr klein. Nach dem üblichen Gewinnungsverfahren wird Speichel bis zum pH 9,6 bis 10,0 a;1,1.zal,isc!h gemacht, im Eisschrank stehengelassen und :dann schwach sa.-uer geinacht (etwa PH 5A), oder es wird ein organisches Lösungsmittel, das mit Wasser mischbar ist, z. B. Alkohol oder Aceton allein oder in manchen Fällen zusammen mit Äther, zu dem obenerwähnten sauren Speichel ge- geben und die aktive Substanz ausgefällt. Dieser Niederschlag wird #dann mit schwach alkalischem Wasser mit einem pH--Wert von etwa 8,0 extrahiert untd. an--schließend durchWiederholen dieser Fällung und Extraktion gereinigt, oder es wird ein durch Sättigen der alka.IischenLösung 1-n:i.tKochsalz oderAmmoniumsalfat ausgefallener Niederschlag dialysiert, die bei dem isoelektrischen Punkt bei pH 5,4 bis 6,2 aus dem Dialysat ausgefällte Substanz wieder mit Wasser von pH 8,0 extrahiert und der aktive Bestandteil durch Wiederholen #dieser Ausfällung am isoeIektrischen Punkt und des Extrahierens gereinigt.A substance known as parotin 1-nit has physiological effects (lowering the serum calcium level, increasing the number of leukocytes and accelerating the calcification of rabbit incisor bone) from human and bovine saliva. However, their activity per unit of weight is very small. Saliva is made up to pH 9.6 to 10.0 a; 1.1 an organic solvent that is miscible with water, e.g. Give as alcohol or acetone alone or in some cases together with ether to the above-mentioned acidic saliva bought and precipitated the active substance. This precipitate is then extracted and extracted with weakly alkaline water with a pH of about 8.0 . on - by repeating closing this precipitation and extraction cleaned, or it is a by saturating the alka.IischenLösung 1-n: dialyzed i.tKochsalz oderAmmoniumsalfat precipitate formed, which at the isoelectric point at pH 5.4 to 6.2 from the dialysate the precipitated substance was extracted again with water of pH 8.0 and the active ingredient was purified by repeating this precipitation at the isoelectric point and the extraction.

Es ist jetzt gelungen, eine Substanz mit neuen, starken physiologischen Aktivitäten abzutrennen, die sich von dem genannten aktiven Speichelbestandteil, also dem bekannten Parotin, unterscheidet und die Bezeichnung »Speichelparotin« erhalten hat.It has now succeeded in creating a substance with new, strong physiological To separate activities that differ from said active saliva component, so the well-known parotin, differentiates and the term "salivary parotin" had received.

Die allgemeinen physikalischen und chemischen Eigenschaften und biologischen Wirkungen,des neuen Wirkstoffes Speichelparotin werden in der folgenden Taffielle aufgeführt. Beim Vergleich seiner biologischen Wirkungen mit denen des bekannten Parotins ergibt sich, daß die Aktivität von Speichelparotin je Gewichtseinheit sehr stark -ist. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Speichelparotin unterscheiden sich beträchtlich von denen des Parotin.s. Aus den Ergebnissen von Polarogrammen und des Verlialtens in der Ultrazentrifuge ist zu schließen, daß Speichelparetin eine Substanz von weit geringerem Molekulargewicht als Parotin ist. Vergleich der Eigenschaften des bekannten Parotins mit denen des Speichelparotins Parotin Speichelparotin Isoelektrischer Punkt pl, 5,7 pH 7,2 bis 7,4. Fällt nicht beim iso- elektrischen Punkt. Elektrophorese Homogen (Phosphatpuffer pH 8,0). Fast homogen (Veronalpuffer 8,6). Wandert außerordentlich langsam in Phosphatlösungen, Borat- und Acetat- puffer. Werte der Elementaranalyse C: 50,840/9; H: 7,31 %; N: 