MXPA97010007A

MXPA97010007A - Sistema de expresion auto-internsificadores farmacologicamente controlables

Info

Publication number: MXPA97010007A
Application number: MXPA/A/1997/010007A
Authority: MX
Inventors: Sedlacek Hansharald; Muller Rolf
Original assignee: Hoechst Aktiengesellschaf
Priority date: 1996-12-11
Filing date: 1997-12-10
Publication date: 1999-02-01

Abstract

La invención se refiere a un constructo deácido nucleico que constituye un sistema de expresión auto-intensificador y que comprende los componentes siguientes:al menos un primer gen estructural que codifica un compuesto activo;al menos un segundo gen estructural que codifica una proteína de factor de transcripción;y al menos una secuencia de activación constituida por al menos una secuencia que se fija a la proteína de factor de trancripción y al menos una secuencia promotora;en el cual cada secuencia de activación activa la expresión de un gen estructural y la expresión de la proteína de factor de transcripción;y al uso del constucto deácido nucleico para preparar un fármaco para tratamiento de enfermedades.

Description

SISTEMAS DE EXPRESIÓN AUTO-INTENSIPICADORES FARMACOLÓGICAMENTE CONTROLABLES Fundamentos de la invención La invención se refiere a un constructo auto-intensifi-cador de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia reguladora acoplada a al menos un gen estructural y al menos un gen de proteína de factor de transcripción. A pesar de diversos enfoques utilizados en terapia génica, los resultados de la investigación preclínica y clínica obtenidos hasta ahora indican que quedan por resolver dos problemas fundamentales. Uno de ellos es la expresión transgénica insuficiente de células diana in vi tro o in vivo debido a procesos de parada intracelulares . El segundo es un control inadecuado de la expresión transgénica. En un intento de corregir estas deficiencias de la técnica anterior, Rivera et al., Nature Med., 2, 1028 (1996)), Belshaw et al. (PNAS USA 93, 4604 (1996)) y Ho et al. (Nature 382, 822 (1996)) han desarrollado las primeras técnicas para control externo de la expresión transgénica. Estos enfoques se basan en la adición del compuesto activo rapamicina, que acopla dos subunidades. El producto de acoplamiento resultante actúa como factor de transcripción. La primera subunidad constituye una proteína de fusión formada entre una proteína de fijación de ADN y la proteína de fijación de FK506 (FKBP), proteína que fija también rapamicina. La segunda subunidad es una proteína de fusión que se forma entre una proteína FRAP, que se fija también a rapamicina, y la secuencia de activación de la proteína NF-kB de factor de transcripción. La proteína de factor de transcripción funcional que se produce por el acoplamiento de estas dos subunidades con rapamicina activa a su vez la secuencia en el transgén para activación del gen estructural . La ventaja de este enfoque externo es que la expresión de un gen estructural puede ponerse en marcha o pararse por adición o eliminación, respectivamente, del compuesto activo rapamicina. Sin embargo, este enfoque no resuelve el problema de la expresión inadecuada de un gen estructural . De acuerdo con ello, persiste la necesidad de un enfogue para aumentar la expresión transgénica. Sumario de la invención La invención colma las necesidades no satisfechas de la técnica proporcionando constructos de ácido nucleico, composiciones que contienen los constructos y métodos de utilización de los mismos para conseguir una expresión transgénica alta. La invención logra esto por incorporación de un sistema positivo de retroalimentación dentro del propio constructo de ácido nucleico. El sistema resultante se designa en esta memoria como un "sistema de expresión autointensificador" .

En una realización de la invención, se proporciona un constructo de ácido nucleico que comprende: al menos un primer gen estructural que codifica un compuesto activo; al menos un segundo gen estructural que codifica una proteína de factor de transcripción; y al menos una secuencia de activación constituida por al menos una secuencia que fija la proteína de factor de transcripción y al menos una secuencia promotora,-en el cual, cada secuencia de activación activa la expresión de un gen estructural y la expresión de la proteína de factor de transcripción. En otra realización de la invención, se proporciona un constructo de ácido nucleico que comprende: al menos un primer gen estructural que codifica un compuesto activo ; al menos un segundo gen estructural que codifica una proteína de factor de transcripción; al menos una secuencia de activación constituida por al menos una secuencia que fija dicha proteína de factor de transcripción y al menos un módulo de control farmacológico que comprende, en orden sucesivo, al menos un pro- motor, al menos un gen de proteína de fusión que codifica un dominio de activación de una proteína de factor de transcripción y que codifica una proteína de sustancia de acoplamiento, al menos un promotor, al menos un gen de proteína de fusión que codifica una proteína de fijación de ADN y que codifica una segunda proteína de sustancia de acoplamiento, y el menos una secuencia de activación que comprende un sitio para la proteína de fijación de ADN en el cual cada secuencia de activación activa la expresión de un gen estructural y la expresión de la proteína de factor de transcripción. En otra realización adicional de la invención, se proporciona un constructo de ácido nucleico que comprende: al menos un primer gen estructural que codifica un compuesto activo; al menos un segundo gen estructural que codifica al menos una primera proteína de fusión que comprende un dominio de activación de una proteína de factor de transcripción y una secuencia que fija una sustancia de acoplamiento; al menos un tercer gen estructural que codifica al menos una segunda proteína de fusión que comprende una proteína que fija una sustancia de acoplamiento y una proteína de fijación de ADN; al menos una secuencia de activación que comprende al menos una secuencia que fija dicha segunda proteína de fusión acoplada a dicha primera proteína de fusión por una sustancia de acoplamiento y al menos una secuencia promotora; en el cual cada secuencia de activación activa la expresión de al menos uno de dichos genes estructurales. Realizaciones adicionales serán fácilmente evidentes para los expertos, después de la lectura de la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas. El siatema de expresión auto-intensificador En su realización más sencilla, el nuevo sistema de expresión auto-intensificador comprende los componentes siguientes : a) al menos una secuencia a) y/o a1 ) para fijar una proteína de factor de transcripción d) , b) al menos una secuencia promotora b) y/o b'), c) al menos un gen estructural c) que codifica un compues- to activo, y d) al menos un gen que codifica una proteína de factor de transcripción d) que se fija al componente a) . De acuerdo con la invención, los componentes a) y/o a') y b) y/o b') constituyen una secuencia para activación del gen estructural c) y para activación de la expresión de la proteína de factor de transcripción d) . En una forma preferida de acuerdo con la invención, los componentes pueden disponerse como se representa en la Fig. 1. Las secuencias de fijación a) y a') pueden ser idénticas o diferentes y se fijan al factor de transcripción d) . Las secuencias promotoras [componentes b) y b')] pueden ser idénticas o diferentes. La activación a bajo nivel de las secuencias promotoras b) y b') da como resultado una expresión de bajo nivel del gen estructural [componente c) ] y del gen para la proteína de factor de transcripción d) [componente d) ] . La proteína de factor de transcripción d) fabricada de este modo, se fija a su vez a secuencias de fijación [componentes a) y a1)] . Esta fijación activa a su vez secuencias promotoras b) y b1), dando como resultado una expresión intensificada tanto del gen estructural como del gen para la proteína de factor de transcripción d) . Esta expresión intensificada da como resultado a su vez una mayor cantidad de proteína de factor de transcripción d) , que re-troalimenta y estimula adicionalmente este sistema. De acuerdo con la invención, la disposición de los componentes tal y como se representa en la Fig. 1 puede suple-mentarse (es decir, se pueden añadir "apéndices" en el extremo de aguas arriba) con genes que codifican