CZ422398A3

CZ422398A3 - Konstrukty nukleové kyseliny, jejichž aktivita je ovlivněna inhibitory kináz závislých na cyklinu, způsob přípravy takových konstruktů a jejich použití pro přípravu léčiva

Info

Publication number: CZ422398A3
Application number: CZ984223A
Authority: CZ
Inventors: Martin Prof. Dr. Eilers; Andrea Buergin; Hans-Harald Prof. Dr. Sedlacek
Original assignee: Hoechst Marion Roussel Deutschland Gmbh
Priority date: 1997-12-20
Filing date: 1998-12-18
Publication date: 1999-07-14
Also published as: BR9805152A; HUP9802961A3; AU9720498A; TR199802648A3; HU9802961D0; JPH11308997A; KR19990063284A; KR19990063285A; PL330452A1; US6265562B1; TR199802648A2; CA2255141A1; TR199802649A3; AU758030B2; PL330451A1; AR016436A1; CN1227871A; AU9720598A; EP0926236A1; TR199802649A2

Description

Oblast techniky

Předkládaná přihláška se týká proteinu, který inhibuje buněčný protein p27, a tím ruší inhibici buněčné proliferace způsobenou p27, jeho mutanty s částečně dominantně interferujícím charakterem, odpovídající nukleové kyseliny kódující takové proteiny, a použití proteinu a nukleové kyseliny k profylaxi a léčení nemocí. Proto vynález dále poskytuje konstrukty nukleové kyseliny, obsahující již zmíněnou nukleovou kyselinu, pro genovou terapii nemocí.

Dosavadní stav techniky

A) Úvod

Buněčný cyklus eukaryotické buňky je řízen kinázami závislými na cyklinu („cyclin-dependent kinase = cdk) , což jsou kinázy, které pro svou aktivitu potřebují jednu regulační podjednotku (cyklin). Různé procesy v buněčném cyklu (jako např. replikace, vstup do mitózy) jsou řízeny různými druhy cdk (Morgan, Nátuře 374, 1312, 1995) . Přitom aktivita kináz závislých na cyklinu je vysoce regulovaná. Existují vnitřní řídicí mechanismy, které zabraňují např. vstupu do mitózy, dokud není DNA úplně replikována. Řízení vnějšími faktory, jako jsou např. růstové faktory, existuje výlučně na začátku replikace DNA, kdy je replikace iniciována aktivním komplexem „cyklin E/cdk2.

Kromě množství cyklinu na kinázové podjednotce je aktivita kináz závislých na cyklinu regulována ještě malým

inhibitorovým proteinem (Sherr a Roberts, Gene Dev. 9, 1149,

1995). Pro „cyklin E/cdk2 se rozeznávají dva inhibitory, které se označují podle své velikosti p21 a p27. V buňkách, které exprimují vysoké množství p27, je kináza „cyklin E/cdk2 normálně inaktivní a vstup do fáze replikace DNA je tím blokován.

V mnoha lidských nádorech jsou pozitivní regulátory růstu nadměrně exprimovány nebo alespoň exprimovány konstitutivně (Sherr, Science 274, 1672, 1996), negativní regulátory jsou často mutovány nebo exprimovány slabě (Fero et al . , Cell 85, 733, 1996) . Existuje specifická korelace:

tak např. v mnohých nádorech se zjišťuje nadměrná exprese genů cyklinu Dl. Z toho vychází naděje, že kinázy závislé na cyklinu by mohly být cílovými strukturami při hledání nových, selektivně účinných, antiproliferativně působících látek.

Gen pro protein p27 je znám již několik let (K. Polyak et al . , Cell 78, 59-66, 1994) a je přístupný v databázi

Genbank (myší p27, přístupové číslo K 09968, lidský p27, K 10906) . I přes intenzivní hledání nebyly dosud nalezeny mutace v genu p27 v lidských nádorech. To je tím překvapivější, že myši, u kterých je gen p27 inaktivován, vykazují fenotyp s vícečetnou dysplázií a zvýšeným výskytem nádorů (Fero et al . , Cell 85, 733, 1996, Kiyokawa et al . , Cell 85, 721, 1996) . Místo toho je zřejmě funkce p27 v podstatě regulována postranskripčně.

Protein p27 je proteolyticky odbouráván, což se děje také na začátku replikace v normálních buňkách. Schopnost proteolyticky odbourávat p27 je v mnohých nádorech zvýšena ve srovnání s normálními buňkami, a toto zvýšení vykazuje přímou korelaci s nepříznivou prognózou (Loda et al., Nátuře Med. 3, 231, 1997).

• ·

Ale musí existovat ještě další mechanismy, které mohou vést k inaktivaci p27. Např. po transformaci buněk onkogenem myc je p27 nejdříve funkčně inaktivován (tj. neváže se již na komplex cyklin/cdk), ale teprve později je odbouráván. Dosud není jasné, proč např., v jedné řadě nádorů prsu je exprimováno vysoké množství proteinu p27, a přesto tyto nádory velmi rychle rostou. Mechanismy, které inaktivují p27 v těchto buňkách jsou dosud neznámé (Fredersdorf et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 6380, 1997).

V odborném světě představuje tudíž velký zájem objevit, mechanismy, popřípadě látky, které jsou zodpovědné za inaktivaci p27 v nádorech. Pomocí předkládaného vynálezu je tento problém řešen. V přihlášce předkládaného vynálezu popsaný protein pl63 může vázat p27, inhibovat funkci p27 a tak vést k proteolýze p27 v cytoplazmě.

Podstata vynálezu

B) Obecný popis vynálezu

1) Protein pl63 a příslušná sekvence nukleové kyseliny

Předmětem vynálezu je nový protein zvaný pl63, který váže p27, a tím inhibuje jeho funkci a vede k proteolýze v cytoplazmě. Sekvence aminokyselin tohoto proteinu byla stanovena.

Protein pl63 se specificky váže na p27 aniž by se vázal na jiné proteiny jako jsou např. myc, max, bcl-6 nebo prothymosin-a.

Předmětem vynálezu je dále sekvence nukleové kyseliny, která kóduje protein pl63. Tato sekvence je stanovena pro myší protein pl63 a prostřednictvím srovnání sekvencí také pro lidský p!63.

2) Dominantní negativní analogy p!63

Předmětem předkládaného vynálezu jsou také nukleotidové sekvence, které kódují částečný peptid z pl63 a/nebo analogu pl63, což je negativně působící protein, tj. který inhibuje vazbu přirozeného proteinu pl63 na protein p27, aniž by to bylo podstatně na újmu vazbě proteinu p27 na „cyklin E/cdk2, a tím podmíněné inhibici komplexu „cyklin E/cdk2.

Předmětem vynálezu je také použití sekvence nukleové kyseliny, která kóduje dominantní negativní mutantní pl63 nebo jeho částečné sekvence, přičemž použití obsahuje vložení této sekvence nukleové kyseliny do cílové buňky a inhibici vazby mezi vlastním proteinem pl63 této buňky a vlastním proteinem p27 této buňky, takže proliferace této cílové buňky je inhibována volným vlastním proteinem p27.

3) Peptidy inhibující p!63

Předmětem předkládaného vynálezu jsou také nukleotidové sekvence, které kódují proteiny nebo peptidy, které inhibují funkci pl63. Patří sem proteiny nebo peptidy, které se váží na vazebné místo proteinu p!63 pro protein p27 nebo na vazebné místo proteinu pl63 pro protein ran (Loeb et al. , Mol. Cell Biol. 4, 209-222, 1993), a tím inhibují vnitřní buněčný protein pl63.

K takovým proteinům patří peptidy, které odpovídají vazebnému místu proteinu p27 nebo proteinu ran pro protein pl63. K těmto proteinům patří také protilátky nebo fragmenty protilátek, jako např. F(ab)2, Fv a s.c.Fv se specifitou proti proteinu pl63, zvláště pak proti jeho vazebnému místu pro protein p27.

Předmětem vynálezu je dále použití sekvence nukleové kyseliny kódující takové inhibiční proteiny nebo peptidy, přičemž použiti obsahuje ' vložení těchto sekvencí nukleové • · • · ··· · · · · · · · · · • · · · · ···· • · « · · · · ···· · ··· · · · · · ··· ·· ··· ···· *· ·· kyseliny do cílové buňky a inhibici vazby mezi vlastním buněčným proteinem pl63 a vlastním buněčným proteinem p27 nebo vlastním buněčným proteinem ran, takže proliferace cílové buňky je ínhibována volným buněčným proteinem p27.

4) Použití pl63 pro stimulaci buněčného dělení

Předmětem předkládaného vynálezu je dále použití nukleotidové sekvence kódující protein pl63 nebo samotného proteinu pl63 pro inhibici vnitřního buněčného proteinu p27, a tím ke stimulaci buněčného dělení cílové buňky.

5) Inhibice transkripce a translace pl63

Předmětem předkládaného vynálezu je také sekvence nukleové kyseliny, která inhibuje transkripci a/nebo translaci vlastní buněčné sekvence nukleové kyseliny kódující pl63, a tím vede k přítomnosti volného proteinu p27, a tím k inhibici proliferace cílové buňky. Takové sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být např. „antisense triplex DNA (trojšroubovicová DNA s orientací proti smyslu transkripce), „antisense RNA (RNA s orientací proti smyslu transkripce) a/nebo ribozymy.

6) Testovací systémy k vyhledávání inhibitorů pl63

Předmětem vynálezu je dále použiti sekvence nukleové kyseliny kódující protein pl63 nebo jeho částečné sekvence pro testovací systémy, ve kterých se vyhledávají inhibitory vazby mezi proteinem pl63 a proteinem p27 nebo proteinem ran a použití v těchto systémech nalezených inhibitorů proteinu pl63 pro inhibici proliferace cílové buňky.

• ·

7) Průkaz p!63 pro účely diagnostiky onemocnění

Předmětem vynálezu je dále použití konstruktů nukleové kyseliny kódujících protein pl63 nebo částečné sekvence proteinu pl63 nebo použití sekvencí nukleové kyseliny nebo proteinových sekvencí, které se váží na tyto sekvence nukleové kyseliny pro protein pl63, nebo proteinů, které se váží na protein pl63, k prokázání nukleové kyseliny kódující pl63 nebo k detekci proteinu pl63 v buňce nebo tkáni nebo tělesné tekutině pro účely stanovení proliferačního stavu buňky nebo tkáně nebo pro diagnózu stavu nemoci.

8) Expresní systémy obsahující vazebnou sekvenci pro p27 nebo proteinový komplex pl63/p27

Předmětem vynálezu je proto dále expresní systém, obsahující sekvenci nukleové kyseliny, jejíž exprese je řízena proteinem p27 a který v nejjednodušším případě tvořen následujícími složkami:

Složku a)

-alespoň jedna aktivační sekvenci (promotor č. 1)

Složka b)

-alespoň jeden gen pro transkripční faktor sestávající se z fúzního proteinu obsahujícího

-složku b·,/ což je alespoň jedna aktivační doména transkripčního faktoru -složku b₂) což je

1) alespoň jedna sekvence nebo alespoň jedna částečná sekvence proteinu pl63, na kterou se váže protein p27, nebo

2) alespoň jedna protilátka nebo alespoň jeden fragment protilátky jako např. Fab, Fv nebo scFv, • · proteinu p27 pro alespoň jeden Fab, Fv nebo scFv, proteinu pl63 pro které se váží na vazebné místo protein p!63, nebo

3) alespoň jedna protilátka nebo fragment protilátky jako např. které se váží na vazebné místo protein p27, nebo

4) alespoň jedna protilátka nebo alespoň jeden fragment protilátky jako např. Fab, Fv nebo scFv, které se váží na komplex pl63 a p27.

-složku b₃) což je alespoň jedna DNA vazebná doména transkripčního faktoru

Složka c)

-alespoň jedna aktivační sekvence (promotor č. 2), která je aktivována navázáním transkripčního faktoru, který je kódován složkou b)

Složka d)

-alespoň jeden efektorový gen

Příklad uspořádání jednotlivých složek je ukázán na obr. 1. Předpokladem funkčnosti expresního systému podle předkládaného vynálezu je, aby složky b₂l), b₂2) nebo b₂3) byly vloženy mezi, popřípadě na, složky b₂) a b₃) takovým způsobem, že vazba proteinu p27 nebo proteinu pl63 na expresní produkt složky b₂) funkčnost aktivační domény (složka b₂) ) a/nebo DNA vazebné doména (složka b₃) ) inhibuje. Tato inhibice vede v buňkách, kde se vyskytuje volný p27 nebo pl63, k inhibici exprese efektorového genu. V buňkách, kde protein p27 a/nebo pl63 je vázán v komplexu, takže již nemůže reagovat se složkou b₂) nebo ho není k dispozici dostatek nebo již není vůbec, tato inhibice selhává, takže • · » 1 « · transkripční faktor (složka b) ) aktivuje nepoškozenou aktivační sekvenci (složka c) ) a tím může zahájit transkripci efektorového genu.

Zvláštnost představuje složka b₂4) . Vazbou komplexu pl63/p27 na složku b₂4) se v dělící buňce transkripční faktor (složka b)) inhibuje, v klidové buňce (tj. kde je volný p27) je proto transkripční faktor volný a plně funkční.

Transkripce efektorového genu je zahájena aktivací aktivační sekvence (složka a)), která je následována expresí genu pro transkripční faktor (složka b)). Transkripční faktor (složka b)) se zase váže na aktivační sekvenci (složka c)), která indukuje expresi efektorového genu (složka d)).

Ve zvláštním provedení předkládaného vynálezu je složka a) shodná se složkou c). V takovém provedení vynálezu vede i slabá aktivace aktivační sekvence (promotor č. 1, složka a)) k expresi traskripčního faktoru (složka b) ), který zase aktivuje aktivační sekvenci promotoru č. 1 (složka a)) a také aktivační sekvenci promotoru II (složka c) ) , a tím indukuje expresi genu pro efektorový gen (složka d) )a ještě také zesiluje expresi transkripčního faktoru (složka b) ) , čímž se zase zesiluje exprese efektorového genu (složka d)).

Tento expresní systém se muže dále rozšířit -seřazením více shodných nebo rozdílných sekvencí pro efektorový gen (složky d), ď), ď ') ) , které jsou navzájem spojeny shodnými nebo rozdílnými sekvencemi IRES nebo aktivačními sekvencemi (složky c') a c'')) .

-Seřazením více shodných nebo rozdílných genu pro transkripční faktory (složka b)), které jsou navzájem spojeny shodnými nebo rozdílnými sekvencemi IRES nebo aktivačními sekvencemi (složka a) nebo složka c)).

Při vřazení genů pro rozdílné transkripční faktory jsou aktivační sekvence vybrány tak, že obsahují nukleotidové sekvence, na které se může vázat transkripční faktor (složka

b) ) .

Konstruktem nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu může být efektorový gen (složka d)) v závislosti na volbě aktivační sekvence (složka a) nebo c) ) exprimován nespecificky, buněčně specificky nebo virově specificky, nebo specificky pro určité metabolické podmínky nebo specificky pro buněčný cyklus. V případě efektorového genu se jedná o gen, který sám kóduje farmakologicky aktivní látku nebo kóduje enzym, který štěpí inaktivní předstupeň léku na aktivní lék.

Například efektorový gen může být vybrán tak, že tato účinná látka nebo tento enzym je exprimován jako fúzní protein s ligandem, a tento ligand se váže na povrch buňky, např. Endotelové nebo nádorové buňky nebo leukocytu.

Konstrukty nukleové kyseliny podle vynálezu se skládají výhodně z DNA. Pojmem „konstrukty nukleové kyseliny se rozumí umělé výtvory z nukleové kyseliny, které mohou být v buňce transkribovány. Výhodně jdou vloženy do vektoru, přičemž výhodným vektorem je plazmidový nebo virový vektor.

Konstrukt nukleové kyseliny, případně vložený do vektoru, se podá pacientovi k profylaxi nebo léčení nemoci. Podání může být perorální, lokální nebo injekcí či infúzí.

Předmětem předkládaného vynálezu jsou také buňky savce, které obsahují konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu. Ve zvláště výhodném provedení vynálezu jsou konstrukty nukleové kyseliny zavedeny do buněčné linie, která pro transfekci jako nosič expresního systému podle vynálezu se může použít. Takové buňky se mohou použít pro přípravu ·· · · ···· · · · · • ·· · · ···· • · ·· · · · ···· · • · · ·· ··· ··· ·· ··· ···· ·· ·» léčivého přípravku pro pacienta. Popřípadě mohou buňky nebo buněčná linie, jako např. nádorové buňky nebo buňky imunitního sytému nebo endotelové buňky, do kterých je zaveden konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu, pacientovi podat lokálně nebo parenterálně, např. se injikuji intravenózně, intraarteriálně, do tělesné dutiny, do orgánu nebo subkutánně.

Výhodné použití konstruktu nukleové kyseliny podle vynálezu spočívá v profylaxi nebo léčení nemoci, přičemž vynález obsahuje in vitro zavedení konstruktu nukleové kyseliny do cílové buňky, nespecifickou, buněčně specifickou nebo virově specifickou, nebo specifickou pro určité metabolické podmínky nebo specifickou pro buněčný cyklus expresi léčiva v cílové buňce, a lokální nebo parenterální podání cílové buňky pacientovi, a nebo lokální nebo parenterální podání konstruktu nukleové kyseliny pacientovi k in vivo zavedení konstruktu nukleové kyseliny do cílové buňky.

Konstrukty nukleové kyseliny podle vynálezu jsou ve formě, ve které se nevyskytují v přírodě, tj. efektorový gen pro účinnou látku nebo enzym nebo pro fúzní protein „ligand-účinná látka nebo „ligand-enzym nejsou přirozeně kombinovány se sekvencemi nukleové kyseliny, tak jak jsou obsaženy v konstruktech nukleové kyseliny podle vynálezu.

Výhodné efektorové geny (složka d) ) , které jsou zabudovány do expresního systému podle vynálezu, kódují farmakologicky aktivní účinnou látku. Jsou to proteiny nebo glykoproteiny, vybrané ze skupiny obsahující cytokiny, růstové faktory, receptory cytokinů nebo růstových faktorů, • ·

I « • · indukované působící proteiny, proteiny, protilátky nebo fragmenty protilátek, antiproliferativně nebo cytostaticky působící proteiny, apoptoticky nebo antiapoptoticky působící proteiny, nádorové antigeny, inhibitory angiogeneze, trombózou inhibitory srážení, fibrinolyticky proteiny krevní plazmy, proteiny aktivující komplement, látky tvořící obaly virů a bakterií, hormony, peptidy působící na krevní oběh, neuropeptidy, enzymy, mediátory, přírodní, nezměněné regulátorové proteiny a ribozymy nebo nukleotidové sekvence (antisense) inhibičně působící na genovou expresi.

V případě transgenu se výhodně se jedná o efektorový gen, který kóduje ribozym, který inaktivuje mRNA, která kóduje protein vybraný ze skupiny obsahující proteiny kontrolující buněčný cyklus, zvláště cyklin A, cyklin B, cyklin Dl nebo cyklin E, E2F1-5, cdc2, cdc25C, pl63 nebo DPI nebo virové proteiny nebo cytokiny nebo růstové faktory nebo jejich receptory.

V dalším provedení vynálezu může efektorový gen kódovat fůzní protein „1igand-účinná látka, přičemž ligand může být protilátka, fragment protilátky, cytokin, růstový faktor, adhezivní molekula nebo peptidový hormon, a účinná látka může být farmakologicky účinná látka nebo enzym jak byly již popsány výše. tak např. efektorový gen může kódovat fůzní protein „ligand-enzym, přičemž enzym štěpí předstupeň léku na lék a ligand se váže na povrch buňky, výhodně endotelové nebo nádorové buňky.

• ·· · ·· ···· ··· « · · · · · ·· · ··· · ···♦· • · · · · · · ···· · ··· · · ··· ··· ·· ··· ···· ·· ··

Příklady provedení vynálezu

C) Podrobný popis vynálezu pomocí příkladů

1) Charakterizace proteinu pl63 a sekvence nukleové kyseliny kódující protein pl63

Pomocí „dvouhybridní technologie (Two-hybridtechnology, Fields a Song, Nátuře 340, 245, 1989) byl protein pl63 objeven jako partnerský protein proteinu p27. Celá kódující sekvence myšího proteinu p27 byla klonována pomocí PCR do kvasinkového vektoru pGBTIO (Clontech) ve čtecím rámci s DNA-vazebnou doménou transkripčního faktoru GAL4. Kvasinkový kmen Hf7c (Clontech Heidelberg, Matchmaker Two Hybrid, K 1605-1) byl transformován tímto vektorem, kolonie auxotrofní na tryptofan byly izolovány a exprese správného fúzního proteinu byla prokázána westernovým přenosem pomocí specifických protilátek proti GAL4 a p27.

Tento kmen byl ve druhé transformaci transformován cDNA-knihovnou z myšího embrya se značkou VP16 (Vojtek et al., Cell 74, 205, 1993). 400 kolonií, které byly auxotrofní na histidin v přítomnosti 15nM aminotriazolu, bylo nadále analyzováno. 70 těchto klonů bylo sekvencováno, všechny kódovaly různé cykliny typu D, což jsou známí interakční partneři p27. Pomocí Southernova přenosu bylo prokázáno, že 390 ze 400 rezistentních klonů kódovalo D-cykliny. Dva ze zbylých klonů (číslo 163) kódovaly shodný protein, a tyto klony byly úplně sekvencovány.

V jedné knihovně λΖΑΡ-cDNA připravené z buněk Balb/c3T3 bylo identifikováno několik klonů, které byly homologní k pl63. Sekvenční analýza ukázala jeden otevřený čtecí rámec, který byl využit také chiméře VP16 z cDNA knihovny užit. Oba původní klony kódovaly aminokyseliny 121 až 252 • · tohoto čtecího rámce. Klony pl63 byly dále charakterizovány pomocí reportérového genu pro β-galaktosidázu v kvasinkách.

Jak ukazuje tab. 1, kódovaný protein v kvasinkách reagoval specificky s p27, nikoliv s jinými proteiny jako např. myc, max, bel-6 nebo prothymosin-α. Tab. 1 ukazuje také první ohraničení domény p27, ve které dochází k interakci s pl63 . Tato data poukazují na to, že se pl63 váže na stejnou doménu p27 jako kinázy závislé na cyklinu (Russo et al. , Nátuře 382, 325, 1996). Což ukazuje, že pl63 a kinázy závislé na cyklinu kompetují o vazbu na p27. Doména pl63, která interaguje s p27, je vymezena aminokyselinami 121 až 252.

Pro potvrzení těchto výsledků z kvasinkového systému byl exprimovaný rekombinantní pl63 (exprimovaný jako fúzní protein s glutathiontransferázou GST) navázán na kolonu a pak afinitní chromatografií s proteinem p27 označeným ³⁵S na této koloně vyčištěn. Použitím fúzního proteinu pl63 s glutathiontransferázou (GST) bylo možné používat pro tyto experimenty jednotnou matrix (tzv. „GST-pulldowns, Hateboer et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90, 8489, 1993).

Pro tyto experimenty byl čtecí rámec přestavěn z kvasinkového klonu do vektoru pGEX (Pharmacia, Freiburg pGEX-2T, č. 27-4801-01), který kóduje chimérický protein s glutathiopn-S-transferázou (GST) pod kontrolou TAC promotoru indukovatelného IPTG v E. coli (Smith a Johnson, Gene 67, 31, 1988). Chimérický protein z indukovaných kultur E. coli byl pomocí afinitní chromatografie na glutathionagaróze přečištěn (Smith a Johnson, 1988) a pak dialyzován proti roztoku lOOmM Tris-HCl, pH 7,5, lOOmM KC1, 20mM EDTA, 10% glycerol, 0, ImM PMSF. Pro kontrolu byla stejným způsobem přečištěna glutathion-S-transferáza, a také dialyzována, přečištěné proteiny pak byly uloženy při -80 °C.

• · ► · 9 » · I s navazanou agarozou. dialyzačním pufrem s

Následně bylo 10 μ9 obou proteinů inkubováno s 10 pg BSA a 20 mg nasáklé GST-agarózy po 2 hodiny při 4 °C, poté byla agaróza odstředěna a dvakrát promyta v dialyzačním pufru. Jako kontrola pro vazbu proteinu byl alikvotní díl agarózy přímo ve zkušebním pufru povařen a navázané proteiny byly prokázány SDS-gelovou elektroforézou. Protein p27 značený 35S-methioninem byl připraven in vitro translací (podle pokynů výrobce: Promega Mannheim, „TNT coupled retclys systems, č. L4610) a inkuboval se 2 hodiny při 4°C v celkovém objemu 200 μΐ v dialyzačním pufru s 0,1% NP-40 Agaróza pak byla čtyřikrát promyta 0,1% NP-40 a nakonec povařena ve zkušebním pufru s SDS. Navázané proteiny pak byly prokázány SDS gelovou elektroforézou a fluorografií.

