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DE19831420A1 - Expressionssysteme enthaltend chimäre Promotoren mit Bindungsstellen für rekombinante Transkriptionsfaktoren - Google Patents

Expressionssysteme enthaltend chimäre Promotoren mit Bindungsstellen für rekombinante Transkriptionsfaktoren

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Publication number
DE19831420A1
DE19831420A1 DE19831420A DE19831420A DE19831420A1 DE 19831420 A1 DE19831420 A1 DE 19831420A1 DE 19831420 A DE19831420 A DE 19831420A DE 19831420 A DE19831420 A DE 19831420A DE 19831420 A1 DE19831420 A1 DE 19831420A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
component
nucleic acid
protein
binding
acid construct
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19831420A
Other languages
English (en)
Inventor
Rolf Mueller
Dirk Nettelbeck
Hans-Harald Sedlacek
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Original Assignee
Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH
Hoechst Marion Roussel Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH, Hoechst Marion Roussel Inc filed Critical Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH
Priority to DE19831420A priority Critical patent/DE19831420A1/de
Priority to PCT/EP1999/004527 priority patent/WO2000004178A1/de
Priority to JP2000560275A priority patent/JP2002538759A/ja
Priority to CN99808528A priority patent/CN1309716A/zh
Priority to BR9912090-9A priority patent/BR9912090A/pt
Priority to CA002333912A priority patent/CA2333912A1/en
Priority to AU51557/99A priority patent/AU5155799A/en
Priority to EP99936465A priority patent/EP1097232A1/de
Priority to KR1020017000553A priority patent/KR20010071887A/ko
Priority to US09/352,767 priority patent/US20020137699A1/en
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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Nukleinsäurekonstrukt, dadurch charakterisiert, daß es folgende Komponenten enthält: DOLLAR A - Komponente a): mindestens einen Promotor DOLLAR A - Komponente b): DNA kodierend für mindestens einen rekombinanten Transaktivator, dessen Transkription durch die Komponente DOLLAR A a) aktiviert wird und der enthält: DOLLAR A È Komponente b1): DNA, kodierend für eine DNA-bindende Domäne DOLLAR A È Komponente b2): DNA, kodierend für eine Transaktivierungsdomäne, welche reich ist an Glutamin, Serin und Threonin DOLLAR A - Komponente c): mindestens eine DNA-Sequenz zur Bindung des Expressionsproduktes von Komponente b) DOLLAR A - Komponente d): mindestens einen minimalen Promotor, der das CDE-CHR-Element oder das E2F-BS-CHR-Element enthält und mit seinem 5'-Ende an das 3'-Ende von Komponente c) gebunden ist DOLLAR A - Komponente e): mindestens ein Effektorgen, dessen Transkription durch Bindung des Expressionsproduktes von Komponente b) an die Komponente c) aktiviert wird; DOLLAR A seine Herstellung und Verwendung; Vektoren enthaltend das Nukleinsäurekonstrukt, Zellen enthaltend diese Vektoren und die Verwendung des Nukleinsäurekonstrukts zur Herstellung eines Heilmittels.

Description

A) Einleitung
Die Transkription eines Genes wird durch Aktivierungssequenzen (Promotoren und Enhancer) gesteuert. Derartige Aktivierungssequenzen stellen Nukleotidsequenzen dar, an welche Transkriptionsfaktoren binden, die hierdurch die Transkription des zugehörigen Genes in die Wege leiten.
Zahlreiche Aktivierungssequenzen sind als Promotoren oder Enhancersequenzen mittlerweile bekannt.
Entsprechend ihrer Funktion oder Herkunft werden sie eingeordnet in universal, d. h. in jeder Zelle wirkende Aktivierungssequenzen, in Aktivierungssequenzen viraler Herkunft und in eingeschränkt wirkende Aktivierungssequenzen.
Die Einschränkung kann z. B. zellspezifisch, metabolisch (z. B. unter hypoxischen Bedingungen) oder zellzyklusspezifisch sein.
Diese Einschränkungen in der Funktion der Aktivierungssequenzen wird genutzt bei der gezielten Expression eines Strukturgenes, z. B. im Rahmen der Gentherapie. So ist es eine gängige Technologie, die Expression eines Strukturgenes unter die Kontrolle eines zellspezifischen Promotors zu stellen (Sikora, Trends Biotech. 11, 197 (1993)).
Die durch einen zellspezifischen Promotor eingeschränkte Aktivierung der Transkription eines Effektorgenes ist jedoch in vielen Fällen nicht ausreichend, teils weil die Aktivierung des zellspezifischen Promotors nicht genügend zellspezifisch ist, teils weil die Expression des Effektorgenes nur in solchen Zellen des ausgewählten Zelltyps gewünscht wird, die einen bestimmten Funktionszustand aufweisen. Ein derartiger Funktionszustand kann beispielsweise die Zellzyklusphase der Zelle sein.
Für eine weitergehende Regulation der Expression eines Effektorgenes ist es somit wünschenswert, mehrere Promotoren unterschiedlicher Spezifität für die Kontrolle der Expression eines Strukturgenes einzusetzen.
Für die Kombination eines Promotors einer beliebigen Spezifität mit einem zellzyklusspezifischen Promotor wurde die chimäre Promotortechnofogie entwickelt (Patentanmeldungen z. B. GB 9417366.3, EP 97101507.8). Sie besteht in einer Verknüpfung eines stromaufwärts gelegenen Promotors beliebiger Spezifität mit dem stromabwärts gelegenen CDE-CHR Element oder dem E2FBS-CHR Element.
Die Zellteilung wird unterteilt in die aufeinanderfolgenden Phasen G0 oder G1, S. G2 und M. Die S-Phase ist die DNA Synthese-Phase, ihr folgt die Übergangsphase G2 (G2-Phase), an die sich die Mitose-Phase (M-Phase) anschließt, in welcher sich eine Mutterzelle in zwei Tochterzellen teilt. Zwischen der M-Phase und der S-Phase liegt die Ruhephase G0 (G0-Phase) oder die Übergangsphase G1 (G1-Phase).
Die Zellteilung wird vorangetrieben durch die Gruppe von Proteinkinasen, den Cyclin/cdk-Komplexen. Diese bestehen aus einer katalytischen Untereinheit [cyclin dependent kinase (cdk, zum Beispiel cdk-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7 oder -8) und einer regulativen Untereinheit, dem Cyclin (zum Beispiel Cyclin A, -B1-B3, -D1-D3, -E, -H oder -C)].
In jeder Phase des Zellzyklus sind unterschiedliche cdk-Komplexe besonders aktiv, so in der
mittleren G1-Phase cdk4/Cyclin D1-3 und cdk6/Cyclin D1-3
späten G1-Phase cdk2/Cyclin E
S-Phase cdk2/Cyclin A
G2/M-Übergangsphase cdk1/Cyclin B1-3 und cdk1/Cyclin A
Die Aktivität der Cyclin/cdk-Komplexe besteht in der Phosphorylierung und damit Aktivierung oder Inaktivierung von Proteinen, die an der Kontrolle der DNA- Synthese und der Mitose direkt oder indirekt beteiligt sind.
Korrespondierend mit ihrer Funktion im Zellzyklus werden die Gene für einige Cycline und cdk's periodisch transkribiert und/oder periodisch aktiviert oder inhibiert, so durch den regulierten Abbau von Cyclinen, durch zellzyklusphasenspezifische Bindung von inhibitoren (z. B. p16INK4A, p15INK4B, p21Cip1, p27Kip1, p18INK4C, p19INK4D, p57) oder durch Modifizierung durch aktivierende (z. B. durch die cdc25-Phosphatasen, wie cdc25A, cdc25B und cdc25C oder cdk7/Cyclin H) oder inhibierende (z. B. wee1 kinase) Enzyme (Übersicht bei Zwicker und Müller, Progr. Cell Cycle Res. 91 (1995); La Thangue, Curr Opin. Cell Biol. 443 (1994); MacLachlan et al., Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expr. 127 (1995)).
Die periodische Expression von cdc25C in der G2-Phase des Zellzyklus wird im wesentlichen geregelt durch ein Element (CDE-CHR) in der Promotorregion des Genes für cdc25C. Dieses CDE-CHR-Element ist in der G0-/G1-Phase von einem reprimierenden Protein besetzt und in der G2-Phase frei. Die Nukleotidsequenz dieses Promotorelements konnte identifiziert und gleichermaßen auch in den Promotoren der Gene für Cyclin A und cdk-1 gefunden werden, während im Promotor für B-myb eine zum Teil unterschiedliche Nukleotidsequenz (E2FBS-CHR) nachgewiesen wurde. Die Untersuchung der zellzyklusabhängigen Funktionsweise dieser Promotorelemente zeigte, daß ihre Blockade in der G0-/G1-Phase gefolgt wird von einer Hochregulierung der Transkription des jeweiligen Genes, welches beim B-myb Gen besonders früh (in der mittleren G1-Phase), beim Cyclin A in der G1/S-Übergangsphase, beim cdk-1 Gen in der S-Phase und beim cdc25C Gen erst in der späten S-Phase stattfindet (Zwicker und Müller, Progr. Cell Cycle Res. 91 (1995); Lucibello et al., EMBO J. 132 (1995); Liu et al., Nucl. Acids Res. 2905 (1995); Zwicker et al., Nucl. Acids Res. 3822 (1995); EMBO J. 4514 (1995)).
Überraschenderweise wurde des weiteren gefunden, daß das Element CDE-CHR (des Promotors für das Cyclin 25C, Cyclin A und cdk-1 Gen) wie auch das Element E2FBS-CHR (des Promotors für das B-myb Gen) nicht nur die Aktivierung und Transkription der homologen Gene in der G0-IG1-Phase inhibieren kann, sondern auch die Aktivierung und Transkription anderer Gene. Diese Erfindung führte zu den Patentanmeldungen GB 9417366.3, EP 95930524.4, EP 95931933.6, EP 95931204.2, EP 95931205.9, EP 97101507.8 und EP 97102547.3.
In diesen Patentanmeldungen wird offenbart, einen zellzyklusabhängigen Promotor zu kombinieren mit einem unspezifischen, zellspezifischen, virusspezifischen oder metabolisch aktivierbaren Promotor zur regulierten Aktivierung der Transkription eines Effektorgenes, welches ein Protein kodiert für die Prophylaxe und/oder Therapie einer Erkrankung. Derartige Erkrankungen können beispielsweise Tumorerkrankungen, Leukämien, Autoimmunerkrankungen, Arthritiden, Allergien, Entzündungen, Abstoßungen von transplantierte Organen, Erkrankungen des Blutkreislaufsystems, des Blutgerinnungssystems, Infektionen oder Schäden des zentralen Nervensystems sein.
Für die Kombination von unterschiedlichen Promotoren mit einem zellzyklusspezifischen Promotorelement wurde der sogenannte chimäre Promotor entwickelt. In diesem chimären Promotor wird die Aktivität einer unspezifischen, zellspezifischen, virusspezifischen oder metabolisch aktivierbaren Atkivierungssequenz (bzw. Promotorsequenz) durch das sich stromabwärts unmittelbar anschließende Promotorelement CDE-CHR oder E2FBS-CHR weitgehend auf die S- und G2-Phase des Zellzyklus beschränkt.
Weiterführende Untersuchungen zur Funktionsweise, insbesondere des Promotorelementes CDE-CHR, ergaben, daß die durch das CDE-CHR Element zellzyklusabhängige Regulation einer stromaufwärts gelegenen Aktivatorsequenz weitgehend davon abhängig ist, daß die Aktivierungssequenz von Transkriptionsfaktoren mit glutaminreichen Aktivierungsdomänen aktiviert wird (Zwicker et al., Nucl. Acids. Res. 3822 (1995)).
Zu derartigen Transkriptionsfaktoren gehört beispielsweise Oct-2, Sp1 und NF-Y.
Dieses schränkt konsequenterweise die Verwendung des Promotorelementes CDE- CHR für chimäre Promotoren ein. Gleiches ist für das Promotorelement E2F-BS- CHB des B-myb Genes anzunehmen (Zwicker et al., Nucl. Acids Res. 23, 3822 (1995)).
Es besteht somit ein dringliches Bedürfnis nach einem Expressionssystem, in welchem ein beliebiger Promotor mit einem zellzyklusspezifischen Promotor kombiniert werden kann.
B) Allgemeine Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist nunmehr ein Nukleinsäurekonstrukt, in welchem ein beliebiger Promotor mit dem CDE-CHR Element oder dem E2FBS-CHR Element zu einem funktionsfähigen chimären Promotor verknüpft werden kann und der folgende Komponenten enthält:
Komponente a)
mindestens ein Promotor
Komponente b)
DNA kodierend für mindestens einen rekombinanten Transaktivator, dessen Expression durch die Komponente a) aktiviert wird und der enthält
  • 1. DNA, kodierend für eine DNA bindende Domäne
  • 2. DNA, kodierend für eine Transaktivierungdomäne, welche reich ist an Glutamin, Serin und Threonin.
Komponente c)
mindestens eine DNA Sequenz zur Bindung von Komponente b)
Komponente d)
mindestens ein minimaler Promotor, der das CDE-CHR Element oder das E2F-BS-CHR Element enthält und mit seinem 5' Ende an das 3' Ende der Komponente c) gebunden ist
Komponente e)
mindestens ein Effektorgen, dessen Expression durch Bindung der Komponente b) an die Komponente c) aktiviert wird.
Die Anordnung der einzelnen Komponenten ist beispielhaft in Fig. 1 dargestellt. Die Funktionsweise des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes ist dergestalt, daß die Aktivierung des zellspezifischen, metabolisch aktivierbaren, virusspezifischen, zellzyklusspezifischen oder universell aktivierbaren Promotors [Komponente a)] zu einer Transkription des Genes [Komponente b)] für den rekombinanten Transkriptionsaktivator führt, welcher wiederum an seine DNA- Bindesequenz [Komponente c)] bindet, hierdurch den minimalen CDE-CHR enthaltenden Promotor [Komponente d)] aktiviert und dadurch die Transkription des Effektorgenes (Komponente e)] in die Wege geleitet wird.
In der G0/G1-Phase des Zellzyklus ist das CDE-CHR Element der Komponenten d) durch Bindung des sogenannten CDF Proteins blockiert und damit die Aktivierung der Transkription der Komponente e) inhibiert.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt kann in verschiedener Form erweitert werden:
  • - Es können mehrere gleiche oder unterschiedliche Effektorgene [Komponenten e, e', e"] in das Nukleinsäurekonstrukt eingeführt werden, wobei diese Effektorgene entweder mit jeweils einer IRES-Sequenz miteinander verbunden oder aber jedem Effektorgen die Komponenten c) und d) stromaufwärts angefügt werden.
  • - Der Komponente a) kann die Komponente c) stromaufwärts angefügt werden, so daß der rekombinante Transaktivator, exprimiert von Komponente b), auch eine Verstärkung der Aktivierung der Komponente a) im Sinne eines selbst verstärkenden Promotors bewirkt.
    Derartige Expressionssysteme sind beispielsweise in Fig. 2/II dargestellt.
    Derartige selbstverstärkende Promotoren wurden bereits in der Patentanmeldung DE 196 51 443.6 im Detail beschrieben.
    In einer besonderen Ausführungsform dieser Erfindung kann das selbstverstärkende Promotorsystem auch dem erfindungsgemäßen Expressionssystem angefügt werden, wie beispielsweise in Fig. 2/l dargestellt.
  • - Die Komponente b) kann durch Einführung einer Komponente b3), die ein Protein A exprimiert, welches an eine Kupplungssubstanz [Komponente f)] bindet und durch Einfügung einer Komponente b4), die ein Protein B exprimiert, welches ebenso an die Kupplungssubstanz f) bindet, zu einem durch die Kupplungssubstanz f), d. h. pharmakologisch kontrollierbaren rekombinanten Transaktivator [Komponente b')], erweitert werden.