una señal de exportación nuclear (NES) y un factor de exportación nuclear (NEF) en el extremo 3 ' del gen estructural . La expresión del NEF está bajo el control de un promotor adicional (componente b' ' ') . Esta secuencia promotora adicional puede ser idéntica a o diferente de cualquier parte de las secuencias de activación [componentes a) y b) y/o a1) y b'l] representadas en la Figura 2. La señal de exportación nuclear (NES) es una secuencia nucleotídica que impide el transporte de un ARN pre-mensa-jero, que está unido a ella, a través de la membrana nuclear. El NES constituye por consiguiente, por sí mismo, una señal de retención nuclear (NRS) . No obstante, si el NRS se fija a una proteína de exportación, denominada en esta memoria "factor de exportación nuclear" o "NEF", el NRS adquiere la función de una NES . Esto se debe a que el factor de exportación nuclear (NEF) media el transporte del ARN premensajero o mensajero que contiene NES al exterior del núcleo celular y al interior del citoplasma. Un ARN premensajero o mensajero que contiene NES es secretado por consiguiente fuera del núcleo celular por fijarse al NEF como ha sido descrito por Fischer et al., Cell 82, 475 (1995). De acuerdo con la invención, los componentes c) y d) pueden estar enlazados también uno a otro (es decir "enlazados mutuamente") por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) en lugar de estarlo por enlace con los componentes a') y b') . Dichos IRES conducen a la expresión de dos secuencias de ADN que están enlazadas entre sí por medio de los IRES. El enlace por medio de un IRES puede efectuarse, por ejemplo, como se representa en la Fig. 3. Esta disposición asegura también en la misma proporción que, cuando la secuencia promotora b) ha sido sometida a activación de bajo nivel, que el gen para la proteína de factor de transcripción [componente d) ] se expresa también, por medio de la secuencia IRES. Esta expresión tiene lugar mientras que se expresa el gen estructural [componente c) ] . Adicionalmente, la proteína de factor de transcripción se fija a la secuencia de fijación a) , lo cual intensifica la activación de la secuencia promotora b) , intensifica la expresión del gen estructural c) y, una vez más por la vía de la secuencia IRES, intensifica también la expresión del gen de la proteína de factor de transcripción d) . La disposición, de acuerdo con la invención, de componentes individuales como se representan en las Figuras 1-3 es un sistema de expresión auto- intensificador que opera como se muestra en la Figura 4. El sistema de expresión auto- intensificador puede extenderse encadenando varias secuencias idénticas o diferentes para genes estructurales [componentes c) , C ) ye'1)]. Estos genes estructurales están entrelazados por secuencias IRES idénticas o diferentes, o por la secuencia de fijación a) , la secuencia promotora b') y la secuencia promotora b' ' ) . Una disposición representativa se muestra en la Figura 5. El sistema de expresión auto- intensificador puede extenderse también uniendo en cadena varios genes idénticos o diferentes para la proteína de factor de transcripción d) [componentes d) , d') y d1 1)]. Un ejemplo representativo se muestra en la Figura 6, que indica el enlace por secuencias IRES. Las secuencias IRES, opcionalmente, pueden ser una misma secuencia. La secuencia de fijación a) es preferiblemente de un solo tipo en todas las secuencias de activación. Todas las proteínas de factores de transcripción d) , d') y d'') deben fijarse a estas secuencias de fijación. Cuando las secuencias de fijación no son del mismo tipo (p.ej . cuando el componente a) no es el mismo que el componente a'), entonces las proteínas de factores de transcripción [componente d) , d') y d' ')] deben fijarse a la totalidad de las secuencias de fijación. Las secuencias de activación se designan o seleccionan preferiblemente de tal manera que las mismas son reconocidas por todos los productos de las proteínas de factores de transcripción d) , d' ) y d' ' ) - De una manera similar a la que se muestra en la Figura 2, los componentes de la Figura 3 pueden suplementarse con genes que codifican una señal de exportación nuclear (NES) y un factor de exportación nuclear. Esta disposición con un gen NES en el extremo 3' del gen estructural [componente c) ] y un gen NEF se muestra en la Figura 7. En este último ejemplo, NEF es activado separadamente por un componente de secuencia promotora adicional b1 ' ' ) . La secuencia del componente b1 ' ' ) puede ser idéntica o no idéntica a los componentes a) y b) . El módulo promotor farmacológicamente controlable En su forma más simple, el nuevo modulo promotor farmacológicamente controlable ("módulo de control farmacológico") comprende los componentes siguientes: e) al menos una secuencia promotora, f) al menos un gen que codifica una proteína de fusión f) que comprende un dominio de activación de una proteína de factor de transcripción y una proteína A de fijación a la sustancia de acoplamiento [componente j)], g) al menos una secuencia promotora adicional [idéntica o no idéntica al componente e) ] de al menos un IRES, h) al menos un gen codificante de una proteína de fusión h) que comprende un dominio de fijación de ADN y una proteína B de fijación a la sustancia de acoplamiento [componente j ) ] , i) al menos una secuencia de activación que tiene un sitio para fijación de la proteína de fusión h) , y j) al menos una sustancia de acoplamiento j) que comprende juntamente un sitio A) para la proteína de fijación A en la proteína de fusión f) [producto de expresión del componente f ) ] y un sitio B) para la proteína de fija- ción B) en la proteína de fusión h) [producto de expresión del componente h) ] . Los componentes e-i) pueden estar dispuestos en serie, como por ejemplo, de acuerdo con el esquema que se muestra en la Figura 8. Esta disposición asegura que las proteínas de fusión f) y h) [componentes f) y h) ] se expresan cuando se activan las secuencias promotoras e) y g) . Cuando está presente la sustancia de acoplamiento [componente j)], las dos proteínas de fusión están enlazadas una a otra ("enlazadas mutuamente") para formar una proteína de factor de transcrip-ción funcional para activar la secuencia de activación [componente i) ] . En esta realización de la invención, el módulo promotor, que está constituido por componentes individuales, funciona en presencia de una sustancia de acoplamiento tal como el componente j) . El módulo se hace funcional por adición del componente j) de la sustancia de acoplamiento. La Figura 9 muestra un ejemplo de esta realización. El sistema de expresión auto-intensificador farmacológicamente controlable El sistema de expresión auto- intensificador puede estar combinado con un módulo promotor farmacológicamente controlable. Esta combinación se efectúa entonces, por ejemplo, por inserción de un módulo promotor farmacológicamente controlable [componentes e) a i)] en el sistema de expresión auto-intensificador (véanse Figs. 1, 2, 3, ó 7) en lugar de la secuencia promotora (componente b) y/o b1)) . La construcción de esta secuencia nucleotídica combinada se ilustra, a modo de ejemplo, en la fig. 10. En este ejemplo, un gen estructural se transcribe solamente cuando las proteínas de fusión f) y h) [productos de expresión de los componentes f) y h) ] están enlazadas por el componente de la sustancia de acoplamiento j) para formar una proteína de factor de transcrip-ción. Alternativamente, o adicionalmente, el módulo promotor farmacológicamente controlable puede insertarse en el sistema de expresión auto-intensificador en lugar del gen de la proteína de factor de transcripción [componente d) ] , la secuen-cia para fijación de la proteína de factor de transcripción d) [componente a) ] y la secuencia promotora b) [componente b) ] . En este caso, el sitio del componente de fijación h) debería fijarse, al menos por su extremo 5', a una de las secuencias promotoras e) y g) . La construcción de esta se-cuencia nucleotídica combinada se ilustra en la Figura 11. El sistema auto-intensificador puede combinarse también con el módulo promotor farmacológicamente controlable de otros modos. Por ejemplo, la Figura 8 muestra que la secuencia promotora (componente b''1)) del NEF (véase la Figura 2 ó 7) puede reemplazarse por un módulo promotor farmacológicamente controlable. Una manera de construir esta secuencia nucleotídica se muestra en la Figura 12.