V tab. 2 jsou ukázány výsledky těchto pokusů. Ty dokládají, že rekombinantni p27, syntetizovaný in vitro a označený ³⁵S, se váže na kolonu, naplněnou chimérickým fúzním proteinem GST-pl63, ale neváže se na kolonu, která je naplněna stejným množstvím samotné GST. Tab. 2 také dokládá, že p27 z buněčného extraktu se váže neúčinně na GST-pl63, v takovém extraktu je totiž p27 vázán na komplex kinázy závislé na cyklinu. Krátké působení teplem uvolní p27 z takových komplexů a dovolí pak vazbu na pl63. To dokládá, že pl63 a kinázy závislé na cyklinu kompetují o vazbu na p27 .

Nukleotidová sekvence podle předkládaného vynálezu, která kóduje myší protein pl63, je uvedena v tab. 3. K této sekvenci existuje homolog v databázi, a sice gen pro nukleoprotein 2 (Nup2) kvasinky. Nup2 je protein jaderné membrány, který se podílí na vytváření jaderného proteinu a na transportu proteinů z jádra a do jádra. Nup2 se v kvasinkách podílí asi především na exportu.

Více funkčních domén je konzervativních, ačkoliv celková homologie není nijak vysoká (viz tab. 4) . Tak např. vazebné místo pro regulátorový protein (ran, GTP-vazebný protein), který reguluje jaderný transport, mezi ran vazebným proteinem (RBP-1), NuP-2 a pl63 je konzervována (viz tab. 5), stejně jako krátká pentapeptidová sekvence, které se přisuzuje strukturní funkce.

Aby se prokázalo, že v případě pl63 se bezpochyby jedná o nukleoporin, bylo použito polyklonální antisérum proti proteinu (histidin-pl63, aminokyseliny 121 až 252) připraveno a afinitně přečištěno, toto sérum zcela nesporně rozeznávající nukleoporin, bylo rozpoznatelné jako typické zabarvení jaderných póru (obarvené „tečky na povrchu a v periferii jádra) v imunofluorescenčním testu.

K prokázání intracelulárního spojení mezi pl63 nebo Nup2 a p27 byly oba proteiny transientnš exprimovány v buňkách HeLa pomocí CMV-vektoru, po 48 hodinách byly buňky lyžovány a vyšetřovány na možné interakce obou proteinů pomocí imunoprecipitace a westernového přenosu (Peukert et al . , EMBO J., 16, 5672, 1997). Asociace p27 a Nup2 byla prokázána pomocí polyklonálních protilátek proti Nup2 a proti myšímu p27. Protein p27 precipitoval dobře jen tehdy, byl-li exprimován pl63 (viz tab. 7) . To je průkaz toho, že Nup2 a p2 7 v HeLa buňkách in vivo se mohou navzájem asociovat.

Srovnáváni sekvencí a prohledávání databáze lidských EST klonů vedlo k identifikaci sekvence nukleové kyseliny lidského proteinu pl63 . Vazebná doména ran byla zjištěna v sekvenci AA161285 v pozicích 175 až 575, vazebná doména p27 leží v pozici 318 až 486 sekvence R62312 a další fragment z pl63 je v sekvenci THC199124 v pozici 348 až 489.

• ····

Aby se podrobněji definovalo, které aminokyseliny z p27 se účastní interakce s Nup2-pl63, byl v kvasinkách vyhledán mutant, který již nereagoval s pl63. Pro tento účel se cDNA kódující p27 podrobila PCR-reakci, která záměrně indukovala chyby (podmínky pro PCR byly dle „PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplifications, H.A.Erlich, Stockton Press, NY, 1989) a výsledné klony, obsahující náhodné chyby, byly testovány na interakci s Nup2 a pro kontrolu také s cyklinem Dl. Pokud se podmínky PCR lišily od výše zmíněné publikace, pak byly následující: 40 cyklů v přítomnosti 1 U Taq-polymerázy GIBCO a 0,1 mM MnCl2.

Získané fragmenty cDNA byly prostřednictvím vektoru pGBTIO, který byl linearizován BamHI a EcoRI a vyčištěn, kotransformovány do kvasinkového kmene Hf7c-pl63/Nup2. Transformované kolonie byly selektovány na médiu s chybějícím -Leu-Trp. Bylo tak izolováno 960 jednotlivých kolonií, které se vysely opět na selektivní médium (-LeuHis-Trp). S klony, které nerostly na tomto selektivním médiu byl proveden ještě další β-galaktosidázový test coby druhý test interakce. Negativní klony byly identifikovány a z nich byl izolován plazmid pGBT10-p27. Takto získané plazmidy byly nejprve retransformovány pomocí kvasinkového expresního plazmidu, který exprimoval pl63/Nup2 jako chiméru s transaktivační doménou, a pak byly retransformovány jako kontrola s plazmidem, který exprimoval cyklin Dl jako chiméru s transaktivační doménou. Získaly se tak tři klony, které selektivně již nadále nereagovaly s Nup2, ale zato reagovaly s cyklinem Dl. Tyto plazmidy byly společně s kontrolami sekvencovány.

Souhrnný přehled získaných fenotypů je uveden v tab. 13. V tomto pokuse se projevuje interakce jako růst v nepřítomnosti histidinu (-Trp-Leu-Hís, selektivní), • · · · · • · · · • · · · • ··· · · • · · • fe fefe zatímco kontrola (-Trp-Leu, neselektivní), ukazuje, že oba proteiny jsou v kvasinkách exprimovány. Z celkového počtu 1000 klonů byly nalezeny 3, které specificky nereagují s p!63-Nup2, zatímco interaguji s cyklinem Dl. Sekvence jsou uvedeny v tab. 14. Všechny tři klony, na rozdíl od řady kontrolních klonu, nesou stejnou mutaci v aminokyselině argininu 90 (mutován na glycin). Sekvence také ukazují, že klony vznikly nezávisle, neboť nesou další, rozdílné mutace. Tím se definoval arginin 90 zřetelně jako centrální aminokyselina při vzájemném působení p27 a Nup2. Mutanty jsou k dispozici pro ověření biologické relevance této interakce.

2) Nukleotidové sekvence pro dominantní negativně působící analogy proteinu p!63

Funkčními analýzami popsanými v předchozím textu byly poznány dvě domény proteinu pl63, které jsou rozhodující pro jeho funkci.

Jedna doména je doména (aminokyseliny 121 až 252) pro vazbu na p27. Druhou doménou je doména (aminokyseliny 3 07467) pro vazbu na ran, GTP-vazebný protein, který reguluje transportní funkci.

Předmětem předkládaného vynálezu jsou proto i sekvence nukleové kyseliny pro protein pl63 nebo části tohoto proteinu, přičemž tyto sekvence nukleové kyseliny vykazují mutace ve vazebné doméně pro p27 a/nebo vazebné doméně ran, takže vazba exprimovaného mutovaného proteinu s p27 nebo ran je výrazně snížena. Takové analogy pl63 zavedené do buňky inhibují funkční buněčné pl63. Tím zůstává p27 volný, což vede k inhibici buněčného dělení. Příklady takových dominantních negativních mutantů p!63 jsou uvedeny v tab. 8

• fc a 9. Tab. 8 ukazuje pl63 s delecí p27 vazebné domény, tab. 9 ukazuje pl63 bez ran vazebné domény.

Předmětem vynálezu je také zavedení konstruktu nukleové kyseliny kódující dominantní negativní pl63 analogy do buňky s cílem inhibovat proliferací této buňky. Toto zavedení do buňky se může provést in vivo nebo in vitro.

Pro co nej lepší a/nebo řízenou expresi konstruktu nukleové kyseliny podle vynálezu je tento výhodně navázán na aktivační sekvenci. Příklady takových aktivačních sekvencí jsou uvedeny v oddíle 8.3. pro lokalizaci v jádře je do nukleotidové sekvence kódující pl63 vložen jaderný lokalizační signál (NLS). Takové NLS jsou odborníkovi známé.

Konstrukt nukleové kyseliny je do buňky zaveden jako nahá DNA nebo pomocí nevirového vektoru nebo je vložen do virového vektoru metodami odborníkovi známými.

3) Nukleotidové sekvence pro proteiny nebo peptidy, které se váží na vazebné domény pl63

Prostřednictvím popsaného výzkumu mohla být určena vazebná doména proteinu pl63 pro p27 v úseku aminokyselin 121 až 252 a vazebná doména pro ran v úseku aminokyselin 307 až 467.

Předmětem předkládaného vynálezu jsou proto také konstrukty nukleové kyseliny, které kódují peptidy, jež se buďto váží na vazebnou doménu proteinu pl63 pro p27 a tím inhibuj í vazbu pl63 a p27 nebo se váží na vazebnou doménu proteinu pl63 pro ran a tím inhibuj í vazbu pl63 a ran. Díky této inhibici existuje zůstává volný p27, který vazbou např. na cyklinE/cdk2 inhibuje buněčnou proliferací. Příkladem takového inhibujícího peptidů jsou sekvence aminokyselin, které odpovídají vazebné doméně proteinu p27 pro pl63 (aminokyseliny 69 až 178) nebo ran proteinu.

Β ·« Β ΒΒ ·· ·· • · · · ΒΒΒΒ Β Β · ·

Β ·Β Β · · · ΒΒ · Β · Β Β Β ΒΒ Β β · • Β Β β Β ΒΒΒ

ΒΒΒ ΒΒ ΒΒΒ ΒΒΒΒ ΒΒ «Β

Dalším příkladem jsou protilátky nebo fragmenty protilátek jako F(ab)₂, Fab, Fv nebo s.c.Fv, které se váží na pl63, zvláště pak na p27 vazebnou doménu nebo ran vazebnou doménu pl63. Takové protilátky se mohou získat např. imunizací zvířat p27 vazebnou doménu nebo ran vazebnou doménu pl63. Tyto domény jsou znázorněny v tab. 5 (ran-vazebná doména) nebo tab. 10 (p27-vazebná doména).

Předmětem vynálezu je také zavedení konstruktů nukleové kyseliny kódující pl63 vazebné proteiny do buňky s cílem inhibovat proliferaci této buňky. Zavedení do buňky se může provést in vitro nebo také in vivo.

4) Nukleotidové sekvence pl63 pro stimulaci buněčného dělení

Zavedení nukleotidové sekvence pro pl63 nebo samotného proteinu pl63 do buňky vede k inhibici intracelulárního p27. Tím je komplex „cyklin E/cdk2 (který je inhibován p27) volný, což iniciuje buněčné dělení.

Předmětem vynálezu je proto také zavedení konstruktu nukleové kyseliny kódující pl63 do buňky s cílem podpořit proliferaci této buňky. Toto zavedení může být provedeno in vitro nebo in vivo.

Pro co nej lepší a/nebo řízenou expresi konstruktu nukleové kyseliny podle vynálezu je tento výhodně navázán na • 9 • · • · · • · » · · • 9 00 • 9 · 0 · ·· « · · · 0 · 0

9 ·· nukleotidové sekvence lokalizační signál (NLS) aktivační sekvenci. Příklady takových aktivačních sekvencí jsou uvedeny v oddíle 8.3. pro lokalizaci v jádře je do kódující pl63 vložen jaderný Takové NLS j sou odborníkovi známé.

Zavedením konstruktu nukleové kyseliny kódujícím pl63 se mohou např. buňky v buněčné kultuře nebo také buňky in vivo, např. při nedostateční proliferací, stimulovat k proliferací.

5) Nukleotidové sekvence pro inhibici transkripce a/nebo translace proteinu pl63

Znalost nukleotidové sekvence proteinu pl63 poskytuje možnost připravit oligonukleotidy, jimiž může být specificky inhibována transkripce nebo translace pl63. K takovým antisense nukleovým kyselinám patří oligonukleotidy, antisense triplex DNA, ribozymy nebo antisense RNA. Způsob přípravy triplexních oligonukleotidů DNA je podrobně popsán v Frank-Kamenetski a Mirkin, Ann. Rev. Biochem. 64, 65, 1995 a způsob přípravy antisense oligonukleotidů je popsán v Neckers et al . , Crit. Rev. Oncogen 3, 175, 1992, Carter a Lemoine, Br. J. Cancer 67, 869, 1993, Mukhdopadhyay a Roth, Crit. Rev. Oncogen 7, 151, 1996 a Mercola a Cohen, Cancer Gene Ther. 2, 47, 1995.

Výhodné podle vynálezu je použití triplexní DNA nebo antisense RNA oligonukleotidů, které hybridizují s nukleotidovými sekvencemi pl63, které částečně kódují vazebnou doménu pro protein p27 (celkový rozsah aminokyselin 121 až 252) nebo vazebnou doménu pro ran protein (celkový rozsah aminokyselin 307 až 467).

·· ·· • · · · <9 · «· ··· · · • · · • · ·· « ·· • · · · • ·· • · « · • · · ··· ·· • *» ·· « · • · • · · • · ·· · ····

K nukleotidovým sekvencím, které inhibují transkripci a/nebo translaci pl63, patří dále ribozymy specifické pro oblast nukleotidové sekvence proteinu pl63.

Způsob přípravy ribozymů je podrobně popsán v Burke, Nucl. Acids Mol. Biol . 8, 105, 1994, Christoffersen a Marr, J. Med. Chem. 38, 2023, 1995 a Scott et al. , Science 274, 2065, 1996. Výhodné jsou podle vynálezu ribozymy, které hybridizují s nukleotidovými sekvencemi pl63, které leží v rozmezí nukleotidové sekvence vazebné domény pro protein p27 (aminokyseliny 121 až 252) nebo vazebné domény pro protein ran (aminokyseliny 307 až 467) .

Příklady nukleotidových sekvencí pl63 štěpitelných ribozymy jsou uvedeny v tab. 11.

Triplexní DNA, antisense RNA nebo ribozymy se mohou podat jako oligonukleotidy (připravené a chráněné proti odbourávání DNázami popřípadě RNázami způsoby odborníkovi známými, viz výše citovaná literatura) buďto in vitro do cílových buněk nebo také in vivo injekcí nebo lokální aplikací.

Předmětem vynálezu je také zavedení konstruktu nukleové kyseliny do buňky s cílem, aby v buňce transkripcí antisense RNA nebo ribozymů vznikl oligonukleotid podle vynálezu, který by inhiboval proliferaci této buňky. Zavedení se může uskutečnit způsobem in vitro stejně jako in vivo.

Pro co nej lepší a/nebo řízenou expresi je konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu výhodně spojen s aktivační sekvencí. Příklady takových aktivačních sekvencí jsou uvedeny v oddíle 8.3.

Konstrukt nukleové kyseliny se do buňky vloží jako nahá

DNA nebo prostřednictvím nevirového vektoru nebo pomocí virového vektoru způsobem odborníkovi známým.

» 9 · · » · · · • · · · ·

6) Testovací systémy pro vyhledávání inhibitorů pl63

Objevení proteinu pl63 a jeho vzájemného působení s proteinem p27 umožňuje hledat inhibitory tohoto vzájemného působení. Proto jsou zapotřebí takové testovací systémy, ve kterých je vazba mezi proteinem p27 a proteinem pl63 inhibována, a tato inhibice může být prostřednictvím indikátoru sledována.

Je známo mnoho metod. Jedním z příkladů takové metody je test sledování dvou hybridů „two hybrid screen assay (viz oddíl Cl a tab. 1).

Alternativně se může ke screeningu využít afinitni systém, kde pl63 (výhodně p27 vazebná doména, aminokyseliny 121 až 2 52) je navázán na pevnou fázi, inkubuj e se s testovanou látkou a vazba testované látky se stanovuje prostřednictvím inhibice vazby označené vazebné partnerské molekuly pro p27 vazebnou doménu proteinu pl63. Tímto označeným, vazebným partnerem může být p27 nebo protilátka specificky se vážící na p27 vazebnou doménu protein u pl63.

Stejným způsobem jako pro inhibitory vazby mezi pl63 a p27 se mohou vytvořit testovací systémy pro inhibitory vazby mezi pl63 a ran, které lze pak využít pro testování. Předmětem vynálezu je proto také použití sekvence nukleové kyseliny kódující protein pl63 nebo část proteinu pl63 nebo použití proteinu pl63 nebo části tohoto proteinu pro vyhledávání inhibitorů pl63.

7) Použití sekvence nukleové kyseliny pro p!63 nebo proteinové sekvence pl63 pro diagnostiku proliferačního stadia buňky nebo stavu nemoci

Jak již bylo uvedeno v úvodu v oddíle A) , celá řada nádorů vykazuje zvýšenou intracelulární koncentraci p27.

Základem skutečnosti, že tyto nádory proliferují, je může uskutečnit značenou látku.

inhibování funkce zvýšeného p27. Podle předkládaného vynálezu je pl63 specifickým inhibitorem p27. Průkaz tohoto inhibitoru v buňce umožňuje usuzovat na proliferační stav buňky. Toto usuzování může být velmi důležité, neboť se např. může týkat určení malignity nádorové buňky nebo tkáně. Buněčnou smrtí dochází k uvolnění proteinu pl63. Průkaz pl63 v tělesných tekutinách dovoluje také soudit na proliferační a/nebo buněčnou smrtí začínající, např. zánětlivé procesy v těle. Průkaz proteinu pl63 se prostřednictvím specifické vazby na

K takovým specificky se vážícím látkám patří např. protein p27, protein ran a protilátky, např. protilátky získané imunizací zvířete proteinem pl63 nebo částečnou sekvencí tohoto proteinu.

Průkaz mRNA pro pl63 v buňce nebo tkáni je možné provést hybridizaci sekvence nukleové kyseliny kódující pl63 s odpovídající mRNA. Zvýšení citlivosti takového průkazu je možné dosáhnout pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR), která je odborníkům známa, a kterou lze amplifikovat (zmnožit) několik kopií hledané sekvence nukleové kyseliny pomocí tzv. páru oligonukleotidových primerů.

Příklady oligonukleotidových párů vhodných pro amplifikaci a k průkazu sekvence nukleové kyseliny kódující pl63 jsou uvedeny v tab. 12a, 12b a 12c

Průkaz RNA kódující pl63 je možný také např. fluorescenční in šitu hybridizaci způsobem, který publikoval von Gussoni et al., Nátuře Biotechnol. 14, 1012, 1996.

Předmětem předkládaného vynálezu je také průkaz sekvence nukleové kyseliny kódující pl63 nebo proteinu pl63 pro určení proliferačního stavu buňky nebo tkáně nebo pro průkaz proliferačních nebo buněčnou smrtí zahájených změn v živém savci.

• · • ·

8) Zvláštnosti expresních systémů, které jsou řízeny pl63, p27 nebo komplexem pl63/p27

8.1 Složka b_x)

8.1.1. Vazebná sekvence pro pl63, p2 7 nebo proteinový komplex pl63/p27 (složka b₂) )

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu obsahuje expresní systém ve své složce b₂) alespoň sekvenci nukleové kyseliny pro protein pl63 nebo pro takovou jeho část, která se váže na protein p27.

V dalším výhodném provedení vynálezu expresní systém obsahuje ve složce b₂) alespoň jednu sekvenci nukleové kyseliny pro protilátku nebo část protilátky s vazebnou sekvencí (VH a VL)

-pro vazebné místo proteinu p27 pro protein pl63, nebo -po vazebné místo proteinu pl63 pro protein p27.

V tomto provedení se např. v buňce se vyskytující volný protein p27 nebo volný protein p!63 váže na expresní produkt složky b₂) a tím inhibuje transkripční faktor kódovaný složkou b) a blokuje tak expresní systém. Pokud je přesto např. v buňce vytvořen komplex spojující protein p27 a protein pl63, tak zůstává expresní produkt složky b₂) volný a tedy také transkripční faktor (složka b)) je volný a expresní systém je funkční.

Takový expresní systém podle předkládaného vynálezu je proto funkční v dělících se buňkách (v přítomnosti komplexů pl63/p27) a v klidových buňkách je inhibován (volný p27).

V dalším zvláštním provedení vynálezu obsahuje expresní systém ve své složce b₂) alespoň jednu sekvenci nukleové kyseliny pro protilátku nebo část protilátky s vazebnými sekvencemi (VH a VL) pro komplex tvořený p27a pl63.

• ·

V takovém provedení se komplexy z p27 a pl63 váží na expresní produkt složky b₂) a blokují tak expresní systém, zatímco volný p27 nebo volný pl63 se na expresní produkt složky b₂) neváží.

Takový expresní systém podle předkládaného vynálezu je proto blokován v dělících se buňkách (v přítomnosti komplexů pl63/p27) a je funkční v klidových buňkách (volný p27).

Vhodnou volbou protilátek pro složku b₂) jsou výhodně části protilátky vážící epitop FV_LFV_H, v případě myších protilátek v humanizované podobě. Humanizace protilátek se provádí způsobem, který publikovali Winter et al. (Nátuře 349, 293, 1991) a Hoogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Kemobiol. 36, 19, 1993) . Fragmenty protilátek se připraví způsobem známým ze stavu techniky, např. jak popsali Winter et al. (Nátuře 349, 293, 1991), Hoogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19, 1993, Girol. Mol. Immunol. 28, 1379, 1991) nebo Huston et al . (Int. Rev. Immunol. 10, 195, 1993). Detailní popis přípravy protilátek, fragmentů protilátek a rekombinantních fragmentů protilátek je k dispozici v patentové přihlášce DE 9649645.4.

Rekombinantní fragmenty protilátek byly připraveny přímo z již existujících hybridomů anebo byly získány pomocí techniky „phage display z knihovny myších, popřípadě lidských protilátkových fragmentů (Winter et al. , Annu. Rev. Immunol. 12, 433, 1994). Tyto fragmenty protilátek byly pak užity na genetické úrovni přímo pro spojení se složkami b-J a b₃) .

Pro přípravu rekombinantních protilátkových fragmentů z hybridomů byla získána genetická informace kódující antigen vážící domény (VH, VL) protilátky tak, že se izolovala mRNA, RNA se reverzně transkribovala do cDNA a nakonec se prostřednictvím polymerázové řetězové reakce

(PCR) amplifikovala pomocí oligonukleotidů komplementárních k 5'konci popřípadě 3'konci variabilního fragmentu. Takto získané fragmenty DNA kódující protilátkové fragmenty V_H a V_Lbyly pak klonovány do bakteriálních expresních vektorů, takže mohly být exprimovány např. fragmenty FV, jednořetězcové fragmenty Fv (scFv) nebo fragmenty Fab.

Nové fragmenty protilátek se mohly izolovat pomocí techniky „phage display také přímo z knihovny protilátek (tzv. imunoknihovna, nebo naivní knihovna) myšího nebo lidského původu. Při použití techniky „phage display byly antigen vážící domény klonovány jako fúzní proteiny s genem, pro obalový protein g3P vláknitého bakteriofága buďto do fágového genomu nebo do fagemidového vektoru ve formě genu pro scFv fragment nebo fragment Fab. Fágy, které vázaly antigen, byly selektovány pomocí plastikových misek povlečených antigenem („rýžování), pomocí paramagnetických kuliček („beads) konjugovaných s antigenem nebo prostřednictvím vazby na buněčné povrchy.

Imunoknihovny byly připraveny amplifikací pomoci PCR genu pro variabilní protilátkový fragment z B-lymfocytů imunizovaného zvířete nebo pacienta. K tomu se použila kombinace oligonukleotidů, které jsou specifické pro myší nebo lidské imunoglobuliny popřípadě lidské imunoglobulinové genové rodiny.

Naivní knihovny je možné připravit využitím neimunizovaného dárce jako zdroje imunoglobulinového genu. Alternativně se mohou využít geny imunoglobulinové zárodečné řady pro přípravu semisyntetického repertoáru protilátek. Přitom komplementaritu určující úsek 3 doplněn variabilního fragmentu se doplnil prostřednictvím PCR pomocí degenerovaných primerů. Tyto knihovny, tzv. „single pot knihovny mají ve srovnání s imunoknihovnami tu výhodu, že ·· ··

• · » · « • · · · mohou být izolovány fragmenty protilátek proti několika antigenúm z jediné knihovny.

Afinita protilátkových fragmentů může být ještě zvýšena prostřednictvím techniky „phage display, přičemž může být připravena nová knihovna z již existujících fragmentů protilátek pomoci náhodné, na kodonech založené nebo cílené mutageneze, pomocí přesunu „chain shuffling jednotlivých domén fragmentů z naivního repertoáru nebo pomocí bakteriálního mutátorového kmenu, a pak se fragmenty se zlepšenými vlastnostmi izolují reselekcí za stringentních podmínek. Kromě toho se mohou myší protilátkové fragmenty postupnou výměnou variabilní domény za lidský repertoár a následnou selekcí s původním antigenem („guided selection) humanizovat. Alternativně se humanizace myších protilátek provede cílenou výměnou hypervariabilních úseků lidských protilátek za odpovídající úseky původních myších protilátek.