    Eine derartige Erweiterung ist beispielsweise in Fig. 3 dargestellt.
    Durch Einfügung eines derartigen Transaktivators ist das erfindungsgemäße Expressionssystem pharmakologisch kontrollierbar. Derartige Expressionssysteme wurden bereits im Detail in der Patentanmeldung DE 196 51 443.6 beschrieben.
  • - Durch Kombination der Komponente b) und/oder der Komponente f) mit der Progesteronrezeptorligand-Bindedomäne (Wang et al., Gene Therapy 4, 432 (1997)) besteht ein weiteres, durch Progesteron induzierbares Expressionssystem.
  • - Das Expressionssystem kann durch Einfügung der Nukleinsäuresequenz für ein Bindeprotein [Komponente b5)] für ein zelluläres Regulatorprotein zwischen oder an die Komponenten b1) und b2) [Komponente b" bestehend aus Komponente b1), b2) und b5)] eine zusätzliche Steuerung erfahren. Diese ist dadurch bedingt, daß in der normalen Zelle das Regulatorprotein an das Bindeprotein haftet und hierdurch die Funktion des von der Komponente b") exprimierten rekombinanten Transaktivators, nämlich seine Bindung an die Komponente c), blockiert. In Zellen, in denen das zelluläre Regulatorprotein mutiert ist und hierdurch nicht an das Bindeprotein haften kann oder in denen das Regulatorprotein vermindert ist, fehlt oder an mit der Komponente b5) konkurrierenden zellulären, viralen, bakteriellen oder parasitären Bindeproteinen gebunden ist, ist der rekombinante Transaktivator [Komponente b")] funktionsfähig und kann an die Komponente c) binden.
    Die Komponente b") ist beispielhaft in Fig. 4 dargestellt.
  • - Durch Einfügung eines nuklearen Lokalisationssignales in die Komponente b), b') oder b") kann die Funktionsfähigkeit des erfindungsgemäßen Expressionssystems gesteigert werden.
  • - Durch Kombination von zwei oder mehr der aufgeführten Erweiterungen.
Das Effektorgen [Komponente d)] kodiert für einen pharmakologisch aktiven Wirkstoff, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Cytokine, Wachstumsfaktoren, Antikörper oder Antikörperfragmente, Rezeptoren für Cytokine oder Wachstumsfaktoren, antiproliferativ, apoptotisch oder zytostatisch wirkende Proteine, Angiogeneseinhibitoren, Gerinnungshemmer, Thrombose-induzierte Substanzen und Gerinnungshemmer, fibrinolytisch wirkende Substanzen, Plasmaproteine, Komplement-aktivierende Proteine, Peptidhormone, Virushüllproteine, bakterielle Antigene und parasitäre Antigene, auf den Blutkreislauf wirkende Proteine und Ribozyme.
Bevorzugterweise kodiert das Effektorgen für ein Ribozym, welches die mRNA inaktiviert, welche kodiert für ein Protein ausgewählt aus der Gruppe umfassend Zellzykluskontrollproteine, insbesondere Cyclin A, Cyclin B, Cyclin D1, Cyclin E, E2F1-5, cdc2, cdc25C oder DP1 oder Virusproteine oder Cytokine oder Wachstumsfaktoren oder deren Rezeptoren.
In einer anderen Ausführungsform kodiert das Effektorgen für ein Enzym, welches eine Vorstufe eines Pharmakons in ein Pharmakon spaltet.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Effektorgen für ein Ligand- Effektorfusionsprotein kodieren, wobei der Ligand ein Antikörper, ein Antikörperfragment, ein Cytokin, ein Wachstumsfaktor, ein Adhäsionsmolekül oder ein Peptidhormon sein kann und der Effektor ein wie oben beschriebener pharmakologisch aktiver Wirkstoff oder ein Enzym. Beispielsweise kann das Strukturgen ein Ligand-Enzymfusionsprotein kodieren, wobei das Enzym eine Vorstufe eines Pharmakons in ein Pharmakon spaltet und der Ligand an eine Zelloberfläche bindet, bevorzugt an Endothelzellen oder Tumorzellen.
Die Nukleinsäurekonstrukte bestehen bevorzugterweise aus DNS. Unter dem Begriff Nukleinsäurekonstrukte werden künstliche Gebilde aus Nukleinsäure verstanden, die in den Zielzellen transkribiert werden können. Sie sind bevorzugt in einen Vektor eingefügt, wobei Plasmidvektoren oder virale Vektoren besonders bevorzugt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform werden diese Vektoren Patienten äußerlich oder innerlich, lokal, in eine Körperhöhle, in ein Organ, in den Blutkreislauf, in den Atemweg, in den Magen-Darm-Trakt, in den Urogenitaltrakt oder intramuskulär oder subkutan verabreicht.
Durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte kann ein Effektorgen [Komponente e)] sowohl zellspezifisch, virusspezifisch, unter bestimmten metabolischen Bedingungen und/oder zellzyklusspezifisch exprimiert werden, wobei es sich bei dem Effektorgen bevorzugt um ein Gen handelt, das für einen pharmakologisch aktiven Wirkstoff oder aber für ein Enzym kodiert, welches eine inaktive Vorstufe eines Pharmakons in ein aktives Pharmakon spaltet. Das Effektorgen kann so gewählt sein, daß der pharmakologisch aktive Wirkstoff oder das Enzym als Fusionsprotein mit einem Liganden exprimiert wird und dieser Ligand an die Oberfläche von Zellen, z. B. proliferierende Endothel- oder Tumorzellen, bindet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Zellen von Hefen oder Säugern, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt enthalten. In besonders bevorzugter Ausführungsform werden die Nukleinsäurekonstrukte in Zellinien eingebracht, die dann nach Transfektion zur Expression des Transgens verwendet werden können. Diese Zellen können somit zur Bereitstellung eines Heilmittels für Patienten verwendet werden. Eine bevorzugte Verwendung des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes besteht in der Behandlung einer Erkrankung, wobei die Bereitstellung des Heilmittels die Einführung eines Nukleinsäurekonstruktes in eine Zielzelle und dessen virus- oder zielzellspezifische oder metabolisch spezifische oder unspezifische und zellzyklusspezifische Expression umfaßt.
Gegenstand der Erfindung ist des weiteren die Verabreichung von Säugerzellen, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt enthalten, zur Herstellung eines Heilmittels zur Behandlung einer Erkrankung. Beispielsweise können Endothelzellen aus dem Blut gewonnen, in vitro mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt transfiziert und dem Patienten beispielsweise intravenös injiziert werden.
Derartige in vitro transfizierte Zellen können auch in Kombination mit einem erfindungsgemäßen Vektor Patienten verabreicht werden. Diese Kombination beinhaltet, daß Zellen und Vektoren jeweils gleichzeitig oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten, an gleichen oder an unterschiedlichen Orten verabreicht oder injiziert werden.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte kommen in dieser Form nicht in der Natur vor, d. h. das Effektorgen für den Wirkstoff oder für ein Enzym oder für ein Ligand-Effektor-Fusionsprotein ist nicht natürlicherweise kombiniert mit dem erfindungsgemäßen minimalen Promotor enthaltend ein CDE-CHR Element oder ein E2F-BS-CHR Element und mit einer DNA-Bindesequenz für einen rekombinanten Transaktivator.
Die Promotoren und das Effektorgen für den Wirkstoff (oder für das Enzym) der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte werden je nach Verwendungszweck ausgewählt.
C) Detaillierte Beschreibung der Komponenten des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes I) Promotoren [Komponente a)]
Im Sinne der Erfindung sind als Promotorsequenzen Nukleotidsequenzen zu verwenden, welche nach Bindung von Transkriptionsfaktoren die Transkription eines am 3'-Ende benachbart gelegenen Strukturgenes aktivieren. Die Wahl der mit der CDE-CHR oder E2F-BS-CHR enthaltenden Promotorsequenz [Komponente d)] zu kombinierenden Promotorsequenz richtet sich nach der zu behandelnden Erkrankung und der zu transduzierenden Zielzelle. So kann die zusätzliche Promotorsequenz uneingeschränkt, zielzellspezifisch, unter bestimmten metabolischen Bedingungen, zellzyklusspezifisch oder virusspezifisch aktivierbar sein. Zu den auszuwählenden Promotorsequenzen gehören beispielsweise:
  • a) uneingeschränkt aktivierbare Promotoren und Aktivatorsequenzen, wie beispielsweise
    • 1. der Promotor der RNA-Polymerase III
    • 2. der Promotor der RNA-Polymerase II
    • 3. der CMV-Promotor und -Enhancer
    • 4. der SV40-Promotor und -Enhancer
  • b) virale Promotor- und Aktivatorsequenzen, wie beispielsweise
    • 1. HBV
    • 2. HCV
    • 3. HSV
    • 4. HPV
    • 5. EBV
    • 6. HTLV
    • 7. HIV
      Bei Verwendung des HIV-Promotors ist die gesamte LTR-Sequenz einschließlich der TAR-Sequenz [Position < -453 bis < -80, Rosen et al., Cell 41, 813 (1985)] als virusspezifischer Promotor einzusetzen.
  • c) Metabolisch aktivierbare Promotor- und Enhancersequenzen, wie beispielsweise der durch Hypoxie induzierbare Enhancer (Semenza et al., PNAS 88, 5680 (1991); McBurney et al., Nucl. Acids Res. 19, 5755 (1991)) oder durch Strahlung induzierbare Promotoren wie beispielsweise das durch ionisierende Strahlen induzierbare Element des egr-1 Promotors (Hallahan et al., Nature Med. 1, 786, 1995)).
  • d) Zellzyklusspezifisch aktivierbare Promotoren. Solche sind beispielsweise der Promotor des cdc25C Gens, des Cyclin A Gens, des cdc2 (cdk-1) Gens, des Bmyb Gens, des DHFR-Gens oder des E2F-1 Gens, oder aber Bindesequenzen für während der Zellproliferation auftretende oder aktivierte Transkriptionsfaktoren. Zu diesen Bindesequenzen sind Monomere oder Multimere der als Myc E-Box bezeichneten Nukleotidsequenz [5'- GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3'; SEQ ID NO: 1]; Blackwood und Eisenmann, Science 251, 1211 (1991)] zu zählen.
  • e) Tetrazyklin aktivierbare Promotoren, wie beispielsweise der Tetrazyklin-Operator in Kombination mit einem entsprechenden Repressor.
  • f) Zellspezifisch aktivierbare Promotoren
    Hierzu zählen bevorzugt Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern von solchen Genen, die für Proteine bevorzugt gebildet in ausgewählten Zellen kodieren.
Zum Beispiel sind im Sinne der Erfindung in folgenden Zellen Promotoren für folgende Proteine bevorzugt zu verwenden:
  • 1. Promotor- und Aktivatorsequenzen aktiviert in Endothelzellen
    • 1. Hirn-spezifischer, endothelialer Glucose-1-Transporter
    • 2. Endoglin
    • 3. VEGF-Rezeptor-1 (flt-1)
    • 4. VEGF-Rezeptor-2 (flk-1, KDR)
    • 5. VEGF-Rezeptor-3 (flt-4)
    • 6. tie-1 oder tie-2
    • 7. B61-Rezeptor (Eck-Rezeptor)
    • 8. B61
    • 9. Endothelin, im speziellen Endothelin B oder Endothelin-1
    • 10. Endothelin-Rezeptoren, insbesondere der Endothelin B-Rezeptor
    • 11. Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren
    • 12. von Willebrand Faktor
    • 13. PECAM-1
    • 14. ICAM-3
    • 15. IL-1α, IL-1β
    • 16. IL-1-Rezeptor
    • 17. Vascular Cell Adhesion Molecule (VCAM-1)
    • 18. synthetische Aktivatorsequenzen
      Als Alternative zu natürlichen endothelzellspezifischen Promotoren lassen sich auch synthetische Aktivatorsequenzen verwenden, die aus oligomerisierten Bindestellen für Transkriptionsfaktoren, die preferentiell oder selektiv in Endothelzellen aktiv sind, bestehen. Ein Beispiel hierfür ist der Transkriptionsfaktor GATA-2, dessen Bindestelle im Endothelin-1 Gen 5'- TTATCT-3' ist [Lee et al., Biol. Chem. 266, 16188 (1991), Dormann et al., J. Biol. Chem. 267, 1279 (1992) und Wilson et al., Mol. Cell Biol. 10, 4854 (1990)].
  • 2. Promotoren oder Aktivatorsequenzen, aktiviert in Zellen in Nachbarschaft aktivierter Endothelzellen
    • 1. VEGF
      Die genregulatorischen Sequenzen für das VEGF-Gen sind die 5' flankierende Region, die 3' flankierende Region, das c-Src-Gen oder das v- Src-Gen
    • 2. Steroid-Hormonrezeptoren und deren Promotorelemente (Truss und Beato, Endocr. Rev. 14, 459 (1993)), insbesondere der Maus-Mammatumor-Virus- Promotor
  • 3. Promotoren oder Aktivatorsequenzen aktiviert in Muskelzellen, insbesondere glatten Muskelzellen
    • 1. Tropomyosin
    • 2. α-Actin
    • 3. α-Myosin
    • 4. Rezeptor für PDGF
    • 5. Rezeptor für FGF
    • 6. MRF-4
    • 7. Phosphofructokinase A
    • 8. Phosphoglyceratmutase
    • 9. Troponin C
    • 10. Myogenen
    • 11. Rezeptoren für Endothelin A
    • 12. Desmin
    • 13. VEGF
      Die genregulatorischen Sequenzen für das VEGF-Gen sind bereits im Abschnitt "Promotoren aktiviert in Zellen in Nachbarschaft aktivierter Endothelzellen" aufgeführt worden (s. o.)
    • 14. "artifizielle" Promotoren
      Faktoren der Helix-Loop-Helix (HLH)-Familie (MyoD, Myf-5, Myogenen, MRF4) sind als muskelspezifische Transkriptionsfaktoren beschrieben. Des weiteren gehören zu den muskelspezifischen Transkriptionsfaktoren das Zinkfingerprotein GATA-4.
      Die HLH-Proteine sowie GATA-4 zeigen muskelspezifische Transkription nicht nur mit Promotoren von muskelspezifischen Genen, sondern auch im heterologen Kontext, so auch mit artifiziellen Promotoren. Derartige artifizielle Promotoren sind beispielsweise multiple Kopien der (DNA) Bindestelle für muskelspezifische HLH-Proteine wie der E-Box (Myo D) (z. B. 4x AGCAGGTGTTGGGAGGC, SEQ ID NO: 2); oder multiple Kopien der DNA Bindestelle für GATA-4 des α-Myosin-Heavy Chain Gens (z. B. 5'- GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG3', SEQ ID NO: 3)
  • 4. Promotoren und Aktivatorsequenzen, aktiviert in Gliazellen
    Hierzu zählen im besonderen die genregulatorischen Sequenzen bzw. Elemente aus Genen, die beispielsweise für folgende Proteine kodieren:
    • 1. das Schwannzell-spezifische Protein Periaxin
    • 2. Glutaminsynthetase
    • 3. das Gliazell-spezifische Protein (Glial fibrillary acid protein = GFAP)
    • 4. das Gliazellprotein S100b
    • 5. IL-6 (CNTF)
    • 6. 5-HT-Rezeptoren
    • 7. TNFα
    • 8. IL-10
    • 9. Insulin-like Growth Factor Receptor I and II
    • 10. VEGF
      Die genregulatorischen Sequenzen für das VEGF-Gen sind bereits oben aufgeführt worden.
  • 5. Promotoren und Aktivatorsequenzen aktiviert in blutbildenden Zellen
    Zu solchen genregulatorischen Sequenzen gehören Promotorsequenzen für Gene eines Cytokins oder seines Rezeptors, die in blutbildenden Zellen oder in benachbarten Zellen, wie beispielsweise dem Stroma, exprimiert sind.