Los constructos de ácido nucleico de la invención están constituidos ventajosamente por ADN. La expresión "constructo de ácido nucleico" denota una estructura artificial que comprende ácido nucleico y que puede transcribirse en una célula diana. Un constructo de ácido nucleico está insertado ventajosamente en un vector. En este contexto, es completamente deseable un vector plasmídico o un vector vírico. Dependiendo de la elección de la secuencia promotora, puede utilizarse un constructo nuevo de ácido nucleico para expresar un gen estructural [componente c) ] inespecíficamente. De modo alternativo, la expresión se controla adicionalmente por especificidad celular, especificidad vírica, una condición definida, o una condición de ciclo celular. El gen estructural codifica preferiblemente un compuesto farmacoló-gicamente activo o enzima que escinde un precursor desactivo de un fármaco para formar un fármaco activo. El gen estructural puede estar diseñado adicionalmente para expresar una proteína de fusión enzima-ligando. En este caso, el ligando puede fijarse a una superficie celular. En este contexto es preferible un ligando que se fija a la superficie de una célula endotelial proliferante o célula tumoral. La presente invención se refiere también a células, particularmente células de levadura o de mamífero, que albergan un constructo nuevo de ácido nucleico. Una realización particularmente deseable, se introduce un constructo de ácido nucleico en una línea de células que es transfectada por la adición o administración de una sustancia de acoplamiento [componente j)] . La adición de la sustancia de acoplamiento estimula la expresión del gen estructural . Las células que contienen estas construcciones pueden utilizarse para preparar una composición farmacéutica. Sin embargo, las células pueden administrarse también a un paciente como agente terapéutico, o composición farmacéutica, para tratar una enfermedad. Alternativamente, el nuevo constructo de ácido nucleico puede incorporarse en un vector y administrarse de modo directo local o parenteralmente a un paciente. Durante su empleo, el constructo está diseñado para una enfermedad parti-cular tal que el constructo expresa una o más proteínas, o ácido nucleico que evita o mejora uno o más síntomas de la enfermedad. La cantidad de constructo de ácido nucleico que debe utilizarse en este contexto está determinada por la vía de administración, el estado del paciente, y por la naturaleza de la enfermedad, como es conocido por los expertos en la técnica . El caso de la administración directa a un paciente, puede administrarse adicionalmente una sustancia de acopíamiento [componente j)] con objeto de expresar el gen estructural . La sustancia de acoplamiento da lugar a la formación de una proteína de factor de transcripción completa por acoplamiento de la proteína de fusión f) con la proteína de fusión h) dentro de las células transfectadas, como se mues-tra en la Figura 9. En consecuencia, las células transfectadas expresan únicamente el gen estructural en tanto que la sustancia de acoplamiento está presente en el cuerpo. La duración y la intensidad de la expresión pueden controlarse por la administración de la sustancia de acoplamiento. Un uso preferido del nuevo constructo de ácido nucleico consiste, por consiguiente, en el tratamiento de una enfermedad, comprendiendo la provisión del fármaco introducir un constructo de ácido nucleico en una célula diana y expresar el constructo de una manera inespecífica, específica del virus o específica de la célula diana y/o específica del ciclo celular por medio de la administración de un sustancia de acoplamiento. Los constructos de ácido nucleico de la invención pueden utilizarse para preparar una composición farmacéutica por la vía de síntesis en una célula. En este contexto, una célula se transforma con un constructo de ADN de la invención. La célula transformada se cultiva luego para obtener un clon de células, creando con ello copias múltiples del constructo de ADN. Preferiblemente, se utiliza multiplicación génica para aumentar el número de copias del constructo de ADN en cada célula. Después de cultivar la célula transformada para obtener copias múltiples del constructo de ADN, el constructo de ADN puede purificarse a partir de las células cultivadas. Se prefiere E. coli como la célula cultivada para obtener copias múltiples del constructo de ADN. El ADN purificado se utiliza como componente en una composición farmacéutica por mezcla con otra u otras sustancias tales como tampón, sales, u otros excipientes como los que se conocen en la técnica. Los nuevos constructos de ácido nucleico no existen en esta forma en la naturaleza, es decir, el gen estructural para el compuesto activo o para una enzima o para una proteí-na de fusión ligando/enzima no se combina naturalmente con las nuevas secuencias de ácido nucleico para formar un sistema de expresión auto-intensificador. Este sistema no se combina tampoco naturalmente con un módulo promotor farmacológicamente controlable. Genes estructurales preferidos, que se incorporan en un sistema de expresión auto- intensificador farmacológicamente controlable, codifican compuestos farmacológicamente activos . Estos compuestos activos son proteínas y glicoproteínas que se seleccionan del grupo constituido por citoquinas, factores de crecimiento, citoquinas receptoras o factores de crecimiento, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, proteínas que tienen un efecto antiproliferante o citostático, inhibidores de la angiogénesis, proteínas inductoras de trombosis, inhibidores de coagulación, proteínas del plasma sanguíneo, proteínas activadoras del complemento, sustancias de revestimiento víricas y bacterianas, hormonas, péptidos que tienen un efecto sobre la circulación, neuropéptidos, enzimas y mediadores y proteínas de fusión que comprenden al menos dos de estas proteínas o glicoproteínas. Descripción detallada de los componentes del sistema de expresión auto-intensificador, farmacológicamente controlable 1) Secuencias de activación y proteínas de factor de transcripción para sistemas de expresión auto-in- tensificadores Dentro del significado de la invención, la proteína de factor de transcripción d) [producto génico del componente d) ] se fija específicamente a la secuencia de fijación relevante a) [componente a)] que, por su parte, activa la secuencia promotora adyacente a 3' b) (o b' o b' ') . Los componentes a) y b) constituyen, por consiguiente, una secuencia de activación que comprende una secuencia para fijación de la proteína de factor de transcripción relevante d) . Por otra parte, la proteína de factor de transcripción d) tiene que comprender un dominio de fijación que es especí-fico para la secuencia de fijación correspondiente de la secuencia activadora [componente a) ] , así como un dominio de transactivación. Una señal de localización nuclear (NLS) adicional promueve la interacción con la secuencia de activación a) . Ejemplos de constructos de ácido nucleico que satisfacen este requisito previo son: Realización A) , gue comprende 1. Una secuencia de activación que comprende un componente a) . que tiene al menos una secuencia [p.ej. secuencia nucleotídica: 5 ' -CGGACAACTGTT-GACCG-3 ' ] para fijación de la proteína Gal4 (Chasman y Kornberg, Mol. Cell Biol., 10, 2916 (1990)) y, en su extremo 3', un componente b) , que comprende: . el promotor basal de SV40 (ácidos nucleicos 48 a 5191; Tooze (compilador), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor, New York, NY (1980) ) ; Cold Spring Harbor Laboratory) , el promotor c-fos (Das et al., Nature, 374. 