14,53 %; C - 46,62 %; H: 6,99 %; N: 15,21 %; S: 0,77%; Asche: Keine. S: Keiner; Asche: Keine. Parotin Speichelparotin Polarograiiiiiie Zweite Welle Weder C 0 ++ noch C 0. . . bewirkt - 1,35 Volt (C 0 Reduktion. - 1.35 Volt (Co... Dritte Welle - 1,57 Volt (CO++) - 1,60 Volt (CO... Wellenlänge bei maximaler 277 ± 0,5 in #t. 277,5 0,5 m#t. Absorption Ultrazentrifugieren 3,43 - 10-13 (Pliusphatpuffer) s20w 1,01 - 10-13 (Phosphatpuffer) Aminnsäurebestandteile, Glyciii, Alanin, Valin, Leuein, Phenyl- Glycin, Alanin, Valin, Leuciii, Aspa- alanin, Asparaginsäure, Glutamin- raginsäure, Glutaminsäure, Arginin, säure, Arginin, Lysin, Histidin, Serin, Prolin, Lysin, Try tophan, , p Cystin, Methionin. Serin, Threonin, Histidin und Tyrosin. (Enthält 1,4eine Prolin, Tryptophan und Tyrosin, schwefellialtigen Aminosäuren.) insgesamt 17. Wärmestabilität Instabil. Wird in einem siedenden Stabil. Wird in einem siedenden Wasserbad innerhalb 30 Minuten Wasserbad innerhalb 30 Minuten nur inaktiviert. wenig inaktiviert. Stabilität gegen Säure und Wird durch 0,1 n-HCI (pI, 1,08) Stabil gegen 0,1 n-HCI. Bei Behand- Alkali fast inaktiviert und durch 0,1 in- lung mit 0,1 m-Na.-CO., wird die Na2 C 0, wenig. Aktivität zur Herabsetzung des Cal- ciumspiegels nicht verändert, doch geht die Aktivität zur Erhöhung der Anzahl der Leukozyten verloren. Denaturierung Wird durch Harnstoff und NaN0, Weder die Aktivität zur Herabsetzung denaturiert, und die Aktivität zur des Serunicalciumspiegels noch die Herabsetzung des Calciumspiegels zur Erhöhung der Anzahl der Leuko- geht verloren. zyten wird verändert. Aktivität zur Herabsetzung Die Mindestmenge zur Herabsetzung 0,05 bis 0,1 mg/kg bei intravenöser des Kaninchenserum- des Serunicalciumspiegels auf 151/o Inj ektion. ealciumspiegels beträgt 1,0 bis 1,5 rng/kg bei intra- venöser Injektion. Aktivität zur Erhöhung der Erhöhung auf das 2- bis 3fache mit 0,005 bis 0,01 mg/kg bei intravenöser Anzahl der Leukozyten 1 bis 5 mg/k-g bei intravenöser In- Injektion. jektion. Aktivität zur Beschleuni- Die wirksame Mindestdosis, um die 0,05 nig/kg bei intravenöser Injektion. gung der Verkalkung von Aktivität zur Beschleunigung der Kaninchenschneidezahn- Verkalkung von Schneidezähnen zu k# bein zeigen, beträgt 1,0 mg/kg bei intra- venöser Iniektion. Aus obiger Tabelle ist zu entnehmen, diaß beide Substanzen physic>Iogisch fast in dergleichen Hinsicht wirksam sind, daß sie aber trotzdem doch völl(ig voneinander verschieden sind, weil Speichelpalotin keine schwefelhaltige Aminosäure als Bestandteil enthält und auch auf Grund anderer Merkmale und -weil Speichelparotin stärkere physiologische Aktivitäten hat als Parchtin.The general physical and chemical properties and biological effects of the new active ingredient salivary parotene are listed in the following table. A comparison of its biological effects with those of the known parotene shows that the activity of salivary parotene per unit weight is very strong. The physical and chemical properties of salivary parotene differ considerably from those of parotene. From the results of polarograms and the results in the ultracentrifuge it can be concluded that salivary paretin is a substance of far lower molecular weight than parotin. Comparison of the properties of the known parotene with those of salivary parotene Parotene Salivary parotene Isoelectric point p1, 5.7 pH 7.2 to 7.4. Does not apply to the iso- electrical point. Electrophoresis Homogeneous (phosphate buffer pH 8.0). Almost homogeneous (veronal buffer 8.6). Migrates in extremely slowly Phosphate solutions, borate