    Hierzu gehören Promotorsequenzen für beispielsweise folgende Cytokine und ihre Rezeptoren:
    • 1. Stern Cell Factor-Receptor
    • 2. Stern Cell Factor
    • 3. IL-1α
    • 4. IL-1-Rezeptor
    • 5. IL-3
    • 6. IL-3-Rezeptor (α-subunit)
    • 7. IL-3-Rezeptor (β-subunit)
    • 8. IL-6
    • 9. IL-6-Rezeptor
    • 10. GM-CSF
    • 11. GM-CSF-Rezeptor (α-Kette)
    • 12. Interferon Regulatory Factor 1 (IRF-1)
      Der Promotor von IRF-1 wird durch IL-6 gleichermaßen aktiviert wie durch IFNγ oder IFNβ
    • 13. Erythropoietin
    • 14. Erythropoietin-Rezeptor.
  • 6. Promotoren und Aktivatorsequenzen aktiviert in Lymphozyten und/oder Makrophagen
    Hierzu gehören beispielsweise die Promotor- und Aktivatorsequenzen der Gene für Cytokine, Cytokinrezeptoren und Adhäsionsmoleküle und Rezeptoren für das Fc-Fragment von Antikörpern.
Hierzu gehören beispielsweise:
  • - IL-1-Rezeptor
  • - IL-1α
  • - IL-1β
  • - IL-2
  • - IL-2-Rezeptor
  • - IL-3
  • - IL-3-Rezeptor (a-subunit)
  • - IL-3-Rezeptor (β-subunit)
  • - IL-4
  • - IL-4-Rezeptor
  • - IL-5
  • - IL-6
  • - IL-6-Rezeptor
  • - Interferon Regulatory Factor 1 (IRF-1)
    (Der Promotor von IRF-1 wird durch IL-6 gleichermaßen aktiviert wie durch IFNγ oder IFNβ).
  • - IFNγ Responsive Promotor
  • - IL-7
  • - IL-8
  • - IL-10
  • - IL-11
  • - IFNγ
  • - GM-CSF
  • - GM-CSF-Rezeptor (α-Kette)
  • - IL-13
  • - LIF
  • - Makrophagen-Colony Stimulating Factor (M-CSF)-Rezeptor
  • - Typ I und II Makrophagen Scavenger Rezeptoren
  • - MAC-1 (Leukozytenfunktionsantigen)
  • - LFA-1α (Leukozytenfunktionsantigen)
  • - p150,95 (Leukozytenfunktionsantigen)
  • - Promotor- und Aktivatorsequenzen aktiviert in Synovialzellen
    Hierzu gehören die Promotorsequenzen für Matrix-Metalloproteinasen (MMP), beispielsweise für:
    • 1. MMP-1 (interstitielle Kollagenase)
    • 2. MMP-3 (Stromelysin/Transin)
      Hierzu gehören des weiteren die Promotorsequenzen für Tissue lnhibitors of Metalloproteinases (TIMP), beispielsweise
    • 3. TIMP-1
    • 4. TIMP-2
    • 5. TIMP-3
  • - Promotoren und Aktivatorsequenzen aktiviert in Leukämiezellen
    Hierzu gehören beispielsweise Promotoren für
    • 1. c-myc
    • 2. HSP-70
    • 3. bcl-1/cyclin D-1
    • 4. bcl-2
    • 5. IL-6
    • 6. IL-10
    • 7. TNFα,TNFβ
    • 8. HOX-11
    • 9. BCR-Abl
    • 10. E2A-PBX-1
    • 11. PML-RARA (Promyelocytic Leukemia - Retinoic Acid Receptor)
    • 12. c-myc
    • 13. c-myc-Proteine binden an und aktivieren Multimere der als Myc E-Box bezeichneten Nukleotidsequenz (5'-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTG CTTCC-3', SEQ ID NO: 1)
  • - 
    • 1. c-myc
    • 2. HSP-70
    • 3. bcl-1/cyclin D-1
    • 4. bcl-2
    • 5. IL-6
    • 6. IL-10
    • 7. TNFα,TNFβ
    • 8. HOX-11
    • 9. BCR-Abl
    • 10. E2A-PBX-1
    • 11. PML-RARA (Promyelocytic Leukemia - Retinoic Acid Receptor)
    • 12. c-myc
    • 13. c-myc-Proteine binden an und aktivieren Multimere der als Myc E-Box bezeichneten Nukleotidsequenz (5'-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTG CTTCC-3', SEQ ID NO: 1)
  • - Promotoren oder Aktivatorsequenzen aktiviert in Tumorzellen
    Als Promotor- oder Aktivatorsequenz ist eine genregulatorische Nukleotidsequenz vorgesehen, mit der Transkriptionsfaktoren, gebildet oder aktiv in Tumorzellen, interagieren.
    Im Sinne dieser Erfindung zählen zu den bevorzugten Promotoren oder Aktivatorsequenzen genregulatorische Sequenzen bzw. Elemente aus Genen, die besonders in Krebszellen oder Sarkomzellen gebildete Proteine kodieren. So wird bei kleinzelligen Bronchialkarzinomen bevorzugt der Promotor des N- CAM-Proteins, bei Ovarialkarzinomen der Promotor des "Hepatitis growth factor"-Rezeptors oder des L-Plastin und bei Pankreaskarzinomen der Promotor des L-Plastins oder des polymorphen epithelialen Mucins (PEM) verwendet.
II) Der rekombinante Transaktivator [Komponente b)]
Der rekombinante Transaktivator besteht im einfachsten Falle aus einer DNA- bindenden Domäne [Komponente b1) und einer Transaktivierungsdomäne, reich an Glutamin, Ser und/oder Thr [Komponente b2)].
Im Falle eines pharmakologisch kontrollierbaren rekombinanten Transaktivators [Komponente b')] werden die Komponenten b3) und b4) für die die Kopplungssubstanz bindenden Proteine eingefügt, im Falle eines durch Onkogene oder Viren gesteuerten rekombinanten Transaktivators [Komponente b")] wird die Komponente b5) für das Bindungsprotein für ein Regulatorprotein eingefügt.
Durch Einfügung eines nuklearen Lokalisationssignals (NLS) kann die Funktionsfähigkeit der Komponente b), b') oder b") gesteigert werden. Als NLS kann beispielsweise die NLS von SV40 (Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) verwendet werden.
1) Die DNA bindende Domäne [Komponente b1)]
Die DNA bindende Domäne stellt dar mindestens eine Sequenz
  • - der cDNA für die DNA-Bindedomäne des Gal4-Proteins (Aminosäuren 1 bis 147; Chasman und Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)) oder
  • - des LexA-Proteins (Aminosäuren 1 bis 81; Kim et al., Science 255, 203 (1992) oder das ganze LexA-Protein (Aminosäuren 1 bis 202; Brent et al., Cell 43, 729 (1985)) oder
  • - des lac-Repressor (lac I) Proteins (Brown et al., Cell 49, 603 (1987); Fuerst et al., PNAS USA 86, 2549 (1989)) oder
  • - des Tetracyclin-Repressor(tet-R)-Proteins (Gossen et al., PNAS USA 89, 5547 (1992); Dingermann et al., EMBO J. 11, 1487 (1992)) oder
  • - des ZFHD1-Proteins (Pomerantz et al., Science 267, 93 (1995)).
2) Die Transaktivierungsdomäne [Komponente b2)]
Im Sinne der Erfindung ist die DNA solcher Transaktivierungsdomänen zu verwenden, welche reich an Glutamin, Serin und/oder Threonin sind.
Der Begriff reich bedeutet im Sinne dieser Erfindung, daß insgesamt
mindestens 20 × Glufamin
mindestens 10 × Serin und/oder
mindestens 10 × Threonin
in der Transaktivierungsdomäne enthalten sind.
Im Sinne der Erfindung gehören zu diesen Transaktivierungsdomänen beispielsweise die
  • 1. Aktivierungsdomäne von Oct-2 (Aminosäuren 438 bis 479; Tanaka et al., Mol. Ceil Biol. 14, 6064 (1994)) oder Aminosäuren 3 bis 154; Das et al., Nature 374, 657 (1995)) oder
  • 2. Aktivierungsdomäne von SP1 (Aminosäuren 340 bis 485; Courey und Tijan, Cell 55, 887 (1988)) oder
  • 3. Aktivierungsdomäne von NFY-1A (Aminosäuren 1 bis 132 oder 1 bis 233; Li et al., J. Biol. Chem. 267, 8984 (1992); von Hujisduijnen et al., EMBO J. 9, 3119 (1990); Sinha et al., J. Biol. Chem. 92, 1624 (1995); Coustry et al., J. Biol. Chem. 270, 468 (1995)) oder
3) Die die Kopplungssubstanz [Komponente f)] bindenden Proteine A [Komponente b3)] und B [Komponente b4)]
Beispiele für Kopplungssubstanzen und die zugehörigen Proteine A und B wurden bereits im Detail in der Patentanmeldung DE 196 51 443.6 beschrieben, auf welche ausdrücklich Bezug genommen wird.
Zu diesen Proteinen A und B gehören beispielsweise:
  • 1. für die Kopplungssubstanz: Rapamycin oder Rapamycin-Analoga
    • 1. das FK506 bindende Protein (FKBP)
    • 2. das an den Rapamycin-FKBP-Komplex bindende FKBP-Rapamycin assoziiertes Protein, oder dessen an den Rapamycin-FKBP-Komplex bindende Teilsequenz (FRAP)
    • 3. statt Gene für das FKBP und das FRAP können Gene für rek. Fv verwendet werden, welche an Rapamycin binden und/oder die Bindung von FKBP bzw. von FRAP an Rapamycin inhibieren
  • 2. für die Kopplungssubstanz: Dimere (FK1012) von FK506
    • 1. das FK506 bindende Protein (FKBP)
    • 2. Calcineurin oder dessen an den FK506 Komplex bindende Teilsequenz
    • 3. statt des Genes für Calcineurin kann das Gen für ein rek. Fv eingefügt werden, welches die Bindung von FK506 an Calcineurin inhibiert
  • 3. für die Kopplungssubstanz: Dimere von Cyclosporin A
    • 1. Cyclophilin
    • 2. Calcineurin oder dessen an den Cyclosporin A/Cyclophilin Komplex bindende Teilsequenz
    • 3. statt des Genes für Cyclophilin kann das Gen für ein rek. Fv eingefügt werden, welches die Bindung von Cyclosporin A an Cyclophilin inhibiert
  • 4. für die Kopplungssubstanz: Monomere von Cyclosporin A mit folgenden bindenden Proteinen
    • 1. Cyclophilin
    • 2. Gen für einen rek. Fv, welcher an Cyclosporin A im Cyclophilin/Cyclosporin A- Komplex bindet
    • 3. alternativ zu Cyclophilin können Gene für unterschiedliche rek. Fv verwendet werden, welche an unterschiedliche Epitope von Cyclosporin A binden
  • 5. für die Kopplungssubstanz: Methotrexat
    • 1. Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Methotrexate
    • 2. Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen die Pteridingruppe
    • 3. Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen die Benzen-Gruppe
    • 4. Dihydrofolatreductase
  • 6. für die Kopplungssubstanz: Gentamycin
    • 1. Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Gentamycin
  • 7. für die Kopplungssubstanz:
    • 1. Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen
  • 8. für die Kopplungssubstanz: Cephalexin
    • 1. Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen die acyl Seitenkette an der C-7 Position des Cephem
  • 9. für die Kopplungssubstanz: Folsäure
    • 1. Folsäure bindendes Protein
    • 2. Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Folsäure
  • 10. für die Kopplungssubstanz: Retinoinsäure
    • 1. Retinoinsäure bindende Domäne des zelluläre Retinoinsäure-bindenden Proteins
    • 2. Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Retinoinsäure
  • 11. für die Kopplungssubstanz:
    • 1. Antikörper oderAntikörperfragmente (rek. Fv) gegen Amoxicillin
    • 2. Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen die Benzylpenicilloyl- Gruppe
    • 3. Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Penicillin
    • 4. das Penicillin-bindende Protein
  • 12. für die Kopplungssubstanz: 4-Hydroxy-Tamoxifen oder Tamoxifen
    • 1. Östrogen-bindende Domäne des Östrogenrezeptor-Proteins
    • 2. Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen den Östrogen-Rezeptor- Östrogen- bzw. 4-Hydroxy-Tamoxifen-Komplex
  • 13. für die Kopplungssubstanz: Tetrazyklin
    • 1. das Tetrazyklin-Repressor-Protein
    • 2. Antikörper und Antikörperfragmente gegen Tretrazyklin
  • 14. für die Kopplungssubstanz: Konjugat aus Tetrazyklin- und Isopropyl-β-D- thiogalactoside
    • 1. das Tetrazyklin-Repressor-Protein
    • 2. das lac-Repressor-(lac I)-Protein
4) Das Bindeprotein für ein Regulatorprotein [Komponente b5)]
Zahlreiche zelluläre Bindeproteine für Regulatorproteine sind bereits beschrieben worden [Zwicker und Müller, Progress in Cell Cycle Res. 1: 91 (1995); Boulikas et al., Int. J. Oncol. 6: 271 (1995); Pawson, Nature 373: 573 (1995); Cotter, Leuk. Lymph. 18: 231 (1995); Hesketh, the Oncogene Facts Book Acad. Press, ISBN 0-12-344550-7 (1995); Miller and Sarver, Nature Med. 3: 389 (1997)].
Geeignet im Sinne der Erfindung sind inbesondere Bindeproteine oder deren Bindesequenzen für solche Regulatorproteine, welche in erkrankten Zellen nur gering exprimiert sind, in ihrer Bindung an die Bindesequenz inhibiert sind, durch einen Überschuß der Bindesequenz nicht oder nur geringfügig in freier Form vorliegen oder in ihrer Funktion anderweitig, wie zum Beispiel durch Mutation, beeinträchtigt oder verändert sind.
Zu solchen Regulatorproteinen gehören beispielsweise die Proteine exprimiert von Tumorsuppressorgenen.
Eine die Erfindung nicht beschränkende Auswahl für derartige Regulatorproteine und ihre zugehörigen Bindeproteine und deren Bindesequenzen ist in folgenden Beispielen aufgeführt:
Regulatorprotein Komponente b2) (zelluläres Bindeprotein mit Bindesequenz für das Regulatorprotein)
p53 MDM-2
PRb - Transcription factor E2F, -1, -2, -3
- Cyclin-D1, D2, -D3, oder -C
- Cyclin-A, -E
- Transcription factor PU.1
- Transcription factor Elf-1
p130 Transcription factor E2F-5
- Cyclin A, -E
Max - Myc
MAD - Myc
VHL - Elongin C, -B
cdk4 p14, p15, p16, p18, p27, p57, p21
MTS-1 (p16) - cdk4
WT-1 - p53
SMAD2 (MADR2) - DPC4
DPC-4 - SMAD2
β-catenin - LEF-1
LEF-1 -β-catenin
In einer besonderen Ausführungsform dieser Erfindung ist die Komponente b5) eine Bindesequenz von einem nicht zelleigenen Bindeprotein für ein Regulatorprotein. Eine solche nicht-zelleigene Bindesequenz kann beispielsweise viralen, bakteriellen oder parasitären Ursprungs sein.
Die Verwendung einer derartigen nicht zelleigenen Bindesequenz ermöglicht, daß in Normalzellen durch Bindung des zugehörigen Regulatorproteins an die Komponente b5) die Funktion der Komponente b) gehemmt ist. In infizierten Zellen wird jedoch durch die intrazelluläre Produktion des die Bindesequenz enthaltenden Bindeproteins durch den jeweiligen Infektionserreger das zugehörige Regulatorprotein weitgehend gebunden. Damit ist in diesen Zellen die Komponente b) frei und funktionsfähig.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform dieser Erfindung ist die Komponente b5) ein Antikörper oder ein Teil eines Antikörpers mit Bindesequenzen (VH und VL) für ein Regulatorprotein.