657 (1995)) y en su extremo 3', el dominio de transactivación de ácido (TAD) VP16 de HSVl (aminoácidos 406 a 488; Treizenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Treizenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5_, 190 (1995) ) , . el promotor U2 sn de ARN y (en su extremo 3') el TAD VP16 de HSVl o al menos una secuencia del dominio de activación de Oct-2 (aminoácidos 438 a 479; Tanaka et al., Mol. Cell Biol. 14, 6046 (1994); Das et al., Nature 374.657 (1995)) o el promotor TK de HSV (Papavassiliou et al., J. Biol. Chem. 265, 9402 (1990); Park et al., Molec. Endocrinol. 7, 319 (1993)) u otro promotor inespecífico, específico de células, específico de virus o específico del ciclo celular o metabólicamente activable, y 2. el gen para la proteína de factor de transcripción relevante d) [componente d) ] que contiene el ADNc para el dominio de fijación de ADN de la proteína Gal4 (aminoácidos 1 a 147; Chasman y Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)) al ex- tremo 3' del cual está unida la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T grande de SV40; aminoácidos 126 a 132; p.ej. PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)), a cuyo extremo 3' está unido el dominio de transactivación de ácido (TAD) VP16 de HSV-1 (aminoácidos 406 a 488; Trie- zenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)) . Realización B) que comprende 1. una secuencia de activación que comprende un componente a) que contiene al menos una secuencia [p.ej. secuencia nucleotídica 5 ' -TACTGTATGTACA-TACAGTA-3 ' ] para fijar la proteína LexA [operador LexA; Brent et al., Nature, 612. 312 (1984)] y, en su extremo 3', un componente b) que comprende: el promotor basal de SV40 (ácidos nucleicos 48 a 5191; Tooze (compilador) , DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor New York, (1980) NY; Cold Spring Harbor Laboratory] u otro promotor (véase la realización A) , 2. el gen para la proteína de factor de transcripción asociada d) [componente d) ] que contiene el ADNc para el dominio de fijación de ADN de la proteína LexA (aminoácidos 1 a 81; Kim et al., Science, 255. 203 (1992)) o la proteína LexA completa (aminoácidos 1 a 202; Brent et al., Cell 43, 729 (1985)) a cuyo extremo 31 está unida la señal de localización nuclear de SV40 (NLS) (T grande de SV40; aminoácidos 126 a 132: p.ej. PKKKRKV; Ding- wall et al., TIBS 16_, 478 (1991)), a cuyo extremo 3 ' están unidos los dominios de transactivación de ácido (TAD) VP16 de HSV-1 (aminoácidos 406 a 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Open. Gen. Developm. 5, 190 (1995) ) . Realización C) que comprende 1 . una secuencia de activación que comprende un componente a) que contiene al menos una secuencia de operador lac (p.ej. la secuencia nucleotídica: 5 ' -GAATTGTG- AGCGCTCACAATTC-3 ' ) para fijación de la proteína del represor lac I (Fuerst et al., PNAS USA 86., 2549 (1989); Simons et al., PNAS USA 81, 1624 (1984)) y, en su extremo 3', un componente b) que comprende: el promotor basal de SV40 (ácidos nucleicos 48 a 5191; Tooze (compilador) DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, N.Y., P(1980) Cold Spring Harbor Laboratory) u otro promotor (véase la Realización A) , y 2. el gen para la proteína de factor de transcripción asociada d) [componente d) ] que contiene el ADNc para la proteína del represor lac (lac I) (Brown et al., Cell 49_, 603 (1987); Fuerst et al., PNAS USA ££, 2549 (1989)), a cuyo extremo 3' está unida la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T grande de SV40; aminoácidos: 126-132; p.ej. PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)), a cuyo extremo 3' está unido el dominio de transactivación de ácido (TAD) VP16 de HSV-1 (aminoácidos: 406-488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988) ; Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)). Realización D) que comprende 1. Una secuencia de activación que comprende un componente a) que contiene al menos una secuencia de operador tetraciclina (tet O) (p.ej. la secuencia nucleotídica: 5 ' -TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGA- GAAAAGTGAAAG-3 ' ) para fijar la proteína del repre- sor de tetraciclina (tet R) y, en su extremo 3', un componente b) que comprende: el promotor basal de SV40 (ácidos nucleicos 48 a 5191; Tooze (compilador) DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, 1980 N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory) u otro promotor (véase la Realización A) y 2. el gen para la proteína de factor de transcripción asociada d) [componente d) ] que contiene . el ADNc para la proteína del represor de tetraciclina (tet R) (Gossen et al., PNAS USA 82, 5547 (1992); Dingermann et al., EMBO J. 11, 1487 (199- 2)) y, en su extremo 3' la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T grande de SV40; aminoáci- dos 126-132; p.ej. PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) y, en su extremo 3', el dominio de transactivación de ácido (TAD) VP16 de HSV-1 (aminoácidos: 406-488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2 , 718 (1988) ; Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)). Realización E) que comprende . una secuencia de activación que comprende un componente a) que contiene al menos una secuencia [p.ej. la secuencia nucleotídica 5 ' -TAATGATGGGCG-3 ' ] para fi- jar la proteína ZFHD-1 (Pomerantz et al., Science 267, 93 (1995)) y, en su extremo 3', un componente b) que comprende: el promotor basal de SV40 (ácidos nucleicos 48 a 5191; Tooze (compilador) DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, 1980 N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory) u otro promotor (véase la Realización A) y 2. el gen para la proteína de factor de transcripción aso- ciada d) [componente d) ] que contiene el ADNc para la proteína ZFHD1 (Pomerantz et al., Science 267 , 93 (1995)), y, en su extremo 3', la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T grande de SV40; aminoácidos 126-132; p.ej. PKKK- RKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) y, en su extremo 3 ' , el dominio de transactivación de ácido (TAD) VP16 de HSV-l (aminoácidos: 406 a 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995) ) . 