and acetate buffer. Elemental analysis values C: 50.840 / 9; H: 7.31 %; N: 14.53%; C - 46.62%; H: 6.99 %; N: 15.21 %; S: 0.77%; Ashes: None. S: none; Ashes: None. Parotene Salivary parotene Polarograiiiiiie Second wave Neither C 0 ++ nor C 0.. . causes - 1.35 volts (C 0 reduction. - 1.35 volts (Co ... Third wave - 1.57 volts (C O ++) - 1.60 volts (CO ... Wavelength at a maximum of 277 ± 0.5 in #t. 277.5 0.5 m # t. absorption Ultracentrifugation 3.43 - 10-13 (pliusphate buffer) s20w 1.01 - 10-13 (phosphate buffer) Amic acid components, Glyciii, Alanine, Valine, Leuein, Phenyl- Glycine, Alanine, Valine, Leuciii, Aspa- alanine, aspartic acid, glutamic acid, glutamic acid, arginine, acid, arginine, lysine, histidine, serine, proline, lysine, try tophan, , p Cystine, methionine. Serine, threonine, histidine and tyrosine. (Contains 1.4 a Proline, tryptophan and tyrosine, sulphurous amino acids.) a total of 17. Thermal stability Unstable. Will be in a boiling stable. Will be in a boiling Water bath within 30 minutes Water bath within 30 minutes only inactivated. little inactivated. Stability against acids and becomes stable against 0.1 normal HCl due to 0.1 n HCl (pI, 1.08). When treating Alkali almost inactivated and by 0.1 inhaling with 0.1 m-Na.-CO., The Na2 C 0, little. Activity to lower the cal- cium mirror not changed, but the activity goes to increase the Number of white blood cells lost. Denaturation is caused by urea and NaN0, neither reducing the activity denatured, and the activity of the serum calcium level still the Reduction of the calcium level to increase the number of leuco is lost. cytes is changed. Activity for reducing The minimum amount for reducing 0.05 to 0.1 mg / kg when administered intravenously of the rabbit serum serum calcium level to 151 / o injection. ealcium level is 1.0 to 1.5 mg / kg in intra- venous injection. Activity to increase the increase by 2 to 3 times with 0.005 to 0.01 mg / kg with intravenous White blood cell count 1 to 5 mg / kg with intravenous injection. jection. Activity to accelerate- The minimum effective dose, around the 0.05 nig / kg for intravenous injection. the calcification of activity to accelerate the Rabbit incisor - calcification of incisors too k # leg is 1.0 mg / kg for intra- venous initiation. From the table above it can be seen that both substances are physically effective in almost the same way, but that they are nevertheless completely different from one another, because salivary palotin does not contain any sulphurous amino acids as a constituent and also because of other characteristics and because salivary parotene has stronger physiological activities than Parchtin.

Fig. 1 der Zeichnung ist eine Mikrofotografie (in 1000facher Vergrößerung) der neuen Substanz, die nach dein Verfahren der vorliegen-den Erfindung erhalten und aus einer 2/3geSättigten Ammoniumsulfatlösung abgeschieden wurde; Fig. 2 ist ein gefärbter Schnitt durch einen Schneidezahn, der das Wachstum von Kaninchenschneidezalinhein und die Aktivität zur Beschletini-,gung der Verkalkung desselben durch die neue Substanz zeigt; Fig. 3 ist ein Verfahrensschema der vorliegenden Erfindung. 1 of the drawings is a photomicrograph (magnified 1000 times) of the novel substance obtained by the process of the present invention and deposited from a 2/3 saturated ammonium sulfate solution; Fig. 2 is a colored section through an incisor showing the growth of rabbit incisor and the activity of the novel substance to accelerate calcification thereof; Figure 3 is a process scheme of the present invention.