Eine die Erfindung nicht beschränkende Auswahl nicht-zelleigener Bindesequenzen ist in folgenden Beispielen aufgeführt:
Regulatorprotein Komponente b2) (virales Bindeprotein mit Bindesequenz für das Regulatorprotein)
p53 - IE 84 von CMV
- E1B (55 Kd) von AV
- EBNA-5 von EBV
- BHFR1 von EBV
- E6 von HPV, z. B. von HPV-16 oder -18
- HBX protein von HBV
- T Antigen von SV40
PRb - E1A von AV
- EBNA-2 von EBV
- EBNA-1 oder -5 von EBV
- E7 von HPV
- T-Antigen von SV40
p130 - E1A von AV
CBF-1 (RBP-JK) - EBNA-2 von EBV
NF-Kappa B - Tax von HIV
Lyn-tyrosinkinase - LMP-1 von EBV
- LMP-2A oder LMP-2B von EBV
Bak - E1B (16 Kd) von AV
Bax - E1B (19 kD) von Av
Regulatorprotein Antikörper bzw. Antikörperfragmente mit Bindesequenz (VH, VL) für das Regulatorprotein
p53 monoklonale Antikörper spezifisch für die nicht mutierte DNA-Bindedomäne
pRb - monoklonale Antikörper spezifisch für aktives (nicht phosphoryliertes) pRb
myc - monoklonale Antikörper spezifisch für die DNA-Bindedomäne
Bei Wahl eines Antikörpers sind bevorzugt die epitopbindenen Teile des Antikörpers FVL FVH als Komponente b5) einzusetzen, bei murinem Ursprung in humanisierter Form. Die Humanisierung erfolgt in der von Winter et al. (Nature 349, 293 (1991) und Hoogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)) dargestellten Weise. Die Antikörperfragmente werden entsprechend dem Stand der Technik hergestellt, beispielsweise in der von Winter et al., Nature 349, 293 (1991), Hoogenboom et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993), Girol. Mol. Immunol. 28, 1379 (1991) oder Huston et al., Int. Rev. Immunol. 10, 195 (1993) beschriebenen Weise.
Rekombinante Antikörperfragmente werden direkt aus existierenden Hybridomen hergestellt oder werden mit Hilfe der "phage display"-Technologie (Smith, Science 228, 1315, (1985)) aus Bibliotheken muriner bzw. humaner Antikörperfragmente isoliert (Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433 (1994)). Diese Antikörperfragmente werden dann auf genetischer Ebene direkt für die Kopplung mit den Komponenten b1) und b2) eingesetzt.
Zur Herstellung von rekombinanten Antikörperfragmenten aus Hybridomen wird die genetische Information, die für die antigenbindenden Domänen (VH, VL) der Antikörper kodiert, durch Isolierung der mRNA, die reverse Transkription der RNA in cDNA und die anschließende Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion (Saiki et al., Science 230, 1350 (1985)) und Oligonukleotiden komplementär zu den 5'- bzw. 3'-Enden der variablen Fragmente (Orlandi et al. 1989) gewonnen. Die VH- und VL-Fragmente werden dann in bakterielle Expressionsvektoren z. B. in Form von Fv-Fragmenten (Skerra und Plückthun, Science 240, 1038 (1988)), einzelkettigen Fv-Fragmenten (scFv) (Bird et al., Science 242, 423 (1988); Huston et al., PNAS USA 85, 5879 (1988)) oder als Fab-Fragmente (Better et al., Science 240, 1041 (1988)) kloniert.
Neue Antikörperfragmente können mittels der "phage display"-Technologie auch direkt aus Antikörperbibliotheken (Immunbibliotheken, naive Bibliotheken) murinen oder humanen Ursprungs isoliert werden (McCafferty et al., Nature 348, 552 (1990); Reitling et al., Gene 104, 147 (1991); McCafferty et al., Nature 348, 552 (1990); Hoogenboom et al., Nucl. Acid Res. 19, 4133 (1991); Barbas et al., PNAS USA 88, 7978 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992); Marks et al., Bio/Technol. 11, 1145 (1993)).
Immunbibliotheken werden hergestellt durch PCR-Amplifikation der variablen Antikörperfragmente aus B-Lymphozyten immunisierter Tiere (Sastry et al., PNAS USA 86, 5728 (1989); Ward et al., Nature 341, 544 (1989); Clackson et al., Nature 352, 624 (1991)) oder Patienten (Mullinax et al., PNAS USA 87, 8095 (1990); Barbas et al., PNAS USA 88, 7978 (1991)).
Die Affinität von Antikörperfragmenten kann mittels der "phage display"-Technologie weiter erhöht werden, wobei neue Bibliotheken von bereits existierenden Antikörperfragmenten durch zufällige (Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992); Gram et al., PNAS USA 89, 3576 (1992)), kodonbasierende (Glaser et al., J. Immunol. 149, 3903 (1992)) oder gezielte Mutagenese (Balint und Larrick, Gene 137, 109 (1993)), durch "chain shuffling" einzelner Domänen mit Fragmenten aus naiven Repertoires (Marks et al., Bio/Technol. 10, 779 (1992)) oder unter Zuhilfenahme von bakteriellen Mutatorstämmen (Low et al., J. Mol. Biol. 260, 359 (1996)) hergestellt werden und durch Reselektion unter stringenten Bedingungen (Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992)) Antikörperfragmente mit verbesserten Eigenschaften isoliert werden.
III) Die DNA-Bindesequenz für Komponente b) [Komponente c)]
Die Auswahl der DNA-Bindesequenz richtet sich nach der Wahl der DNA-bindenden Domäne. Für die unter II.1) aufgeführten Beispiele für die DNA-Bindedomänen bestehen beispielsweise folgende Möglichkeiten:
  • - mindestenes eine Bindesequenz für das Gal4-Protein [Nukleotidsequenz: 5'- CGGACAACTGTTGACCG-3', SEQ ID NO: 4]; Chasman und Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990) oder [Nukleotidsequenz: 5'-CGGAGGACTGTCCTCCG 3', SEQ ID NO: 5]; oder [Nukleotidsequenz: 5'-CGGAGTACTGTCCTCCG-3', SEQ ID NO: 6]; Giniger et al., PNAS USA 85, 382 (1988)
  • - mindestens eine Bindesequenz [Nukleotidsequenz: 5'-TACTGTATGTACATA­ CAGTA-3', SEQ ID NO: 7]; für das LexA Protein [LexA-Operator; Brent et al., Nature 612, 312 (1984)]
  • - mindestens eine Lac-Opertor-Bindesequenz (Nukleotidsequenz: 5'-GAATTGTG­ AGGCTCACAATTC-3', SEQ ID NO: 8); für das lac I Repressorprotein (Fuerst et al., PNAS USA 86, 2549 (1989); Simons et al., PNAS USA 81, 1624 (1984))
  • - mindestens einer Tetrazyklin-Operator(tet O)-Bindesequenz (Nukleotidsequenz: 5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3', SEQ ID NO: 9); für das Tetracyclin-Repressor(tet R)-Protein
  • - mindestens eine Bindesequenz (Nukleotidsequenz: 5'-TAATGATGGGCG-3', SEQ ID NO: 10); für das ZFHD-1 Protein (Pomeranth et al., Science 267, 93 (1995))
IV) Der minimale Promotor enthaltend CDE-CHR oder E2F-BS-CHR [Komponente d)]
Beispielsweise können Fragmente
  • - des cdc25C Genes (Nukleinsäuren -20 bis +121 oder Nukleinsäuren -20 bis +50)
  • - des cdc2 (cdk-1) Genes (Nukleinsäuren -26 bis +121; Liu et al., Nucl. Acids Res. 24, 2905 (1996))
  • - des CyclinA Genes (Nukleinsäuren -40 bis +94; Liu et al., Nuc(. Acids Res. 24, 2905 (1996))
  • - des B-myb Genes (Nukleinsäuren -50 bis +50; Liu et ah Nucl. Acids Res. 24, 2905 (1996))
verwendet werden.
V) Effektorgene [Komponente e)]
Im Sinne der Erfindung kodieren die Effektorgene für einen Wirkstoff zur Prophylaxe und/oder Therapie einer Erkrankung. Effektorgene und Promotorsequenzen sind im Hinblick auf die Art der Therapie der Erkrankung und unter Berücksichtigung der zu transduzierenden Zielzelle auszuwählen.
Beispielsweise sind bei folgenden Erkrankungen folgende Kombinationen von Promotorsequenzen (Beispiele siehe Abschnitt C I) und Effektorgenen zu wählen (eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in den Patentanmeldungen EP 95930524.4, EP 95931933.6, EP 95931204.2, EP 95931205.9,EP 97101507.8, D 196.17851.7 und D 196.39103.2 auf die Bezug genommen wird).
  • a) Therapie von Tumoren
  • b) a.1) Zielzellen:
    • 1. proliferierende Endothelzellen oder
    • 2. der Endothelzelle benachbarte Stromazellen und Muskelzellen oder
    • 3. Tumorzellen oder Leukämiezellen
  • c) a.2) Promotoren:
    • 1. endothelzellspezifisch und zellzyklusspezifisch oder
    • 2. zellunspezifisch oder muskelzellspezifisch und zellzyklusspezifisch oder
    • 3. tumorzellspezifisch (solide Tumoren, Leukämien) und zellzyklusspezifisch
  • d) a.3) Effektorgene für Inhibitoren der Zellproliferation, zum Beispiel für
    • 1. das Retinoblastomprotein (pRb = p110) oder die verwandten p107 und p130 Proteine
      Das Retinoblastomprotein (pRb/p110) und die verwandten p107 und p130 Proteine werden durch Phosphorylierung inaktiviert. Bevorzugt sind solche Gene dieser Zellzyklusinhibitoren zu verwenden, welche Mutationen für die Inaktivierungsstellen der exprimierten Proteine aufweisen, ohne daß diese hierdurch in ihrer Funktion beeinträchtigt werden. Beispiele für diese Mutationen wurden beschrieben für das p110.
      In analoger Weise wird die DNA-Sequenz für das p107 Protein oder das p130 Protein mutiert.
    • 2. das p53 Protein
      Das Protein p53 wird in der Zelle inaktiviert entweder durch Bindung an spezielle Proteine, wie beispielsweise MDM2, oder durch Oligomerisierung des p53 über das dephosphorylierte C-terminale Serin. Bevorzugt wird somit eine DNA-Sequenz für ein p53 Protein verwendet, welches C-terminal verkürzt ist um das Serin 392.
    • 3. das p21 (WAF-1)
    • 4. das p16 Protein
    • 5. andere cdk-lnhibitoren
    • 6. das GADD45 Protein
    • 7. das bak Protein
  • e) a.4) Effektorgene für Gerinnung induzierende Faktoren und Angiogeneseinhibitoren, zum Beispiel:
    • 1. Plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1)
    • 2. PAI-2
    • 3. PAI-3
    • 4. Angiostatin und/oder Endostatin
    • 5. Interferone (IFNα, IFNβ oder IFNγ)
    • 6. Platelet factor 4
    • 7. IL-12
    • 8. TIMP-1
    • 9. TIMP-2
    • 10. TIMP-3
    • 11. Leukemia Inhibitory Factor (LIF)
    • 12. Tissue Factor (TF) und dessen gerinnungsaktive Fragmente
  • f) a.5) Effektorgene für zytostatische und zytotoxische Proteine, zum Beispiel für
    • 1. Perform
    • 2. Granzym
    • 3. IL-2
    • 4. IL-4
    • 5. IL-12
    • 6. Interferone, wie beispielsweise IFN-α, IFNβ oder IFNγ
    • 7. TNF, wie TNFα oder TNFβ
    • 8. Oncostatin M
    • 9. Sphingomyelinase
    • 10. Magainin und Magainin-Derivate
  • g) a.6) Effektorgene für zytostatische oder zytotoxische Antikörper und für Fusionsproteine zwischen antigenbindenden Antikörperfragmenten mit zytostatischen, zytotoxischen oder entzündungserregenden Proteinen oder Enzymen.
    • 1. Zu den zytostatischen oder zytotoxischen Antikörpern gehören solche gerichtet gegen Membranstrukturen von Endothelzellen wie sie beispielsweise von Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994)), Hughes et al., (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) und Maruyama et al., (PNAS USA 87, 5744 (1990)) beschrieben wurden. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF-Rezeptoren.
    • 2. Des weiteren gehören hierzu zytostatische oder zytotoxische Antikörper gerichtet gegen Membranstrukturen auf Tumorzellen. Derartige Antikörper wurden zum Beispiel von Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, München (1992) übersichtlich dargestellt. Weitere Beispiele stellen dar Antikörper gegen Sialyl Lewis; gegen Peptide auf Tumoren, welche von T-Lymphozyten erkannt werden; gegen von Onkogenen exprimierte Proteine; gegen Ganglioside wie GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3, Fucosyl GM1; gegen Blutgruppenantigene und deren Vorläufer; gegen Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin; gegen Antigene auf Heat Shock Proteinen.
    • 3. Des weiteren gehören hierzu gehören Antikörper gerichtet gegen Membranstrukturen von Leukämiezellen. Eine große Anzahl derartiger monoklonaler Antikörper sind bereits für diagnostische und therapeutische Verfahren beschrieben worden (Übersichten bei Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7,1(1989); Stickney et al., Curr.. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cancer Invest. 9, 69 (1991)). Je nach Typ der Leukämie sind als Liganden beispielsweise monoklonalen Antikörper oder deren antigenbindende Antikörperfragmente gerichtet gegen folgende Membranantigene geeignet:
      Zellen
      Membranantigen
      AML CD13
      CD15
      CD33
      CAMAL
      Sialosyl-Le
      B-CLL CD5
      CD1c
      CD23
      Idiotypen und Isotypen der Membranimmunglobuline
      T-CLL CD33
      M38
      IL-2-Rezeptoren
      T-Zell-Rezeptoren
      ALL CALLA
      CD19
      Non-Hodgkin Lymphoma
    • 4. Die Humanisierung muriner Antikörper, die Herstellung und Optimierung der Gene für Fab und rek. Fv Fragmente erfolgt entsprechend der dem Fachmann bekannten Technik (Winter et al., Nature 349, 293 (1991); Hoogenbooms et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993); Girol. Mol. Immunol. 28, 1379 (1991) oder Huston et al., Intern. Rev. Immunol. 10, 195 (1993)). Die Fusion der rek. Fv-Fragmente mit Genen für zytostatische, zytotoxische oder entzündungserregende Proteinen oder Enzymen erfolgt gleichermaßen entsprechend dem dem Fachmann bekannten Stand der Technik.
  • h) a.7) Effektorgene für Fusionsproteine von Zielzell-bindenden Liganden mit zytostatischen und zytotoxischen Proteinen. Zu den Liganden gehören alle Substanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Endothelzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu
    • 1. Cytokine wie beispielsweise IL-1 oder Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Endothelzellen binden, wie beispielsweise PDGF, bFGF, VEGF, TGF.
    • 2. Des weiteren gehören hierzu Adhäsionsmoleküle, welche an aktivierte und/oder proliferierende Endothelzellen binden. Hierzu gehören beispielsweise SLex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4 oder Vitronectin.
    • 3. Hierzu gehören des weiteren Substanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren von Tumor- oder Leukämiezellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Leukämiezellen oder Tumorzellen binden.
      Derartige Wachstumsfaktoren wurden bereits beschrieben (Übersichten bei Cross et al., Cell 64, 271 (1991), Aulitzky et al., Drugs 48, 667 (1994), Moore, Clin. Cancer Res. 1, 3 (1995), Van Kooten et al., Leuk. Lymph. 12, 27 (1993)).