2. Módulos promotores farmacológicamente controlables De acuerdo con la invención, los genes siguientes son componentes específicos de los módulos promotores farmacológicamente controlables (véanse las asimismo las Figs. 8 y 9) : - para la proteína de fusión f) [componente f) ] : el gen para el dominio de activación de una proteína de factor de transcripción, y al menos un gen para una proteína A que fija la sustancia de acoplamiento j), en caso apropiado suplementado con una señal de localización nuclear (NLS) para la proteína de fusión h) [componente h) ] : al menos un gen para una proteína B que fija la sustancia de acoplamiento j ) y el gen para una proteína que se fija al ADN de la secuencia de activación [componente i) ] para la sustancia de acoplamiento el componente j ) que tiene al menos un sitio para fijación de la proteína A y para fijación de la proteína B y la secuencia de activación que comprende un sitio para fijación de la proteína de fusión h) [componente h) ] y un elemento promotor para el componente i) . La elección de la sustancia de acoplamiento [componente j ) ] determina inevitablemente la naturaleza de las proteínas A y B de fijación del componente j) en los componentes f) y h) , respectivamente. En este contexto, las proteínas A y B de fijación del componente j) en los componentes f) y h) pueden ser idénticas o no idénticas. Proteínas A y B de fijación del componente j) idénticas pueden utilizarse, en particular, cuando la sustancia de acoplamiento [componente j)] posee varios sitios de fijación idénticos. Dentro del significado de la invención, sin embargo, se prefieren proteínas A y B de fijación del componente j) no idénticas en los componentes f) y h) . Esto significa que la sustancia de acoplamiento [componente j)] está fijada por la proteína de fusión f) [componente f)] en un sitio que es diferente de aquél en el que está fijada por la proteína de fusión h) [componente h) ] , de tal modo que las proteínas de fusión f) y h) no compiten una con otra en cuanto a la fijación a la sustancia de acoplamiento. Pueden utilizarse sustancias de acoplamiento que son ya conocidas para fijarse a proteínas celulares particulares cuyos genes se pueden utilizar en los componentes f) y h) del promotor farmacológicamente controlable. Sin embargo, esta invención se refiere también, en particular, a la utilización de anticuerpos monoclonales, y anticuerpos recombinantes derivados de ellos, o sus fragmentos, que se fijan a la sustancia de acoplamiento j) . La inserción de estos anticuerpos monoclonales, en particular sus fragmentos Fv recombinantes, las proteínas de fusión f) y h) [componentes f) y h) ] constituye una característica particular de esta invención. En este contexto, fragmentos Fv recombinantes que reconocen sitios de fijación diferentes (epíto-pes de los sitios de fijación A y B respectivamente) en la sustancia de acoplamiento [componente j ) ] se emplean prefe-riblemente en las proteínas de fusión [componentes f) y h) ] . Dentro del significado de la invención, puede hacerse uso de anticuerpos monoclonales tanto murinos como humanos . Los anticuerpos monoclonales murinos se emplean preferiblemente en forma humanizada. La humanización se efectúa de la manera descrita por Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)) y Hoogenbooms et al., (Tr. Tranfus . Hemobiol . 36., 19 (1993) ) . Se preparan fragmentos de anticuerpos de acuerdo con la técnica anterior, por ejemplo de la manera descrita por Winter et al., Nature 349, 293 (1993); Hoogenboom et al., (Tr. Tranfus. Hemobiol. ¿6, 19 (1993); Girol, Mol. Immunol . 28, 1379 (1991) y Huston et al., Int. Rev. Immunol . 10, 195 (1993) . Se preparan fragmentos recombinantes de anticuerpos directamente a partir de hibridomas existentes o se aislan de genotecas de fragmentos de anticuerpos murinos o humanos (Winter et al., Annu. Rev. Immunol . ¿¿, 433 (1994)) utilizando tecnología de presentación de fago (Smith, Science 228, 1315 (1985)). Estos fragmentos de anticuerpos se emplean luego directamente, al nivel genético, para fusión con otras proteínas o péptidos [con el dominio de activación de una proteína de factor de transcripción (componente f) o con la proteína de fijación de ADN (componente h) ] . Con objeto de preparar fragmentos de anticuerpos recombinantes a partir de hibridomas, la información genética que codifica los dominios de fijación de antígeno (VH y VL) de los anticuerpos se obtiene por aislamiento del ARNm, transcripción inversa del ARN en ADNc y multiplicación posterior del ADNc por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (Saiki et al., Science 230, 1350 (1985)) utilizando oligonucleótidos que con complementarios a los extremos 5' y 3', respectivamente, de los fragmentos variables (Orlandi et al., PNAS-USA 86, 3833 (1989)) . Los fragmentos VH y VL se clonan luego en vectores de expresión bacterianos, por ejemplo en la forma de fragmentos Fv (Skerra & Plückthun, Science 240, 1038 (1988)), fragmentos monocatenarios Fv (scFv) (Bird et al., Science 242, 423 (1988; Huston et al., PNAS-USA 85, 5879 (1988)) o fragmentos Fab (Better et al., Science 240, 1041 (1988) ) . Pueden aislarse también nuevos fragmentos de anticuerpos directamente a partir de genotecas de anticuerpos (genotecas inmunes o genotecas naturales) de origen murino o humano utilizando tecnología de presentación de fago. En la presentación de fago de fragmentos de anticuerpos, los dominios de fijación de antígeno se clonan, sea en el genoma del fago (McCafferty et al., Nature 348, 552 (1990)) o en vectores de fagémido (Breitling et al., Gene 104 , 147 (1991)), en la forma de fragmentos scFv (McCafferty et al . , Nature 348 , 552 (1990)) o fragmentos Fab (Hoogenboom et al., Nucí. Acid Res. 19, 4133 (1991); Barbas et al., PNAS-USA 88., 7978 (1991)) como proteínas de fusión junto con la proteína g3P de revestimiento de bacteriófagos filamentosos. Se seleccionan fagos de fijación de antígeno sobre receptáculos de plástico cargados con antígeno ("lavado en batea") (Marks et al., J. Mol. Biol. 222 , 581 (1991) ) , sobre bolitas paramagnéticas conjugadas con antígeno (Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992)) o por fijación a superficies celulares (Marks et al., Bio/Technol. 