In Fig. 2 der Zeichnung ist A Zahnbein und B die Zahnpulpa; das Zahnwachstum verläuft in der durch den Pfeil angezeigten Richtung. a ist ein Teil, der über Nacht gewachsen ist, b ist ein Teil, der am Tage gewachsen, ist (a und b zeigen a:Iso zusammen, das Wach.gttim an einem ganzen Tag). c ist eine Linie, die auftrat, als Bleiacetat gegelyen wurde. d zeigt die Zeit, zu der Speichelparotin injiziert wurde. Erfinidungsgemäß wird einVerfahren zurGewinnung eines neuen Wirkstoffes aus menschlichem oder tierischem Speichel vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den nach Zusatz von Aceton bei einer Acetonkonzentration der Lösung von 70 bis 80% anfallenden Niederschlag trocknet, diesen mit der 15fachen Menge Eisessig extrahiert, aus dem Extrakt den aktivenBestan#dteil inGegenwart von etwa 0,2Volumprozent gesättigter Kochsalzlösung mit einer dem Extraktvolumen entsprechenden Menge Äther ansfällt, den Niederschlag bei pi etwa 10 in Wasser löst, die Lösung bei pl, 7,0 gegen Wasser bei einer Temperatur unter 5' C so lange ialysiert, bis die Wirkstofflösung einen pli-Wert von 5,6 bis 5,8 besitzt, den entstehenden Niederschlag entfernt, die gekühlte Lösung mit einer gesättigten Ainftioniumsulfatlösung bis zu einer Konzentration von 28%Ammoniumsulfat versetzt, den Niederschlag in Wasser löst, gegen Wasser dialysiert und trocknet. Dabei wird die Extraktion mit Eisessig unter Erwärmen OrzuoSweise ' v bei 60 bis 70'C durchgeführt. Als Extraktionslösung kann auch ein Gemisch aus 40Volumprozent Eisessig und 60 Volumprozent Methanol verwendet werden.In Figure 2 of the drawings, A is dentin and B is dental pulp; tooth growth is in the direction indicated by the arrow. a is a part that has grown overnight, b is a part that has grown during the day (a and b show a: Iso together, the awake.gttim on a whole day). c is a line that appeared when lead acetate was gelatinized. d shows the time at which salivary parotene was injected. According to the invention, a method for obtaining a new active ingredient from human or animal saliva is proposed, which is characterized in that the precipitate obtained after the addition of acetone at an acetone concentration of the solution of 70 to 80% is dried and extracted with 15 times the amount of glacial acetic acid from which In the extract, the active constituent is obtained in the presence of about 0.2 percent by volume of saturated sodium chloride solution with an amount of ether corresponding to the volume of the extract, the precipitate dissolves in water at pi about 10 , the solution at pi, 7.0 against water at a temperature below 5 ° C so long ialysed until the active ingredient solution has a pli value of 5.6 to 5.8 , the resulting precipitate is removed, the cooled solution is mixed with a saturated ammonium sulfate solution up to a concentration of 28% ammonium sulfate, the precipitate is dissolved in water against water dialysed and dries. The extraction is carried out with glacial acetic acid while warming OrzuoSweise ' v at 60 to 70'C . A mixture of 40 percent by volume glacial acetic acid and 60 percent by volume methanol can also be used as the extraction solution.

Im einzelnen wird nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ein getrockneter Niederschlag, der durch Behandeln von menschlichem oder tierischemSpeichel mit einem organischenLösungsmittel erhalten wird, als Aus 'gangsmaterial verwendet. Am Ahend des Tages, an dem Speichel (pl, 6,8 bis 7,2) gesammelt worden ist, wird Aceton unter Rühren in den Speichel getropft, bis die Konzentration an Aceton 70 bis 8011/o beträgt. Wenn die Konzentration des Acetons kleiner als 70% ist, ist die Ausfällung des wirksamen Bestandteils unvollständig. je mehr Zeit nach dem Auffangen des Speichels vergeht, desto kleiner ist diedurch Aceton ausgefällte Menge. Wenn eine große Menge Aceton ohne Rühren auf einmal zugesetzt wird, ist,die Fällung unvollständig. Wenn die Lösung mit 70 bis 801)/o Aceton über Nacht stehengelassen Nvorden ist, damit der Niederschlag vollständig ausfällt, wird der Niederschlag 1 durch Entfernen der klaren überstehenden Flüssigkeit mittels eines Saughebers erhalten. Dieser Niederschlag wird zentrifugiert, mit reinem Aceton oder Äther gewaschen und im Vakuum im Exslikkator über Phosphorpentoxydgetrocknet. je frischerderSpeichel ist, desto größer ist die Ausbeute an diesem Acetonniederschlag 1 und desto höher ist die Wirksamkeit je Gewichtseinheit. Die Ausbeute an diesem Acetonniederschlag beträgt im Durchschnitt 200 m,-/100 ccm Speichel, ist aber von Fall zu Fall verschieden.More specifically, according to the method of the present invention, a dried precipitate obtained by treating human or animal saliva with an organic solvent is used as a starting material. At the end of the day on which saliva (pl, 6.8 to 7.2) has been collected, acetone is dripped into the saliva with stirring until the concentration of acetone is 70 to 8011 / o. If the concentration of acetone is less than 70%, the precipitation of the active ingredient is incomplete. the more time passes after the saliva is collected, the smaller the amount precipitated by acetone. If a large amount of acetone is added at one time without stirring, the precipitation is incomplete. When the solution with 70 to 80% acetone has been left to stand overnight so that the precipitate completely separates out, the precipitate 1 is obtained by removing the clear supernatant liquid by means of a siphon. This precipitate is centrifuged, washed with pure acetone or ether and dried over phosphorus pentoxide in a vacuum in a desiccator. the fresher the saliva, the greater the yield of this acetone precipitate 1 and the higher the effectiveness per unit weight. The yield of this acetone precipitate is on average 200 m.- / 100 ccm of saliva, but it varies from case to case.