    • 4. Die Fusion der Gene dieser an die Zielzelle bindenden Liganden mit zytostatischen, zytotoxischen oder entzündungserregenden Proteinen oder Enzymen erfolgt entsprechend dem Stand der Technik mit den dem Fachmann bekannten Methoden.
  • i) a.8) Effektorgene für Induktoren von Entzündungen, zum Beispiel für
    • 1. IL-1
    • 2. IL-2
    • 3. RANTES (MCP-2)
    • 4. monocyte chemotactic and activating factor (MCAF)
    • 5. IL-8
    • 6. macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1α, -β)
    • 7. neutrophil activating protein-2 (NAP-2)
    • 8. IL-3
    • 9. IL-5
    • 10. human leukemia inhibitory factor (LIF)
    • 11. IL-7
    • 12. IL-11
    • 13. IL-13
    • 14. GM-CSF
    • 15. G-CSF
    • 16. M-CSF
    • 17. Cobra venum factor (CVF) oder Teilsequenzen vom CVF, welchem dem menschlichen Komplementfaktor C3b funktionell entsprechen, d. h. welche an den Komplementfaktor B binden können und nach Spaltung durch den Faktor D eine C3 Konvertase darstellen
    • 18. der menschliche Komplementfaktor C3 oder seine Teilsequenz C3b
    • 19. Spaltprodukte des menschlichen Komplementfaktors C3, welche funktionell und strukturell dem CVF ähneln
    • 20. bakterielle Proteine, welche Komplement aktivieren oder Entzündungen auslösen, wie beispielsweise Porine von Salmonella typhi murium, "clumping" Faktoren von Staphylococcus aureus, Moduline besonders von gram-negativen Bakterien, "Major outer membrane protein" von Legionellen oder von Haemophilus influenza Typ B oder von Klebstellen oder M-Moleküle von Streptokokken Gruppe G.
  • j) a.9) Effektorgene für Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika, zum Beispiel für Enzyme, welche inaktive Vorsubstanzen (Prodrugs) in aktive Zytostatika (Drugs) spalten.
    Derartige Substanzen und die jeweils zugehörigen Prodrugs und Drugs sind bereits von Deonarain et al. (Br. J. Cancer 70, 786 (1994)), Mullen, Pharmac. Ther. 63, 199 (1994)) und Harris et al. (Gene Ther. 1, 170 (1994)) übersichtlich beschrieben worden. Beispielsweise ist die DNA-Sequenz eines der folgenden Enzyme zu verwenden:
    • 1. Herpes Simplex Virus thymidinkinase
    • 2. Varizella Zoster Virus Thymidinkinase
    • 3. bakterielle Nitroreduktase
    • 4. bakterielle β-Glucuronidase
    • 5. pflanzliche β-Glucuronidase aus Secale cereale
    • 6. humane β-Glucuronidase
    • 7. humane Carboxy peptidase (CB) zum Beispiel CB-A der Mastzelle, CB-B des Pankreas oder bakterielle Carboxy peptidase
    • 8. bakterielle β-Laktamase
    • 9. bakterielle Cytosine deaminase
    • 10. humane Catalase bzw. Peroxidase
    • 11. Phosphatase, im besonderen humane alkalische Phosphatase, humane saure Prostataphosphatase oder Typ 5 saure Phosphatase
    • 12. Oxidase, im besonderen humane Lysyloxidase oder humane saure D- aminooxidase
    • 13. Peroxidase, im besonderen humane Gluthation Peroxidase, humane Eosinophilen Peroxidase oder humane Schilddrüsen Peroxidase
    • 14. Galaktosidase
  • k) Therapie von Autoimmunerkrankungen und Entzündungen (eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in der Patentanmeldung EP 95931205.9, auf die Bezug genommen wird)
  • l) b.1) Zielzellen:
    • 1. proliferierende Endothelzellen oder
    • 2. Makrophagen und/oder Lymphozyten oder
    • 3. Synovialzellen
  • m) b.2) Promotoren:
    • 1. endothelzellspezifisch und Zellzyklusspezifisch oder
    • 2. makrophagen- und/oder lymphozytenspezifisch und/oder zellzyklusspezifisch oder
    • 3. synovialzellspezifisch und/oder Zellzyklusspezifisch
  • n) b.3) Effekorgene für die Therapie von Allergien, zum Beispiel für
    • 1. IFNβ
    • 2. IFNγ
    • 3. IL-10
    • 4. Antikörper bzw. Antikörperfragmente gegen IL-4
    • 5. lösliche IL-4-Rezeptoren
    • 6. IL-12
    • 7. TGFβ
  • o) b.4) Effektorgene für die Verhinderung der Abstoßung von transplantierten Organen, zum Beispiel für
    • 1. IL-10
    • 2. TGFβ
    • 3. lösliche IL-1-Rezeptoren
    • 4. lösliche IL-2-Rezeptoren
    • 5. IL-1-Rezeptorantagonisten
    • 6. lösliche IL-6-Rezeptoren
    • 7. immunsuppressive Antikörper oder deren VH und VL enthaltende Fragmente oder deren über einen Linker verbundene VH- und VL-Fragmente. Immunsuppressive Antikörper sind beispielsweise Antikörper spezifisch für den T-Zell-Rezeptor oder seinen CD3-Komplex, gegen CD4 oder CD8 des weiteren gegen den IL-2-Rezeptor, IL-1-Rezeptor oder IL-4-Rezeptor oder gegen die Adhäsionsmoleküle CD2, LFA-1, CD28 oder CD40
  • p) b.5) Effektorgene für die Therapie von Antikörper-mediierten Autoimmunerkrankungen, zum Beispiel für
    • 1. TGFβ
    • 2. IFNα
    • 3. IFNβ
    • 4. IFNγ
    • 5. IL-12
    • 6. lösliche IL-4-Rezeptoren
    • 7. lösliche IL-6-Rezeptoren
    • 8. immunsuppressive Antikörper oder dessen VH und VL-enthaltende Fragmente
  • q) b.6) Effektorgene für die Therapie von Zell-medüerten Autoimmunerkrankungen, zum Beispiel für
    • 1. IL-6
    • 2. IL-9
    • 3. IL-10
    • 4. IL-13
    • 5. TNFα oder TNFβ
    • 6. IL-13
    • 7. einen immunsuppressiven Antikörper oder dessen VH- und VL-enthaltende Fragmente
  • r) b.7) Effektorgene für Inhibitoren der Zellproliferation, zytostatische oder zytotoxische Proteine und Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika.
    Beispiele für Gene kodierend für derartige Proteine sind bereits im Abschnitt "Effektorgene für die Therapie von Tumoren" aufgeführt.
    In gleicher Form wie dort bereits beschrieben, können im Sinne der Erfindung Strukturgene verwendet werden, welche für Fusionsproteine aus Antikörpern bzw. Fab oder rek. Fv-Fragmenten dieser Antikörper oder anderen Liganden spezifisch für die Zielzelle und den o. a. Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, zytostatischen oder zytotoxischen Proteinen und Enzymen kodieren.
  • s) b.8) Effektorgene für die Therapie der Arthritis
    Im Sinne der Erfindung werden Strukturgene ausgewählt, deren exprimiertes Protein die Entzündung beispielsweise im Gelenk direkt oder indirekt hemmt und/oder die Rekonstitution von extrazellulärer Matrix (Knorpel, Bindegewebe) im Gelenk fördert.
    Hierzu gehören zum Beispiel
    • 1. IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1-RA);
      IL-1-RA inhibiert die Bindung von IL-1α, β
    • 2.  - löslicher IL-1-Rezeptor;
      löslicher IL-1-Rezeptor bindet und inaktiviert IL-1
    • 3. IL-6
      IL-6 erhöht die Sekretion von TIMP und Superoxiden und vermindert die Sekretion von IL-1 und TNFα durch Synovialzellen und Chondrozyten
    • 4. löslicher TNF-Rezeptor
      löslicher TNF-Rezeptor bindet und inaktiviert TNF.
    • 5. IL-4
      IL-4 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1, TNFα und MMP
    • 6. IL-10
      IL-10 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1, TNF∝ und MMP und erhöht die Sekretion von TIMP
    • 7. Insulin-like growth factor (IGF-1)
      IGF-1 stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix.
    • 8. TGFβ, im speziellen TGFβ1 und TGFβ2
      TGFβ stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix.
    • 9. Superoxiddismutase
    • 10. TIMP, im speziellen TIMP-1, TIMP-2 oder TIMP-3
  • t) Therapie der mangelhaften Bildung von Zellen des Blutes (eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in der Patentanmeldung EP 95931205.9, auf die Bezug genommen wird)
  • u) c.1) Zielzellen:
    • 1. proliferierende, unreife Zellen des blutbildenden Systems oder
    • 2. Stromazellen benachbart den blutbildenden Zellen
  • v) c.2) Promotoren:
    • 1. spezifisch für blutbildende Zellen und/oder Zellzyklusspezifisch
    • 2. zellunspezifisch und zellzyklusspezifisch
  • w) c.3) Effektorgene für die Therapie der Anämie, zum Beispiel für
    • 1. Erythropoietin
  • x) c.4) Effektorgene für die Therapie der Leukopenie, zum Beispiel für
    • 1. G-CSF
    • 2. GM-CSF
    • 3. M-CSF
  • y) c.5) Effektorgene für die Therapie der Thrombozytopenie, zum Beispiel für
    • 1. IL-3
    • 2. Leukemia Inhibitory Factor (LIF)
    • 3. IL-11
    • 4. Thrombopoietin
  • z) Therapie von Schäden des Nervensystems (eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in der Patentanmeldung EP 95931933.6, auf die Bezug genommen wird)
  • aa) d.1) Zielzellen:
    • 1. Gliazellen oder
    • 2. proliferierende Endothelzellen
  • ab) d.2) Promotoren:
    • 1. Gliazell-spezifisch und zellzyklusspezifisch oder
    • 2. Endothelzell-spezifisch und Zellzyklusspezifisch oder
    • 3. unspezifisch und Zellzyklusspezifisch
  • ac) d.3) Effektorgene für neuronale Wachstumsfaktoren, zum Beispiel
    • 1. FGF
    • 2. Nerve growth factor (NGF)
      Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)
    • 3. Neurotrophin-3 (NT-3)
    • 4. Neurotrophin-4 (NT-4)
    • 5. Ciliary neurotrophic factor (CNTF)
  • ad) d.4) Effektorgene für Enzyme, zum Beispiel für
    • 1. Tyrosinhydroxylase
    • 2. Dopadecarboxylase
  • ae) d.5) Effektorgene für Cytokine und deren Inhibitoren, welche die neurotoxische Wirkung von TNFα inhibieren oder neutralisieren, zum Beispiel für
    • 1. TGFβ
    • 2. lösliche TNF-Rezeptoren
    • 3. TNF-Rezeptoren neutralisieren TNFα
    • 4. IL-10
      IL-10 inhibiert die Bildung von IFNγ, TNFα, IL-2 und IL-4
    • 5. lösliche IL-1-Rezeptoren
    • 6. IL-1-Rezeptor I
    • 7. IL-1-Rezeptor II
    • 8. lösliche IL-1-Rezeptoren neutralisieren die Aktivität von IL-1
    • 9. IL-1-Rezeptor-Antagonist
    • 10. lösliche IL-6-Rezeptoren
  • af) Therapie von Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems (eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in den Patentanmeldungen EP 95930524.4, EP 97101507.8, DE 196 17 851.7 und DE 196 39 103.2, auf welche Bezug genommen wird)
  • ag) e.1) Zielzellen:
    • 1. Endothelzellen oder
    • 2. proliferierende Endothelzellen oder
    • 3. somatische Zellen in Nachbarschaft von Endothelzellen und glatte Muskelzellen oder
    • 4. Makrophagen
  • ah) e.2) Promotoren:
    • 1. zellunspezifisch und zellzyklusspezifisch oder
    • 2. spezifisch für Endothelzellen, glatte Muskelzellen oder Makrophagen und zellzyklusspezifisch
  • ai) e.3) Effektorgene für die Inhibition der Gerinnung oder für die Förderung der Fibrinolyse, zum Beispiel für
    • 1. Tissue Plasminogen Activator (tPA)
    • 2. Urokinase-type Plasminogen Activator (uPA)
    • 3. Hybride von tPA und uPA
    • 4. Protein C
    • 5. Hirudin
    • 6. Serin Proteinase Inhibitoren (Serpine), wie beispielsweise C-1S-Inhibitor, α1- Antitrypsin oder Antithrombin III
    • 7. Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)
  • aj) e.4) Effektorgene für die Förderung der Gerinnung, zum Beispiel für
    • 1. F VIII
    • 2. F IX
    • 3. von Willebrand factor
    • 4. F XIII
    • 5. PAI-1
    • 6. PAI-2
    • 7. Tissue Factor and Fragmente hiervon
  • ak) e.5) Effektorgene für Angiogenesefaktoren, zum Beispiel für
    • 1. VEGF
    • 2. FGF
  • al) e.6) Effektorgene für die Blutdrucksenkung, zum Beispiel für
    • 1. Kallikrein
    • 2. Endothelzell "nitric oxide synthase"
  • am) e.7) Effektorgene für die Inhibition der Proliferation von glatten Muskelzellen nach Verletzungen der Endothelschicht, zum Beispiel für
    • 1. ein antiproliferatives, zytostatisches oder zytotoxisches Protein oder
    • 2. ein Enzym zur Aufspaltung von Vorstufen von Zytostatika in Zytostatika wie bereits oben (unter Tumor) aufgeführt oder
    • 3. ein Fusionsprotein eines dieser Wirkstoffe mit einem Liganden, beispielsweise einem Antikörper oder Antikörperfragmenten spezifisch für Muskelzellen
  • an) e.8) Effektorgene für weitere Blutplasmaproteine, zum Beispiel für
    • 1. Albumin
    • 2. C1-Inaktivator
    • 3. Serum Cholinesterase
    • 4. Transferrin
    • 5. 1-Antritrypsin
  • ao) Impfungen
    (eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in den Patentanmeldungen EP 95931205.9, EP 97101507.8, EP 97102547.3, auf welche Bezug genommen wird)
  • ap) f.1) Zielzellen:
    • 1. Muskelzellen oder
    • 2. Makrophagen und/oder Lymphozyten
  • aq) f.2) Promotoren:
    • 1. unspezifisch und zellzyklusspezifisch oder
    • 2. zielzellspezifisch und zellzyklusspezifisch
  • ar) f.3) Effektorgene für die Prophylaxe von Infektionserkrankungen
    Die Möglichkeiten, auf konventionellem Wege wirkungsvolle Impfstoffe herzustellen, sind beschränkt.
    Demzufolge wurde die Technologie der DNA-Vakzine entwickelt. Diese DNA- Vakzinen werfen jedoch Fragen zur Wirksamkeitsstärke auf (Fynan et al., Int. J. Immunopharm. 17, 79 (1995); Donnelly et al., Immunol. 2, 20 (1994)).
    Gemäß dieser Erfindung ist mit einer größeren Wirksamkeit der DNA- Vakzine zu rechnen.
    Als Wirksubstanz ist die DNA eines vom Infektionserreger gebildeten Proteins auszuwählen, welches durch Auslösung einer Immunreaktion, d. h. durch Antikörperbindung und/oder durch zytotoxische T-Lymphozyten zur Neutralisierung und/oder zur Abtötung des Erregers führt. Derartige sogenannte Neutralisationsantigene werden als Impfantigene bereits angewandt (siehe Übersicht bei Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)).