11, 1145 (1993)). Se preparan genotecas inmunes por multiplicación mediante PCR de los fragmentos variables de anticuerpos a partir de los linfocitos B de animales inmunizados (Sastry et al., PNAS-USA, 8£, 5728 (1989); Ward et al., Nature 341, 544 (1989) ; Clackson et al., Nature 352, 624 (1991)) o de pacientes (Mullinax et al. PNAS-USA, 87, 8095 (1990); Barbas et al., PNAS-USA, 88, 7978 (1991)). Para esto, se hace uso de combinaciones de oligonucleótidos que son específicos para murino (Orlandi et al., PNAS-USA, 86, 3833 (1989); Sastry et al., PNAS-USA, 86, 5728 (1989)) o genes de inmunoglobulina humanos (Larrick et al., BBRC 160, 1250 (1989)), o son espe-cíficos para las familias de genes de inmunoglobulina humanos (Marks et al., Eur. J. Immunol . 21, 985 (1991)). Pueden prepararse genotecas nativas mediante utilización de donantes no inmunizados como fuente de los genes de inmunoglobulina (Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)). Alternativamente, pueden utilizarse genes de la línea germinal de inmunoglobulinas para preparar repertorios de anticuerpos semisintéticos, en los que la región 3 determinante de la complementariedad de los fragmentos variables está multiplicada por medio de PCR utilizando iniciadores degene-rados (Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1992); Barbas et al., PNAS-USA 89, 4457 (1992); Nissim et al., EMBO J. 13, 692 (1994); Griffiths et al., EMBO J. 13, 3245 (1994)) . En comparación con las genotecas inmunes, las denominadas genotecas mono-cesta tienen la ventaja de que pueden aislarse fragmentos de anticuerpos contra un gran número de antígenos a partir de una sola genoteca (Nissim et al., EMBO J. 13, 692 (1994) ) . La afinidad de los fragmentos de anticuerpos puede aumentarse todavía más utilizando tecnología de presentación de fago, con nuevas genotecas preparadas a partir de fragmentos de anticuerpos pre-existentes por medios aleatorios (Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992); Gram et al., PNAS-USA 89. 3576 (1992)), basadas en codones (Glaser et al., J. Immu-nol. 149, 3903 (1992)) o mutagénesis dirigida al sitio (Ba-lint & Larrick, Gene 137, 109 (1993), por mezcla desordenada de las cadenas de dominios individuales con las de fragmentos de repertorios naturales (Marks et al., Bio/Technol . 10, 779 (1992) ) o mediante el empleo de cepas mutantes bacterianas (Low et al., J. Mol. Biol. 2£0, 359 (1996)), y aislamiento de fragmentos de anticuerpos que tienen propiedades mejoradas por reselección en condiciones severas (Hawkins et al . , J. Mol. Biol. 2¿£, 889 (1992)). Adicionalmente, fragmentos de anticuerpos murinos pueden humanizarse por el reemplazamiento progresivo de uno de los dominios variables con un repertorio humano y selección subsiguiente utilizando el antígeno original (selección guiada) (Jespers et al., Bio/Technol . 12, 889 (1994)). Alternativamente, se humanizan anticuerpos murinos por reemplazamiento específico de las regiones hipervariables de anticuerpos humanos con las regiones correspondientes del anticuerpo murino original (Jones et al . , Nature 321 , 522 (1987) ) . Por consiguiente, dentro del significado de la invención, las sustancias de acoplamiento incluyen básicamente todas las sustancias que son capaces de penetrar en una célula. Dentro del significado de esta invención, se hace referencia particular a aquellas sustancias de acoplamiento que se utilizan ya como productos farmacéuticos con independencia de la terapia génica. Por ejemplo, estas sustancias de acoplamiento incluyen las sustancias de acoplamiento siguientes [componente j)] junto con las proteínas asociadas que se fijan a la sustancia de acoplamiento particular y cuyos genes han de insertarse en componentes f) y h) con objeto de expresar las proteínas de fusión f) y h) , respectivamente: sustancia de acoplamiento: rapamicina o análogos de rapamicina, tales como L685818 (Becker et al., J. Biol. Chem. 268, 11335 (1993)), junto con las proteínas de fijación siguientes (y sus genes) ; la proteína de fijación FK506 (FKBP; Bierer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 9231 (1990)); la proteína asociada a FKBP/rapamicina, que se fija al complejo rapamicina/FKBP, o su secuencia parcial que se fija al complejo rapamicina/FKBP (FRAP; Brown et al., Nature 369, 756 (1994); Chiu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA £1, 12574 (1994); Sabatini et al., Cell 78, 35 (1994); Sa- bers et al., J. Biol. Chem. 270, 815 (1995)). En lugar de utilizar genes para FKBP y FRAP, puede hacerse uso de genes para un fragmento recombinan- te Fv que se fija a rapamicina y/o inhibe la fijación de FKBP o de FRAP a rapamicina. Sustancia de acoplamiento: dímeros (FK1012) de FK506 (Spencer et al., Science 262, 1019 (1993); Pruschy et al., Chem. Biol. 1, 163 (1994)) junto con las proteínas de fijación siguientes (y sus genes) : la proteína de fijación FK506 (FKBP, véase anteriormente) ; calcineurina (Lin et al., Cell 66, 807 (1991)) o su secuencia parcial que se fija al complejo FK506 (Clipstone et al., J. Biol. Chem. 269, 26431 (1994) ) ; y el gen para un fragmento recombinante Fv que inhibe la fijación de FK506 a calcineurina (Ho et al., Nature 382, 822 (1996) ) y puede insertarse en lugar del gen de calcineurina. Sustancia de acoplamiento: dímeros de ciclosporina A (Belshaw et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93., 4604 (1996)) junto con las proteínas de fijación siguientes (y sus genes) : ciclofilina (Belshaw et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93, 4604 (1996)); calcineurina o su secuencia parcial que se fija al complejo ciclosporina A/ciclofilina (véase ante- riormente) ; y el gen para un fragmento recombinante Fv que inhibe la fijación de ciclosporina A a ciclofilina puede insertarse en lugar del gen de ciclofilina. Sustancia de acoplamiento : monómeros de ciclosporina A junto con las proteínas de fijación siguientes (y sus genes) : ciclofilina; gen para un fragmento recombinante Fv que se fija a ciclosporina A en el complejo ciclofilina/ci- closporina A (Calacano et al., Molec. Immunol . 29, 107 (1992)); como alternativa a la ciclofilina, puede hacerse uso de genes para fragmentos recombinantes Fv diferentes que se fijan a epítopes diferentes de la ciclosporina A (Vix et al., Proteins. 15., 339 (1993); Calacano et al., Mol. Immunol . 29., 107 (1992); Rauffer et al., Molec. Immunol . 