Der wirksame Bestandteil bzw. das Speichelparotin kann in guter Ausbeute aus dem Niederschlag 1 mit Eisessig oder einem Gemisch von Eisessig und Methanol (40:60Volumprozent) extrahiert werden. Das vollständig , 'getrocknete Pulver des Niederschlags 1 wird mitdern 15fachen seines Gewichtes an Eisessig unter 2stündigem Rühren bei 60 bis 700 C behandelt. -Nach zwei- bis dreimaliger Wiederholung dieser Behandlung ist fast der gesamte wirksame Bestandteil extrahiert; d.h., etwa 73% des wirksamen Bestand,-teiles werden bei der erst-en, etwa 20 % bei der zweiten und etwa 71/o bei der dritten Extraktion, extrahiert. (Im Tierversuch zeigte der Rückstand wenig Aktivität an Speichelparotin.) Die Gegenwart von Was4ger bei diesem Extraktionsverfahren, bewirkt wah-rscheinlich, daß unreines Protein. eluiert und dier wirksame Bestandteil hydrolytisch gespalten wird; Wasser solltedeshalb nicht züi- n sein. Der wirksame Bestandteil e' e ge kann auch bei Raumtemperatur extrahiiert werden. Es Z, Clibt jedoch so viele Keime im Speichel, daß es vorzuziehen ist, den Speichel zu erwärmen, um ihn vollständig zu sterilisieren.The active ingredient or the salivary parotene can be extracted in good yield from the precipitate 1 with glacial acetic acid or a mixture of glacial acetic acid and methanol (40:60 percent by volume). The complete, 'dried powder of the precipitate 1 is treated mitdern 15 times its weight of glacial acetic acid with stirring for 2 hours at 60 to 700C. - After repeating this treatment two to three times, almost all of the active ingredient is extracted; that is, about 73% of the effective constituent part is extracted in the first extraction, about 20% in the second and about 71% in the third extraction. (In animal experiments the residue showed little activity on salivary parotene.) The presence of Was4ger in this extraction process probably causes the protein to be impure. eluted and the active ingredient is hydrolytically cleaved; Therefore, the water should not be on. The active ingredient e 'e ge can be extrahiiert even at room temperature. However, there are so many germs in the saliva that it is preferable to warm the saliva in order to completely sterilize it.

Die drei Extrakte werden vereinigt und das Gem,isch filtriert, worauf es mit einem Zehntel bis einem Fünftel einer gesättigten wäßrigen Kochsalzlösung je 100ccm des durchsichtigen Filtrats versetzt wird. Eine dein Filtrat entsprechende Menge Äther wird. in kleinen Portionen unter Schütteln zugesetzt. Die Lösung wird über Nacht im Eisschraii,-k stehengelassen, um die Abscheidung des Niederschlages zu vervollständigen. Der Niederschlag2 wird durch Filtrieren mittels eines Glasfilters oder durch Zentrifugieren erhalten. Der -Niederschlag wird mit Aceton und/oder Äther gewaschen, die Essigsäure entfernt und der Niederschlag im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an Niederschlag2 beträgt etwa 15% von der des Niederschlags 1. The three extracts are combined and the mixture is filtered, whereupon one tenth to one fifth of a saturated aqueous common salt solution per 100 cc of the transparent filtrate is added. A quantity of ether corresponding to your filtrate will be. added in small portions with shaking. The solution is left to stand overnight in the icebox in order to complete the separation of the precipitate. The precipitate 2 is obtained by filtering through a glass filter or by centrifugation. The precipitate is washed with acetone and / or ether, the acetic acid is removed and the precipitate is dried in vacuo. The yield of precipitate 2 is about 15% of that of precipitate 1.