    Bevorzugt im Sinne der Erfindung wird die DNA kodierend für Neutralisationsantigene folgender Erreger:
    • 1. Influenza A-Virus
    • 2. HIV
    • 3. Tollwut-Virus
    • 4. HSV (Herpes Simplex Virus)
    • 5. RSV (Respiratory Syncytial Virus)
    • 6. Parainfluenza Virus
    • 7. Rotavirus
    • 8. VZV (Varizella Zoster Virus)
    • 9. CMV (Cytomegalo-Virus)
    • 10. Masern-Virus
    • 11. HPV (Humanes Papillomvirus)
    • 12. HBV (Hepatitis B-Virus)
    • 13. HCV (Hepatitis C-Virus)
    • 14. HDV (Hepatitis D-Virus)
    • 15. HEV (Hepatitis E-Virus)
    • 16. HAV (Hepatitis A-Virus)
    • 17. Vibrio Cholera-Antigen
    • 18. Borrelia Burgdorferi
    • 19. Helicobacter pylori
    • 20. Malaria-Antigen
    • 21. Zu derartigen Wirksubstanzen im Sinne der Erfindung gehört jedoch auch die DNA eines Antiidiotyp-Antikörpers oder seiner Antigen-bindenden Fragmente, dessen Antigenbindungsstrukturen (die "complementary determining regions") Kopien der Protein- oder Kohlenhydratstruktur des Neutralisationsantigens des Infektionserregers darstellen.
      Derartige Antiidiotyp-Antikörper können besonders Kohlenhydratantigene bei bakteriellen Infektionserregern ersetzen.
      Derartige antiidiotypische Antikörper und ihre Spaltprodukte wurden von Hawkins et al. (J. Immunother. 14, 273 (1993)) und Westerink und Apicella (Springer Seminars in immunopathol. 15, 227 (1993)) übersichtlich beschrieben.
  • as) f.4) Effektorgene für "Tumorvakzinen"
    • 1. Hierzu gehören Antigene auf Tumorzellen. Derartige Antigene wurden zum Beispiel von Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol 43, Karger Verlag, München (1992) übersichtlich dargestellt.
    Weitere Beispiele stellen die Gene für folgende Antigene bzw. für Antiidiotypantikörper korrespondierend mit folgenden Antigenen dar:
    • 1. Sialyl Lewis
    • 2. Peptide auf Tumoren, welche von T-Lymphozyten erkannt werden
    • 3. von Onkogenen exprimierte Proteine
    • 4. Blutgruppenantigene und deren Vorläufer
    • 5. Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin
    • 6. Antigene auf Heat Shock Proteinen
  • at) die Therapie von chronischen Infektionserkrankungen
    (eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in den Patentanmeldungen EP 95931205.9 und EP 97102547.3, auf welche Bezug genommen wird)
  • au) g.1) Zielzelle:
    • 1. Leberzelle
    • 2. Lymphozyt und/oder Makrophage
    • 3. Epithelzelle
    • 4. Endothelzelle
  • av) g.2) Promotoren:
    • 1. virusspezifisch oder zelispezifisch und zellzyklusspezifisch
  • aw) g.3) Effektorgene, beispielsweise für
    • 1. ein Protein, welches zytostatische, apoptotische oder zytotoxische Wirkungen aufweist.
    • 2. ein Enzym, welches eine Vorstufe einer antiviralen oder zytotoxischen Substanz in die aktive Substanz spaltet.
  • ax) g.4) Effektorgen für antivirale Proteine
    • 1. antiviral wirksame Cytokine und Wachstumsfaktoren. Hierzu zählen beispielsweise IFNα, IFNβ, IFNγ, TNFβ, TNFα, IL-1 oder TGFβ
    • 2. Antikörper einer Spezifität, die das jeweilige Virus inaktiviert oder dessen VH und VL enthaltende Fragmente oder dessen über einen Linker verbundene VH und VL Fragmente herstellt wie bereits beschrieben.
      Antikörper gegen Virusantigen sind beispielsweise:
      anti HBV
      anti HCV
      anti HSV
      anti HPV
      anti HIV
      anti EBV
      anti HTLV
      Anti Coxackie Virus
      anti Hantaan Virus
    • 3. ein Rev bindendes Protein. Diese Proteine binden an die Rev-RNA und inhibieren Rev-abhängige posttranskriptionelle Stufen der Retrovirus- Genexpression. Beispiele für Rev-bindende Proteine sind:
      RBP9-27
      RBP1-8U
      RBP1-8D
      Pseudogene von RBP1-8
    • 4. für Ribozyme, welche die mRNA von Genen für Zellzykluskontrollproteine oder die mRNA von Viren verdauen. Ribozyme katalytisch für HIV wurden beispielsweise von Christoffersen et al., J. Med. Chem. 38, 2033 (1995) übersichtlich beschrieben.
  • ay) g.5) Effektorgene für antibakterielle Proteine
    Zu den antibakteriellen Proteinen gehören beispielsweise Antikörper, die bakterielle Toxine neutralisieren oder Bakterien opsonieren. Beispielsweise gehören hierzu Antikörper gegen
    Meningokokken C oder B
    E. coli
    Borrelia
    Pseudomonas
    Helicobacter pylori
    Staphylococcus aureus
VI) Kombination gleicher oder unterschiedlicher Effektorgene (eine detaillierte Beschreibung erfolgte in EP 95930524.4 und EP 97102547.3, auf welche Bezug genommen wird)
Zur Expression von zwei oder mehreren Effektorgenen [z. B. Komponenten e, e', e"] ist jeweils eine weitere Komponente c) und Komponente d) oder vorzugsweise die cDNA einer "internal ribosome entry site" (IRES) als regulatorisches Element zwischen den jeweiligen Effektorgenen geschaltet.
Eine IRES ermöglicht die Expression zweier über eine IRES miteinander verbundener DNA-Sequenzen.
Derartige IRES wurden beispielsweise von Montford und Smith (TIG 11, 179 (1995); Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19, 4485 (1991); Morgan et al., Nucl. Acids Res. 20, 1293 (1992); Dirks et al., Gene 128, 247 (1993); Pelletier und Sonenberg, Nature 334, 320 (1988) und Sugitomo et al., BioTechn. 12, 694 (1994)) beschrieben.
So kann beispielsweise die korrespondierende DNA-Sequenz der IRES-Sequenz des Poliovirus (Position < 140 bis < 630 des 5' UTR verwendet werden.
Bevorzugt im Sinne der Erfindung sind über weitere Komponenten c) und d) oder über eine IRES-Sequenz Effektorgene zu verknüpfen, welche eine additive Wirkung aufweisen.
Im Sinne der Erfindung sind bevorzugte Kombinationen von Effektorgenen beispielsweise für
  • a) die Therapie von Tumoren
    • 1. gleiche oder unterschiedliche, zytostatische, apoptotische, zytotoxische und/oder entzündungserregende Proteine oder
    • 2. gleiche oder unterschiedliche Enzyme für die Spaltung der Vorstufe eines Zytostatikums
  • b) die Therapie von Autoimmunerkrankungen
    • 1. unterschiedliche Cytokine oder Rezeptoren mit synergistischer Wirkung zur Hemmung der zellulären und/oder humoralen Immunreaktion oder
    • 2. unterschiedliche oder gleiche TIMPs
  • c) die Therapie von mangelhafter Bildung von Zellen des Blutes
    • 1. unterschiedliche, hierarchisch aufeinanderfolgende Cytokine, wie beispielsweise
      IL-1, IL-3, IL-6 oder GM-CSF und Erythropoietin, G-CSF oder Thrombopoietin
  • d) die Therapie von Nervenzellschäden
    • 1. ein neuronaler Wachstumsfaktor und ein Cytokin oder der Inhibitor eines Cytokines
  • e) die Therapie von Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems
    • 1. ein Antithrombotikum und ein Fibrinolytikum (z. B. tPA oder uPA) oder
    • 2. ein zytostatisches, apoptotisches oder zytotoxisches Protein und ein Antithrombotikum oder ein Fibrinolytikum
    • 3. mehrere unterschiedliche, synergistisch wirkende Blutgerinnungsfaktoren, beispielsweise F VIII und vWF oder F VIII und F IX
  • f) Impfungen
    • 1. ein Antigen und ein immunstimulierendes Cytokin, wie beispielsweise IL-1α, IL-1β, IL-2, GM-CSF, IL-3 oder IL-4 Rezeptor
    • 2. unterschiedliche Antigene eines Infektionserregers oder unterschiedlicher Infektionserreger oder
    • 3. unterschiedliche Antigene eines Tumortyps oder unterschiedlicher Tumortypen
  • g) Therapie von viralen Infektionserkrankungen
    • 1. ein antivirales Protein und ein zytostatisches, apoptotisches oder zytotoxisches Protein
    • 2. Antikörper gegen unterschiedliche Oberflächenantigene eines Virus oder mehrere Viren
  • h) Therapie von bakteriellen Infektionserkrankungen
    • 1. Antikörper gegen unterschiedliche Oberflächenantigene und/oder Toxine eines Keimes
VII) Einfügung von Signalsequenzen und Transmembrandomänen
  • a) Zur Verstärkung der Translation kann am 3' Ende der Promotorsequenz und unmittelbar am 5' Ende des Startsignals (ATG) der Signal- bzw. Transmembransequenz die Nukleotidsequenz GCCACC oder GCCGCC eingefügt (Kozak, J. Cell Biol. 108, 299 (1989)) werden.
  • b) Zur Erleichterung der Sekretion des Expressionsproduktes des Effektorgenes kann die ggf. in der DNA-Sequenz des Effektorgenes enthaltende homologe Signalsequenz ersetzt werden durch eine heterologe, die extrazelluläre Ausschleusung verbessernde Signalsequenz.
    So kann beispielsweise die Signalsequenz für das Immunglobulin (DNA Position < 63 bis < 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)) oder die Signalsequenz für das CEA (DNA-Position < 33 bis < 134; Schrewe et al., Mol. Cell Biol. 10, 2738 (1990); Berling et al., Cancer Res. 50, 6534 (1990)) oder die Signalsequenz des humanen Respiratory Syncytial Virus Glycoproteins (cDNA der Aminosäuren < 38 bis < 50 oder 48 bis 65; Lichtenstein et al., J. Gen. Virol. 77, 109 (1996)) eingefügt werden.
  • c) Zur Verankerung des Wirkstoffes in die Zellmembran der den Wirkstoff bildenden transduzierten Zelle kann alternativ oder zusätzlich zur Signalsequenz eine Sequenz für eine Transmembrandomäne eingeführt werden.
    So kann beispielsweise die Transmembransequenz des menschlichen Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktors (DNA-Position < 1485 bis < 1554; Cosman et al., Behring Inst. Mitt. 83, 15 (1988)) oder die DNA-Sequenz für die Signal- und Transmembranregion des menschlichen Respiratory Syncytial Virus (RSV)-Glykoproteins G (Aminosäuren 1 bis 63 oder deren Teilsequenzen, Aminosäuren 38 bis 63; Vijaya et al., Mol. Cell Biol. 8, 1709 (1988); Lichtenstein et al., J. Gen. Virol. 77, 109 (1996)) oder die DNA- Sequenz für die Signal- und Transmembranregion der Influenzavirus- Neuraminidase (Aminosäuren 7 bis 35 oder die Teilsequenz Aminosäuren 7 bis 27; Brown et al., J. Virol. 62, 3824 (1988)) zwischen der Promotorsequenz und der Sequenz des Effektorgens eingefügt werden.
  • d) Zur Verankerung des Wirkstoffes in die Zellmembran der den Wirkstoff bildenden transduzierten Zellen kann jedoch auch die Nukleotidsequenz für einen Glykophospholipid-Anker eingefügt werden.
    Die Einfügung eines Glykophospholipid-Ankers erfolgt am 3' Ende der Nukleo­ tidsequenz für das Strukturgen und kann zusätzlich zur Einfügung einer Signalsequenz erfolgen.
    Glykophospholipid-Anker sind beispielsweise für das CEA, für das N-CAM und für weitere Membranproteine, wie beispielsweise Thy-1, beschrieben worden (siehe Übersicht Ferguson et al., Ann. Rev. Biochem. 57, 285 (1988)).
  • e) Eine weitere Möglichkeit der Verankerung von Wirkstoffen an die Zellmembran entsprechend der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer DNA- Sequenz für ein Ligand-Wirkstoff-Fusionsprotein. Die Spezifität des Liganden dieses Fusionsproteins ist gerichtet gegen eine Membranstruktur auf der Zellmembran der gewählten Zielzelle.
  • f) e.1) Zu den Liganden, welche an die Oberfläche von Zellen binden, gehören beispielsweise Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Strukturen auf der Oberfläche von beispielsweise
    • 1. Endothelzellen. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF Rezeptoren oder gegen Kinin-Rezeptoren
    • 2. oder von Muskelzellen, wie Antikörper gegen Actin oder Antikörper gegen Angiotensin II-Rezeptoren oder Antikörper gegen Rezeptoren für Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise gegen EGF-Rezeptoren oder gegen PDGF-Rezeptoren oder gegen FGF-Rezeptoren oder Antikörper gegen Endothelin A-Rezeptoren
    • 3. Zu den Liganden gehören auch Antikörper oder deren Fragmente, welche gerichtet sind gegen tumorspezifische oder tumorassoziierte Antigene auf der Tumorzellmembran. Derartige Antikörper wurden bereits beschrieben.
  • g) Die murinen monoklonalen Antikörper sind bevorzugt in humanisierter Form einzusetzen. Fab und rek. Fv-Fragmente und deren Fusionsprodukte werden, wie bereits beschrieben, mit der dem Fachmann bekannten Technologie hergestellt.
  • h) e.2) Zu den Liganden gehören des weiteren alle Wirkstoffe, wie beispielsweise Cytokine oder Adhäsionsmoleküle, Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, Mediatoren oder Peptidhormone, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf der jeweiligen ausgewählten Zelle binden. Beispielsweise gehören hierzu
    • 1. Liganden für Endothelzellen, wie IL-1, PDGF, bFGF, VEGF, TGGβ (Pusztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)) oder Kinin und Derivate oder Analoga von Kinin.
    • 2. Des weiteren gehören hierzu Adhäsionsmoleküle. Derartige Adhäsions­ moleküle, wie beispielsweise SLex, LFA-1, MAC-1, LeCAM-1, VLA-4 oder Vitronectin und Derivate oder Analoga von Vitronectin, wurden bereits für Endothelzellen beschrieben (Übersichten bei Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119, 483 (1992); Pauli et al., Cancer Metast. Rev. 9, 175 (1990); Honn et al., Cancer Metast. Rev. 11, 353 (1992); Varner et al., Cell Adh. Commun. 3, 367 (1995)).
Die Erfindung wird an folgenden Beispielen näher erläutert, ohne sich darauf zu beschränken.