31, 913 (1994) ) . Sustancia de acoplamiento: metotrexato junto con las proteínas de fijación siguientes (y sus genes) : . anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (fragmentos recombinantes Fv) contra metotrexato (Pimm et al., Brit. J. Cáncer 61, 508 (1990); Kato et al., J. Immunol. Methods 67, 321 (1984)); anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (fragmen- tos recombinantes Fv) contra el grupo de la pteri- dina (Cot et al., Hybridoma 6, 87 (1987)); anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (fragmentos recombinantes Fv) contra el grupo del benceno (Cot et al., Hybridoma 6, 87 (1987)); y dihidrofolato-reductasa (Masters et al., Gene 21, 59 (1983); Swift et al., Mol. Gen. Genetics 181, 441 (1981); Goldsmith et al., Mol. Cell Biol. 6, 878 (1986) ) . - Sustancia de acoplamiento: gentamicina junto con las proteínas de fijación siguientes (y sus genes) : anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (fragmentos recombinantes Fv) contra gentamicina (Sierra-Madero et al., J. Clin. Microbiol. 26, 1904 (1988)). - Sustancia de acoplamiento: ceftazidima junto con las proteínas de fijación siguientes (y sus genes) : anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (fragmentos recombinantes Fv) contra ceftazidima (Shimizu et al., Int. Arch. Allergy Immunol . 98_, 392 (1992)). - Sustancia de acoplamiento: cefalexina junto con las proteínas de fijación siguientes (y sus genes) : anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (fragmentos recombinantes Fv) contra la cadena lateral acilo en la posición C7 del cefem (Nagakura et al., Int. Arch. Allergy Applied Immunol . 93., 126 (1990)). Sustancia de acoplamiento: ácido fólico junto con las proteínas de fijación siguientes (y sus genes) : proteína de fijación de ácido fólico (Ratnam et al., Biochem. 28., 8249 (1989); Elwood, J. Biol. Chem. 264. 14893 (1989); Sadasivan et al., Bio- chem. Biophys. Acta 1131, 91 (1992)) anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (fragmentos recombinantes Fv) contra ácido fólico (Rayburn et al., Clin. Chem. 30, 1007 (1984)). Sustancia de acoplamiento: ácido retinoico junto con las proteínas de fijación siguientes (y sus genes) : dominio de fijación de ácido retinoico de la proteína celular de fijación de ácido retinoico (Stoner et al., Cáncer Res. 49, 1497 (1989); Eller et al., Clin. Res. 39, 560A (1991)); y . anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (fragmentos recombinantes Fv) contra ácido retinoico (Twal et al., Developm. Biol. 168, 225 (1995); Zhou et al., J. Immunol. Methods. 131, 211 (1991)). Sustancia de acoplamiento: penicilina junto con las proteínas de fijación siguientes (y sus genes) : anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (fragmentos recombinantes Fv) contra amoxicilina (Mayorga et al., Toxicol. 97, 225 (1995); Mayorga et al., Int. Arch. Allergy Applied Immunol . 9_9, 443 (1992)); . anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (fragmentos recombinantes Fv) contra el grupo de bencilpenici- loílo (de Haan et al., Int. Arch. Allergy Applied Immunol. 7_6, 42 (1985); Fukushima et al., Clin. Exp. Immun. 68, 427 (1987)); . anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (fragmentos recombinantes Fv) contra penicilina (Sierra-Madero et al., J. Clin. Microbiol. 26, 1904 (1988)); y la proteína de fijación de penicilina (Popham et al., J. Bacteriol. 177, 326 (1995); J. Bacteriol. 176, 7197 (1994) ) . Sustancia de acoplamiento: 4-hidroxitamoxifeno o tamoxi- feno junto con las proteínas de fijación siguientes (y sus genes) : dominio de fijación de estrógenos de la proteína receptora de estrógenos (Spreafico et al., Eur. J. Pharmacol. 227, 353 (1992); Green et al., Nature 320, 134 (1986) ) ; y anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (fragmentos recombinantes Fv) contra el complejo receptor de estrógenos/estrógeno o 4-hidroxitamoxifeno (Gian- biagi et al., J. Esteroid Biochem. 3.0, 213 (19- 88); Biochím. Biophys. Acta 883, 559 (1986); Kat- zenellenbogen et al., Biochem. 2_6, 2364 (1987); Tate et al., Breast Cáncer Res. Treatm. 3 , 267 (1983) ) . Sustancia de acoplamiento: tetraciclina junto con las proteínas de fijación siguientes (y sus genes) : la proteína del represor de tetraciclina (Gossen et al., PNAS USA 81, 5547 (1992)); y anticuerpos y fragmentos de anticuerpo contra tetraciclina. - Sustancia de acoplamiento: conjugado de tetraciclina e isopropil-beta-D-tiogalactosido junto con las proteínas de fijación siguientes (y sus genes) : la proteína del represor de tetraciclina (Gossen et al., PNAS USA 81, 5547 (1992)); y . la proteína del represor lac (lac I) (Brow et al., Cell 4£, 603 (1987) ) . De acuerdo con la invención, los genes para las proteínas de fijación de la sustancia de acoplamiento [componente j ) ] A y B se enlazan - en la proteína de fusión f) [componente f) , proteína A] , al gen para el dominio de activación de una proteína de factor de transcripción, y en la proteína de fusión h) [componente h) , proteína B] , al gen para una proteína de fijación de ADN, seleccionándose esta proteína de fijación de ADN de tal manera que la misma se fija específicamente - a la secuencia de activación [componente i) ] (véanse las Figs. 8 y 9) . En este contexto, una "proteína existente naturalmente" es una proteína que se encuentra en la naturaleza. Así pues, un dominio de fijación que procede de una "proteína existente naturalmente" es distinto de un dominio de fijación que ha sido diseñado por el hombre. Una proteína existente naturalmente se encuentra y se aisla de la naturaleza. La información sobre la secuencia de ácidos nucleicos de un "dominio de fijación" puede utilizarse separadamente o combinada con otra información de secuencia para formar un dominio de fijación a partir de una proteína existente naturalmente. Dentro del significado de la invención, puede utilizarse lo siguiente, por ejemplo, como la secuencia nucleotídica para el dominio de activación en el componente f) : - dominio de transactivación VP16 del virus de herpes (Greaves et al., J. Biol. 64, 2716 (1990); 65, 6705 (1991)) ; la subunidad p65 de la proteína de factor de transcripción NF-xB (Schmitz et al., EMBO J. 10, 3805 (1991); y - el dominio Oct-2 N-terminal rico en glutamina que está enlazado directa o indirectamente (p.ej. por la vía de la proteína de fijación Gal4) al dominio 0ct-2 C-terminal rico en prolina de 0ct-2 (Tanaka et al., Mol. Cell Biol. 14, 6046 (1994) ) . Lo que sigue puede, por ejemplo, utilizarse como la secuencia nucleotídica para la proteína de fijación de ADN en la proteína de fusión h) [componente h) ] y como la secuencia de activación asociada [componente i)] : Realización F) , que comprende 1. una secuencia nucleotídica para la proteína de fijación de ADN en la proteína de fusión h) , que comprende: un ADNc para el dominio de fijación de ADN de la proteína Gal4 (aminoácidos 1 a 147; Chasman y Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)) y, en su extremo 3', la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T grande de SV40; aminoácidos 126 a 132: p.ej. PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS ü, 488 (1991)) y, en su extremo 3', el dominio de transactivación de ácidos VP16 de HSV-l (TAD) (aminoácidos 406 a 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988) ; Triezenberg Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995), y la secuencia de activación asociada [componente i)] , que comprende : . al menos una secuencia [p.ej. la secuencia nucleotídica 5' -CGGACAACTGTTCACCG-3' ] para fijación de la proteína Gal4 (Chasman y Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1989)) y, en su extremo 3', el promotor basal de SV40 (ácidos nucleicos 48 a 5191; Tooze (compilador) DNA Tumor. Viruses (Cold Spring Harbor New York, NY; Cold Spring Harbor Laboratory) o el promotor c-fos (Das et al., Nature 374, 657 (1995)) y, en su extremo 3', el dominio de tran- sactivación de ácido (TAD) VP16 de HSV1 (aminoácidos 406 a 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988) ,- Triezenberg, Curr. Opin. Gen Developm. 