Der Niederschlag 2 wird in ungefähr dem 80fachen 5 seiner Menge an Natronlauge bi s zu einem pH-Wer-t von 10,0 bis 11,0 gelöst. Der ungelöste Rückstand wird zentrifugiert. Die reine überstehende Flüssigkeit wird mit 1 n-HCI auf einen; pH-Wert von etwa 7,0 ein-gestellt und 5 bis 6 Tage lang mit etwa 2 1 destilliertern Wasser, das jeden Tag erneuert wird, bei tiefer Temperatur - am besten unter 5' C - unter Verwendung eines Cellophanbeutels dialyslert. Wenn die Lösung mehr als 5 Stunden stark alkalisch gelassen wird, sinkt die Aktivität. Deshalb sollte die 5 Lösung in diesem Dialysebeutel so bald wie möglich neutraHsiert werden. Wenn das plIder Lösung in dem Beutel bei dieser Dialyse,dern der Außenlösung gleich wird, d. li. etwa 5,6 bis 5,8 erreicht (Methylrot), werden die Verunreinigungen ausgefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert. Das Filtrat wird dann durch Ausfrieren getrocknet (Ausbeute 70 bis 75% des Niederschlags 2) und anschließend in destilliertem Wasser gelöst. Oder aber das Filtrat wird, ohne getrocknet zu werden, unverändert mit destilliertem Wasser ver-5 dünnt, bis es eine Konzentration von etwa 1 % erreicht. Wenn eine gesättigte Ammorviumsulfatlösung bei pH 5,6 bis 5,8 unter Rühren und Kühlen mit Eis in diese Lösung getropft wird, beginnt bei einer Konzentration von etwa 151/o Ammoniumsulfat ein Nie-3, derschlag3 auszufallen. Die Ammoniumsulfatlösun-, wird zugesetzt, bis eine Konzentration von 28% Ammoniumsulfat erreicht ist. Wenn die Lösung über Nacht im Eisschrank stehengelassen wird, w#ird der aktive Bestandteil in Form bräunlichgelber Körnchen 5 ausgeschieden.The precipitate 2 is in bi about 80 times its amount of sodium hydroxide solution 5 s at a pH Who-t 10.0 to 11.0 solved. The undissolved residue is centrifuged. The pure supernatant liquid is diluted with 1 N HCl on a; pH is brought one-of about 7.0, and 5 to 6 days with about 2 1 destilliertern water every day is renewed at low temperature - dialyslert using a Cellophanbeutels - preferably under 5 'C. If the solution is left strongly alkaline for more than 5 hours, the activity will decrease. Therefore, the solution should be 5 neutraHsiert in this dialysis bag as soon as possible. If the lower solution in the bag becomes the same as the outer solution during this dialysis, i. left When it reaches about 5.6 to 5.8 (methyl red), the impurities are precipitated. The precipitate is filtered off. The filtrate is then dried by freezing (yield 70 to 75% of the precipitate 2) and then dissolved in distilled water. Or the filtrate, without being dried, is diluted unchanged with distilled water until it reaches a concentration of about 1 %. If a saturated ammonium sulphate solution at pH 5.6 to 5.8 is added dropwise to this solution while stirring and cooling with ice, a low-level 3 starts to precipitate at a concentration of about 151% ammonium sulphate. The ammonium sulfate solution is added until a concentration of 28% ammonium sulfate is reached. If the solution is left to stand in the refrigerator overnight, the active ingredient is excreted in the form of brownish-yellow granules 5.