D) Beispiele zur Erläuterung des Erfindungsgedankens I) Herstellung und Prüfung eines Expressionssystems enthaltend ein chimäres Promotorsystem mit einem rekombinanten Transkriptionsfaktor in Endothelzellen b) Klonierung der verwendeten Plasmide
Das erfindungsgemäße Expressionssystem besteht aus den im Folgenden aufgeführten Konstrukten RTA-(Rekombinanter Transkriptionsaktivator) Konstrukt und Reporterkonstrukt 1 oder 2 mit unterschiedlichen, stromabwärts aufeinanderfolgenden Nukleotidsequenzen:
RTA-Konstrukt (Fig. 5A)
  • 1. der SV40 Promotor und Enhancer (Genbank SV40 zirkuläres Genom, NID g965480: Nukleotide 5172-294)
  • 2. dem Kaninchen β-Globin-Intron II (Genbank β-Globin-Gen, Accession-Nr. V00882: Nukleotide 700-1305, van Ooyen et al., Science 206, 337 (1979))
  • 3. der cDNA für die DNA-Bindedomäne des Gal4 Proteins [Aminosäuren 1 bis 147; Chasman und Kornberg, Mol. Cell Biol. 2916 (1990)]
  • 4. dem Linker: ATA GGC CGG GCC (SEQ ID NO: 11)
  • 5. der cDNA für die Transaktivierungsdomäne von NF-YA [Aminosäuren 1 bis 261 + Stop-Codon (TAG); Li et al., J. Biol. Chem. 267, 8984 (1992); von Hujisduijnen et al., EMBO J. 9, 3119 (1990); Sinka et al., J. Biol. Chem. 92, 1624 (1995)]
  • 6. dem SV40-Poly A-Signal (Vektor pGL3, Promega) (dieses Transkriptionsterminationssignal ist am 3' Ende aller nachfolgend angeführten Konstrukte angefügt, ohne gesondert aufgeführt zu sein
Reporterkonstrukt 1 (Fig. 5B)
  • 1. 5x der Bindesequenz [Nukleotidsequenz: 5 × 5'- CGGAGTACTGTCCTCCG-3', SEQ ID NO: 6] für das Gal4 Protein (Webster et al., Cell 52, 169 (1988))
  • 2. dem basalen Promotor von cdc25C [Nukleotidsequenz -20 bis +121; Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)]
  • 3. der cDNA für Luciferase; sämtliche Luziferasekonstrukte sind in den Vektor pGL3 (Promega) kloniert, der zur Transkriptionstermination das SV40-Poly A-Signal beinhaltet
Reporterkonstrukt 2 (Fig. 5C)
  • 1. 3x der Bindesequenz [Nukleotidsequenz: 5 × 5'- CGGAGTACTGTCCTCCG-3', SEQ ID NO: 6] für das Gal4 Protein (Webster et al., Cell 52, 169 (1988))
  • 2. dem basalen Promotor von cyclin A (Nukleotidsequenz -40 bis +94; Henglein et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 91, 5490-5494 (1994))
  • 3. der cDNA für Luciferase (pGL3, Promega)
Als Kontrollen dienten folgende Konstrukte
Reporterkonstrukt 3 (Fig. 5D)
Entspricht dem Reporterkonstrukt 1, wobei in dem basalen Promotor von cdc25C [Nukleotidsequenz -20 bis +121; Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)] das CDE Element TGGCGGA mutiert wurde zu TGGCtGA.
Kontrollkonstrukt 1 (Fig. 6A)
"pGL3promoter" von Promega:
Expressionssystem mit folgenden Nukleotidsequenzen
  • 1. SV40 Promotor
  • 2. cDNA für Luciferase
Kontrollkonstrukt 2 (Fig. 6B)
Expressionssystem mit folgenden Nukleotidsequenzen
  • 1. cyclin A Promotor (-214 bis +100, Henglein et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 91, 5490-5494 (1994))
  • 2. cDNA für Luciferase
Kontrollkonstrukt 3 (Fig. 6C)
Expressionsprodukt mit folgenden Nukleotidsequenzen
  • 1. cdc25C Promotor (-290 bis +121, Lucibello et al., EMBO J. 14, 132-142 (1995))
  • 2. cDNA für Luciferase
Zur Klonierung sämtlicher Reporterkonstrukte und Kontrollkonstrukte wurde pGL3 (Promega, Luziferase-cDNA-Reporter) als Vektor verwendet. Die in diesen Vektor klonierten Promotorelemente wurden mittels PCR aus humaner, genomischer DNA amplifiziert. Die dazu verwendeten Oligonukleotide enthielten jeweils 4 Nukleotide Überhang (5'-GATC-3'), gefolgt von 6 Nukleotiden mit den benötigten Restriktionsschnittstellen (5'-Primer: BamHI (GGATCC)/3'-Primer: HindIII (AAGCTT) für die Kontrollplasmide 1 und 2 und die Reporterplasmide 1 und 3; 5'- Primer: Bgl II (AGATCT)/3'-Primer: HindIII für das Reporterplasmid 2) und anschließend 20-25 zu dem zu amplifizierenden Promotor komplementäre Nukleotide (beginnend mit der in Klammern angezeigten Position relativ zum Transkriptionsstart). Die in Klammern angegebenen Positionen beziehen sich auf die in der zitierten Literaturstelle aufgeführte Sequenz.
Die PCR-Produkte wurden mit QIAquickTM Spin-Säulen (Qiagen) nach Anleitung des Herstellers aufgereinigt, mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut (diese Enzyme sind käuflich zu erwerben) und nach Auftrenn 14269 00070 552 001000280000000200012000285911415800040 0002019831420 00004 14150ung durch Agarosegelelektrophorese erneut mit QIAquickTM Spin-Säulen aufgereinigt.
Gal4-Bindungsstellen wurden als Oligonukleotide mit für die entsprechenden Restriktionsschnittstellen benötigten Überhängen synthetisiert (5': BamHl/ 3': Bgl II), mit SephadexG25 (Pharmacia) aufgereinigt und hybridisiert.
Die verdauten PCR-Produkte und hybridisierten Oligonukleotide wurden anschließend in die entsprechend geschnittenen und aufgereinigten Vektoren unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (Promega) ligiert.
Sämtliche durch PCR und unter Verwendung von Oligonukleotiden erhaltenen Konstrukte wurden sequenziert, um Mutationen auszuschließen.
b) Reporterassays: Transiente Transfektion, Synchronisation und Luziferaseassay
Die Promotoraktivität der unter a) beschriebenen Konstrukte wurde durch transiente Transfektion bzw. Kotransfektion in Endothelzellen mit anschließender Messung der Luziferaseaktivität bestimmt. BAECs (bovine aortic endothelial cells = Rinder­ aortaendothelzellen) wurden nach der DEAE/Dextran-Methode [modifiziert nach Sompayrac et al., PNAS 78, 7575 (1981)] transient transfiziert. Der Luciferaseassay wurde, wie in Lucibello et al. (EMBO J. 14, 132 (1995)) beschrieben, durchgeführt.
Es wurden 8 mg Plasmid pro 3,5 cm-Schale transfiziert. Bei Kotransfektionen wurden 4 + 4 µg Plasmid transfiziert, wobei bei den Kontrollen mit dem pUC19- Plasmid aufgefüllt wurde. Zur Messung einer zellzyklusabhängigen Promtoraktivität wurden proliferierende Zellen (Vollmedium) mit durch einen 48-stündigen Methioninentzug in der G1-Phase des Zellzyklus arretierten Zelten verglichen. Dabei diente das nicht zellzyklusregulierte Kontrollkonstrukt 1 (enthaltend den SV40-Promotor) zur Standardisierung (seine Aktivität wurde gleich 1 gesetzt).
c) Ergebnisse
Folgende Ergebnisse wurden erzielt (in Klammern angegebene Meßwerte stellen die relative Luziferaseaktivität (standardisiert mit dem SV40-Promotor = Kontrollkonstrukt 1) in proliferierenden Zellen/relative Luziferaseaktivität in G1- Zellen dar):
Mit den Kontrollkonstrukten 2) und 3) transfizierte Endothelzellen bilden deutlich mehr Luziferase wenn sie proliferieren (DNA < 25), als wenn sie in der G1-Phase des Zellzyklus (DNA = 25) arretiert sind (Kontrollkonstrukt 3: < 40x; Kontrollkonstrukt 2: < 150x). Diese Konstrukte dienten als Kontrollen für die Experimente mit den erfindungsgemäßen Expressionssystemen.
Bei Kotransfektion der Reporterkonstrukte 1) und 2) mit dem RTA-Konstrukt konnte ebenfalls eine höhere Luziferaseaktivität in proliferierenden als in G1 arretierten Endothelzellen gezeigt werden (Reporterkonstrukt 1: 5,5x; Reporterkonstrukt 2: 8,3x). Kein Unterschied wurde nach Kotransfektion des Kontrollkonstruktes 3) mit dem RTA-Konstrukt gesehen (1,0x). Die Luziferaseaktivität lagen jeweils deutlich höher als nach Transfektion der jeweiligen Reporterkonstrukte alleine.
Eine deutliche Zellzyklusregulation des erfindungsgemäßen Expressionssystems in Endothelzellen konnte somit gezeigt werden
II) Herstellung und Prüfung eines Expressionssystems enthaltend ein chimäres Promotorsystem mit einem rekombinanten Transkriptionsfaktor in Melanomzellen a) Klonierung der verwendeten Plasmide
Das erfindungsgemäße Expressionssystem besteht aus folgenden Konstrukten mit unterschiedlichen, stromabwärts aufeinanderfolgenden Nukleotidsequenzen:
RTA-Konstrukte
Die RTA (Rekombinanter Transkriptionsaktivator)-Plasmide kodieren für ein Fusionsprotein aus der Gal4-DNA-Bindungsdomäne und der Serin-, Threonin- und Glutamin-reichen Transaktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors NF-YA.
CMV-GN Gal4 (As 1-147), Linker: ATA GGC CGG GCC (SEQ ID. NO: 11),
mNF-YA
(As 1-261 + Stop-Codon (TAG)) unter Kontrolle des
CMV-Promotors und -Enhancers (nts 232-863 aus pcDNA3,
Invitrogen), SV40-PolyA (Fig. 7A)
(Li et al., J. Biol. Chem. 267, 8984-8990 (1992))
Tyr-GN Gal4 (As 1-147), Linker: ATA GGC CGG GCC (SEQ ID NO: 11),
mNF-YA (As 1-261 + Stop-Codon (TAG)) unter Kontrolle des
Tyrosinase-Promotors (s. Konstrukt Tyr), SV40-PolyA (Fig. 7B)
(Li et al., J. Biol. Chem. 267, 8984-8990 (1992))
Tyr-G Gal4 -Stop (As 1-147 + Stop-Codon (TAG)) unter Kontrolle des
Tyrosinase-Promotors, SV40-PolyA (Fig. 7C)
Reporterkonstrukte
5G25C identisch dem Reporterkonstrukt 1) unter I)
5G25CRT7 identisch dem Reporterkonstrukt 2) unter I)
8GCycA 8 × Gal4-DNA-Bindungsstelle + cyclin A-Promotor
(-40/+94; Henglein et al., Proc. Natl Acad. Sci.
USA 91, 5490-5494 (1994)) (Fig. 8A)
8GCycART7 wie 8GCycA, mit mutiertem CDE (TCGCGGG
-<TCGCtGG, Zwicker et al. EMBO J. 14: 4514,
1995) (Fig. 8B)
Gal4-DNA-Bindungsstelle 5'-CGGAGTACTGTCCTCCG-3',
SEQ ID NO: 6
Kontrollkonstrukte
basic = "pGL3basic" (Promega, ohne Promotor oder Enhancer)
(Fig. 9A)
SV40p = "pGL3promoter" (Promega, mit dem Simian Virus 40
Basalpromotor) identisch dem Kontrollkonstrukt 1 unter I
(Fig. 6A)
Tyr Tyrosinase-Promotor: 2 × distales Element (TDE, -2014/-1811)
und 1 × proximales Element (TPE, -209/+51) (Shibata et al., J.
Biol. Chem. 267, 20584 (1992)), cDNA für Luziferase (pGL3,
Promega) (Fig. 9B)
cdc25C cdc25C-Promotor (-2901+121) (Lucibello et al., EMBO J. 14,
132-142 (1995)), cDNA für Luziferase (pGL3, Promega);
identisch dem Kontrollkonstrukt 3 unter I (Fig. 6C)
cycA cyclin A-Promotor (-214/+100) (Henglein et al., Proc. Natl Acad.
Sci. USA 91, 5490-5494 (1994)), cDNA für Luziferase (pGL3,
Promega); identisch dem Kontrollkonstrukt 2 unter I (Fig. 6B)
Bei sämtlichen Reporterkonstrukten und Kontrollkonstrukten wurde pGL3 (Promega, Luziferase-cDNA-Reporter) als Vektor verwendet. Die in diesen Vektor klonierten Promotorelemente wurden mittels PCR aus humaner, genomischer DNA amplifiziert. Die dazu verwendeten Oligonukleotide enthielten jeweils 4 Nukleotide Überhang (GATC), gefolgt von 6 Nukleotiden mit den benötigten Restriktionsschnittstellen (BamHl (GGATCC)/HindIII (AAGCTT) für die Kontrollplasmide cdc25C und cycA und die Reporterplasmide 5G25C und 5G25CRT7; Kpnl (GGTACC) INhel (GCTAGC) bzw. NheI/XhoI (CTCGAG) für das TDE und Xhol/BgI II (AGATCT) für das TPE, Bgl II/HinDIII für die Reporterplasmide 8GCycA und SGCycART7 und anschließend 20-25 zu dem zu amplifizierenden Promotor komplementäre Nukleotide (beginnend mit der in Klammern angezeigten Position relativ zum Transkriptionsstart). Die in Klammern angegebenen Positionen beziehen sich auf die in der zitierten Literaturstelle aufgeführte Sequenz.
Die PCR-Produkte wurden mit QIAquick™ Spin-Säulen (Qiagen) nach Anleitung des Herstellers aufgereinigt, mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut (diese Enzyme sind käuflich zu erwerben) und nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese erneut mit QIAquick™ Spin-Säulen aufgereinigt.
Gal4-Bindungsstellen wurden als Oligonukleotide mit für die entsprechenden Restriktionsschnittstellen benötigten Überhängen synthetisiert (Kpnl (top: 5'-; bottom: 3'-)/Xhol (top:5'-; bottom: 3'-) oder BamHl (top: 5'-; bottom: 3'-) /Bgl II (top: 5'-; bottom: 3'-)), mit SephadexG25 (Pharmacia) aufgereinigt und hybridisiert. Die verdauten PCR-Produkte und hybridisierten Oligonukleotide wurden anschließend in die entsprechend geschnittenen und aufgereinigten Vektoren unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (Promega) ligiert.
Sämtliche durch PCR und unter Verwendung von Oligonukleotiden erhaltenen Konstrukte wurden sequenziert, um Mutationen auszuschließen.
b) Reporterassays: transiente Transfektion, Synchronisation und Luziferaseassay
Die Promotoraktivität der unter a) beschriebenen Konstrukte wurde durch transiente Kotransfektion in Melanozyten (MeWo, human), Fibroblasten (3T3, murin) und Prostatakarzinomzellen (PC-3, human) mit anschließender Messung der Luziferaseaktivität bestimmt. Die Zellen wurden mit DOTAP Boehringer, Mannheim) nach Angaben des Herstellers transient transfiziert.
Der Luciferaseassay wurde wie in Lucibello et al. (EMBO J., 14, 132 (1995)) beschrieben durchgeführt. Es wurden 1 mg (Reporter) + 2 mg (RTA) Plasmid mit 6 ml DOTAP pro 3,5 cm-Schale transfiziert, wobei bei den Kontrollen pUC19-Plasmid anstelle des RTA-Plasmids eingesetzt wurde.
Zur Messung einer zellzyklusabhängigen Promotoraktivität wurden proliferierende Zellen (Vollmedium) mit in der G1-Phase des Zellzyklus arretierten Zellen verglichen. Dabei diente das nicht zellzyklusregulierte Konstrukt SV40p zur Standardisierung (seine Aktivität wurde gleich 1 gesetzt). Die Synchronisation der Zellen in der G1-Phase erfolgte durch einen 60-stündigen Methioninentzug nach der Transfektion.
Zur Messung der zelltypspezifischen Promotoraktivität wurden die Luziferase- Aktivitäten der verschiedenen Zelltypen nach Standardisierung mit den Werten für den ubiquitären SV40-Promotor verglichen (mit SV40p = 1).
c) Ergebnisse
Tabelle 1 zeigt eine deutliche Zelltypspezifität des Systems: (1) das 8GCycA- Konstrukt hat eine nur geringe Aktivität, die im Bereich der Aktivität des Leervektors basic liegt, (2) durch Kotransfektion des CMV-GN-Konstruktes erfolgt eine deutliche Aktivierung in allen 3 Zellinien, (3) eine spezifische Aktivierung wird durch Kotransfektion des Tyr-GN-Konstruktes nur in den Targetzellen, d. h. in den Melanomzellen, durch selektive Expression des Gal-NF-Y-Fusionsproteins erzielt und (4) es erfolgt eine nur sehr geringe Aktivierung durch Kotransfektion des Tyr-G- Konstruktes, d. h. die Aktivierung in (3) ist auf die Transaktivierungsdomäne des NF- YA zurückzuführen.