8.1.3. Aktivační doména (složka b_x) ) a DNA-vazebná doména (složka b₃) )

Podle vynálezu se mohou pro složku b) použít všechny dostupné geny aktivačních domén a DNA-vazebných domén transkripčního faktoru. Neomezující příklady takových genů j sou :

- Aktivační domény (složka b_x) ) alespoň jedna sekvence • cDNA pro kyselou transaktivační doménu (TAD) HSV1-VP16 (aminokyseliny 406 až 488, Triezenberg et al. , Genes Developm. 2, 718, 1988, Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190, 1995 nebo aminokyseliny • · • ·· · · · · ·· • · * · · · · ··· · • · · · · · · ··· · · ······· ·· ··

413 až 490, Regier et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA

90, 883, 1993) nebo • aktivační doména Oct-2 (aminokyseliny 438 až 479,

Tanaka et al . , Mol. Cell Biol., 14, 6046, 1994, nebo aminokyseliny 3 až 154, Das et al., Nátuře, 374, 657,

1995) nebo • aktivační doména SPI (aminokyseliny 340 až 485,

Courey a Tijan, Cell 55, 887, 1988) nebo • aktivační doména NFY (aminokyseliny 1 až 233, Li et al., J. Biol. Chem. 267, 8984, 1992, van Hujisduijnen et al., EMBO J. 9, 3119, 1990, Sinha et al., J. Biol.

Chem. 92, 1624, 1995, Coustry et al . , J. Biol. Chem.

270, 468, 1995) nebo • aktivační doména ITF2 (aminokyseliny 2 až 452, Seipel et al., EMBO J. 13, 4961, 1992) nebo • aktivační doména c-myc (aminokyseliny 1 až 262, Eilers et al.) nebo • aktivační doména CTF (aminokyseliny 399 až 499,

Mermod et al. , Cell 58, 741, 1989, Das a Herr, Nátuře

374, 657, 1995)

- DNA-vazebné domény (složka b₃) ) alespoň jedna sekvence • cDNA pro DNA-vazebnou doménu proteinu Gal4

(aminokyseliny Cell Biol., 10,	1 až 147, Chasman a 2916, 1990) nebo	Kornberg,	Mol .
• proteinu LexA	(aminokyseliny 1 až 81	, Kim et	al. ,
Science 255,	203, 1992) nebo celý	protein	LexA
(aminokyseliny	1 až 202, Brent et al.,	Cell 43,	729,

1985) nebo • · • ·

• proteinu represoru lac (lac I) (Brown et al . , Cell

49, 603, 1987, Fuerst et al . , PNAS USA 86, 2549, 1989) nebo • proteinu tetracyklinového represoru (tet R) (Gossen et al . , PNAS USA 89, 5547, 1992, Dingermann et al. ,

EMBO J. 11, 1487, 1992) nebo • proteinu ZFHD1 (Pomerantz et al. , Science 267, 93,

1995).

Výhodné podle předkládaného vynálezu je vložení jaderného lokalizačního signálu (NLS) na 3'konec DNA-vazebné domény.

8.2. Aktivační sekvence promotorové jednotky II (složka c)) aktivovatelná složkou b)

Výběr této aktivační sekvence se řídí podle výběru DNAvazebné domény (složka b₃)) v genu pro transkripční faktor (složka b)).

Pro příklady DNA-vazebných domén uvedené v oddíle

8.1.2. existují např. následující možnosti:

8.2.1. Možnost A) je vložena aktivační sekvence s alespoň jednou vazebnou sekvencí (nukleotidové sekvence: 5'-CGGACAACTGTTGACCG-3') (sekvence s identifikačním číslem 1) pro protein Gal4 (Chasman a Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916, 1990) a má (na svém 3' konci) • bazální promotor SV40 (nukleotidy 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor, New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory) nebo ·· · ·

• promotor c-fos	(Das et al . , Nátuře	374,	657, 1995)
nebo
• promotor U2 snRNA nebo
• promotor HSV TK	(Papavassiliou et al.	, J.	Biol. Chem.
265, 9402, 1990	, Park et al . , Molec	. Endocrinol. 7,

319, 1993) .

8.2 . 2 . Možnost Β)

- je vložena aktivační sekvence • s alespoň jednou vazebnou sekvencí (nukleotidová sekvence 5'-TACTGTATGTACATACAGTA-3j (sekvence s identifikačním číslem 2) pro protein LexA (operátor LexA, Brent et al. , Nátuře 612, 312, 1984) a (na jejím 3' konci) • bazální promotor SV40 (nukleotidy 48 až 5191, Tocze (ed.) , DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor New York,

New York, Cold Spring Harbor Laboratory) nebo jiný promotor (viz Možnost A).

8.2.3. Možnost C)

- je vložena aktivační sekvence • s alespoň jednou vazebnou sekvencí operátoru lac (nukleotidová sekvence: 5'-GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3j (sekvence s identifikačním číslem 3) pro represorový protein lac I (Fuerst et al. , PNAS USA 86, 2549, 1989, Simons et al . , PNAS USA 81, 1624, 1984) a (na jejím 3' konci) • bazální promotor SV40 (nukleotidy 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor New York, Ν. Y., Cold Spring Harbor Laboratory), nebo jiný promotor (viz Možnost A).

8.2.4 . Možnost D)

- je vložena aktivační sekvence • s alespoň jednou vazebnou sekvencí tetracyklinovéno operátoru (tet 0) (nukleotidová sekvence:

5' -TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG- 3')

(sekvence s	identifikačním číslem	4)	pro
tetracykllnový	represorový protein (tet	R) a	(na
jejím 3' konci)
bazální promotor SV40 (nukleotidy 48 až	5191, ^r	rooze
(ed.), DNA Tumor Viruses, Cold Spring	Harbor	New
York, N. Y. ,	Cold Spring Harbor Laboratory),	nebo
j iný promotor	(viz Možnost A).

8.2.5. Možnost E)

- je vložena aktivační sekvence • s alespoň jednou vazebnou sekvencí (nukleotidová sekvence: 5'-TAATGATGGGCG-3') (sekvence s identifikačním číslem 5) pro protein ZFHD-1 (Pomerantz et al., Science 267, 93, 1995) a (na jejím

3' konci) • bazální promotor SV40 (nukleotidy 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory), nebo jiný promotor (viz Možnost A).

8.3. Aktivační sekvence I (složka a))

Podle předkládaného vynálezu jsou jako aktivační sekvence použitelné nukleotidové sekvence, které po navázání transkripčního faktoru aktivují transkripci sousedního na 3'konci ležícího genu. Výběr aktivační sekvence se řídí podle toho, o jakou cílovou buňku a jakou nemoc se jedná, podle toho může být aktivační sekvence (složka a)) být • 9

... 9 · · 0 ·· j ...........

• •0 9· 0 0 0 .·. ·· 900 9000 ·· ·· aktivovatelná neomezeně nebo specificky pro cílovou buňku, specificky pro určité metabolické podmínky, specificky pro buněčný cyklus nebo virově specificky. Detailní popis takových promotorových sekvencí již byl uveden v patentových přihláškách EP95930524.4, EP95931933.6, EP95931204.2,

EP95931205.9, EP97101507.8 , DE19617851.7, DE19639103.2 a DE19651443.6,

8.3.1. Promotorové a aktivátorové sekvence, které mohou být aktivovány neomezeným způsobem, jako například

- promotor RNA polymerázy III

- promotor RNA polymerázy II

- promotor CMV a zesilovač CMV

- promotor SV40

8.3.2. Virové promotorové a aktivátorové sekvence, jako například

- HBV

- HCV

- HSV

- HPV

- EBV

- HTLV

- HIV

Když je použit promotor HIV, je použita celá sekvence LTR včetně sekvence TAR (pozice -453 až -80, Rosen et al., Cell, 41, 813, 1985) jako virově specifický promotor.

8.3.3. Metabolicky aktivovatelné promotorové sekvence a sekvence zesilovače (enhanceru), jako je například zesilovač indukovatelný hypoxií.

• · • ·

8.3.4. Promotory aktivovatelné specificky pro buněčný cyklus

Takové jsou například promotor genu cdc25C, genu cyklinu A, genu cdc2, genu B-myb, genu DHFR, genu E2F-1, genu cdc25B, nebo jiné vazebné sekvence pro transkripční faktory, které se objevují nebo jsou aktivovány během buněčné proliferace. K těmto vazebným sekvencím patří například vazebné sekvence pro proteiny c-myc. Tyto vazebné sekvence také zahrnují monomery nebo multimery nukleotidové sekvence, která se nazývá E-box genu myc (5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3' (sekvence s identifikačním číslem 6) (Blackwood a Eismann, Science 251, 1211, 1991).

8.3.5. Promotory aktivovatelné tetracyklinem, jako například tetracyklinový operátor v kombinaci s odpovídajícím represorem.

8.3.6. Chimérické promotory

Chimérický promotor tvoří kombinace aktivátorové sekvence proti směru čtení, která může být aktivována buněčně specifickým způsobem, metabolicky nebo způsobem virově specifickým, s promotorovým modulem po směru čtení, který může obsahovat nukleotidové sekvence CDE-CHR nebo E2FBS-CHR, na které se vážou supresorové proteiny, které prostřednictvím aktivace aktivátorové sekvence proti směru čtení mohou zastavit buněčný cyklus ve fázích G_o a (PCT/GB9417366.3, Lucibello et al., EMBO J. 14, 12, 1994).

8.3.7. Promotory aktivovatelné buněčně specificky

Patří k nim přednostně promotorové nebo aktivátorové sekvence promotorů nebo zesilovačů takových genů, které kódují proteiny přednostně tvořené ve vybraných buňkách.

Například podle předkládaného vynálezu se nejvhodněji používají v uvedených buňkách promotory pro následující proteiny:

8.3.7.1. promotorové a aktivátorové sekvence aktivované v endotelových buňkách

- pro mozek specifický endotelový přenašeč glukózy 1

- endoglin

- receptor VEGF 1 (flt-1)

- receptor VEGF 2 (flk-1, KDR)

- tie-1 nebo tie-2

- receptor B61 (receptor Eck)

- B61

- endotelin, zejména endotelin B nebo endotelin-1

- receptory endotelinu, zejména receptor endotelinu B

- receptory mannózo-6-fosfátu

- von Wilebrandtův faktor

- IL-la, IL-ΐβ

- receptor IL-1

- adhezivní molekula cévní buňky (VCAM-1)

- syntetické aktivátorové sekvence

Jako alternativa k přirozeným promotorům endotelově specifickým se mohou také použít syntetické aktivátorové sekvence, které obsahují oligomerizovaná vazebná místa pro transkripční faktory, které jsou přednostně nebo selektivně aktivní v endotelových buňkách. Takovým příkladem je transkripční faktor GATA-2, jehož vazebné místo v genu endotelinu-1 je 5'-TTATCT-3' (Lee et al . , Biol. Chem. 266, 16188, 1991, Dormann et al . , J. Biol. Chem. 267, 1279, 1992 a Wilson et al., Mol. Cell Biol. 10, 4854, 1990).

8.3.7.2. Promotorové nebo aktivátorové sekvence aktivované v buňkách v sousedství aktivovaných endotelových buněk

- VEGF

Genově regulační sekvence pro gen VEGF jsou 5' hraniční oblast, 3' hraniční oblast, gen c-src nebo gen v-src

- Receptory steroidních hormonů a jejich promotorové prvky (Truss a Beato, Endocr. Rev., 14, 459, 1993), zejména promotor viru myšího tumoru mléčné žlázy.

8.3.7.3. Promotorové nebo aktivátorové sekvence aktivované ve svalových buňkách, zejména v buňkách hladkého svalstva

- tropomyozin

- a-aktin

- a-myozin

- receptor pro PDGF

- receptor pro FGF

- MRF-4

- fosfofruktokináza A

- fosfoglycerátmutáza

- troponin C

- myogenin

- receptory pro endotelin A

- dezmin

- VEGF

Genové regulační sekvence pro gen VEGF již byly uvedeny v části nazvané „Promotory aktivované v buňkách v sousedství aktivovaných endotelových buněk (viz výše).

- „umělé promotory

Faktory rodiny HLH (šroubovice-smyčka-šroubovice, „helix-loop-helix) (MyoD, Myf-5_Z myogeny a MRF4) jsou ·· ·· > * · <

• · uváděny jako transkripční faktory svalově specifické. Dále ke svalově specifickým transkripčním faktorům patří protein „zinkového prstu GATA-4.

Proteiny HLH, a také GATA-4, projevují transkripci svalově specifickou nejenom s promotory genů svalově specifických, ale také v heterologním kontextu, tedy rovněž se syntetickými promotory. Takové umělé promotory jsou například mnohonásobné kopie (DNA) vazebného místa pro svalově specifické proteiny HLH, jako je box E (Myo D) (např. 4x AGCAGGTGTTGGGAGGC sekvence s identifikačním číslem 7) nebo mnohonásobné kopie DNA-vazebného místa pro GATA-4 geny těžkého řetězce α-myozinu (např. 5'-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG-3') (sekvence s identifikačním číslem 8).

8.3.7.4. Promotorové a aktivátorové sekvence aktivované v gliových buňkách.

Tyto zahrnují zejména genově regulační sekvence, popřípadě prvky genů, které například kódují následující proteiny:

- protein periaxin specifický pro Schwannovy buňky

- glutaminsyntetázu

- protein specifický pro gliové buňky (gliový vláknitý kyselý protein = GFAP)

- protein SlOOb gliové buňky

- IL-6 (CNTF)

- receptory 5-HT

- TNFa

- IL-10

- receptor růstového faktoru podobný inzulínu I a II

VEGF

• fe ·· • · · · • · ·· • · · · · • · ·

Genové regulační sekvence pro gen VEGF již byly uvedeny výše.

8.3.7.5. Promotorové a aktivátorové sekvence aktivované v hematopoetických buňkách

K těmto genovým regulačním sekvencím patří promotorové sekvence pro geny cytokinů nebo jejich receptorů, tyto geny jsou exprimovány v hematopoetických buňkách nebo v sousedních buňkách, jako jsou buňky stromatu.

Tyto sekvence zahrnují promotorové sekvence například pro následující cytokiny a jejich receptory:

- receptor faktoru kmenové buňky

- faktor kmenové buňky

- IL-la

- receptor IL-1

- IL-3

- receptor IL-3 (podjednotka a)

- receptor IL-3 (podjednotka β)

- IL-6

- receptor IL-6

- GM-CSF

- receptor GM-CSF (řetězec a)

- interferonový regulační faktor 1 (IRF-1)

Promotor IRF-1 je aktivován do stejné míry prostřednictvím IL-6 jako prostřednictvím IFNy nebo IFNP.

- erytropoetin

- receptor erytropoetinu

Μ « · · · • *

99 • · · · • · • · •

»·« ···· ·· ·· • · · · • · <·· • ··· · · • « · e· ··

8.3.7.6. Promotorové a aktivátorové sekvence aktivované v lymfocytech a/nebo makrofázích

Patří k nim například promotorové a aktivátorové sekvence genů cytokinů, cytokinových receptorů a adhezivních molekul a receptorů pro fragment Fc protilátek.

Patří k nim například:

receptor	IL-1
IL-la
IL-ΐβ
IL-2
receptor	IL-2
IL-3
receptor	IL-3
receptor	IL-3
IL-4
receptor	IL-4
IL-5
IL-6
receptor	IL-6
interferonový

(Promotor IRF-1 je aktivován prostřednictvím IL-6 do stejné míry jako prostřednictvím IFNy nebo ΙΕΝβ).

- promotor responzivní na IFNy

- IL-7

- IL-8

- IL-10

- IL-11

- IFNy

- GM-CSF

- receptor GM-CSF (řetězec a)

- IL-13

LIF • · • e

- receptor faktoru stimulujícího kolonii makrofágů (M-CSF)

- receptory makrofága I a II

- MAC-1 (leukocytární funkční antigen)

- LFA-la (leukocytární funkční antigen)

- pl50,95 (leukocytární funkční antigen)

8.3.7.7. Promotorové sekvence a aktivátorové sekvence aktivované v synoviálních buňkách

Patří k nim promotorové sekvence pro metaloproteinázy mezibuněčné hmoty (MMP), například pro

- MMP-1 (intersticiální kolagenáza)

- MMP-3 (stromelyzin/tranzin)

Dále k nim patří promotorové sekvence pro tkáňové inhibitory metaloproteináz (TIMP), například

- TIMP-1

- TIMP-2

- TIMP-3

8.3.7.8. Promotory a aktivátorové sekvence aktivované v leukemických buňkách

Patří k nim například promotory pro

- c-myc

- HSP-70

- bcl-l/cyklin D-l

- bcl-2

- IL-6

- IL-10

- TNFa, TNFP

- HOX-11

BCR-Abl

- E2A-PBX-1

- PML-RARA (promyelocytární leukemie - receptor kyseliny retinové(

- c-myc

Proteiny c-myc se váží na a aktivují nukleotidové sekvence, která se nazývá (5' -GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC- 3') s identifikačním číslem 6).

multimery E-box myc (sekvence

8.3.7.9. Promotory nebo aktivátorové sekvence aktivované v nádorových buňkách sekvence, se kterými interagují které se tvoří nebo jsou aktivní se považuj í za promotorové nebo

Genové regulační transkripční faktory, v nádorových buňkách, aktivátorové sekvence.

Podle předkládaného vynálezu výhodné promotory nebo aktivátorové sekvence zahrnují genově regulační sekvence nebo prvky z genů, které kódují proteiny, které jsou tvořeny zejména v rakovinných buňkách nebo buňkách sarkomů. Tedy v případě malobuněčných bronchiálních karcinomů je výhodné použití promotoru proteinu N-CAM, v případě ovariálních karcinomů použití promotoru receptoru růstového faktoru hepatitidy nebo L-plastinu, a v případě pankreatických karcinomů použití promotoru L-plastinu nebo polymorfního epitelového mucinu (PEM).

8.4. Efektorový gen (složka d))

Podle předkládaného vynálezu efektorové geny (složka

d) ) kódují sloučeninu pro profylaxi a/nebo léčbu nemoci. Efektorové geny a promotorové sekvence jsou vybírány s ohledem na povahu léčby nemoci a berou se do úvahy cílové buňky, které mají být transdukovány.

• · ► i • ·

Například následující kombinace promotorových sekvencí a efektorových genů se vybírají ve spojení s následujícími nemocemi (detailní popis byl již uveden v patentových přihláškách EP95930524.4, EP95931933.6,

EP95931205.9, EP97101507.8, D196.17851.7, a D196.51443.6, na které se tímto odkazuje).

EP95931204.2, D196.39103.2

8.4.1. Léčba nádorů

1.1. Cílové buňky:

- proliferující endotelové buňky nebo

- buňky stromatu a svalové buňky, které sousedí s endotelovými buňkami nebo

- nádorové nebo leukemické buňky

1.2. Promotory:

specifické pro endotelové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo buněčně nespecifické nebo specifické pro svalové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro nádorové buňky (solidní nádory a leukemie) a specifické pro buněčný cyklus

1.3. Efektorové geny inhibitorů buněčné proliferace například pro:

protein retinoblastomu (pRb=pllO) nebo příbuzné proteiny pl07 a pl30

Protein retinoblastomu (pRb/pllO) a příbuzné proteiny pl07 a pl30 jsou inaktivovány fosforylací. Dává se přednost použití takových genů těchto inhibitorů buněčného cyklu, které projevují mutace pro inaktivační místa exprimovaných proteinů, aniž by se tím zhoršila

funkce těchto proteinů. Příklady těchto mutací jsou popsány v případě pllO. Sekvence DNA proteinu pl07 nebo proteinu pl30 je mutována analogicky.

- protein p53

V buňce je protein p53 inaktivován buď vazbou na speciální proteiny, jako je MDM2, nebo oligomerizací p53 prostřednictvím defosforylovaného šeřinu na C-koncové části. Proto se dává přednost použití sekvence DNA pro protein p53, který byl na C-koncové části zkrácen odstraněním šeřinu 392.

- p21 (WAF-1)

- protein plS

- další inhibitory cdk

- protein GADD45

- protein bak

- vazebný protein pro regulační protein (viz II. 1.)

1.4. Efektorové geny pro faktory vyvolávající koagulaci a inhibitory angiogeneze, například:

- inhibitor aktivátoru plazminogenu 1 (PAI-1)

- PAI-2

- PAI-3

- angiostatin

- interferony (IFNa, IFNp nebo IFNy)

- destičkový faktor 4

- TIMP-1

- TIPM-2

- TIMP-3

- leukemický inhibiční faktor (LIF) tkáňový faktor (TF) a jeho koagulačně aktivní fragmenty

1.5. Efektorové geny pro cytostatické a cytotoxické proteiny, například pro:

- perforin

- granzym

- IL-2

- IL-4

- IL-12

- interferony, jako například IFN-α, IFNp nebo IFNy

- TNF, jako TNFa nebo TNFp

- onkostatin M

- sfingomyelináza

- magainin a deriváty magaininu

1.6 Efektorové geny pro cytostatické nebo cytotoxické protilátky a pro fúzní proteiny mezi protilátkovými fragmenty vázajícími antigen a cytostatickými, cytotoxickými nebo zánět vyvolávajícími proteiny nebo enzymy.

- K cytostatickým nebo cytotoxickým protilátkám patří ty, které jsou namířené proti membránovým strukturám endotelových buněk, jak byly popsány například autory: Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155, 1994), Hughes et al. (Cancer Res. 49, 6214, 1989) a Maruyama et al. (PNAS USA 87, 5744, 1990). Tyto protilátky zahrnují zejména protilátky proti receptorům VEGF.

Patří k nim dále cytostatické nebo cytotoxické protilátky, které jsou namířené proti membránovým strukturám na nádorových buňkách. Protilátky této povahy byly uvedeny v přehledech autory: Sedlaček et al. (Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Můnchen, 1988, a Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, Můnchen, 1992). Dalšími příklady jsou protilátky proti sialyl Lewis, proti peptidům na nádorech, které jsou rozeznávány T buňkami, proti proteinům, které j ako GD3, antigenům jsou exprimovány onkogeny, proti gangliosidům,

GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3, fukosyl GM1, proti krevních skupin a jejich prekurzorům, proti antigenům na polymorfním epitelovém mucinu, proti antigenům na proteinech tepelného šoku.

Dále k nim patří protilátky, které jsou namířeny proti membránovým strukturám leukemických buněk. Velké množství monoklonálních protilátek této povahy již bylo popsáno v diagnostických a léčebných způsobech (přehledy: Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52, 1994, Schranz,

Therapia Hungarica 38, 3, 1990, Drexler et al. , Leuk. Res.

10, 279, 1986, Naeim, Dis. Markers 7, 1, 1989, Stickney et al . , Curr. Opin. Oncol . 4, 847, 1992, Drexler et al. , Blut

57, 327, 1988, Freedman et al., Cancer Invest. 9, 69, 1991).

V závislosti na typu leukemie jsou jako ligandy vhodné například monoklonální protilátky nebo jejich protilátkové fragmenty vázající antigen namířeny proti následujícím membránovým antigenům:

Buňky Membránový antigen

AMD CD13

CD15

CD3 3

CAMAL

Sialosyl-Le B-CLL CD5

CDlc

CD2 3

Idiotypy a izotypy membrány imunoglobulinů

Buňky Membránový antigen

T-CLL CD33

M3 8 receptory IL-2 receptory T buněk

ALL CALLA

CD19

Nehodgkinský lymfom

- Humanizace myších protilátek, příprava a optimalizace genů pro Fab a rekombinantní fragmenty Fv se prováděj i podle odborníkům známé techniky (Winter et al. , Nátuře 349, 293, 1991, Hoogenbooms et al . , Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19, 1993, Girol, Mol. Immunol. 28, 1379, 1991 nebo Huston et al., Intern. Rev. Immunol. 10, 195,

1993) . Fúze rekombinantních fragmentů Fv s geny pro cytostatická, cytotoxické nebo zánět vyvolávající proteiny nebo enzymy se provádějí v souladu se stavem techniky, který je odborníkům znám.

1.7. Efektorové geny pro fúzní proteiny ligandů vázajících cílovou buňku s cytostatickými a cytotoxickými proteiny.

K takovým ligandům patří všechny látky, které se váží na membránové struktury nebo membránové receptory na endotelových buňkách. Například sem patří

- Cytokiny, jako například IL-1 nebo růstové faktory nebo jejich fragmenty či částečné sekvence, které se váží na receptory, které jsou exprimovány endotelovými buňkami, jako například PDGF, bFGF, VEGF a TGF.

- Dále k nim patří adhezivní molekuly, které se váží na aktivované a/nebo proliferující endotelové buňky. Patří • · · · · k nim například Slex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4 nebo vitronektin.

- Patří k nim další látky, které se váží na membránové struktury nebo membránové receptory nádorových nebo leukemických buněk. Například sem patří hormony nebo růstové faktory nebo jejich fragmenty či částečné sekvence, které se váží na receptory, které jsou exprimovány leukemickými nebo nádorovými buňkami.

Růstové faktory této povahy již byly popsány (přehledy autorů: Cross et al. , Cell 64, 271, 1991, Aulitzky et al. ,

Drugs 48, 667, 1994, Moore, Clin. Cancer Res. 1, 3, 1995,

Van Kooten et al., Leuk. Lymph. 12, 27, 1993).