Dieser Niederschlag 3 wird durch Zentrifugieren abgetrennt, in einer kleinen Menge Wasser gelöst und 5 bis 6 Tage mit etwa 2 1 destilliertem Wasser, das j eden Tag erneuert wird, und unter Verwendung eines j Cellophanbeutels zur vollständigen Entfernung des Ammoniu#msulf ats dialysiert. Der dabei in kleiner Menge entstandene Niederschlag wird abfiltriert. Das Filtrat wird durch Ausfrieren getrocknet. Die Ausbeute an diesem getrockneten Produkt 4 beträgt etwa 5 35 % des Niederschlags 2 und liegt bei 7 bis 10 mg je 100 ccm Speichel. Dieses getrocknete Produkt 4 ist Speichelparotin.This precipitate 3 is separated by centrifugation, dissolved in a small amount of water and 5 distilled to 6 days with about 2 1 of water, the j very day is renewed, and dialyzed using a j Cellophanbeutels to completely remove the Ammoniu # msulf ats. The precipitate formed in small amounts is filtered off. The filtrate is dried by freezing. The yield of this dried product 4 is about 5 35% of the precipitate 2 and is 7 to 10 mg j e 100 cc saliva. This dried product 4 is salivary parotene.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung in Verbindung mit Filg. 3 der Zeichnung.The following example illustrates the invention in connection with Filg. 3 of the drawing.

Beispiel In 4,5 1 Speichel wurde die 4fach#e Menge Aceton unter Rühren eingetropft, um eine 801/oi,-e Konzentration an Aceton zu erzielen. Das Gemisch wurde 5 über Nacht stehengelassen. Die reine überstehende Flüssigkeit wurde abgehebert. Der Niederschlag wurdedurch Zentriftigieren,gesammelt, mehrmals mit 100ccm Aceton, und Äther gewaschen und im Vakutimexsikkator über Phosphorpentoxyd getrocknet. Die Ausbeute an Niederschlag aus dem 801/oigen Aceton betrug etwa lOg.EXAMPLE 4 times the amount of acetone was added dropwise to 4.5 l of saliva with stirring in order to achieve a concentration of 80% of acetone. The mixture was allowed to stand for 5 overnight. The pure supernatant liquid was siphoned off. The precipitate was centrifuged, collected, washed several times with 100ccm acetone and ether and dried over phosphorus pentoxide in a vacuum desiccator. The yield of precipitate from the 801% acetone was about 10 g.

lOg dieses getrockneten Pulvers wurden unter Zusatz von 150 ccm Eisessig verrührt und extrahiert, während alles auf einem Wasserbad 2 Stunden bei 5 60' C gehalten wurde. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde der Extrakt durch ein Glasfilter filtriert. Der Rückstand wurde zweimal mit 150 ccm Eisessig wie oben extrahiert. Er wurde dann mit 50 ccm Eisessig gewaschen. Beim Vereinigen der drei Filtrate wurden 500 ccm Extrakt erhalten. Wenn zu iliesem Extrakt 1 ceni einer gesättigten -wäßrigen Kochsalzlösung - eben wurde, wurde die Lösung Z, zeg trübe. Wenn ferner 500 ecin Äther in mehreren Anteilen zu der Lösung gegeben wurden, scliied sich ein weißer Niederschlag ans. _Nach Stehen über -Nacht irn Ei-,schrank wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren isoliert. Der Niederschlag wurde zweimal mit 30 ccm Aceton und mehrmals mit 30 ccm Äther gewaschun. iiiii die Essigsätire zu entfernen. Der Niederschlag wurde dann im \'akuumexsikkator Über Phosphorpentoxydgetrocknet. DieAusbeutebetrug1,558g. Dieser Ätherniederschlag wurde in 100 cem Wasser von etwa 1),1 10,0 gelöst, und die unlöslichen Bestan#dteile wurden durch Zeiitrifti-ieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde init 1 n-H CI auf pH 7,0 gebracht und mit 2 1 düstIiierteni Wasser unter Verwendung eines Cellophanbeutels unter 5' C dialvsiert. Die äußere Flüsszigkeit bei der Dialyse wurde täglich erneuert und die Dialyse 6 Tage lang ausgeführt. Es hatte sieh dann üin Niederschlag in dein Dialvsebeutel #ebilidet. Der p11-Wert betrug 5,6 bis 5,8 (-\l#tli-,71 rot) . Wenn der Niederschlag mit seinem Filtripapier filtriert wurde. wurde die durchsichtige bräunlrichge-Ibe Lösung erhalten. Die Konzentration an Protein in dieser Lösung betrug etwa 1 %. Die Menge dieser Löz#ung betru - etwa 111 ccm. Wenn 222 ccin einer geen z#I -ziittigteil wäßrigen Amrnonitimsulfatlösuilg unter Rühren in die Lösung eingetropft wurden, während die Lösun- mit Eis gekühlt wurde, und die Konzentration auf 28% gebracht wurde, fiel der aktive BestancIteil in Forrn von bräunlichgelben Körnchen aus (s. Fig. 1). Nach Stehen über