Die Spezifität des Systems 8GCycA+Tyr-GN liegt bei 58 (Vergleich MeWo: PC-3) bzw. 73 (Vergleich MeWo: 3T3) bei sehr geringer Aktivität in Nicht-Targetzellen. Die Werte in Tabelle 2 belegen die zellzyklusregulierte Aktivität des Systems:
  • - der cyclinA-Promotor zeigt eine 26-fache Zellzyklusregulation (Aktivität proliferierende MeWos: Aktivität MeWos in G1, Positivkontrolle)
  • - das System 8GCycA + Tyr-GN zeigt eine Zellzyklusregulation von 22.5-fach (ist also annähernd so gut reguliert wie der cyclinA Wildtyppromotor, bei nahezu gleicher Aktivität in proliferierenden Zellen) und
  • - eine Mutation des CDE-Elementes (RT7) führt zu einer drastisch erhöhten Aktivität in G1-Zellen und damit zu einer geringeren Zellzyklusregulation von 5-fach. Die Zellzyklusregulation ist daher v. a. auf die CDE/CHR-vermittelte Repression in G1 (durch den CDE/CHR-bindenden Repressor, der die durch NF-YA bedingte Transaktivierung in G1-Zellen reprimiert) zurückzuführen. Die verbleibende Zellzyklusregulation der RT7-Mutante kann auf eine ebenfalls geringe Zellzyklusregulation des Tyrosinase-Promotors selbst (4.2- fach) zurückgeführt werden.
Die Tabellen 3 und 4 zeigen, daß das System bei Verwendung des cdc25C- CDE/CHR-Elementes ebenfalls sowohl eine deutliche Zelltypspezifität (3,9-fach) sowie Zellzyklusregulation (8,4-fach) aufweist.
Die gewebespezifische Expression eines Gal-NF-Y-Fusionsproteins, das über Gal4- DNA-Bindungsstellen stromaufwärts eines CDE/CHR-Elementes die Expression eines Gens sowohl gewebespezifisch als auch proliferationsabhängig steuert, konnte damit beispielhaft gezeigt werden. Dabei wurde bei Verwendung des melanozytenspezifischen Tyrosinase-Promotors und des cyclinA-CDE/CHR- Elementes eine <20-fache Zellzyklusregulation bei <50-facher Zelltypspezifität erzielt. Die Aktivität des Systems ist in proliferierenden Targetzellen mit der Aktivität des Wildtyp-cyclin A-Promotors vergleichbar und in nicht-proliferierenden Targetzellen und in Nicht-Targetzellen kaum höher als die des Leervektors pGL3basic.
Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3
Tabelle 4
Figurenlegende:
Fig. 1 bis 4: Erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukte
Fig. 5: Schematische Darstellung des RTA-Konstruktes und der Reporterkonstrukte zu I
Fig. 6: Schematische Darstellung der Kontrollkonstrukte zu I. Fein: pGL3- Vektor von Promega; fett: Promotoren in der MCS von pGL3
Fig. 7: Schematische Darstellung der RTA-Konstrukte zu II, das Vektorgerüst stammt von pGL3 (Promega)
Fig. 8: Schematische Darstellung der Reporterkonstrukte zu II
Fig. 9: Schematische Darstellung der Kontrollkonstrukte zu II. Fein: pGL3- Vektor von Promega; fett: Promotoren in der MCS von pGL3
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (39)

1. Nukleinsäurekonstrukt, dadurch charakterisiert, daß es folgende Komponenten enthält:
  • 1. Komponente a): mindestens einen Promotor
  • 2. Komponente b): DNA kodierend für mindestens einen rekombinanten Transaktivator, dessen Transkription durch die Komponente a) aktiviert wird und der enthält:
    • 1. Komponente b1): DNA, kodierend für eine DNA­ bindende Domäne
    • 2. Komponente b2): DNA, kodierend für eine Transaktivierungsdomäne, welche reich ist an Glutamin, Serin und Threonin
  • 3. Komponente c): mindestens eine DNA-Sequenz zur Bindung des Expressionsproduktes von Komponente b)
  • 4. Komponente d): mindestens einen minimalen Promotor, der das CDE-CHR- Element oder das E2F-BS-CHR Element enthält und mit seinem 5'-Ende an das 3'-Ende von Komponente c) gebunden ist.
  • 5. Komponente e): mindestens ein Effektorgen, dessen Transkription durch Bindung des Expressionsproduktes von Komponente b) an die Komponente c) aktiviert wird.
2. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1, dadurch charakterisiert, daß an das 5'-Ende der Komponente a) mindestens eine Komponente c) angefügt ist und das Expressionssystem selbst amplifizierend ist.
3. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 oder 2, enthaltend die Komponente b'), bei welcher
  • 1. die Komponente b1) gekoppelt ist an Komponente b3), welche für ein Protein A kodiert, welches an eine Kopplungssubstanz f) bindet und
  • 2. die Komponente b2) gekoppelt ist an Komponente b4), welche für ein Protein B kodiert, welches ebenso an die Kopplungssubstanz f) bindet und
  • 3. bei welchem die Kopplungssubstanz f) die Expressionsprodukte der Komponenten b1), b3), b4) und b2) zu einem funktionsfähigen rekombinanten Transaktivator verbindet.
4. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, enthaltend die Komponente b"), bei welcher die Komponenten b1) und b2) verbunden sind mit der Komponente b5), welche kodiert für mindestens ein Bindeprotein für ein zelluläres Regulatorprotein, wobei die Bindung des zellulären Regulatorproteins an das zugehörige Bindeprotein die Funktion des Transaktivators exprimiert von Komponente b") inhibiert.
5. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere gleiche oder unterschiedliche Effektorgene [Komponenten e), e'), e")] durch eine IRES-Sequenz oder durch eine Aktivierungssequenz bestehend aus den Komponenten c) und d) miteinander verbunden sind.
6. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Komponente b), b) oder b") ein nukleäres Lokalisationssignal angefügt ist.
7. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein in der Komponente a) vorliegende Promotor ausgewählt ist aus
  • 1. unspezifischen Promotorsequenzen, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend den Promotor der RNA-Polymerase III oder der RNA-Polymerase II, CMV- Promotor und Enhancer, den SV40-Promotor
  • 2. viralen Promotor- und Aktivatorsequenzen, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend solche Sequenzen von HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, HIV;
  • 3. zellzyklusspezifisch aktivierbaren Promotorsequenzen, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend solche Sequenzen vom cdc25C-, Cyclin A-, cdc2- (cdk-1), Bmyb-, DHFR-, E2F-1-Gen oder Bindesequenzen für zellproliferationsabhängig auftretende oder aktivierte Transkriptionsfaktoren wie Monomere oder Multimere der Myc E-Box;
  • 4. zellspezifisch aktivierbare Promotoren, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Promotoren, die zellspezifisch aktivierbar sind in Endothelzellen, Bindegewebszellen, Muskelzellen, Gliazellen, blutbildenden Zellen, Lymphozyten, Markrophage, Synovialzellen, Leukämiezellen oder Tumorzellen, Zellen der Magen-Darmschleimhaut, der Niere, des Respirationsorgans der Geschlechtsorgane und der hamableitenden Wege;
  • 5. metabolisch aktivierbaren Promotoren, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend durch Hypoxie induzierbare Enhancersequenzen.
8. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente b1) ausgewählt ist aus einer Gruppe enthaltend DNA-Bindedomänen entstammend dem Gal4-Protein, dem LexA- Protein, dem lac-Repressor Protein, dem Tetracyclin Repressorprotein oder dem ZFHD1-Protein.
9. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente b2) ausgewählt ist aus solchen Transaktivierungsdomänen, welche insgesamt mindestens 20 × Glutamin, 10 × Serin und 10 × Threonin enthalten.
10. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9, bei welchem die Komponente b2) ausgewählt ist aus einer Gruppe enthalten die Transaktivierungsdomänen von Oct-2, SP1 und NFY-1.
11. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß
  • 1. in den Komponenten b3) oder b4) mindestens eine der die Kopplungsstruktur f) bindenden Proteine A und B ein rekombinanter Antikörper oder ein rekombinantes Antikörperfragment ist.
12. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß
  • 1. mindestens eines der die Kopplungssubstanz f) bindenden Proteine A und B ein einzelkettiges Fv-Fragment ist, enthaltend eine variable Kette und eine leichte Kette, die durch eine kurze Peptidsequenz kovalent verbunden sind.
13. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der die Kopplungssubstanz f) bindenden Proteine A und B die Bindungsdomäne eines in der Natur vorkommenden Bindeproteins für die jeweilige Komponente f) darstellt.
14. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungssubstanz f) ein Arzneimittel ist.
15. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungssubstanz f) eine Substanz ist, welche durch die Zellmembran in die Zeile eindringen kann.
16. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungssubstanz f) ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend Rapamycin, FK506, Cyclosporin A, Methotrexat, Folsäure, Retinoinsäure, Penicillin, 4-Hydroxy-Tamoxifen, Tamoxifen, Tetrazyklin oder ein Tetrazyklin-isopropyl-β-D-thiogalactosidkonjugat.
17. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 4 bis 16 dadurch charakterisiert, daß die Bindesequenz [Komponente b5)] für ein zelluläres Regulatorprotein ein zelluläres Bindeprotein oder ein Teil dieses Bindeproteins ist.
18. Nukleinsäurekonstrukte nach Anspruch 17, dadurch charakterisiert, daß das zelluläre Bindeprotein oder ein Teil dieses Bindeproteins an ein zelluläres Regulatorprotein bindet, das ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend p53, pRb, p130, Max, MAD, VHL, cdk-4, MTS-1 (p16), WT-1, SMAD-2, DPC-4.
19. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 17, dadurch charakterisiert, daß die Komponente b5) ausgewählt ist aus einer Gruppe von zellulären Bindeproteinen umfassend E2F-1, -2, -3, -4, -5, Cyclin-D1, -D2, -D3 oder -C, Cyclin A, -E, Myc, Transkriptionsfaktor PU.1 oder Elf-1, Elongin-B, -C, p14, p15, p16, p18, p21, p27, p53, Myc, cdk-4, DPC-4 und SMAD-2.
20. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 17, dadurch charakterisiert, daß die Bindesequenz [Komponente b5)] für ein zelluläres Regulatorprotein ein virales Bindeprotein oder ein Teil dieses Bindeproteins ist.
21. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 20, dadurch charakterisiert, daß das virale Bindeprotein oder ein Teil dieses Bindeproteins an ein zelluläres Regulatorprotein bindet, das ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend p53, pRb (p110), NFKB, p130, CBF-1, Lyn-Tyrosinkinase, bak und bax.
22. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 20, dadurch charakterisiert, daß die Komponente b5) ausgewählt ist aus einer Gruppe von viralen Bindeproteinen, umfassend IE 84 von CMV, E1 B (55 kD) von AV, EBNA-5 von EBV, BHFR von EBV, E6 von HPV-16 oder -18, x Protein von HBV, T-Antigen von SV40, E1A von AV, EBNA-2 von EBV, EBNA-1 von EBV, E7 von HPV, Tax von HIV, LMP-1 von EBV, LMP-2A oder LMP-2B von EBV, E1 B (16 kD) von AV, E1 B (10 kD) von AV.
23. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, dadurch charakterisiert, daß die Bindesequenz [Komponente b5)] für ein zelluläres Regulatorprotein ein Antikörper oder ein Teil dieses Antikörpers ist.
24. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz [Komponente c)] zur Bindung von Komponente b), b') oder b") ausgewählt ist aus einer Gruppe enthaltend die Bindesequenz für das Gal4-Protein, die Bindesequenz für das LexA-Protein, die Bindesequenz für das Lac I Repressorprotein, die Bindesequenz für den Tetrazyklin-Operator und die Bindesequenz für das ZFHD-1 Protein.
25. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß der minimale Promotor (Komponente d)] enthaltend CDE- CHR entnommen ist aus einer Gruppe umfassend das cdc25C Gen, das cdc2 (cdk-1) Gen und das Cyclin A Gen.
26. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß der minimale Promotor [Komponente d)] enthaltend E2F- BS-CHR entnommen ist dem Bmyb Gen.
27. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Effektorgen (Komponente c) um ein Gen handelt, das für einen Wirkstoff kodiert, der ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend Cytokine, Chemokine oder Wachstumsfaktoren, antiproliferativ oder zytostatisch oder apoptotisch wirkende Proteine, entzündungserregende oder immunsuppressive Proteine, Antikörper, Antikörperfragmente, Angiogeneseinhibitoren, Peptidhormone, Gerinnungsfaktoren, Gerinnungshemmer, fibrinolytische Proteine, auf den Blutkreislauf wirksame Peptide oder Proteine, Blutplasmaproteine und Antigene von Infektionserregern oder von Zellen oder von Tumoren, wobei das ausgewählte Antigen eine Immunreaktion bewirkt.
28. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Effektorgen um ein Gen handelt, das für ein Enzym kodiert, welches eine Vorstufe eines Pharmakons in ein Pharmakon spaltet.
29. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1-26, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Effektorgen um ein Gen handelt, das für ein Ligand-Wirkstoff- Fusionsprotein oder ein Ligand-Enzym-Fusionsprotein kodiert, wobei der Ligand ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend Cytokine, Wachstumsfaktoren, Antikörper, Antikörperfragmente, Peptidhormone, Mediatoren und Zelladhäsionsmoleküle.
30. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Nukleinsäure um DNS handelt.
31. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäurekonstrukt eingefügt ist in einen Vektor.
32. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen Plasmidvektor handelt.
33. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen viralen Vektor handelt.
34. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß es äußerlich, peroral, intravesikal, nasal, intrabronchial oder in den Magen-Darm-Trakt verabreicht oder in ein Organ, in eine Körperhöhle, in die Muskulatur, subkutan oder in den Blutkreislauf injiziert wird zur Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung.
35. Isolierte Zelle dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 33 enthält.
36. Isolierte Zellen gemäß Anspruch 35, wobei diese Zelle ausgewählt ist aus einer Gruppe enthaltend Endothelzellen, Lymphozyten, Makrophagen, blutbildende Zellen, Fibroblasten, Muskelzellen, Leberzellen, Nierenzellen, Epithelzellen des Magen-Darm-Traktes, der Luftwege, der harnableitenden Wege, der Geschlechtsorgane, der Haut, Gliazellen, Zellen des Nervensystems, Tumorzellen und Leukämiezellen.
37. Verwendung eines Nukleinsäurekonstruktes nach einem der Ansprüche 1 bis 34, oder einer Zelle nach Anspruch 33, zur Herstellung eines Heilmittels zur Behandlung einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Infektionen, Tumore, Leukämien, Autoimmunerkrankungen, Allergien, Arthritiden, Entzündungen, Organabstoßungen, Transplantat gegen Wirt- Reaktionen, Blutgerinnungserkrankungen, Kreislauferkrankungen, Blutarmut, Hormonerkrankungen und ZNS-Schäden.
38. Verfahren zur Herstellung der Nukleinsäurekonstrukte nach einem der Ansprüche 1 bis 37, bei dem die einzelnen Komponenten schrittweise zusammenligiert werden.
39. Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 35 oder 36, zur Herstellung eines Heilmittels zur Therapie von Erkrankungen gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Zelle äußerlich, intravesikal, nasal, intrabronchial, oral oder in den Magen-Darm-Trakt verabreicht oder in ein Organ, in eine Körperhöhle, in die Muskulatur, subkutan oder in den Blutkreislauf injiziert wird zur Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung.
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