- Geny ligandů, které se váží na cílovou buňku, jsou fúzovány s geny pro cytostatické, cytotoxické nebo zánět vyvolávající proteiny nebo enzymy v souladu se stavem techniky za použití metod, které jsou odborníkovi známy.

1.8. Efektorové geny pro induktory zánětů, například pro:

- IL-1

- IL-2

- RANTES (MCP-2)

- monocytární chemotaktický a aktivační faktor (MCAF)

- IL-8

- makrofágový zánětlivý protein 1 (ΜΙΡ-Ια, -β)

- neutrofilový aktivační protein 2 (NAP-2)

- IL-3

- IL-5

- lidský leukemický inhibiční faktor (LIF)

- IL-7

- IL-11

- IL-13

GM-CSF

- G-CSF

- M-CSF

- faktor kobřího jedu (CVF) nebo částečné sekvence CVF, které funkčně odpovídají lidskému komplementovému faktoru C3b, tj., které jsou schopny se vázat ke komplementovému faktoru B a které tvoří konvertázu C3 po štěpení faktorem D lidský komplementový faktor C3 nebo jeho částečná sekvence C3b

- štěpné produkty lidského komplementového faktoru C3, které jsou funkčně a strukturálně podobné CVF

- bakteriální proteiny, které aktivují komplement nebo vyvolávají záněty, jako jsou například poriny Salmonella typhimurium, „srážlivé („dumping) faktory

Staphylococcus aureus, moduliny, negativních bakterií, „hlavní protein legionel nebo Haemophilus influenzae typu B nebo klebsiel, nebo M molekuly streptokoků skupiny G.

zejměna z grammvnější membránový

1.9. Efektorové geny pro enzymy pro aktivaci prekurzorů cytostatik, například pro enzymy, které štěpí inaktivní prekurzorové látky (předléky) na aktivní cytostatika (léky).

Látky této povahy a předléky a léky, ke kterým jsou již byly uvedeny (Br. J. Cancer 70, připojeny v jednotlivých případech, v přehledech autorů: Deonarain et al.

786, 1994), Mullen (Pharmac. Ther. 63, 199, 1994) a Harris et al. (Gene Ther. 1, 170, 1994) . Lze použít například sekvence DNA pro jakýkoliv enzym z následujícíh:

- thymidinkináza viru herpes simplex

- thymidinkináza viru varicella zoster

- bakteriální nitroreduktáza

- bakteriální β-glukuronidáza

- rostlinná β-glukuronidáza ze Secale cereale

- lidská β-glukuronidáza lidská karboxypeptidáza (CB), například CB-A mastocytů, pankreatická CB-B nebo bakteriální karboxypeptidáza

- bakteriální β-laktamáza

- bakteriální cytosindeamináza

- lidská kataláza popř. peroxidáza

- fosfatáza, zejména lidská alkalická fosfatáza, lidská kyselá prostatická fosfatáza nebo kyselá fosfatáza typu 5 oxiaáza, zejména lidská lysyloxidáza nebo lidská kyselá D-aminooxidáza peroxidáza, zejména lidská glutathionperoxidáza, lidská eosinofilní peroxidáza nebo lidská thyroidní peroxidáza

- galaktosidáza

8.4.2. Léčba autoimunitních nemocí a zánětů

2.1. Cílové buňky:

- proliferující endotelové buňky nebo

- makrofágy a/nebo lymfocyty nebo

- synoviální buňky

2.2. Promotory:

specifické pro endotelové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro makrofágy a/nebo specifické pro lymfocyty a/nebo specifické pro buněčný cyklus

- specifické pro synoviální buňky a/nebo specifické pro buněčný cyklus • · ··

2.3. Efektorové geny pro léčbu alergií, například pro:

- IFNP

- IFNy

- IL-iO

- protilátky nebo protilátkové fragmenty proti IL-4

- rozpustné receptory IL-4

- IL-12

- TGFP

2.4. Efektorové geny pro prevenci rejekce transplantovaných orgánů, například pro:

- IL-10

- TGFp

- rozpustné receptory IL-1

- rozpustné receptory IL-2

- antagonisty receptoru IL-1

- rozpustné receptory IL-6 imunosupresivní protilátky nebo jejich fragmenty obsahující V_H a V_L nebo jejich fragmenty V_H a V_L, které jsou spojeny prostřednictvím spojky. Imunosupresivní protilátky jsou například protilátky specifické pro T buněčný receptor nebo jeho komplex CD3, proti CD4 nebo CD8, dále proti receptoru IL-2, receptoru IL-1 nebo receptoru IL-4 nebo proti adhezivním molekulám CD2, LFA-1, CD28 nebo CD40.

2.5. Efektorové geny pro léčbu autoimunitních nemocí zprostředkovaných protilátkami, například pro:

- TFGp

- IFNa

- IFNP

- IFNy • · » « • ·

- IL-12

- rozpustné receptory IL-4

- rozpustné receptory IL-6

- imunosupresivní protilátky nebo jejich fragmenty obsahující V_H a V_L

2.6. Efektorové geny pro léčbu autoimunitních nemocí zprostředkovaných buňkami, například:

- IL-6

- IL-9

- IL-10

- IL-13

- TNFa. nebo ΤΝΕβ

- imunosupresivní protilátky nebo jejich fragmenty obsahující V_H a V_L

2.7. Efektorové geny pro inhibitory buněčné proliferace, cytostatické nebo cytotoxické proteiny a enzymy pro aktivaci prekurzorů cytostatik.

Příklady genů kódujících proteiny této povahy již byly uvedeny v části nazvané „Efektorové geny pro léčbu nádorů.

Podle předkládaného vynálezu mohou být použity, ve stejné formě jak již bylo v příslušném bodě popsáno, efektorové geny, které kódují fúzní proteiny, které obsahují protilátky nebo fragmenty Fab nebo rekombinantní fragmenty Fv těchto protilátek nebo jiných ligandů, které jsou specifické pro cílové buňky, a výše zmíněné cytokiny, růstové faktory, receptory, cytostatické nebo cytotoxické proteiny a enzymy.

2.8. Efektorové geny pro léčbu artritis

Ve smyslu vynálezu jsou vybrány efektorové geny, jejichž exprimovaný protein přímo nebo nepřímo inhibuje zánět, například v kloubu, a/nebo podporuje rekonstituci mezibuněčné hmoty (chrupavky a vazivové tkáně) v kloubu.

Patří k nim například:

- antagonista receptoru IL-1 (IL-l-RA)

IL-l-RA inhibuje vazbu IL-Ια, β

- rozpustný receptor IL-1 rozpustný receptor IL-1 váže a inaktivuje IL-1

- IL-6

IL-6 zvyšuje sekreci TIMP a superoxidů a snižuje sekreci IL-1 a TNFa synoviálními buňkami a chondrocyty

- rozpustný receptor TNF rozpustný receptor TNF váže a inaktivuje TNF

- IL-4

IL-4 inhibuje tvorbu a sekreci IL-1, TNFa a MMP

- IL-10

IL-10 inhibuje tvorbu a sekreci IL-1, TNFa a MMP a zvyšuje sekreci TIMP

- růstový faktor podobný inzulínu (IGF-1)

IGF-1 stimuluje syntézu mezibuněčné hmoty

- TGF3, zejména TGFpi a TGFP2

TGF3 stimuluje syntézu mezibuněčné hmoty

- superoxiddismutáza

- TIMP, zejména TIMP-1, TIMP-2 nebo TIMP-3

8.4.3. Léčba nedostatečné hematopoézy

3.1. Cílové buňky:

- proliferující nezralé buňky hematopoetického systému nebo

- buňky stromatu v sousedství hematopoetických buněk

3.2. Promotory:

- specifické pro hematopoetické buňky a/nebo specifické pro buněčný cyklus

- buněčně nespecifické a specifické pro buněčný cyklus

3.3. Efektorové geny pro léčbu anémie, například pro:

- erytropoetin

3.4. Efektorové geny pro léčbu leukopenie, například pro:

- G-CSF

- GM-CSF

- M-CSF

3.5. Efektorové geny pro léčbu trombocytopenie, například pro:

- IL-3

- leukemický inhibiční faktor (LIF)

- IL-11

- trombopoetin

8.4.4. Léčba poškození nervového systému:

4.1. Cílové buňky:

- gliové buňky nebo

- proliferující endotelové buňky

4.2. Promotory:

- specifické pro gliové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo • · ·· • · ·

·· ·· > · » ·

I · · »

9 · a • · « • · · · specifické pro endotelové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo

- nespecifické a specifické pro buněčný cyklus

4.3. Efektorové geny pro neuronové růstové faktory, například:

- FGF

- nervový růstový faktor (NGF)

- neurotrofický faktor pocházející z mozku (BDNF)

- neurotrofin-3 (NT-3)

- neurotrofin-4 (NT-4)

- ciliární neurotrofický faktor (CNTF)

4.4. Efektorové geny pro enzymy, například pro:

- tyrosinhydroxylázu

- dopadekarboxylázu

4.5. Efektorové geny pro cytokiny a jejich inhibitory, které inhibují nebo neutralizují neurotoxický účinek TNFa, například pro:

- TGF3

- rozpustné receptory TNF receptory TNF neutralizují TNFa

- IL-10

IL-10 inhibuje tvorbu IFNy, TNFa, IL-2 a IL-4

- rozpustné receptory IL-1

- IL-1 receptor I

- IL-1 receptor II rozpustné receptory IL-1 neutralizují aktivitu IL-1

- antagonista receptoru IL-1

- rozpustné receptory IL-6

Β ΒΒ » Β • Β • · · • · • ΒΒ

8.4.5. Léčba poruch krevního koagulačního systému a krevního oběhu

5.1. Cílové buňky:

- endotelové buňky nebo

- proliferující endotelové buňky nebo somatické buňky v sousedství endotelových buněk a buněk hladkého svalstva nebo

- makrofágy

5.2. Promotory:

- buněčně nespecifické a specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro endotelové buňky, buňky hladkého svalstva nebo makrofágy a specifické pro buněčný cyklus

5.3. Strukturální geny pro inhibici koagulace nebo pro podporu fibrinolýzy, například pro:

- aktivátor tkáňového plazminogenu (tPA)

- aktivátor plazminogenu urokinázového typu (uPA)

- hybridy tPA a uPA

- protein C

- hirudin inhibitory serinové proteázy (serpiny), jako například inhibitor C-1S, al-antitrypsin nebo antitrombin III

- inhibitor dráhy tkáňového faktoru (TFPI)

5.4. Efektorové geny pro podporu koagulace, například pro:

- F VIII

- F IX

- von Willebrandúv faktor • ·

- F XIII

- PAI-1

- PAI-2

- tkáňový faktor a jeho fragmenty

5.5. Efektorové geny pro angiogenní faktory, například pro:

- VEGF

- FGF

5.6. Efektorové geny pro snížení krevního tlaku, například pro:

- kalikrein

- syntázu oxidu dusnatého endotelových buněk

5.7. Efektorové geny pro inhibici proliferace buněk hladkého svalstva po poranění vrstvy endotelu, například pro:

antiproliferační, cytostatický nebo cytotoxický protein nebo enzym pro štěpení prekurzorů cytostatik na cytostatika, jak již bylo uvedeno výše (pod nádory) nebo

- fúzní protein těchto aktivních sloučenin s ligandem, například protilátkami nebo fragmenty protilátek specifickými pro svalové buňky

5.8. Efektorové geny pro další proteiny krevní plazmy, například pro:

- albumin

- inaktivátor Cl

- sérovou cholinesterázu

- transferin

- 1-antitrypsin • · · · e · *· ·· • fcfc · · · · · · · · · ··· · ····· fc··· fc ······· ··· ·· ··· ··· ·· ······· «· ··

8.4.6. Vakcinace

6.1. Cílové buňky:

- svalové buňky

- makrofágy a/nebo lymfocyty

- endotělové buňky

6.2. Promotory:

- nespecifické a specifické pro buněčný cyklus nebo

- specifické pro cílovou buňku a specifické pro buněčný cyklus

6.3. - Efektorové geny pro profylaxi infekčních nemocí:

Možnosti přípravy účinných vakcín obvyklým způsobem jsou omezeny.

Proto tedy byla vyvinuta technologie DNA vakcín. Avšak tyto DNA vakcíny vyvolávají otázky s ohledem na sílu jejich účinnosti (Fynan et al. , Int. J. Immunopharm. 17, 79, 1995,

Donelly et al., Immunol. 2, 20, 1994).

Podle předkládaného vynálezu je třeba počítat s vyšší účinností DNA-vakcín.

DNA, která má být vybrána jako aktivní látka, je DNA pro protein, který je tvořen infekčním agens a který prostřednictvím vyvolání imunitní reakce, tj . pomocí vazby protilátky a/nebo prostřednictvím cytotoxických lymfocytů T, vede k neutralizaci a/nebo destrukci agens. Takzvané neutralizační antigeny této povahy jsou již používány jako vakcinační antigeny (viz přehled v Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263, 1992) .

Výhodné podle vynálezu jsou DNA kódující neutralizační antigeny následujících infekčních agens:

- virus chřipky A

- HIV

- virus rabies

- virus HSV (virus herpes simplex)

- RSV (respirační syncyciální virus)

- virus parainfluenzy

- rotavirus

- VZV (virus varicella zoster)

- CMV (cytomegalovirus)

- virus spalniček

- HPV (lidský papilomavirus)

- HBV (virus hepatitidy B)

- HCV (virus hepatitidy C)

- HDV (virus hepatitidy D)

- HEV (virus hepatitidy E)

- HAV (virus hepatitidy A)

- antigen vibria cholery

- Borrelia burgdorferi

- Helicobacter pylori

- antigen malárie

- Avšak podle vynálezu k aktivním látkám této povahy patří také DNA pro anti - idiotypovou protilátku nebo její fragmenty vázající antigen, jejichž struktury vázající antigen (komplementaritu určující oblasti) tvoří kopie proteinové nebo sacharidové struktury neutralizačního antigenu infekčního agens.

Anti-ídíotypové protilátky této povahy mohou nahradit zejména sacharidové antigeny v případe bakteriálních infekčních agens.

Anti-ídíotypové protilátky této povahy a jejich štěpné produkty byly uvedeny v přehledech autorů: Hawkins et al.

(J. Immunother. 14, 273, 1993) a Westerink a Apicella (Springer Seminars in Immunopathol. 15, 227, 1993).

• · • ·

9 9

6.4. Efektorové geny pro „nádorové vakcíny

Patří sem antigeny na nádorových buňkách. Antigeny této povahy byly uvedeny například v přehledech autorů:

Sedlaček et al. , Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag,

Múnchen, 1988, a Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag,

Můnchen, 1992.

Další příklady jsou tvořeny geny pro následující proteinové antigeny, popřípadě variabilní oblast (V_L, V_H) anti-idiotypových protilátek, odpovídající následujícím antigenům neproteinové povahy:

- gangliosidy

- sialyl Lewis

- peptidy na nádorech, které jsou rozpoznávány T buňkami

- proteiny exprimované onkogeny

- antigeny krevních skupin a jejich prekurzory

- antigeny na mucinu spojeném s nádory

- antigeny na proteinech tepelného šoku

8.4.7. Léčba chronických infekčních nemocí

7.1. Cílová buňka:

- jaterní buňka

- lymfocyt a/nebo makrofág

- epitělová buňka

- endotelová buňka

7.2. Promotory:

virově specifické nebo a specifické pro buněčný cyklus specifické buněčně

7.3. Efektorové geny například pro:

protein, který projevuje cytostatické, apoptotické nebo cytotoxické účinky.

enzym, který štěpí prekurzor antivirové nebo cytotoxické látky na aktivní látku.

7.4. Efektorové geny pro antivirové proteiny

- antivirově účinné cytokiny a růstové faktory. Patří k nim například IFNa, IFNp, IFNy, ΤΝΡβ, TNFa, IL-1 nebo TGFp protilátky mající specifitu, která inaktivuje příslušný virus, nebo jejich fragmenty obsahující V_Ha V_L, nebo jejich fragmenty V_H a V_L, které jsou spojeny prostřednictvím spojky, připraveny, jak již bylo popsáno.

Protilátky proti virovým antigenům jsou například: anti HBV anti HCV anti HSV anti HPV anti HIV anti EBV anti HTLV anti Coxsackie virus anti Hantaan virus

- protein vázající rev. Tyto proteiny se váží k rev RNA a inhibují kroky následující po transkripci závislé na rev v expresi retrovirových genů. Příklady proteinu vázajících rev jsou:

RBP9-27

RBP1-8U • »· · · · · · •· · · 0 0 0 0 0 0 0 0 • · 0 · 0 · · · · ·· 0 · 0 · · 0·00 0

0·· 00 0··

0 00 000 00 00 0· «0

RBP1-8D pseudogeny RBP1-8

- pro ribozymy, které štěpí mRNA genů pro proteiny, které řídí buněčný cyklus, nebo mRNA virů. Ribozymy, které jsou katalytické pro HIV, byly uvedeny v přehledech, například Christoffersen et al. , J. Med. Chem. 38, 2033, 1995.

7.5. Efektorové geny pro antibakteriální proteiny

K antibakteriálním proteinům patří například protilátky, které neutralizují bakteriální toxiny nebo které opsonizují baktérie. Patří k nim například protilátky proti

- meningokokům C nebo B

- E. coli

- Borreliím

- Pseudomonas

- Helicobacter pylori

- Staphylococcus aureus

8.5. Kombinace totožných nebo odlišných efektorových genů

Předmětem vynálezu je dále samozesilující, farmakologicky regulovatelný expresní systém, ve kterém jsou kombinovány sekvence DNA dvou totožných nebo dvou odlišných

ď)

Pro expresi obou efektorových genů (složky d) sekvencí DNA je jako regulační prvek mezi oba efektorové geny vložena další promotorové sekvence nebo výhodně cDNA vnitřního ribozomálního vstupního místa (IRES).

IRES umožňuje expresi dvou sekvencí DNA, které jsou spojeny k sobě navzájem prostřednictvím IRES.

IRES této povahy byly popsány například v článcích autorů: Montford a Smith (TIG 11, 179, 1995), Kaufman et al.

• · • · ► » · · > · · · • · · · · • · · • · · · (Nucl. Acids Res. 19, 4485, 1991), Morgan et al . (Nucl.

Acids Res. 20, 1293, 1992), Dirks et al. (Gene, 128, 247,

1993), Pelletier a Sonenberg (Nátuře 334, 320, 1988) a Sugitomo et al. (BioTechn. 12, 694, 1994).

Tak například může být použita cDNA sekvence IRES polioviru (pozice < 140 až > 630 z 5' UTR.

Podle vynálezu jsou výhodně spojovány přes další promotorové sekvence nebo sekvence IRES efektorové geny, které projevují aditivní účinek.

Ve smyslu vynálezu jsou výhodné kombinace efektorových genů například pro:

8.5.1. Léčbu nádorů totožné nebo odlišné cytostatické, apoptotické, cytotoxické nebo zánět vyvolávající proteiny nebo

- totožné nebo odlišné enzymy pro štěpení prekurzorů cytostatik

8.5.2. Léčbu autoimunitních nemocí odlišné cytokiny nebo receptory se synergickým účinkem na inhibici buněčné a/nebo humorální imunitní reakce nebo

- odlišné nebo totožné TIMP

8.5.3. Léčbu nedostatečné hematopoezy odlišné, hierarchicky následující cytokiny, jako například IL-1, IL-3, IL-6 nebo GM-CSF a erytropoetin,

G-CSF nebo trombopoetin

8.5.4. Léčbu poškození nervové buňky

- neuronový růstový faktor a cytokin nebo inhibitor cytokinů • · » · · · · « • · · · · • · · · · · < • · · , • · ··· ·· ··

8.5.5. Léčbu poruch krevního koagulačního systému a krevního oběhu

- antitrombotický přípravek a fibrinolytický přípravek (např. tPA nebo uPA) nebo cytostatický, apoptotický nebo cytotoxický protein a antitrombotický přípravek nebo fibrinolytický přípravek několik odlišných, synergisticky působících koagulačních faktorů, například F VIII a vWF nebo F VIII a F IX

8.5.6. Vakcinace

- antigen a cytokin stimulující imunitu, jako například IL-la, IL-ΐβ, IL-2, GM-CSF, IL-3 nebo receptor IL-4 různé antigeny jednoho infekčního agens nebo odlišných infekčních agens nebo

- různé antigeny jednoho nádorového typu nebo odlišných nádorových typu

8.5.7. Léčbu virových infekčních nemocí

- antivirový protein a cytostatický, apoptotický nebo cytotoxický protein protilátky proti odlišným povrchovým antigenům jednoho viru nebo několika virů

8.5.8. Léčbu bakteriálních infekčních nemocí

- protilátky proti odlišným povrchovým antigenům a/nebo toxinúm organismu • · » · » • · · • · • ·

8.6. Vložení signálních sekvencí a transmembránových domén

8.6.1. Zesílení translace Aby se zesílila translace, nukleotidová sekvence 3' konec promotorové startovacího signálu může být vložena například na na 5' konec popřípadě

GCCACC nebo GCCGCC sekvence a přímo (ATG) signální sekvence transmembránové sekvence (Kozák, J. Cell Biol. 108, 299,

1989).

8.6.2. Usnadnění sekrece

Aby se usnadnila sekrece expresního produktu efektorového genu, může být nahrazena homologní signální sekvence, která je přítomná v sekvenci DNA efektorového genu, heterologní signální sekvencí, která zlepšuje extracelulární sekreci.

Tedy například může být vložena signální sekvence pro imunoglobulin (pozice DNA < 63 až > 107, Riechman et al. , Nátuře 332, 323, 1988) nebo signální sekvence pro CEA (pozice DNA < 33 až > 134, Schrewe et al. , Mol. Cell Biol. 10, 2738, 1990, Berling et al. , Cancer Res. 50, 6534, 1990) nebo signální sekvence glykoproteinu lidského respiračního syncyciálního viru (cDNA pro aminokyseliny < 38 až > 50 nebo 48 až 65, Lichtenstein et al. , J. Gen. Virol. 77, 109, 1996).

8.6.3. Ukotvení aktivní sloučeniny

3.1. Aby se ukotvila aktivní sloučenina v buněčné membráně transdukované buňky, která tvoří aktivní sloučeninu, může být alternativně nebo kromě signální sekvence vložena sekvence pro transmembránovou doménu.

• · · • · ·

Tedy například mezi promotorovou sekvenci a sekvenci efektorového genu může být vložena transmembránová sekvence lidského faktoru stimulujícího kolonie makrofágú (pozice DNA < 1485 až > 1554, Cosman et al., Behring Inst. Mitt. 83, 15, 1988) nebo sekvence DNA pro signální a transmembránové oblasti glykoproteinu G lidského respiračního syncyciálního viru (RSV) (aminokyseliny 1 až 63 nebo jejich částečná sekvence, aminokyseliny 38 až 63, Vijaya et al . , Mol. Cell Biol. 8, 1709, 1988, Lichtenstein et al. , J. Gen. Virol. 77, 109, 1996) nebo sekvence DNA pro signální a transmembránové oblasti neuraminidázy viru chřipky (aminokyseliny 7 až 35 nebo částečná sekvence aminokyseliny 7 až 27, Brown et al. , J. Virol., 62, 3824, 1988).

3.2. Aby se ukotvila aktivní sloučenina v buněčné membráně transdukované buňky, která tvoří aktivní sloučeninu, může být však také vložena nukleotidové sekvence pro glykofosfolipidovou kotvu.

Glykofosfolipidová kotva je vložena nukleotidové sekvence pro efektorový gen vložení může být provedeno navíc kromě vložení signální sekvence.

Glykofosfolipidové kotvy byly popsány například pro CEA, pro N-CAM a pro další membránové proteiny, jako například Thy-1 (viz přehled Ferguson et al. , Ann. Rev. Biochem. 57, 285, 1988).

na 3' konec tak, že toto

3.3. Další možností pro ukotvení aktivní sloučeniny v buněčné membráně v souladu s předkládaným vynálezem je použití sekvence DNA pro fůzní protein ligand/aktivní sloučenina. Specifita ligandu tohoto fúzního proteinu je • · · · • · · • · · · · · namířena proti membránové struktuře na buněčné membráně vybrané cílové buňky.

K ligandům, které se váží na povrch buněk, patří například protilátky nebo protilátkové fragmenty namířené proti povrchovým strukturám, například:

endotelových buněk, zejména sem patří protilátky proti receptorům VEGF nebo kininovým receptorúm

- nebo svalových buněk, jako protilátky proti aktinu nebo protilátky proti receptorúm angiotenzinu II nebo protilátky proti receptorúm pro růstové faktory, jako například proti receptorům EGF nebo proti receptorům PDGF nebo proti receptorům FGF nebo protilátky proti receptorům endotelinu A

K ligandům také patří protilátky nebo jejich fragmenty, které jsou namířeny proti nádorově specifickým nebo s nádorem spojeným antigenům na buněčné membráně nádorových buněk. Protilátky této povahy již byly popsány.