Nacht im Eisschrank wurde der Niederschlag durch Zentrifugiereil abgetrennt. DerNiederschlag hatte zu dieserZeit dieForm eines bräunlichgelben Harzes. Wenn dieser Nieder-,chla- in 30ccin destilliertem Wasser -elöst und b 6 Tage lang in 2 1 destilliertem Wasser, das täglich Z, C, erneuert wurde, unter Verwendung eines Cel-lophanbentels dialysiert wurde, wurde eine geringe Menge eines Niederschlags ausgeschieden. Der Niederschlag wurde mit feinem Filtripapier filtriert. Das so erlialtene durchsichtige Filtrat wurde durch Ausfrieren getrocknet. Die Ausbeute betrug 341,5 rng.10 g of this dried powder were stirred with the addition of 150 cc of glacial acetic acid and extracted, while everything was kept on a water bath at 560.degree. C. for 2 hours. After cooling to room temperature, the extract was filtered through a glass filter. The residue was extracted twice with 150 cc of glacial acetic acid as above. It was then washed with 50 cc of glacial acetic acid. When the three filtrates were combined, 500 cc of extract was obtained. When this extract 1 ceni of a saturated aqueous saline solution - the solution Z, zeg became cloudy. Furthermore, when 500 ecin ether were added in several portions to the solution, a white precipitate formed. After standing overnight in an oven, the precipitate was isolated by centrifugation. The precipitate was washed twice with 30 cc of acetone and several times with 30 cc of ether. iiiii remove the acetic acid. The precipitate was then dried over phosphorus pentoxide in the vacuum desiccator. The yield was 1.558g. This ether precipitate was dissolved in 100 cem water of about 1), 1 10.0 , and the insoluble constituents were removed by etching. The supernatant was brought init 1 nH CI at pH 7.0 and with 2 dialvsiert 1 düstIiierteni water using a Cellophanbeutels under 5 'C. The external fluid in dialysis was renewed daily and dialysis was carried out for 6 days. It was then deposited in your dialvsebag #ebilidet. The p11 value was 5.6 to 5.8 (- \ l # tli-, 71 red) . When the precipitate was filtered with its filter paper. the transparent brownish-brown solution was obtained. The concentration of protein in this solution was about 1 %. The amount of these Loez # ung betru - cc about 111th When 222 cc of a small, partially aqueous ammonium sulfate solution were added dropwise to the solution with stirring while the solution was being cooled with ice, and the concentration was brought to 28%, the active ingredient precipitated in the form of brownish-yellow granules (see Sect . Fig. 1). After standing overnight in the refrigerator, the precipitate was separated off by centrifugation. The precipitate at that time was in the form of a brownish-yellow resin. If this is low, Chla- 30ccin in distilled water and b -elöst for 6 days in 2 1 of distilled water daily Z, C, renewed, was dialyzed using a Cel-lophanbentels, a small amount was eliminated a precipitate. The precipitate was filtered with fine filter paper. The transparent filtrate thus obtained was dried by freezing out. The yield was 341.5 ml.

Claims

PATENT CLAIMS. 1. A process for obtaining a new active ingredient from human or animal saliva, characterized in that the precipitate obtained after the addition of acetone at an acetone concentration of the solution of 70 to 8011 / o is dried, extracted with 15 times the amount of glacial acetic acid the extract the active ingredient in the presence of about 0,2Volumprozent saturated saline solution with a volume of the extract entsprechendenMen, geÄther fails, 'triggers Ziederschlag at pI, about 10 in water, the solution at 7.0 PII against water at a temperature lower than 5' to the C is dialyzed until the active ingredient solution has a pH of 5.6 b) is 5.8 , the resulting precipitate is removed, the cooled solution with a saturated ammonium Z :, zn sulfate solution up to a concentration of 281 / o Ammonium sulfate is added, the precipitate is dissolved in water, dialyzed in water and dried.

2. The method according to claim 1, characterized in that the extraction with glacial acetic acid with heating, preferably at 60 to 70 ° C, is carried out. i. Process according to Claim 1, characterized in that a mixture of 40 percent by volume glacial acetic acid and 60 percent by volume methanol is used as the extraction solution.