Myší monoklonální protilátky se výhodně používají v humanizované formě. Fragmenty Fab a rekombinantní fragmenty Fv a jejich fůzní produkty, jak byly již popsány, se připravují technologii odborníkovi známou.

K ligandům dále patří všechny aktivní sloučeniny, jako například cytokiny nebo adhezivní molekuly, růstové faktory nebo jejich fragmenty či částečné sekvence, mediátory nebo peptidové hormony, které se vážou na membránové struktury nebo membránové receptory na vybraných konkrétních buňkách. Například sem patří

- ligandy pro endotelové buňky, jako IL-1, PDGF, bFGF,

VEGF, TGGP nebo kinin a deriváty nebo analogy kininu

- k dalším patří adhezivni molekuly. Adhezivni molekuly této povahy, jako například Slex, LFA-1, MAC-1, LeCAM1, VLA-4 nebo vitronektin a deriváty nebo analogy vitronektinu, již byly popsány pro endotelové buňky (přehledy Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119, 483, 1992, Pauli et al . , Cancer Metast. Rev. 9, 175, 1990, Honn et al. , Cancer Metast. Rev. 11, 353, 1992, Varner et al., Cell Adh. Commun. 3, 367, 1995).

Popis obrázků

Obrázek 1: Konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu.

Tabulka 1

DNAvazebná doména (GA14)

Partner. molekula I

Partner. molekula II

Aktivační doména (VP16)

Aktivita galaktosidázy p27 (1-198)

+	p27 (1-198)	-	+	-
+	p27 (1-198)	p163	+	+++
+	-	-	-	-
-	-	p163	+	-
+	Myc 262439	p163	+	-
+	Max	p163	+	-
+	Prothymosin	p163	+	-
+	LAZ3/Bcl6	p163	+	-
+	p27 (1-178)	p163	+	+++
+	p27 (1-94)	p163	+	+
+	p27 (69-198)	p163	+	+++
+	p27 (69-94)	p163	+	n.d.
+	p27 (1-198)	p163 (121252)	+	+++

• ·

Tabulka 2

Na kolonu naneseno:	Vazba na kolonu afinitní chromatografie s navázaným:
	Fúzní protein glutathiontransferáza - pl63	Glutathion- transferáza
rekombinantní p27 (značený ³⁵S)	+ + +	+
buněčný extrakt (RATl-Myc ER), obsahující p27	( + )
buněčný extrakt (RATl-Myc ER), obsahující p27 (zahřátý 95 °C, 2 min)	+ + +	-
cdk-2 (buněčný extrakt)	-	-
cdk-4 (buněčný extrakt)	-	-

	69	• · · • · · · • · · • · · · • · · • · · · ·	• ·· ·· • · · · · 9 9 9 9 9 9 9 i ·· · • 9 9 9999999 99	• · • · • · 9 · • · • ·
Tabulka 3
(Sekvence	s identifikačním číslem 9)
TCGAATTGGG	TACCGGGCCC CCCCTCGAGG TCGACGGTAT	CGATAAGCTT	GATATCGAAT	60
TCGCGGCCGC	TCGAGTTACA AGATGGCGGC CCCGGGCGCT	CTCTTCACCG	TTCTGTAGCA	120
GCTTCGGGCT	GAGCGGATGT CTCTTCTTGT CCTCAGTGTC	GGACTCAGAG	ACACACGGCT	180
CCCGAGTTCT	GCTGATCACG AAGTTCCCGG AGGCGCTCGA	CGCACCGGAA	TCTCCCAGCG	240
GCCGCGACCG	CCGCCTCGGC CCTGCTCGCC GCGGCGCCGG	GACTCCAGCG	TGATCGGCGG	300
CGGCAGTCAA	GGTTCACAAA AATGGCGAAG AGAGTTGCGG	AGAAGGAGTT	GACTGACAGG	360
AACTGGGATG	AGGAAGACGA AGTTGAAGAG ATGGGAACAT	TCTCAGTGGC	CAGTGAGGAA	420
GTCATGAAGA	ACAGAGCCGT AAA.GAAGGCA AAGCGCAGAA	ACGTTGGATT	TGAATCTGAT	480
AGCGGAGGAG	CCTTTAAAGG TTTCAAAGGT TTGGTTGTGC	CTTCTGGAGG	AGGAGGGTTT	540
TCTGGATTTG	GTGGCTCTGG AGGAAAGCCT CTGGAAGGAC	TGACAAATGG	AAACAGCACA	600
GACAATGCCA	CGCCCTTCTC CAATGTAAAG ACAGCAGCAG	AGCCCAAGGC	AGCCTTTGGT	660
TCTTTTGCTG	TGAATGGCCC TACTACCTTG GTGGATAAAG	TTTCAAATCC	AAAAACTAAT	720
GGGGACAGCA	ATCAGCCGCC CTCCTCCGGC CCTGCTTCCA	GTACCGCCTG	CCCTGGGAAT	780
GCCTATCACA	AGCAGCTGGC TGGCTTGAAC TGCTCCGTCC	GCGATTGGAT	AGTGAAGCAC	840
GTGAACACAA	ACCCGCTTTG TGACCTGACT CCCATTTTTA	AAGACTATGA	GAGATACTTG	900
GCGACGATCG	AGAAGCAGCT TGAGAATGGA GGCGGCAGCA	GTTCTGAGAG	CCAGACAGAC	960
AGGGCGACGG	CTGGAATGGA GCCTCCTTCC CTTTTTGGTT	CAACAAAACT	ACAGCAAGAG	1020
TCACCATTTT	CATTTCATGG CAACAAAGCG GAGGACACAT	CTGAAAAGGT	GGAGTTTACA	1080

GCAGAAAAGA AATCGGACGC AGCACAAGGA GCAACAAGTG CCTCGTTTAG TTTCGGCAAG 1140

AAAATTGAGA GCTCGGCTTT GGGCTCGTTA AGCTCTGGCT CCCTAACTGG GTTTTCATTC 1200

TCTGCTGGAA GCTCCAGCTT GTTTGGTAAA GATGCTGCCC AGAGTAAAGC AGCCTCTTCG 1260

CTGTTCTCTG CTAAAGCATC CGAGAGTCCG GCAGGAGGCG GCAGCAGCGA GTGCAGAGAT 1320

GGTGAAGAAG AGGAGAATGA CGAGCCACCC AAGGTAGTGG TGACCGAAGT AAAGGAAGAG 1380

GATGCTTTCT ACTCCAAAAA ATGTAAACTA TTTTACAAGA AAGACAACGA ATTTAAAGAG 1440

AAGGGTGTGG GGACCCTGCA TTTAAAACCC ACAGCAACTC AGAAGACCCA GCTCTTGGTG 1500

CGGGCAGACA CCAACCTAGG CAACATACTG CTGAATGTTC TGATCGCCCC CAACATGCCG 1560

TGCACCCGGA CAGGAAAGAA CAACGTCCTT ATCGTCTGTG TCCCCAACCC CCCACTCGAT 1620

GAGAAGCAGC CCACTCTCCC GGCCACCATG CTGATCCGGG TGAAGACGAG CGAGGATGCC 1680

GATGAATTGC ACAAGATTTT ACTGGAGAAA AAGGATGCCT GAGCACTGAG GCTGACCAAG 1740

GCATGTTGCC ACGTTGCTGC TTCCCCTCCG TCCCTAACTT AGTCACATTC TTTCCTCTTC 1800

TACTGTGACA TTCTGAGAAC TTCTAGGTAA CTTGAACTTT TGTGAGGAAG ATTAAGGCCA 1860

ATAAATCCTT TCAGTGGCGG CCGCGAATTC CTGCAGCCCG GGGGATCCAC TAGTTCTAGA 1920

GCGGCCGCCA CCGCGGTGGA GCTCCAGCTT TTGGGAGA

1958 • ·

Tabulka plS3:

YNup2:

P163 :

YNup2:

RAKRVAEKELTDRNWDEEDEVEEM 24 MAKRVA+ ++ +D + +++

MAKRVADAQIQRETYDSNESDDDV 24 (Sek. id. č. 10) (Sek. id. č. 11)

137 NQPPSSGPASSTACPGNAYHKQLAGLNCS N+ +G A P + +L LN

NRADGTGEAQVDNSPTTESNSRLKALNLQ

VRDWIVKHVNTNPLCDLTPIFKDYERYLATI 196 ++ + V PL DL P + F YE Y + I FKAKVDDLVLGKPLADLRPLFTRYELYIKNI 130 (Sek. id. č. 12) (Sek. id. č. 13)

P163:

YNup2:

P163:

YNup2:

P163 :

YNup2:

215 ATAGMEPPSLFGSTKLQQESPFSFHGNKAEDT A + P ST + PF G++

535 ANSSTSPAPSIPSTGFKFSLPFEQKGSQTTTN

SEKVEFTAEKKSDAAQGAT 265 K E T E + +Q AT

DSKEESTTEATGNESQDAT 585 (Sek. id. č. 14) (Sek. id. č. 15)

239 HGNKAEDTSEKVEFTAEKKSDAAQGATSASFSFG 272 (Sek. id Č 16) +G++++D+ + +A + + AT +FSFG

444 NGSESKDSDKPSLPSAVDGENDKKEATKPAFSFG 477 (Sek. id. Č. 17)

399 LGNILLNVLIAPNMPCTRTGKNNVLIVCVPNPPLDEKQPT 438 /_c , · .

+GN+LLN + + Ν ++ P D K T ¹⁰ ’ ^C

655 MGNVLLNATWDSFKYEPLAPGNDNLIKAPTVAADGKLVT 694 (Sek. id. Č

18)

19)

Tabulka 5 ··· · • ·

RBPl	(myš)
RBP1	(člověk)
NU?2p	(kvasinka)
pl63	(myš)
R3P1	(myš)
R3P1	(člověk)
NUP2p	(kvasinka
p!63	(myš)

rbpi (myš)

R3P1 (člověk) NUP2p(kvasinka p!63 (myš)

DSHADHQTST---ENADESTTHP—QFEZIVSVPE---5 DSHADHQTST---ENADESNHDP—QFEQIVSVPE---560 SQTTTNQSKE---ESTTEATGNESQDATKVDATPEESKP

307 QSKAASSLFSAKASESPAGGGSSECRDGEEEENDEPPKV

QEZXTLQEDEEELFKMRAKLEREASENDLPEKKEPRHGDVKLQKHKQFTKTT.FFnEF.FT.FXMRAKT.FRFASENnr.PFWXERGTGDVKLLKHKINLQNGEQDEVALFSQKAKLMTENA—ETKSYQSRGVGEMKQLXXXD WTEVX—EEDAFYSKKCKLEYKKQNEF KEKGVGTLHL-KPTEXGT IRQLHRRQKTLKI-CANH YITPMMELKP-NAG SDRAWVWNTHTD

EKGTIHLLMRRDKTLKI-CANHYITPMMELKP-NAGSDRAWVWNTHTD

DSPKVHLLCRSDGHGNy-LLNATWDSFKYEPLAPGNDNLXKAPTVAA ATQKTQLLVRADTNLGNILLNVLIAPNMPCTRTGKNNVLIVCVPNP—

RBPl	(myš)	FADECP-	-KPELLAIRELNAENAQKFKTKFEECRXEI	(Sek.	s	id.	č.	20)
R3P1	(člověk)	FADECP-	-KPELLAIRELNAENAQKFKTKFEECRKEI	(Sek.	s	id.	č.	21)
NQP2p	(kvasinka)			(Sek.		id.	sz	22)
		s	c.
pl63	(myš)	PLDEKQPTLPATMLIRVKTSEDADELHKILLEKKDAA	(Sek.	s	id.	\s c.	23)

• · · « • · · ·

Tabulka 6 pl63 (myš) (sekvence s identifikačním číslem 24)

Met Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Arg Asn Trp Asp 15 10 15

Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met Gly Thr Phe Ser Val Ala Ser Glu

25 30

Glu Val Met Lys Asn Arg Ala Val Lys Lys Ala Lys Arg Arg Asn Val

40 45

Gly Phe Glu Ser Asp Ser Gly Gly Ala Phe Lys Gly Phe Lys Gly Leu

55 60

Val Val Pro Ser Gly Gly Gly Gly Phe Ser Gly Phe Gly Gly Ser Gly

70 75 80

Gly Lys Pro Leu Glu Gly Leu Thr Asn Gly Asn Ser Thr Asp Asn Ala

90 95

Thr Pro Phe Ser Asn Val Lys Thr Ala Ala Glu Pro Lys Ala Ala Phe

100 105 110

Gly Ser Phe Ala Val Asn Gly Pro Thr Thr Leu Val Asp Lys Val Ser

115 120 125

Asn Pro Lys Thr Asn Gly Asp Ser Asn Gin Pro Pro Ser Ser Gly Pro

130 135 140

Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly Asn Ala Tyr His Lys Gin Leu Ala

145 150 155 160

Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp Trp Ile Val Lys His Val Asn Thr

165 170 175

Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr

180 185 190

Leu Ala Thr Ile Glu Lys Gin Leu Glu Asn Gly Gly Gly Ser Ser Ser

195 200 205

Glu Ser Gin Thr Asp Arg Ala Thr Ala Gly Met Glu Pro Pro Ser Leu

210 215 220

Phe Gly Ser Thr Lys Leu Gin Gin Glu Ser Pro Phe Ser Phe His Gly

225 230 235 240

Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu Lys Val Glu Phe Thr Ala Glu Lys

245 250 255

Lys Ser Asp Ala Ala Gin Gly Ala Thr Ser Ala Ser Phe Ser Phe Gly • · * · ·· ·

260

Lys Lys Ile Glu

275

Thr Gly Phe Ser

290

Ala Ala Gin Ser

305

Glu Ser Pro Ala

Glu Glu Asn Asp 340

Glu Asp Ala Phe 355

Asn Glu Phe Lys 370

Ala Thr Gin Lys 385

Asn Ile Leu Leu

Thr Gly Lys Asn 420

Asp Glu Lys Gin 435

Thr Ser Glu Asp 450

Asp Ala 465

Ser Ser Ala Leu

280

Phe Ser Ala Gly

295

Lys Ala Ala Ser 310

Gly Gly Gly Ser 325

Glu Pro Pro Lys

Tyr Ser Lys Lys

360

Glu Lys Gly Val 375

Thr Gin Leu Leu

390

Asn Val Leu Ile

405

Asn Val Leu Ile

Pro Thr Leu Pro

440

Ala Asp Glu Leu 455

265

Gly Ser Leu Ser

Ser Ser Ser Leu

300

Ser Leu Phe Ser

315

Ser Glu Cys Arg 330

Val Val Val Thr

345

Cys Lys Leu Phe

Gly Thr Leu His 380

Val Arg Ala Asp

395

Ala Pro Asn Met

410

Val Cys Val Pro

425

Ala Thr Met Leu

His Lys Ile Leu 460

270

Ser Gly Ser Leu

285

Phe Gly Lys Asp

Ala Lys Ala Ser 320

Asp Gly Glu Glu 335

Glu Val Lys Glu

350

Tyr Lys Lys Asp 365

Leu Lys Pro Thr

Thr Asn Leu Gly 400

Pro Cys Thr Arg 415

Asn Pro Pro Leu

430

Ile Arg Val Lys 445

Leu Glu Lys Lys

NUP2 (kvasinka) (sekvence s identifikačním číslem 25)

Met Ala Lys Arg Val Ala Asp Ala Gin Ile Gin Arg Glu Thr Tyr Asp 15 10 15

Ser Asn Glu Ser Asp Asp Asp Val Thr Pro Ser Thr Lys Val Ala Ser

25 30

Ser Ala Val Met Asn Arg Arg Lys Ile Ala Met Pro Lys Arg Arg Met

40 45

Ala Phe Lys Pro Phe Gly Ser Ala Lys Ser Asp Glu Thr Lys Gin Ala

• ·· ·· · · • · • · • · ··· ···· • ·· ·· * · • ·· • · · · • · · ··· ·· .{ ·· ·· • · · · • · ·· • ···ft 9 • · · ·· ··

370

375

380

Val

Phe

Ser

Phe

Gly

Ala

Thr

Pro

Ser

Ala

Lys

Glu

Ala

Ser

Gin

385

390

395

400

Glu

Asp

Asn

Val

Glu

Lys

Pro

Ser

Lys

Pro

Ala

Phe

405

410

415

Asn

Phe

Ile

Ser

Asn

Ala

Gly

Thr

Glu

Lys

Glu

Lys

Glu

Ser

Lys

420

425

430

Asp

Ser

Lys

Pro

Ala

Phe

Ser

Phe

Gly

Ile

Ser

Asn

Gly

Ser

Glu

Ser

435

440

445

Lys

Asp

Ser

Asp

Lys

Pro

Ser

Leu

Pro

Ser

Ala

Val

Asp

Gly

Glu

Asn

450

455

460

Asp

Lys

Glu

Ala

Thr

Lys

Pro

Ala

Phe

Gly

Ile

Asn

Thr

Asn

465

470

475

480

Thr

Lys

Thr

Ala

Asp

Thr

Lys

Ala

Pro

Thr

Phe

Thr

Phe

Gly

Ser

485

490

495

Ser

Ala

Leu

Ala

Asp

Asn

Lys

Glu

Asp

Val

Lys

Pro

Phe

Ser

Phe

500

505

510

Gly

Thr

Ser

Gin

Pro

Asn

Thr

Pro

Ser

Phe

Ser

Phe

Gly

Lys

Thr

515

520

525

Thr

Ala

Asn

Leu

Pro

Ala

Asn

Ser

Thr

Ser

Pro

Ala

Pro

Ser

Ile

530

535

540

Pro

Ser

Thr

Gly

Phe

Lys

Phe

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Gin

Lys

Gly

Ser

545

550

555

560

Gin

Thr

Asn

Asp

Ser

Lys

Glu

Ser

Thr

Glu

Ala

Thr

565

570

575

Gly

Asn

Glu

Ser

Gin

Asp

Ala

Thr

Lys

Val

Asp

Ala

Thr

Pro

Glu

580

585

590

Ser

Lys

Pro

Ile

Asn

Leu

Gin

Asn

Gly

Glu

Asp

Glu

Val

Ala

Leu

595

600

605

Phe

Ser

Lys

Ala

Lys

Leu

Met

Thr

Phe

Asn

Ala

Glu

Thr

Lys

Ser

Tyr

610

615

620

Asp

Ser

Arg

Gly

Val

Gly

Glu

Met

Lys

Leu

Lys

Asp

625

630

635

640

Pro

Ser

Lys

Val

Arg

Leu

Cys

Arg

Ser

Asp

Gly

Met

cly

Asn

Val

645

650

655

Leu

Asn

Ala

Thr

Val

Asp

Ser

Phe

Lys

Tyr

Glu

Pro

Leu

Ala

660 665 670

Pro	Gly	Asn 675	Asp	Asn	Leu	Ile	Lys 680	Ala	Pro
Lys	Thr	Tyr	Ile	Val	Lys	Phe	Lys	Gin	Lys
	690					695
Thr	Lys	Ala	Ile	Glu	Asp	Ala	Lys	Lys	Glu
705					710

• « ·· · · · ···· • · · · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ··

Thr Val Ala Ala Asp Gly 685

Glu Glu Gly Arg Ser Phe 700

Lys

715

Tabulka 7

Průkaz asociace mezi p27 a pl63 v buňkách HeLa

	Precipitace celkového transfekovaných s:	proteinu z	HeLa buněk
Precipitace S :	CMV-p27	CMV-p27 + CMV-Nap	CMV-Nap
Protilátkami specifickými pro Nap2	-		+	-
Protilátkami specifickými pro p27	+	+ +	-	-

• · · · ·

Tabulka 8	(Sekvence	s :	Identifikačním	t číslem 26)
Met Ala Lys	Arg Val Ala	Glu	Lys Glu Leu Thr	Asp Arg Asn Trp Asp
1	5		10	15
Glu Glu Asp	Glu Val Glu	Glu	Met Gly Thr Phe	Ser Val Ala Ser Glu
	20		25	30
Glu Val Met	Lys Asn Arg	Ala	Val Lys Lys Ala	Lys Arg Arg Asn Val
35			40	45
Gly Phe Glu	Ser Asp Ser	Gly	Gly Ala Phe Lys	Gly Phe Lys Gly Leu
50		55		60
Val Val Pro	Ser Gly Gly	Gly	Gly Phe Ser Gly	Phe Gly Gly Ser Gly
65	70		75	80
Gly Lys Pro	Leu Glu Gly	Leu	Thr Asn Gly Asn	Ser Thr Asp Asn Ala
	85		90	95
Thr Pro Phe	Ser Asn Val	Lys	Thr Ala Ala Glu	Pro Lys Ala Ala Phe
	100		105	110
Gly Ser Phe	Ala Val Asn	Gly	Pro Phe Thr Ala	Glu Lys Lys Ser Asp
115			120	125
Ala Ala Gin	Gly Ala Thr	Ser	Ala Ser Phe Ser	Phe Gly Lys Lys Ile
130		135		140
Glu Ser Ser	Ala Leu Gly	Ser	Leu Ser Ser Gly	Ser Leu Thr Gly Phe
145	150		155	160
Ser Phe Ser	Ala Gly Ser	Ser	Ser Leu Phe Gly	Lys Asp Ala Ala Gin
	165		170	175
Ser Lys Ala	Ala Ser Ser	Leu	Phe Ser Ala Lys	Ala Ser Glu Ser Pro
	180		185	190
Ala Gly Gly	Gly Ser Ser	Glu	Cys Arg Asp Gly	Glu Glu Glu Glu Asn
195			200	205
Asp Glu Pro	Pro Lys Val	Val	Val Thr Glu Val	Lys Glu Glu Asp Ala
210		215		220
Phe Tyr Ser	Lys Lys Cys	Lys	Leu Phe Tyr Lys	Lys Asp Asn Glu Phe
225	230		235	240
Lys Glu Lys	Gly Val Gly	Thr	Leu His Leu Lys	Pro Thr Ala Thr Gin
	245		250	255
Lys Thr Gin	Leu Leu Val	Arg	Ala Asp Thr Asn	Leu Gly Asn Ile Leu
	260		265	270
Leu Asn Val	Leu Ile Ala	Pro	Asn Met Pro Cys	Thr Arg Thr Gly Lys
275			280	285

• ·

• · • · • · • ·

• •

• ·

• · ·

•

79

Asn

Val

Leu

Ile

Val

Cys

Val

Pro Asn

Pro

Leu

Asp

Glu

Lys

290

295

300

Gin

Pro

Thr

Leu

Pro

Ala

Thr

Het

Leu Ile

Arg

Val

Lys

Thr

Ser

Glu

305

310

315

320

Asp

Ala

Asp

Glu

Leu

His

Lys

Ile

Leu Leu

Glu

Lys

Asp

Ala

325

330

335

Tabulka 9	(Sekvence	s identifikačním	číslem	27)
Met Ala Lys	Arg Val Ala	Glu Lys Glu Leu Thr	Asp Arg	Asn Trp Asp
1	5	10		15
Glu Glu Asp	Glu Val Glu	Glu Met Gly Thr Phe	Ser Val	Ala Ser Glu
	20	25		30
Glu Val Met	Lys Asn Arg	Ala Val Lys Lys Ala	Lys Arg	Arg Asn Val
35		40	45
Gly Phe Glu	Ser Asp Ser	Gly Gly Ala Phe Lys	Gly Phe	Lys Gly Leu
50		55	60
Val Val Pro	Ser Gly Gly	Gly Gly Phe Ser Gly	Phe Gly	Gly Ser Gly
65	70	75		80
Gly Lys Pro	Leu Glu Gly	Leu Thr Asn Gly Asn	Ser Thr	Asp Asn Ala
	85	90		95
Thr Pro Phe	Ser Asn Val	Lys Thr Ala Ala Glu	Pro Lys	Ala Ala Phe
	100	105		110
Gly Ser Phe	Ala Val Asn	Gly Pro Thr Thr Leu	Val Asp	Lys Val Ser
115		120	125
Asn Pro Lys	Thr Asn Gly	Asp Ser Asn Gin Pro	Pro Ser	Ser Gly Pro
130		135	140
Ala Ser Ser	Thr Ala Cys	Pro Gly Asn Ala Tyr	His Lys	Gin Leu Ala
145	150	155		160
Gly Leu Asn	Cys Ser Val	Arg Asp Trp Ile Val	Lys His	Val Asn Ile
	165	170		175
Asn Pro Leu	Cys Asp Leu	Thr Pro Ile Phe Lys	Asp Tyr	Glu Arg Tyr
	180	185		190
Leu Ala Thr	Ile Glu Lys	Gin Leu Glu Asn Gly	Gly Gly	Ser Ser Ser
195		200	205
Glu Ser Gin	Thr Asp Arg	Ala Thr Ala Gly Met	Glu Pro	Pro Ser Leu
210		215	220
Phe Gly Ser	Thr Lys Leu	Gin Gin Glu Ser Pro	Phe Ser	Phe His Gly

• · · • · ·

225 230

Asn Lys Ala Glu Asp Thr

245

Lys Ser Asp Ala Ala Gin 260

Lys Lys Ile Glu Ser Ser 275

Thr Gly Phe Ser Phe Ser 290

Ala Ala Glu Lys Glu Leu 305 310

235

Ser Glu Lys Val Glu Phe

250

Gly Ala Thr Ser Ala Ser 265

Ala Leu Gly Ser Leu Ser 280

Ala Gly Ser Ser Ser Leu 295 300

240

Thr Ala Glu Lys

255

Phe Ser Phe Gly

270

Ser Gly Ser Leu 285

Phe Gly Lys Asp

Tabulka 10 (Sekvence s identifikačním číslem 28)

Thr Thr Leu Val Asp Lys Val Ser Asn Pro Lys Thr Asn Gly Asp Ser 15 10 15

Asn Gin Pro Pro Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly

25 30

Asn Ala Tyr His Lys Gin Leu Ala Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp

40 45

Trp Ile Val Lys His Val Asn Thr Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro

55 60

Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr Leu Ala Thr Ile Glu Lys Gin Leu

70 75 80

Glu Asn Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu Ser Gin Thr Asp Arg Ala Thr

90 95

Ala Gly Met Glu Pro Pro Ser Leu Phe Gly Ser Thr Lys Leu Gin Gin

100 105 110

Glu Ser Pro Phe Ser Phe His Gly Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu

115 120 125

Lys Val Glu Phe

130 • · · · ·

Tabulka 11

Sekvence GUC v pl63

Pozice nukleotidů

Sekvence

422-424	GGAA	GTC	ATGA
818-820	CTCC	GTC	CGCG
1021-1023	AAGA	GTC	ACCA
1287-1289	GAGA	GTC	CGGC
1586-1588	CAAC	GTC	CTTA
1595-1597	TATC	GTC	TGTG
1601-1603	CTGT	GTC	CCCA
v EST 62312	(lidský)
Pozice nukleotidů aminokyselin	Sekvence
212-214	GACT	GTC	GAAT	87
358-360	GACA	GTC	AGCA	136
402-404	TTGT	GTC	GGAA	150

Interagující domény obsahují aminokyseliny 121-252 myší sekvence, na kterou se číslování vztahuje. Tomu odpovídají nukleotidy 685-1078 myší sekvence.

··· · · ···· ·· ·· · · · ···· • · · · · · · • · · · · ······· · · · ·

Tabulka 12a vybraných párů primerů

Skóre	Délka	GC %	Pozice	Jméno	5' 3'
5.8	108	43.5	122 .	. 143	Horní:	AGAAAGCAAAGCGCAGAAATGT
						(Sek. s id. č. 29)
			229.	.209	Dolní:	CAAATCCAGAAAAGCGTCCTC
						(Sek. s id. č. 30)
6.7	119	42.0	104.	. 127	Horní:	TGAAGAATAGAGCCATAAAGAAAG
					(Sek. s id. č. 31)
			240.	.220	Dolní:	AGAAAAGCGTCCTCCTCCAGA
						(Sek. s id. č. 32)
23.3	137	43.8	104.	.127	Horní:	TGAAGAATAGAGCCATAAAGAAAG (Sek. s id. č. 33)
			204.	.220	Dolní:	AGCGCCACTAACCAAATCCAGA
						(Sek. s id. č. 34)
25.7	100	44.0	122.	. 143	Horní:	AGAAAGCAAAGCGCAGAAATGT (Sek. s id. č. 35)
			221.	. 200	Dolní:	GAAAAGCGTCCTCCTCCAGAAG
						(Sek. s id. č. 36)
48.7	122	46.7	123.	. 144	Horní:	GAAAGCAAAGCGCAGAAATGTT (Sek. s id. č. 37)
			244.	. 224	Dolní:	CTCCAGCGCCACTACCAAATC

(Sek. s id. č. 38)

Tabulka 12b

Vybraný pár primeru

Skóre Délka qq % Pozice Jméno

5'

3'

51.3

193

52.8 34. . 53 Horní

226. .205 Dolní

CCCGCACGGAGCAGTTCAAG (Sek. s id. č. 39)

GCAGCGGCAGATCCCAAGGTAG (Sek. s id. č. 40)

Tabulka 12c

Vybraný pár primerů

Skóre Délka GC %

2.4 136 45.6 4

139

Pozice . .20 . . 120

Jméno 5'

3'

Horní: GGCATCCTTTTTCTCCA (Sek. s id. č. 41)

Dolní : CGTTCTTATCGTCTCTGTGTTC (Sek. s id. č. 42)

2.5 120 45.0

5. .23

139. .119

Horní

Dolní

GCATCCTTTTTCTCCAGTA (Sek. s id. č. 43)

TGTTCCAAATCCACCAAT (Sek. s id. č. 44)

2.7

100 48.0

40. .58

139. .119

Horní : GTCTGCATCCTCGCTGGTT (Sek. s id. č. 45)

Dolní : CGTTCTTATCGTCTGTGTTCC (Sek. s id. č. 46)

50.0 105 44.8

57. .75

161. .141

Horní: Dolní:

TTTTACCCGAATCAACAT (Sek. s id. č. 47)

GTACGCGAACAGGGAAGAATA (Sek. s id. č. 48)

Tabulka 13

Shrnutí růstových pokusů

Cyklin Dl Nup2 neselektivní selektivní neselektivní selektivní

wt p27	+++	+++	+++	+++
Mut 106	+++	+++	+++	+++
Mut 152	+++	+	+++	+
Mut 294	+++	+++	+++	-
Mut 660	+++	+++	+++	-
Mut 687	+++	-	+++	-
Mut 826	+++	+++	+++	+++
Mut 850	+++	+++	+++	-

• ·

I 4 • · • · · ·

Tabulka 14

Sekvence mutovaného proteinu p27 ve srovnání s divokým typem

A) lfgpvnhge větší na

RVSNGSPSLSRMDARQADHPK P S *~r

Klon#106

Klon#152

Klon#294

KlonS660

Klon3637

Klonjj826

Xlon#350

Protein

LTRDLEKHCRDMEEASORKWNFDFQNHKPLEGRYEWQEVE

-,-,-i |50 50 70 80

Myší p27 AS vecsina

26	LTRDLEKKC	R D	Μ E E	ASQRXWNF	D F Q N Η X	? L Ξ G R Y E	W Q E	V Ξ	Klon»106	Protein
37	LTRDLEKHC	R D	Μ E E	A S Q 0K W N F	DFQNHhJpLEGRYE	W Q E	V E	Klonf(152	Protein
37	LTRDLEKHC	R D	Μ E E	ASQRXWNF	D F Q N Η K	P L E G R Y E	W Q E	V E	Klon#294	Protein
36	LTRDLEKHC	R D	Μ E Ξ	ASQRXWNF	D F Q N Η X	P L Ξ G R Y E	W Q E	V E	Klon#660	Protein
38	\|e L T R D L Ξ K H	C R	D M\|E	Ieasqrkwn	F D F Q N H	K P L E G R Y	Ξ W Q	E V	] Klon#6S7	Protein
26	LTRDLEKHC	Ido	Μ Ξ Ξ	ASQRKWNF	D F Q N Η K	P L Ξ G R Y E	W Q E	V E	KlonS826	Protein
26	LTRDLEKKC	R D	Μ E E	ASQRXWNF	D F Q N Η K	P L E G R Y E	W Q E	V E	Klon#850	Protein
41	LTRDLEKHC	R D	Μ E Ξ	ASQRXWNF	D F Q N Η K	P L E G R Y E	W Q E	V E	Myší p27 AS
	RGSLPEFYY	R P	? R P	PXSACKVL	A Q Ξ S Q D	V S G S R Q A	V P L	I G
		“Ί-		1		1			Většina
		90 j		100 . 1		110 t		120 L
66	RGSLPEFYY	R P	P 0P	PKSACXVL	A Q E S Q D	V S G S R Q A	V P L	I G	Klon#106	Protein
77	RGSLPEFYY	R P	P R P	PKSACKVL	A Q E S Q D	V S G S R Q A	V P L	I G	Klon#lS2	Protein
77	RGSLPEFYY	Q p	P R P	PKSACKVL	A Q E S Q D	V El· S R Q A	V ? L	I G	Klon«294	Protein
76	RGSLPEFYY	a	P R P	PKSACKVL	A Q Ξ S Q D	V S G S R Q A	V P L	I G	Klon»660	Protein
78	M G Ξ L Ρ Ξ F \|Y (Y]R	P £> R tP > K S A C X v	P A Q E S Q	D V S G S R Q	A V P	L I	] Klon#687	Protein
66	RGSLPEFYY	R P	P R P	PKSACKVL	A Q Ξ S Q D	V S G S R Q A	V P L	I G	Klon»826	Protein
66	RGSLPEFYY	H?	P R ?	PKSACKVL	A Q Ξ S Q D	V S G S R Q A	V P L	I G	Klonff350	Protein
81	RGSLPEFYY	R P	P R P	PKSACXVL	A Q Ξ S Q D	V Ξ G S R Q A	V P L	I G	Myší p2 7 AS
	SQANSEDRH	L V	D Q M	PDSSDNQA	G L A Ξ Q C	P G M R X R P	A A E	D S

150

160

130

140

106

S

Q

A

N

S

Ξ

D

R

H

L

V

D

Q

M

P

D

Ξ

D

N

Q

A

G

Tj

A

£

Q

c

P

G

M

R

K

R

P

A

E

D

s

Klon“106

Protein

117

S

Q

A

N

S

Ξ

D

R

H

L

v

D

Q

M

P

D

s

D

N

Q

A

G

L

A

Ξ

Q

c

P

G

M

R

K

R

P

A

£

D

s

Klon#152

Protein

117

Ξ

Q

A

N

s

E

D

R

H

L

v

D

Q

M

P

D

s

D

N

Q

A

G

L

A

E

Q

c

P

G

M

R

X

R

P

A

Ξ

D

s

Klon#294

Protein

116

S

Q

A

N

S

Ξ

D

R

H

L

v

D

Q

M

P

D

s

D

N

Q

A

G

L

A

E

Q

c

P

G

M

R

K

R

?

A

E

D

s

Κ1οη#660

Protein

118

|g

s

JL

A

N

S

E

D

R

H

L

V

D

JL

M

P

D

Js

li

D

N

JL

A

G

L

A

E

JL

c

P

G

M

R

X

R

P

E

D

] Klon#687

Protein

106

s

Q

A

N

S

£

D

R

H

L

V

D

Q

M

P

D

Ξ

s

D

N

Q

A

G

L

A

E

Q

c

P

G

M

R

X

R

P

A

E

D

S

KlonS826

Protein

106

Ξ

Q

A

N

S

£

D

R

H

L

V

D

Q

?

D

s

D

ějq

A

G

L

A

£

Q

c

P

L

] Klon(t350

Protein

121

S

Q

A

N

s

E

D

R

H

L

v

D

Q

M

P

D

s

D

N

Q

A

G

L

A

Ξ

Q

c

P

G

M

R

X

R

?

A

E

D

s

Myší p27 AS

s

Q

I

X

R

A

N

R

T

E

N

V

s

D

G

s

P

N

A

G

T

V

E

Q

T

P

X

P

G

L

R

Q

T

R

-

Vět- š i na

i

T

170

190

L

EENVSDGS EENVSDGS EENVSDGS _E E N V S D G S

I KRANR t|e Ie n V S DGSPNAGTVEQT KRANRTEENVSDGSPNAGTVEQTP

180

PNAGTVEQTPKKPG L R Γ ? N A G T V E Q T Ρ X X Ρ G Qr R Q T R

PNAGTVEQTPKKPG

L R R Q T R - .

L R R Q T R * P G L Jr fc ~Q Γ - R

FNXRANRTEENVSDGSPNAGTVEQTPKKPGLRRQT

Klon#106 Protein Κ1οη#152 Protein Klon#294 Protein Klontf660 Protein Klonít687 Protein KlonS826 Protein Klon#850 Protein Myší p27 AS

Většina

VDLQP-S-FRAN-FL-FMIFI - - - 86

^B) Sekvence Většina

Klon	*	106
Klon	#	152
Klon	#	294
Klon	#	660
Klon	#	687
Klon	#	826
Klon	#	850
p27	(myš)

Sek, id. č • ·

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...17 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

CGGACAACTG TTGACCG 17 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...20 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

TACTGTATGT ACATACAGTA 2 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...22 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

GAATTGTGAG CGCTCACAAT TC 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...42 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

TCGAGTTTAC CACTCCCTAT CAGTGATAGA GAAAAGTGAA AG 42 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 12 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...12 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5: TAATGATGGG CG 12 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) • · » « » I • · • ···· (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...26 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

GGAAGCAGAC CACGTGGTCT GCTTCC 26 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...17 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7: AGCAGGTGTT GGGAGGC 17 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 41 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...41 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

GGCCGATGGG CAGATAGAGG GGGCCGATGG GCAGATAGAG G • · · • · ·9

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1958 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...1958 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

TCGAATTGGG TACCGGGCCC CCCCTCGAGG TCGACGGTAT CGATAAGCTT GATATCGAAT 60

TCGCGGCCGC TCGAGTTACA AGATGGCGGC CCCGGGCGCT CTCTTCACCG TTCTGTAGCA 120

GCTTCGGGCT GAGCGGATGT CTCTTCTTGT CCTCAGTGTC GGACTCAGAG ACACACGGCT 180

CCCGAGTTCT GCTGATCACG AAGTTCCCGG AGGCGCTCGA CGCACCGGAA TCTCCCAGCG 240

GCCGCGACCG CCGCCTCGGC CCTGCTCGCC GCGGCGCCGG GACTCCAGCG TGATCGGCGG 300

CGGCAGTCAA GGTTCACAAA AATGGCGAAG AGAGTTGCGG AGAAGGAGTT GACTGACAGG 360

AACTGGGATG AGGAAGACGA AGTTGAAGAG ATGGGAACAT TCTCAGTGGC CAGTGAGGAA 420

GTCATGAAGA ACAGAGCCGT AAAGAAGGCA AAGCGCAGAA ACGTTGGATT TGAATCTGAT 480

AGCGGAGGAG CCTTTAAAGG TTTCAAAGGT TTGGTTGTGC CTTCTGGnGG AGGAGGGTTT 540

TCTGGATTTG GTGGCTCTGG AGGAAAGCCT CTGGAAGGAC TGACAAATGG AAACAGCACA 600

GACAATGCCA CGCCCTTCTC CAATGTAAAG ACAGCAGCAG AGCCCAAGGC AGCCTTTGGT 660

TCTTTTGCTG TGAATGGCCC TACTACCTTG GTGGATAAAG TTTCAAATCC AAAAACTAAT 720 • · · · · ·

	91	• · · e • · · · · 4 4 4 4 • 44 ·4 444	• · • · •
GGGGACAGCA	ATCAGCCGCC	CTCCTCCGGC	CCTGCTTCCA	GTACCGCCTG	CCCTGGGAAT	780
GCCTATCACA	AGCAGCTGGC	TGGCTTGAAC	TGCTCCGTCC	GCGATTGGAT	AGTGAAGCAC	840
GTGAACACAA	ACCCGCTTTG	TGACCTGACT	CCCATTTTTA	AAGACTATGA	GAGATACTTG	900
GCGACGATCG	AGAAGCAGCT	TGAGAATGGA	GGCGGCAGCA	GTTCTGAGAG	CCAGACAGAC	960
AGGGCGACGG	CTGGAATGGA	GCCTCCTTCC	CTTTTTGGTT	CAACAAAACT	ACAGCAAGAG	1020
TCACCATTTT	CATTTCATGG	CAACAAAGCG	GAGGACACAT	CTGAAAAGGT	GGAGTTTACA	1080
GCAGAAAAGA	AATCGGACGC	AGCACAAGGA	GCAACAAGTG	CCTCGTTTAG	TTTCGGCAAG	1140
AAAATTGAGA	GCTCGGCTTT	GGGCTCGTTA	AGCTCTGGCT	CCCTAACTGG	GTTTTCATTC	1200
TCTGCTGGAA	GCTCCAGCTT	GTTTGGTAAA	GATGCTGCCC	AGAGTAAAGC	AGCCTCTTCG	1260
CTGTTCTCTG	CTAAAGCATC	CGAGAGTCCG	GCAGGAGGCG	GCAGCAGCGA	GTGCAGAGAT	1320
GGTGAAGAAG	AGGAGAATGA	CGAGCCACCC	AAGGTAGTGG	TGACCGAAGT	AAAGGAAGAG	1380
GATGCTTTCT	ACTCCAAAAA	ATGTAAACTA	TTTTACAAGA	AAGACAACGA	ATTTAAAGAG	1440
AAGGGTGTGG	GGACCCTGCA	TTTAAAACCC	ACAGCAACTC	AGAAGACCCA	GCTCTTGGTG	1500
CGGGCAGACA	CCAACCTAGG	CAACATACTG	CTGAATGTTC	TGATCGCCCC	CAACATGCCG	1560
TGCACCCGGA	CAGGAAAGAA	CAACGTCCTT	ATCGTCTGTG	TCCCCAACCC	CCCACTCGAT	1620
GAGAAGCAGC	CCACTCTCCC	GGCCACCATG	CTGATCCGGG	TGAAGACGAG	CGAGGATGCC	1680
GATGAATTGC	ACAAGATTTT	ACTGGAGAAA	AAGGATGCCT	GAGCACTGAG	GCTGACCAAG	1740
GCATGTTGCC	ACGTTGCTGC	TTCCCCTCCG	TCCCTAACTT	AGTCACATTC	TTTCCTCTTC	1800
TACTGTGACA	TTCTGAGAAC	TTCTAGGTAA	CTTGAACTTT	TGTGAGGAAG	ATTAAGGCCA	1860
ATAAATCCTT	TCAGTGGCGG	CCGCGAATTC	CTGCAGCCCG	GGGGATCCAC	TAGTTCTAGA	1920
GCGGCCGCCA	CCGCGGTGGA	GCTCCAGCTT	TTGGGAGA			1958

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...24 • ·

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

Met Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Arg Asn Trp 15 10 15

Asn Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...24 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

Met Ala Lys Arg Val Ala Asp Ala Gin Ile Gin Arg Glu Thr Tyr 15 10 15

Asp Ser Asn Glu Ser Asp Asp Asp Val (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 60 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...60 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

Asn 1

Gin

Pro

Ser 5

Ser

Gly

Pro

Ala

Ser 10

Ser

Thr

Ala

Cys

Pro 15

Gly

Asn

Ala

Tyr

His

Lys

Gin

Leu

Ala

Gly

Leu

Asn

Cys

Ser

Val

Arg

Asp

20

25

30

Trp

Ile

Val

Lys

His

Val

Asn

Thr

Asn

Pro

Leu

Cys

Asp

Leu

Thr

Pro

35

40

45

Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr Leu Ala Thr Ile 50 55 60 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...60 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

Asn

Arg

Ala

Asp

Gly

Thr

Gly

Glu

Ala

Gin

Val

Asp

Asn

Ser

Pro

Thr

1

5

10

15

Thr

Glu

Ser

Asn

Ser

Arg

Leu

Lys

Ala

Leu

Asn

Leu

Gin

Phe

Lys

Ala

20

25

30

Lys

Val

Asp

Leu

Val

Leu

Gly

Lys

Pro

Leu

Ala

Asp

Leu

Arg

Pro

3 5

40

45

Leu

Phe

Thr

Arg

Tyr

Glu

Leu

Tyr

Ile

Lys

Asn

Ile

50

55

60

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S

IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 51 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein

	(B) POZICE:	1 . .	. 51
(xi)	POPIS SEKVENCE:	SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM
Ala 1	Thr Ala Gly Met 5	Glu	Pro Pro Ser Leu Phe Gly Ser Thr Lys Leu 10 15
Gin	Gin Glu Ser Pro 20	Phe	Ser Phe His Gly Asn Lys Ala Glu Asp Thr 25 30

• · · · · · • · · · · • · · · · · « • · · · • · · · · · · · • · ·

Ser Glu Lys Val Glu Phe Thr Ala Glu Lys Lys Ser Asp Ala Ala Gin 35 40 45

Gly Ala Thr 50 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 51 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY: _v , (A) JMÉNO/OZNACENI: protein (B) POZICE: 1...51 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

Ala 1

Asn

Ser

Thr 5

Ser

Pro

Ala

Pro

Ser 10

Ile

Pro

Ser

Thr

Gly 15

Phe

Lys

Phe

Ser

Leu

Pro

Phe

Glu

Gin

Lys

Gly

Ser

Gin

Thr

Asn

20

25

30

Asp

Ser

Lys

Glu

Ser

Thr

Glu

Ala

Thr

Gly

Asn

Glu

Ser

Gin

35

40

45

Asp Ala Thr 50 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...34 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

His Gly Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu Lys Val Glu Phe Thr Ala 15 10 15' • · • ·

I

ft· · • ·

Glu Lys Lys Ser Asp Ala Ala Gin Gly Ala Thr Ser Ala Ser Phe Ser 20 25 30

Phe Gly (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein

(xi)	(B) POZICE: 1.. 1 POPIS SEKVENCE:	. 34
SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM	ČÍSLEM 17
Asn	Gly Ser Glu Ser Lys	Asp Ser Asp Lys Pro Ser Leu Pro	Ser Ala
1	5	10	15

Val Asp Gly Glu Asn Asp Lys Lys Glu Ala Thr Lys Pro Ala Phe Ser

Phe Gly

20

25

30

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...40 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

Leu Gly Asn Ile Leu Leu Asn Val Leu Ile Ala Pro Asn Met Pro Cys 15 10 15

Thr Arg Thr Gly Lys Asn Asn Val Leu Ile Val Cys Val Pro Asn Pro 20 - 25 30 «· € fc • · fc • · fc ·· < ·· ·· fc · • · • fc • · ··· ···· fcfc fcfc • · · · • · fcfc ··· · « • · · fc· fct

Pro Leu Asp Glu Lys Gin Pro Thr 35 40 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...40 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

Met 1

Gly

Asn

Val

Leu 5

Leu

Asn

Ala

Thr

Val 10

Val

Asp

Ser

Phe

Lys 15

Tyr

Glu

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Asn

Asp

Asn

Leu

Ile

Lys

Ala

Pro

Thr

Val

20

25

30

Ala

A3p

Gly

Lys

Leu

Val

Thr

35

40

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 157 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENí: protein (B) POZICE: 1...157 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:

Asp Ser His Ala Asp His Asp Thr Ser Thr Glu Asn Ala Asp Glu Ser 15 10 15

Thr Thr His Pro Gin Phe Glu Pro Ile Val Ser Val Pro Glu Gin Glu 20 25 30

Ile

Lys

Thr 35

Leu

Glu

Asp

Glu 40

Glu

Leu

Phe

Lys 45

Met

Arg

Ala

Lys

Leu

Phe

Arg

Phe

Ala

Ser

Glu

Asn

Asp

Leu

Pro

Glu

Trp

Lys

Glu

50

55

60

Pro

Arg

His

Gly

Asp

Val

Lys

Leu

Lys

His

Lys

Glu

Lys

Gly

Thr

65

70

75

80

Ile

Arg

Leu

Met

Arg

Asp

Lys

Thr

Leu

Lys

Ile

Cys

Ala

Asn

85

90

95

His

Tyr

Ile

Thr

Pro

Met

Glu

Leu

Lys

Pro

Asn

Ala

Gly

Ser

Asp

100

105

110

Arg

Ala

Trp

Val

Trp

Asn

Thr

His

Thr

Asp

Phe

Ala

Asp

Glu

Cys

Pro

115

120

125

Lys

Pro

Glu

Leu

Ala

Ile

Arg

Phe

Leu

Asn

Ala

Glu

Asn

Ala

Gin

130

135

140

Lys

Phe

Lys

Thr

Lys

Phe

Glu

Cys

Arg

Lys

Glu

Ile

145 150 155 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...157

(xi	) POPIS	SEKVENCE:	SEKVENCE	S IDENTIFIKAČNÍM	ČÍSLEM 21
Asp 1	Ser Hi3	Ala Asp His 5	Asp Thr Ser	Thr Glu Asn Ala Asp 10	Glu Ser 15
Asn	His Asp	Pro Gin Phe 20	Glu Pro Ile 25	Val Ser Val Pro Glu 30	Gin Glu
Ile	Lys Thr 35	Leu Glu Glu	Asp Glu Glu 40	Glu Leu Phe Lys Met 45	Arg Ala
Lys	Leu Phe 50	Arg Phe Ala	Ser Glu Asn 55	Asp Leu Pro Glu Trp 60	Lys Glu
Arg 65	Gly Thr	Gly Asp Val 70	Lys Leu Leu	Lys His Lys Glu Lys 75	Gly Thr 80

98

• · ·

• ·

• · · · · · ·

•

Ile

Arg

Leu

Met

Arg

Asp

Lys

Thr

Leu

Lys

Ile

Cys Ala

Asn

85

90

95

His

Tyr

Ile

Thr

Pro

Met

Glu

Leu

Lys

Pro

Asn

Ala

Gly Ser

Asp

100

105

110

Arg

Ala

Trp

Val

Trp

Asn

Thr

His

Thr

Asp

Phe

Ala

Asp

Glu Cys

Pro

115

120

125

Lys

Pro

Glu

Leu

Ala

Ile

Arg

Phe

Leu

Asn

Ala

Glu

Asn Ala

Gin

130

135

140

Lys

Phe

Lys

Thr

Lys

Phe

Glu

Cys

Arg

Lys

Glu

Ile

145

150

155

INFORMAC

E PRO SEKVENCI

S

IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 158 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...158 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:

Ser 1

Gin

Thr

Thr 5

Asn Asp

Ser

Lys

Glu 10

Glu

Ser

Thr

Glu 15

Ala

Thr

Gly

Asn

Glu

Ser

Gin

Asp

Ala

Thr

Lys

Val

Asp

Ala

Thr

Pro

Glu

20

25

30

Glu

Ser

Lys

Pro

Ile

Asn

Leu

Gin

Asn

Gly

Glu

Asp

Glu

Val

Ala

35

40

45

Leu

Phe

Ser

Gin

Lys

Ala

Lys

Leu

Met

Thr

Phe

Asn

Ala

Glu

Thr

Lys

50

55

60

Ser

Tyr

Asp

Ser

Arg

Gly

Val

Gly

Glu

Met

Lys

Leu

Lys

65

70

75

80

Asp

Ser

Pro

Lys

Val

Arg

Leu

Cys

Arg

Ser

Asp

Gly

Met

Gly

85

90

95

Asn

Val

Leu

Asn

Ala

Thr

Val

Asp

Ser

Phe

Lys

Tyr

Glu

Pro

100

105

110

Leu Ala Pro Gly Asn Asp Asn Leu Ile Lys Ala Pro Thr Val Ala Ala 115 120 125 • · • ·

Asp Gly Lys

Leu

Val

Thr

Tyr 135

Ile

Val

Phe

Lys

Gin 140

Lys

Leu Glu Gly

130

Arg

Ser

Phe

Thr

Lys

Ala

Ile

Glu

Asp

Ala

Lys

Glu

Met

145

150

155

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 160 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...160 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:

Gin 1

Ser

Lys

Ala

Ala 5

Ser

Leu

Phe

Ser 10

Ala

Lys

Ala

Ser

Glu 15

Ser

Pro

Ala

Gly

Ser

Glu

Cys

Arg

Asp

Gly

Glu

20

25

ί n CU

Asn

Asp

Glu

Pro

Lys

Val

Thr

Glu

Val

Lys

Glu

Asp

35

40

45

Ala

Phe

Tyr

Ser

Lys

Cys

Lys

Leu

Phe

Tyr

Lys

Asp

Asn

Glu

50

55

60

Phe

Lys

Glu

Lys

Gly

Val

Gly

Thr

Leu

His

Leu

Lys

Pro

Thr

Ala

Thr

65

70

75

80

Gin

Lys

Thr

Gin

Leu

Val

Arg

Ala

Asp

Thr

Asn

Leu

Gly

Asn

Ile

85

90

95

Leu

Asn

Val

Leu

Ile

Ala

Pro

Asn

Met

Pro

Cys

Thr

Arg

Thr

Gly

100

105

110

Lys

Asn

Val

Leu

Ile

Val

Cys

Val

Pro

Asn

Pro

Leu

Asp

Glu

Lys

115

120

125

Gin

Pro

Thr

Leu

Pro

Ala

Thr

Met

Leu

Ile

Arg

Val

Lys

Thr

Ser

Glu

130

135

140

Asp

Ala

Asp

Glu

Leu

His

Lys

Ile

Leu

Glu

Lys

Asp

Ala

145

150

155

160

(2) INFORMACE PRO

SEKVENCI S

IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 466 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární • · • ·

100 (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...466

(Xi)	POPIS	SEKVENCE:	SEKVENCE	S IDENTIFIKAČNÍM	ČÍSLEM 24
Met 1	Ala Lys	Arg Val Ala 5	Glu Lys Glu	Leu Thr Asp Arg Asn 10	Trp Asp 15
Glu	Glu Asp	Glu Val Glu 20	Glu Met Gly 25	Thr Phe Ser Val Ala 30	Ser Glu
Glu	Val Met 35	Lys Asn Arg	Ala Val Lys 40	Lys Ala Lys Arg Arg 45	Asn Val
Gly	Phe Glu 50	Ser Asp Ser	Gly Gly Ala 55	Phe Lys Gly Phe Lys 60	Gly Leu
Val 65	Val Pro	Ser Gly Gly 70	Gly Gly Phe	Ser Gly Phe Gly Gly 75	Ser Gly 80
Gly	Lys Pro	Leu Glu Gly 85	Leu Thr Asn	Gly Asn Ser Thr Asp 90	Asn Ala 95
Thr	Pro Phe	Ser Asn Val 100	Lys Thr Ala 105	Ala Glu Pro Lys Ala 110	Ala Phe
Gly	Ser Phe 115	Ala Val Asn	Gly Pro Thr 120	Thr Leu Val Asp Lys 125	Val Ser
Asn	Pro Lys 130	Thr Asn Gly	Asp Ser Asn 135	Gin Pro Pro Ser Ser 140	Gly Pro
Ala 145	Ser Ser	Thr Ala Cys 150	Pro Gly Asn	Ala Tyr His Lys Gin 155	Leu Ala 160
Gly	Leu Asn	Cys Ser Val 165	Arg Asp Trp	Ile Val Lys His Val 170	Asn Thr 175
Asn	Pro Leu	Cys Asp Leu 180	Thr Pro Ile 185	Phe Lys Asp Tyr Glu 190	Arg Tyr
Leu	Ala Thr 195	Ile Glu Lys	Gin Leu Glu 200	Asn Gly Gly Gly Ser 205	Ser Ser
Glu	Ser Gin 210	Thr Asp Arg	Ala Thr Ala 215	Gly Met Glu Pro Pro 220	Ser Leu
Phe 225	Gly Ser	Thr Lys Leu 230	Gin Gin Glu	Ser Pro Phe Ser Phe 235	His Gly 240

Asn

Lys

Ala

Glu

Asp 245

Thr

Ser

Glu

Lys

Val 250

Glu

Phe

Thr

Ala

Glu 255

Lys

Ser

Asp

Ala

Gin

Gly

Ala

Thr

Ser

Ala

Ser

Phe

Ser

Phe

Gly

260

265

270

Lys

Ile

Glu

Ser

Ala

Leu

Gly

Ser

Leu

Ser

Gly

Ser

Leu

275

280

285

Thr

Gly

Phe

Ser

Phe

Ser

Ala

Gly

Ser

Leu

Phe

Gly

Lys

Asp

290

295

300

Ala

Gin

Ser

Lys

Ala

Ser

Leu

Phe

Ser

Ala

Lys

Ala

Ser

305

310

315

320

Glu

Ser

Pro

Ala

Gly

Ser

Glu

Cys

Arg

Asp

Gly

Glu

325

330

335

Glu

Asn

Asp

Glu

Pro

Lys

Val

Thr

Glu

Val

Lys

Glu

340

345

350

Glu

Asp

Ala

Phe

Tyr

Ser

Lys

Cys

Lys

Leu

Phe

Tyr

Lys

Asp

355

360

365

Asn

Glu

Phe

Lys

Glu

Lys

Gly

Val

Gly

Thr

Leu

His

Leu

Lys

Pro

Thr

370

375

380

Ala

Thr

Gin

Lys

Thr

Gin

Leu

Val

Arg

Ala

Asp

Thr

Asn

Leu

Gly

385

390

395

400

Asn

Ile

Leu

Asn

Val

Leu

Ile

Ala

Pro

Asn

Met

Pro

Cys

Thr

Arg

405

410

415

Thr

Gly

Lys

Asn

Val

Leu

Ile

Val

Cys

Val

Pro

Asn

Pro

Leu

420

425

430

Asp

Glu

Lys

Gin

Pro

Thr

Leu

Pro

Ala

Thr

Met

Leu

Ile

Arg

Val

Lys

435

440

445

Thr

Ser

Glu

Asp

Ala

Asp

Glu

Leu

His

Lys

Ile

Leu

Glu

Lys

450

455

460

Asp

Ala

465

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 715 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1..715 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:

102

Met 1

Ala

Lys

Arg

Val 5

Ala

Asp

Ala

Gin

Ile 10

Gin

Arg

Glu

Thr

Tyr 15

Asp

Ser

Asn

Glu

Ser

Asp

Val

Thr

Pro

Ser

Thr

Lys

Val

Ala

Ser

20

25

30

Ser

Ala

Val

Met

Asn

Arg

Lys

Ile

Ala

Met

Pro

Lys

Arg

Met

35

40

45

Ala

Phe

Lys

Pro

Phe

Gly

Ser

Ala

Lys

Ser

Asp

Glu

Thr

Lys

Gin

Ala

50

55

60

Ser

Phe

Ser

Phe

Leu

Asn

Arg

Ala

Asp

Gly

Thr

Gly

Glu

Ala

Gin

65

70

75

80

Val

Asp

Asn

Ser

Pro

Thr

Glu

Ser

Asn

Ser

Arg

Leu

Lys

Ala

Leu

85

90

95

Asn

Leu

Gin

Phe

Lys

Ala

Lys

Val

Asp

Leu

Val

Leu

Gly

Lys

Pro

100

105

110

Leu

Ala

Asp

Leu

Arg

Pro

Leu

Phe

Thr

Arg

Tyr

Glu

Leu

Tyr

Ile

Lys

115

120

125

Asn

Ile

Leu

Glu

Ala

Pro

Val

Lys

Phe

Ile

Glu

Asn

Pro

Thr

Gin

Thr

130

135

140

Lys

Gly

Asn

Asp

Ala

Lys

Pro

Ala

Lys

Val

Glu

Asp

Val

Gin

Lys

Ser

145

150

155

160

Ser

Asp

Ser

Glu

Asp

Glu

Val

Lys

Val

Glu

Gly

Pro

Lys

Phe

165

170

175

Thr

Ile

Asp

Ala

Lys

Pro

Ile

Ser

Asp

Ser

Val

Phe

Ser

Phe

Gly

180

185

190

Pro

Lys

Glu

Asn

Arg

Lys

Asp

Glu

Ser

Asp

Ser

Glu

Asn

Asp

195

200

205

Ile

Glu

I le

Lys

Gly

Pro

Glu

Phe

Lys

Phe

Ser

Gly

Thr

Val

Ser

210

215

220

Asp

Val

Phe

Lys

Leu

Asn

Pro

Ser

Thr

Asp

Lys

Asn

Glu

Lys

Thr

225

230

235

240

Glu

Thr

Asn

Ala

Lys

Pro

Phe

Ser

Phe

Ser

Ala

Thr

Ser

Thr

24S

250

255

Glu

Gin

Thr

Lys

Ser

Lys

Asn

Pro

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Ala

Thr

Lys

260

265

270

Thr

Asn

Val

Asp

Asn

Ser

Lys

Ala

Glu

Ala

Ser

Phe

Thr

Phe

Gly

275 280 285

Thr Lys His Ala Ala Asp Ser Gin Asn Asn Lys Pro Ser Phe Val Phe 290 295 300

103

Gly Gin Ala Ala Ala Lys Pro Ser 305 310

Gly Ser Thr Thr Ile Glu Lys Lys 325

Ser Lys Pro Glu Lys Ser Ser Asp 340

Ser Phe Ser Ile Pro Ser Lys Asn 355 360

Phe Asn Phe Gly Val Pro Asn Ser 370 375

Val Phe Ser Phe Gly Ala Ala Thr 385 390

Glu Asp Asp Asn Asn Asn Val Glu 405

Asn Phe Ile Ser Asn Ala Gly Thr 420

Asp Ser Lys Pro Ala Phe Ser Phe 435 440

Lys Asp Ser Asp Lys Pro Ser Leu 450 455

Asp Lys Lys Glu Ala Thr Lys Pro 465 470

Thr Thr Lys Thr Ala Asp Thr Lys 485

Ser Ala Leu Ala Asp Asn Lys Glu 500

Gly Thr Ser Gin Pro Asn Asn Thr 515 520

Thr Ala Asn Leu Pro Ala Asn Ser 530 535

Pro Ser Thr Gly Phe Lys Phe Ser 545 550

Gin Thr Thr Thr Asn Asp Ser Lys 565

Gly Asn Glu Ser Gin Asp Ala Thr 580

Ser Lys Pro Ile Asn Leu Gin Asn 595 600

			• · · • • · • ·	• • · • 4 •	• · • • •	• · • • •	• • * ·
Leu	Glu	Lys 315	Ser	Ser	Phe	Thr	Phe 320
Asn	Asp 330	Glu	Asn	Ser	Thr	Ser 335	Asn
Ser 345	Asn	Asp	Ser	Asn	Pro 350	Ser	Phe
Thr	Pro	Asp	Ala	Ser 365	Lys	Pro	Ser
Ser	Lys	Asn	Glu 380	Thr	Ser	Lys	Pro
Pro	Ser	Ala 395	Lys	Glu	Ala	Ser	Gin 400
Lys	Pro 410	Ser	Ser	Lys	Pro	Ala 415	Phe
Glu 425	Lys	Glu	Lys	Glu	Ser 430	Lys	Lys
Gly	Ile	Ser	Asn	Gly 445	Ser	Glu	Ser
Pro	Ser	Ala	Val 460	Asp	Gly	Glu	Asn
Ala	Phe	Phe 475	Gly	Ile	Asn	Thr	Asn 480
Ala	Pro 490	Thr	Phe	Thr	Phe	Gly 495	Ser
Asp 505	Val	Lys	Lys	Pro	Phe 510	Ser	Phe
Pro	Ser	Phe	Ser	Phe 525	Gly	Lys	Thr
Ser	Thr	Ser	Pro 540	Ala	Pro	Ser	Ile
Leu	Pro	Phe 555	Glu	Gin	Lys	Gly	Ser 560
Glu	Glu 570	Ser	Thr	Thr	Glu	Ala 575	Thr
Lys 585	Val	Asp	Ala	Thr	Pro 590	Glu	Glu
Gly	Glu	Glu	Asp	Glu 605	Val	Ala	Leu

Phe Ser Lys Ala Lys Leu Met Thr Phe Asn Ala Glu Thr Lys Ser Tyr 610 615 620 • · · · • · · · • · · · · * · » a • * » a • ·

104

• · ·

• ·

• · ·

• « · *

• ·

Asp

Ser

Arg

Gly

Val

Gly

Glu

Met Lys

Leu

Lys

Asp

625

630

635

640

Pro

Ser

Lys

Val

Arg

Leu

Cys Arg

Ser

Asp

Gly

Met

Gly

Asn

Val

645

650

655

Leu

Asn

Ala

Thr

Val

Asp Ser

Phe

Lys

Tyr

Glu

Pro

Leu

Ala

660

665

670

Pro

Gly

Asn

Asp

Asn

Leu

Ile

Lys Ala

Pro

Thr

Val

Ala

Asp

Gly

675

680

685

Lys

Thr

Tyr

Ile

Val

Lys

Phe

Lys Gin

Lys

Glu

Gly

Arg

Ser

Phe

690

695

700

Thr

Lys

Ala

Ile

Glu

Asp

Ala

Lys Lys

Glu

Lys

705

710

715 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 335 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TY? MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...335

(xi:	) POPIS	SEKVENCE:	SEKVENCE	S IDENTIFIKAČNÍM	ČÍSLEM 2
Met 1	Ala Lys	Arg Val Ala 5	Glu Lys Glu	Leu Thr Asp Arg Asn 10	Trp Asp 15
Glu	Glu Asp	Glu Val Glu 20	Glu Met Gly 25	Thr Phe Ser Val Ala 30	Ser Glu
Glu	Val Met 35	Lys Asn Arg	Ala Val Lys 40	Lys Ala Lys Arg Arg 45	Asn Val
Gly	Phe Glu 50	Ser Asp Ser	Gly Gly Ala 55	Phe Lys Gly Phe Lys 60	Gly Leu
Val 65	Val Pro	Ser Gly Gly 70	Gly Gly Phe	Ser Gly Phe Gly Gly 75	Ser Gly 80
Gly	Lys Pro	Leu Glu Gly 85	Leu Thr Asn	Gly Asn Ser Thr Asp 90	Asn Ala 95
Thr	Pro Phe	Ser Asn Val 100	Lys Thr Ala 105	Ala Glu Pro Lys Ala 110	Ala Phe

• · • ·

105

Gly

Ser

Phe 115

Ala

Val

Asn

Gly

Pro 120

Phe

Thr

Ala

Glu

Lys 125

Lys

Ser

Asp

Ala

Gin

Gly

Ala

Thr

Ser

Ala

Ser

Phe

Ser

Phe

Gly

Lys

Ile

130

135

140

Glu

Ser

Ala

Leu

Gly

Ser

Leu

Ser

Gly

Ser

Leu

Thr

Gly

Phe

145

150

155

160

Ser

Phe

Ser

Ala

Gly

Ser

Leu

Phe

Gly

Lys

Asp

Ala

Gin

165

170

175

Ser

Lys

Ala

Ser

Leu

Phe

Ser

Ala

Lys

Ala

Ser

Glu

Ser

Pro

180

185

190

Ala

Gly

Ser

Glu

Cys

Arg

Asp

Gly

Glu

Asn

195

200

205

Asp

Glu

Pro

Lys

Val

Thr

Glu

Val

Lys

Glu

Asp

Ala

210

215

220

Phe

Tyr

Ser

Lys

Cys

Lys

Leu

Phe

Tyr

Lys

Asp

Asn

Glu

Phe

225

230

235

240

Lys

Glu

Lys

Gly

Val

Gly

Thr

Leu

His

Leu

Lys

Pro

Thr

Ala

Thr

Gin

245

250

255

Lys

Thr

Gin

Leu

Val

Arg

Ala

Asp

Thr

Asn

Leu

Gly

Asn

Ile

Leu

260

265

270

Leu

Asn

Val

Leu

Ile

Ala

Pro

Asn

Met

Pro

Cys

Thr

Arg

Thr

Gly

Lys

275

280

285

Asn

Val

Leu

Ile

Val

Cys

Val

Pro

Asn

Pro

Leu

Asp

Glu

Lys

290

295

300

Gin

Pro

Thr

Leu

Pro

Ala

Thr

Met

Leu

Ile

Arg

Val

Lys

Thr

Ser

Glu

305

310

315

320

Asp

Ala

Asp

Glu

Leu

His

Lys

Ile

Leu

Glu

Lys

Asp

Ala

325

330

335

INFORMACE PRO SEKVENCI S

IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 310 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...310 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:

106

Met Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu 1 5

Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met Gly 20 25

Glu Val Met Lys Asn Arg Ala Val Lys 35 40

Gly Phe Glu Ser Asp Ser Gly Gly Ala 50 55

Val Val Pro Ser Gly Gly Gly Gly Phe 65 70

Gly Lys Pro Leu Glu Gly Leu Thr Asn 85

Thr Pro Phe Ser Asn Val Lys Thr Ala 100 105

Gly Ser Phe Ala Val Asn Gly Pro Thr 115 120

Asn Pro Lys Thr Asn Gly Asp Ser Asn 130 135

Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly Asn 145 150

Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp Trp 165

Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro Ile 180 185

Leu Ala Thr Ile Glu Lys Gin Leu Glu 195 200

Glu Ser Gin Thr Asp Arg Ala Thr Ala 210 215

Phe Gly Ser Thr Lys Leu Gin Gin Glu 225 230

Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu Lys 245

Lys Ser Asp Ala Ala Gin Gly Ala Thr 260 265

Lys Lys Ile Glu Ser Ser Ala Leu Gly 275 280

Thr Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly Ser 290 295

		• · ·	• ·	•	• · · ·	•
Leu 10	Thr	Asp	Arg	Asn	Trp 15	Asp
Thr	Phe	Ser	Val	Ala 30	Ser	Glu
Lys	Ala	Lys	Arg 45	Arg	Asn	Val
Phe	Lys	Gly 60	Phe	Lys	Gly	Leu
Ser	Gly 75	Phe	Gly	Gly	Ser	Gly 80
Gly 90	Asn	Ser	Thr	Asp	Asn 95	Ala
Ala	Glu	Pro	Lys	Ala 110	Ala	Phe
Thr	Leu	Val	Asp 125	Lys	Val	Ser
Gin	Pro	Pro 140	Ser	Ser	Gly	Pro
Ala	Tyr 155	His	Lys	Gin	Leu	Ala 160
Ile 170	Val	Lys	His	Val	Asn 175	Ile
Phe	Lys	Asp	Tyr	Glu 190	Arg	Tyr
Asn	Gly	Gly	Gly 205	Ser	Ser	Ser
Gly	Met	Glu 220	Pro	Pro	Ser	Leu
Ser	Pro 235	Phe	Ser	Phe	His	Gly 240
Val 250	Glu	Phe	Thr	Ala	Glu 255	Lys
Ser	Ala	Ser	Phe	Ser 270	Phe	Gly
Ser	Leu	Ser	Ser 285	Gly	Ser	Leu
Ser	Ser	Leu	Phe	Gly	Lys	Asp

300

107

• ·

Ala Ala Glu Lys Glu Leu 305 310 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 132 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...132

(xi)	POPIS	SEKVENCE:	SEKVENCE	S IDENTIFIKAČNÍM	ČÍSLEM 28
Thr 1	Thr Leu	Val Asp Lys 5	Val Ser Asn	Pro Lys Thr Asn Gly 10	Asp Ser 15
Asn	Gin Pro	Pro Ser Ser 20	Gly Pro Ala 25	Ser Ser Thr Ala Cys 30	Pro Gly
Asn	Ala Tyr 35	His Lys Gin	Leu Ala Gly 40	Leu Asn Cys Ser Val 45	Arg Asp
Trp	Ile Val 50	Lys His Val	Asn Thr Asn 55	Pro Leu Cys Asp Leu 60	Thr Pro
Ile 65	Phe Lys	Asp Tyr Glu 70	Arg Tyr Leu	Ala Thr Ile Glu Lys 75	Gin Leu 80
Glu	Asn Gly	Gly Gly Ser 85	Ser Ser Glu	Ser Gin Thr Asp Arg 90	Ala Thr 95
Ala	Gly Met	Glu Pro Pro 100	Ser Leu Phe 105	Gly Ser Thr Lys Leu 110	Gin Gin
Glu	Ser Pro 115	Phe Ser Phe	His Gly Asn 120	Lys Ala Glu Asp Thr 125	Ser Glu

Lys Val Glu Phe 130

108 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...22 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:

AGAAAGCAAA GCGCAGAAAT GT 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:

CAAATCCAGA AAAGCGTCCT C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...24 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:

TGAAGAATAG AGCCATAAAG AAAG

109 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:

AGAAAAGCGT CCTCCTCCAG A 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...24 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:

TGAAGATAG AGCCATAAAG AAAG 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...22 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:

AGCGCCACTA ACCAAATCCA GA • ·

110 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...22 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:

AGAAAGCAAA GCGCAGAAAT GT 2 2 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...22 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:

GAAAAGCGTC CTCCTCCAGA AG 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...22 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:

GAAAGCAAAG CGCAGAAATG TT

111 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:

CTCCAGCGCC ACTACCAAAT C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...20 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:

CCCGCACGGA GCAGTTCAAG 2 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...22 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 40:

GCAGCGGCAG ATCCCAAGGT AG

112

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...17 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 41:

GGCATCCTTT TTCTCCA 17 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 42:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...22 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 42:

CGTTCTTATC GTCTCTGTGT TC 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 43:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...19 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 43:

GCATCCTTTT TCTCCAGTA

113 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 44:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...18 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 44:

TGTTCCAAAT CCACCAAT 18 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...19 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 45:

GTCTGCATCC TCGCTGGTT 19 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 46:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 46:

CGTTCTTATC GTCTGTGTTC C

114 • · · * * · • · · · · • · · · · · · • · · · ·«*·· ·· *· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 47:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...18 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 47:

TTTTACCCGA ATCAACAT 18 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 48:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 48:

GTACGCGAAC AGGGAAGAAT A 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 49:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 212 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...212 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 49:

115

Arg 1

Val

Ser

Asn

Gly 5

Ser

Pro

Ser

Leu

Glu Arg Met Asp Ala Arg

Gin

10

15

Ala

Asp

His

Pro

Lys

Pro

Ser

Ala

Cys

Arg

Asn

Leu

Phe

Gly

Pro

Val

20

25

30

Asn

His

Gly

Glu

Leu

Thr

Arg

Asp

Leu

Glu

Lys

His

Cys

Arg

Asp

Met

35

40

45

Glu

Ala

Ser

Gin

Arg

Lys

Trp

Asn

Phe

Asp

Phe

Gin

Asn

His

Lys

50

55

60

Pro

Leu

Glu

Gly

Arg

Tyr

Glu

Trp

Gin

Glu

Val

Glu

Arg

Gly

Ser

Leu

55

70

75

80

Pro

Glu

Phe

Tyr

Arg

Pro

Arg

Pro

Lys

Ser

Ala

Cys

Lys

85

90

95

Val

Leu

Ala

Gin

Glu

Ser

Gin

Asp

Val

Ser

Gly

Ser

Arg

Gin

Ala

Val

100

105

110

Pro

Leu

Ile

Gly

Ser

Gin

Ala

Asn

Ser

Glu

Asp

Arg

His

Leu

Val

Asp

115

120

125

Gin

Met

Pro

Asp

Ser

Asp

Asn

Gin

Ala

Gly

Leu

Ala

Glu

Gin

Cys

130

135

140

Pro

Gly

Met

Arg

Lys

Arg

Pro

Ala

Glu

Asp

Ser

Gin

Ile

145

150

155

160

Lys

Arg

Ala

Asn

Arg

Thr

Glu

Asn

Val

Ser

Asp

Gly

Ser

Pro

Asn

165

170

175

Ala

Gly

Thr

Val

Glu

Gin

Thr

Pro

Lys

Pro

Gly

Leu

Arg

Gin

180

185

190

Thr

Arg

Val

Asp

Leu

Gin

Pro

Ser

Phe

Arg

Ala

Asn

Phe

Leu

Phe

Met

195 200 205

Ile Phe Ile Lys 210 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 50:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 183 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...183 • 0 • · · w · · ·· •· · 0 0 0 0 · · • · · · 0 «000 00 00 0 0 0 0000

0 0 0 0 0 0 000 00 0000000 00 00

116

(xi)	' POPIS	SEKVENCE:	SEKVENCE	S IDENTIFIKAČNÍM	ČÍSLEM
Met	Asp Ala	Arg Gin Ala	Asp His Pro	Lys Pro Ser Ala Cys	Arg Asn
1		5		10	15
Leu	Phe Gly	Pro Val Asn	His Gly Glu	Leu Thr Arg Asp Leu	Glu Lys
		20	25	30
His	Cys Arg	Asp Met Glu	Glu Ala Ser	Gin Arg Lys Trp Asn	Phe Asp
	35		40	45
Phe	Gin Asn	His Lys Pro	Leu Glu Gly	Arg Tyr Glu Trp Gin	Glu Val
	50		55	60
Glu	Arg Gly	Ser Leu Pro	Glu Phe Tyr	Tyr Arg Pro Pro Cys	Pro Pro
65		70		75	80
Lys	Ser Ala	Cys Lys Val	Leu Ala Gin	Glu Ser Gin Asp Val	Ser Gly
		85		90	95
Ser	Arg Gin	Ala Val Pro	Leu Ile Gly	Ser Gin Ala Asn Ser	Glu Asp
		100	105	110
Arg	His Leu	Val Asp Gin	Met Pro Asp	Ser Ser Asp Asn Gin	Ala Gly
	115		120	125
Leu	Ala Glu	Gin Cys Pro	Gly Met Arg	Lys Arg Pro Ala Ala	Glu Asp
	130		135	140
Ser	Ser Ser	Gin Ile Lys	Arg Ala Asn	Arg Thr Glu Glu Asn	Val Ser
145		150		155	160
Asp	Gly Ser	Pro Asn Ala	Gly Thr Val	Glu Gin Thr Pro Lys	Lys Pro
		165		170	175
Gly	Leu Arg	Arg Gin Thr	Arg
		180
INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 51:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 199 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...199 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 51:

• · 9 • · 9

9 9 «

117

Arg 1

Val

Ser

Asn

Gly 5

Ser

Pro

Ser

Pro

Glu 10

Arg

Met

Asp

Ala

Arg 15

Gin

Ala

Asp

His

Pro

Lys

Pro

Ser

Ala

Cys

Arg

Asn

Leu

Phe

Gly

Pro

Val

20

25

30

Asn

His

Gly

Glu

Leu

Thr

Arg

Asp

Leu

Glu

Lys

His

Cys

Arg

Asp

Met

35

40

45

Glu

Ala

Ser

Gin

His

Lys

Trp

Asn

Phe

Asp

Phe

Gin

Asn

His

Arg

50

55

60

Pro

Leu

Glu

Gly

Arg

Tyr

Glu

Trp

Gin

Glu

Val

Glu

Arg

Gly

Ser

Leu

65

70

75

80

Pro

Glu

Phe

Tyr

Arg

Pro

Arg

Pro

Lys

Ser

Ala

Cys

Lys

85

90

95

Val

Leu

Ala

Gin

Glu

Ser

Gin

Asp

Val

Ser

Gly

Ser

Arg

Gin

Ala

Val

100

105

110

Pro

Leu

Ile

Gly

Ser

Gin

Ala

Asn

Ser

Glu

Asp

Arg

His

Leu

Val

Asp

115

120

125

Gin

Met

Pro

Asp

Ser

Asp

Asn

Gin

Ala

Gly

Leu

Ala

Glu

Gin

Cys

130

135

140

Pro

Gly

Met

Arg

Lys

Arg

Pro

Ala

Glu

Asp

Ser

Gin

Ile

145

150

155

160

Lys

Arg

Ala

Asn

Arg

Thr

Glu

Asn

Val

Ser

Asp

Gly

Ser

Pro

Asn

165

170

175

Ala

Gly

Thr

Val

Glu

Gin

Thr

Pro

Lys

Pro

Gly

Pro

Arg

Gin

180

185

190

Thr

Arg

Val

Asp

Leu

Gin

Pro

195 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 52:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...199 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 52 • ·

118

•

• • • · ·

• « •

• 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9

99 • ·

Arg

Val

Ser

Asn

Gly

Ser

Pro

Ser

Leu

Glu

Arg

Met

Asp

Ala

Arg

Gin

1

5

10

15

Ala

Asp

His

Pro

Lys

Pro

Ser

Ala

Cys

Arg

Asn

Leu

Phe

Gly

Pro

Val

20

25

30

Asn

His

Gly

Glu

Leu

Thr

Arg

Asp

Leu

Glu

Lys

His

Cys

Arg

Asp

Met

35

40

45

Glu

Ala

Ser

Gin

Arg

Lys

Trp

Asn

Phe

Asp

Phe

Gin

Asn

His

Lys

50

55

60

Pro

Leu

Glu

Gly

Arg

Tyr

Glu

Trp

Gin

Glu

Val

Glu

Arg

Gly

Ser

Leu

65

70

75

80

Pro

Glu

Phe

Tyr

Gly

Pro

Arg

Pro

Lys

Ser

Ala

Cys

Lys

85

90

95

Val

Leu

Ala

Gin

Glu

Ser

Gin

Asp

Val

Gly

Ser

Arg

Gin

Ala

Val

100

105

110

Pro

Leu

Ile

Gly

Ser

Gin

Ala

Asn

Ser

Glu

Asp

Arg

His

Leu

Val

Asp

115

120

125

Gin

Met

Pro

Asp

Ser

Asp

Asn

Gin

Ala

Gly

Leu

Ala

Glu

Gin

Cys

130

135

140

Pro

Gly

Met

Arg

Lys

Arg

Pro

Ala

Glu

Asp

Ser

Gin

Ile

145

150

155

160

Lys

Arg

Ala

Asn

Arg

Thr

Glu

Asn

Val

Ser

Asp

Gly

Ser

Pro

Asn

165

170

175

Ala

Gly

Thr

Val

Glu

Gin

Thr

Pro

Lys

Pro

Gly

Leu

Arg

Gin

180

185

190

Thr

Arg

Val

Asp

Leu

Gin

Pro

195 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 53:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...199 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 53:

• ·

• · · · · · · ··· · · · · ·

Val 1

Ser

Asn

Gly

Ser 5

Pro

Ser

Leu

Glu

Arg 10

Met

Asp

Ala

Arg

Gin 15

Ala

Asp

His

Pro

Lys

Pro

Ser

Ala

Cys

Arg

Asn

Leu

Phe

Gly

Pro

Val

Asn

20

25

30

His

Gly

Glu

Leu

Thr

Arg

Asp

Leu

Glu

Lys

His

Cys

Arg

Asp

Met

Glu

35

40

45

Glu

Ala

Ser

Gin

Arg

Lys

Trp

Asn

Phe

Asp

Phe

Gin

Asn

His

Lys

Pro

50

55

60

Leu

Glu

Gly

Arg

Tyr

Glu

Trp

Gin

Glu

Val

Glu

Arg

Gly

Ser

Leu

Pro

65

70

75

80

Glu

Phe

Tyr

Gly

Pro

Arg

Pro

Lys

Ser

Ala

Cys

Lys

Val

85

90

95

Leu

Ala

Gin

Glu

Ser

Gin

Asp

Val

Ser

Gly

Ser

Arg

Gin

Ala

Val

Pro

100

105

110

Leu

Ile

Gly

Ser

Gin

Ala

Asn

Ser

Glu

Asp

Arg

His

Leu

Val

Asp

Gin

115

120

125

Met

Pro

Asp

Ser

Asp

Asn

Gin

Ala

Gly

Leu

Ala

Glu

Gin

Cys

Pro

130

135

140

Gly

Met

Arg

Lys

Arg

Pro

Ala

Glu

Asp

Ser

Gin

Ile

Lys

145

150

155

160

Arg

Ala

Asn

Arg

Thr

Glu

Asn

Val

Ser

Asp

Gly

Ser

Pro

Asn

Ala

165

170

175

Gly

Thr

Val

Glu

Gin

Thr

Pro

Lys

Pro

Gly

Leu

Arg

Gin

Thr

180

185

190

Arg

Val

Asp

Leu

Gin

Pro

Ser

195 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 54:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 220 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...220 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 54

- Asn Val Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala 15 10 15 • · · · · · ··· · · · · · · · · · ··· · · · · · · • · * · · · · ···· · ··· ·· · · · ··· ·· ··· ···· ·· ··

Arg

120

Pro

Gin

Ala

Asp 20

His

Pro

Ser

Ala 25

Cys

Arg

Asn

Leu

Phe 30

Gly

Val

Asn

His

Gly

Glu

Leu

Thr

Arg

Asp

Leu

Glu

Lys

His

Cys

Arg

Asp

35

40

45

Met

Glu

Ala

Ser

Gin

Arg

Lys

Trp

Asn

Phe

Asp

Phe

Gin

Asn

His

50

55

60

Lys

Pro

Leu

Glu

Gly

Arg

Tyr

Glu

Trp

Gin

Glu

Val

Glu

Arg

Gly

Ser

65

70

75

80

Leu

Pro

Glu

Phe

Tyr

Arg

Pro

Arg

Pro

Lys

Ser

Ala

Cys

85

90

95

Lys

Val

Pro

Ala

Gin

Glu

Ser

Gin

Asp

Val

Ser

Gly

Ser

Arg

Gin

Ala

100

105

110

Val

Pro

Leu

Ile

Gly

Ser

Gin

Ala

Asn

Ser

Glu

Asp

Arg

His

Leu

Val

115

120

125

Asp

Gin

Met

Pro

Asp

Ser

Asp

Asn

Gin

Ala

Gly

Leu

Ala

Glu

Gin

130

135

140

Cys

Pro

Gly

Met

Arg

Lys

Arg

Pro

Ala

Glu

Asp

Ser

Gin

145

150

155

160

Ile

Lys

Arg

Ala

Asn

Arg

Thr

Glu

Asn

Val

Ser

Asp

Gly

Ser

Pro

165

170

175

Asn

Ala

Gly

Thr

Val

Glu

Gin

Thr

Pro

Lys

Pro

Gly

Leu

Arg

180

185

190

Gin

Thr

Arg

Val

Asp

Leu

Gin

Pro

Ser

Phe

Arg

Ala

Asn

Phe

Leu

Phe

195

200

205

Met

Ile

Phe

Ile

Lys

Val

Ile

Lys

Ile

Ser

210

215

220

INFORMACE PRO SEKVENCI S

IDENTI

FIKAČNÍM ČÍSLEM 5

5 :

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...183 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 55

Met Asp Ala Arg Gin Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn 15 10 15

121 ·· · · ···· • ·· · · · · · · · ·

Leu

Phe

Gly

Pro 20

Val

Asn

His

Gly

Glu 25

Leu

Thr

Arg

Asp

Leu 30

Glu

Lys

His

Cys

Gin

Asp

Met

Glu

Ala

Ser

Gin

Arg

Lys

Trp

Asn

Phe

Asp

35

40

45

Phe

Gin

Asn

His

Lys

Pro

Leu

Glu

Gly

Arg

Tyr

Glu

Trp

Gin

Glu

Val

50

55

60

Glu

Arg

Gly

Ser

Leu

Pro

Glu

Phe

Tyr

Arg

Pro

Arg

Pro

65

70

75

80

Lys

Ser

Ala

Cys

Lys

Val

Leu

Ala

Gin

Glu

Ser

Gin

Asp

Val

Ser

Gly

85

90

95

Ser

Arg

Gin

Ala

Val

Pro

Leu

Ile

Gly

Ser

Gin

Ala

Asn

Ser

Glu

Asp

100

105

110

Arg

His

Leu

Val

Asp

Gin

Met

Pro

Asp

Ser

Asp

Asn

Gin

Ala

Gly

115

120

125

Leu

Ala

Glu

Gin

Cys

Pro

Gly

Met

Arg

Lys

Arg

Pro

Ala

Glu

Asp

130

135

140

Ser

Gin

Ile

Lys

Arg

Ala

Asn

Arg

Thr

Glu

Asn

Val

Ser

145

150

155

160

Asp

Gly

Ser

Pro

Asn

Ala

Gly

Thr

Val

Glu

Gin

Thr

Pro

Lys

Pro

165

170

175

Gly

Leu

Arg

Gin

Thr

Arg

180 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 56:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 138 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY: ~ „ (A) JMÉNO/OZNAČENI: protein (B) POZICE: 1...138 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 56

Met Asp Ala Arg Gin Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn 15 10 15

Leu Phe Gly Pro Val Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys 20 25 30 • ·

122

* · ·

• ·

•

• · · ·

•

• ·

His

Cys

Arg

Asp

Met

Glu

Ala

Ser

Gin

Arg

Lys

Trp

Asn

Phe

Asp

35

40

45

Phe

Gin

Asn

His

Lys

Pro

Leu

Glu

Gly

Arg

Tyr

Glu

Trp

Gin

Glu

Val

50

55

60

Glu

Arg

Gly

Ser

Leu

Pro

Glu

Phe

Tyr

Gly

Pro

Arg

Pro

65

70

75

80

Lys

Ser

Ala

Cys

Lys

Val

Leu

Ala

Gin

Glu

Ser

Gin

Asp

Val

Ser

Gly

85

90

95

Ser

Arg

Gin

Ala

Val

Pro

Leu

Ile

Gly

Ser

Gin

Ala

Asn

Ser

Glu

Asp

100

105

110

Arg

His

Leu

Val

Asp

Gin

Met

Pro

Asp

Ser

Asp

Ser

Gin

Ala

Gly

115

120

125

Leu

Ala

Glu

Gin

Cys

Pro

Gly

Met

Arg

Lys

130

135 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 57:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 197 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...197 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 57:

Met 1

Ser

Asn

Val

Arg Val 5

Ser

Asn Gly

Ser 10

Pro

Ser

Leu

Glu

Arg 15

Met

Asp

Ala

Arg

Gin

Ala

Asp

His

Pro

Lys

Pro

Ser

Ala

Cys

Arg

Asn

Leu

20

25

30

Phe

Gly

Pro

Val

Asn

His

Glu

Leu

Thr

Arg

Asp

Leu

Glu

Lys

His

35

40

45

Cys

Arg

Asp

Met

Glu

Ala

Ser

Gin

Arg

Lys

Trp

Asn

Phe

Asp

Phe

50

55

60

Gin

Asn

His

Lys

Pro

Leu

Glu

Gly

Arg

Tyr

Glu

Trp

Gin

Glu

Val

Glu

65

70

75

80

Arg

Gly

Ser

Leu

Pro

Glu

Phe

Tyr

Arg

Pro

Arg

Pro

Lys

85

90

95

123 • · »· · ·

Ser Ala

Arg Gin

His Leu 130

Ala Glu 145

Ser Ser

Cys Lys 100

Ala Val 115

Val Asp

Gin Cys

Gin Asn

Val Leu

Pro Leu

Gin Met

Ala Gin

Gly Ser

Pro Asn 180

Pro Gly 150

Lys Arg 165

Ala Gly

Ile Gly 120

Pro Asp 135

Met Arg

Ala Asn

Thr Val

Glu Ser 105

Ser Gin

Ser Ser

Lys Arg

Arg Thr 170

Glu Gin 185

Gin Asp

Ala Asn

Asp Asn 140

Pro Ala 155

Glu Glu

Thr Pro

Val Ser 110

Ser Glu 125

Gin Ala

Ala Glu

Asn Val

Lys Lys 190

Gly Ser

Asp Arg

Gly Leu

Asp Ser 160

Ser Asp 175

Pro Gly

Leu Arg Arg Gin Thr 195

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Konstrukt nukleové kyseliny, který obsahuje následující části:

• složku a): aktivační sekvence pro transkripci složky b) • složku b): gen pro transkripčni faktor obsahující

- b_x) což je aktivační doména - b₂) což je vazebná sekvence pro inhibitor - b₃) což je DNA-vazebná doména • složku c): aktivační sekvence, která je aktivována

navázáním expresního produktu složky b), a která indukuje transkripci složky d) • složku d): efektorový gen.
2. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 1, kde složka a) je shodná se složkou c).
3. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 1 nebo 2, kde složka a) je promotorové sekvence, která je aktivovatelná nespecificky, buněčně specificky, specificky pro určité metabolické podmínky nebo virově specificky a/nebo specificky pro buněčný cyklus.
4. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 3, kde složka a) je vybrána ze skupiny obsahující • promotory aktivované v endotelových buňkách, v buňkách peritonea a pleury, v epitelových buňkách kůže, plic, gastrointestinálního traktu, ledvin a močových cest, ve svalových buňkách, v buňkách pojivové tkáně, v hematopoetických buňkách, v makrofágách, lymfocytech, v leukemických, nádorových nebo gliových buňkách, » · · · · <

125 • promotorové sekvence viru jako je HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, CMV nebo HIV, • promotorové nebo zesilovací (enhancerové) sekvence aktivované hypoxií nebo aktivační sekvence genů cdc25C, cyklin A, cdc2, E2F-1, B-myb a DHFR, které jsou specifické pro buněčný cyklus, • vazebné sekvence pro transkripční faktory, vyskytující se nebo aktivované v závislosti na buněčné proliferaci, jako jsou monomery nebo multimery E-boxu genu myc.
5. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde aktivační doména ze skupiny aktivačních (složka b-J složky b) ) je vybrána domén transkripčních faktorů obsahující Oct-2, Spi, NFY, ITF-2, VP-16, c-myc a CTF.
6. Konstrukt nukleové kyseliny podie kteréhokoliv nároku 1 až 5, kde vazebná sekvence pro inhibitor (b₂) ) je vybrána ze skupiny obsahující proteiny, které inhibují p27 a tím ruší inhibici buněčné proliferace způsobovanou proteinem p27.
7. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 5, kde vazebná sekvence pro inhibitor (b₂) ) obsahuje aminokyselinovou sekvenci pl63 uvedenou v tab. 6 (sekvence id. č. 24) nebo její část.
8. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 7, kde části sekvence aminokyselin proteinu pl63 jsou vybrány ze skupiny obsahující peptidy se sekvencemi aminokyselin v polohách 1 až 24 (sekvence id. č. 10), v polohách 137 až 196 (sekvence id. č. 12), v polohách 215 až 265 (sekvence id. č. 14), v polohách 239 až 272 (sekvence id. č. 16), v polohách 399 až 438 (sekvence id. č. 18) a v polohách 307 až 469

126 (sekvence id. č. 20), přičemž číslování poloh je vztaženo k číslování podle tab. 6.
9. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 5, kde vazebná sekvence pro inhibitor (b₂) ) se může odvodit z proteinu podle nároku 7 odstraněním (delecí) funkčních domén, přičemž je ze sekvence id. č. 24 uvedené v tab. 6 odstraněna vazebná doména pro p27 nebo vazebná doména pro ran.
10. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 9, který po deleci vazebné domény pro p27 poskytne protein se sekvencí aminokyselin podle tab. 8 (sekvence id. č. 26) a delecí vazebné domény pro ran poskytne protein se sekvencí aminokyselin podle fab. 9 (sekvence id. č. 27) .
11. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 5, kde vazebná sekvence pro inhibitor (b₂) ) se může odvodit z proteinu podle nároku 2 odstraněním (delecí) všech aminokyselinových sekvencí kromě úseku vazebné domény pro p27 .
12. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 11, kde vazebná sekvence pro inhibitor obsahuje sekvenci aminokyselin uvedenou v tab. 10 (sekvence id. č. 28).
13. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 5, kde vazebná sekvence pro inhibitor (b₂) ) je vybrána ze skupiny obsahující inhibitoru odpovídající homologický protein nebo jeho odpovídající část, a sice člověka nebo jiného druhu savce, podle kteréhokoliv z nároků 6 až 12.

• · • · · · • · ·· • · · · · • · · • · ··

127
14. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 13, kde aminokyselinová sekvence inhibitoru je lidský homolog pl63.
15. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 14, kde složka c) obsahuje alespoň jednu DNA-(vazebnou) sekvenci pro vazbu složky b) a touto vazbou je aktivována.
16. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 15, kde ze skupiny obsahující

DNA-vazebná sekvence

č. 2), vazebnou (5' - GAATTGTGAGCC-C j e vybrána vazebnou sekvenci pro protein Gal4 (5'-CGGACAACTGTTGACCCG-3', sekvence id. č. 1), vazebnou sekvenci pro protein LexA (5' -TACTGTATGTACATACAGTA-3', sekvence id.

sekvenci pro represorový protein Lac I

TCACAATTC-3', sekvence id. č. 3), vazebnou sekvenci pro tetracyklinový represorový protein (5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3', sekvence id. č. 4) a vazebnou sekvenci pro protein ZFHD-1 (5'-TAATGATGGGCG-3', sekvence id. č . 5) .
17. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 16, kde efektorový gen (složka d) ) je takový gen, který kóduje účinnou látku vybranou ze skupiny obsahující cytokiny, chemokiny, růstové faktory, receptory cytokinů, chemokinů nebo růstových faktorů, antiproliferativně, cytostaticky nebo apoptoticky působící proteiny, protilátky, fragmenty protilátek, inhibitory angiogeneze, peptidové hormony, koagulační faktory, inhibitory koagulace, fibrinolytické proteiny, peptidy nebo proteiny působící na oběhovou soustavu, proteiny krevní plazmy a antigeny infekčních agens, buněk nebo nádorů, přičemž vybraný antigen vyvolává imunitní reakci.

128
18. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 14, kde efektorový gen je gen kódující enzym, který převádí předstupeň léku (předlék) na lék.
19. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 14, kde efektorový gen je takový gen, který kóduje fúzní protein „ligand-účinná látka nebo fúzní protein „ligandenzym, přičemž ligand je vybrán ze skupiny obsahující cytokiny, růstové faktory, protilátky, fragmenty protilátek, peptidové hormony, mediátory a molekuly buněčné adheze.
20. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z předchozích nároků, přičemž nukleová kyselina je DNA.
21. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z předchozích nároků, přičemž konstrukt nukleové kyseliny je vložen do vektoru.

22 . je . Konstrukt plazmidový nukleové vektor. kyseliny podle nároku 21, kde vektor 23 , . Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 21, kde vektor je virový vektor. 24 . Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nárok 1 až 23, který se pro profylaxi nebo léčení nemoci podává

zevně, perorálně, intravezikálně, nazálně, intrabronchiálně nebo do zažívacího a trávicího traktu, nebo se injikuje do orgánu, do tělní dutiny, do svalu, subkutánně nebo do krevního oběhu.

• · · • ·· • · · · ·

129
25. Izolovaná buňka, která obsahuje konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 24.
26. Použití konstruktu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 24 nebo buňky podle nároku 25 pro přípravu léčiva pro léčení onemocnění vybraného ze skupiny obsahující infekční onemocnění, nádorová onemocnění, leukémie, autoimunitní nemoci, alergie, artritidy, záněty, odvržení orgánu, reakce transplantátu proti hostiteli, poruchy krevní srážlivosti, onemocnění krevního oběhu, anémie, hormonální poruchy a poškození centrálního nervového systému.
27. Způsob přípravy konstruktu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv nároku 1 až 24 vyznačující se t i m, že se jednotlivé složky postupně navzájem spojují ligací.
28. Použití buňky podle nároku 25 pro výrobu léčiva pro profylaxi nebo léčení nemocí podle nároku 24, kdy se alespoň jedna buňka podá s profylaktickým nebo léčebným cílem, a to zevně, .intravezikálně, nazálně, intrabronchiálně, perorálně nebo do zažívacího a trávicího traktu, nebo se injikuje do orgánu, do tělní dutiny, do svalu, subkutánně nebo do krevního oběhu.