5, 190 (1995) ) , o el promotor U2 sn de ARN y, en su extremo 3', el TAD VP16 de HSV-l o al menos una secuencia del dominio de activación Oct-2 (aminoácidos 438 a 479; Tanaka et al., Mol. Cell Biol. 14, 6046 (1994); Das et al., Nature 374, 657 (1995)), o el promotor HSV (Papavassiliou et al., J. Biol. Chem. 265, 9402 (1990); Park et al., Molec. Endo- crinol. 7, 319 (1993) ) , o cualquier otro promotor que pueda ser activado inespecíficamente, específicamente para las células, específicamente para virus y/o específicamente para el ciclo celular. Realización G) , que comprende 1. una secuencia nucleotídica para la proteína de fijación de ADN en la proteína de fusión h) , que comprende: el ADNc para el dominio de fijación de ADN de la proteína LexA (aminoácidos 1 a 81; Kim et al., Science 255, 203 (1992)) o la proteína LexA completa (aminoácidos 1 a 202; Brent et al., Cell 43, 729 (1985)) y, en su extremo 3', la señal de localización nuclear de SV40 (NLS) (T grande de SV40; aminoácidos 126 a 132: p.ej. PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) y, en su extremo 3', los dominios de transactivación de ácido (TAD) VP16 de HSV-l (aminoácidos 406 a 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988) ; Triezenberg, Curr. Opin. Gen Developm. 5, 190 (1995)) y 2. La secuencia de activación asociada [componente i)] : la secuencia [p.ej. secuencia nucleotídica 5'-TAC- TGTATGTACATACAGTA-3' ] para fijación de la proteína LexA (operador LexA, Brent et al., Nature 612, 312 (1984)], a cuyo extremo 3' está unido. el promotor basal de SV40 (ácidos nucleicos 48 a 5191; Tooze (compilador) , DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, NY; Cold Spring Harbor Laboratory) u otro promotor (véase la realización F) . Realización H) , que comprende 1. la secuencia nucleotídica para la proteína de fijación de ADN en la proteína de fusión h) , que comprende el ADNc para la proteína del represor lac (lac I) (Brown et al., Cell 41, 603 (1987); Fuerst et al., PNAS USA ¿£, 2549 (1989)) y, en su extremo 3', la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T grande de SV40; aminoácidos 126-132; p.ej. PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) y, en su extremo 3', el dominio de transactivación de ácido (TAD) VP16 de HSV-l (aminoácidos: 406-488; Trie- zenberg et al., Genes Developm. 2 , 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)) , y 2. la secuencia de activación asociada [componente i)] . que contiene al menos una secuencia de operador lac (p.ej. secuencia nucleotídica: 5 ' -GAATTGTGAGC- GCTCACAATTC-3 ' ) para fijación de la proteina del represor lacl (Fuerst et al., PNAS USA 86, 2549 (1989); Simons et al., PNAS USA 81, 1624 (1984)) y, en su extremo 3', el promotor basal de SV40 (ácidos nucleicos 48 a 5191; Tooze (compilador) DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory) u otro promotor (véase la realización F) . Realización I) , que comprende 1. una secuencia nucleotídica para la proteína de fijación de ADN en la proteína de fusión h) , que comprende el ADNc para la proteína del represor de tetraciclina (tet R) (Gossen et al., PNAS USA 81, 5547 (1992); Dingermann et al., EMBO J. 11, 1487 (1992)) y, en su extremo 3', la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T grande de SV40; aminoácidos 126-132; p.ej. PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) y, en su extremo 3', el domi- nio de transactivación de ácido (TAD) VP16 de HSV- 1 (aminoácidos: 405-488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988) ; Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5., 190 (1995)), y 2. la secuencia de activación asociada [componente i)] que contiene al menos una secuencia de operador tetraciclina (tet 0) (p.ej. la secuencia nucleotí- dica: 5 ' -TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGT- GAAAG-3') para fijación de la proteína del represor de la tetraciclina (tet R) y, en su extremo 3', el promotor basal SV40 (ácidos nucleicos 48 a 5191; Tooze (compilador) DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory) u otro promotor (véase la realización F) . Realización J) , que comprende 1. una secuencia nucleotídica para la proteína de fijación de ADN en la proteína de fusión h) , que comprende el ADNc para la proteína ZFHDl (Pomerantz et al., Science 267, 93 (1995)) y, en su extremo 3', la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T grande de SV40; aminoácidos 126 a 132; p.ej. PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) y, en su extremo 3', el dominio de transactivación de ácido (TAD) VP16 de HSV-l (aminoácidos: 406 a 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5., 190 (1995)) , y 2. la secuencia de activación asociada [componente i)] , que comprende: al menos una secuencia (p.ej. la secuencia nucleotídica: 5' -TAATGATGGGCG-3' ) para fijación de la proteína ZFHD-1 (Pomerantz et al., Science 267, 93 (1995)) y, en su extremo 3', el promotor basal de SV40 (ácidos nucleicos 48 a 5191; Tooze (compilador) DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, NY, Cold Spring Harbor Laboratory) u otro promotor (véase la posibilidad F) . 3) Secuencias promotoras Dentro del significado de la invención, secuencias nucleotídicas que, después de la fijación a proteínas de factores de transcripción, activan la transcripción de un gen estructural que está localizado en una posición adyacente al extremo 3' , se utilizan como secuencias promotoras [componentes b) , e) , g) e i)] . La elección de las secuencias promotoras depende de la enfermedad tratada y de la célula diana sometida a transducción. Así, la secuencia promotora puede activarse de manera no restringida, de una manera específica de la célula diana, en condiciones metabólicas particulares, de un modo específico del ciclo celular o de un modo específico del virus. Adicionalmente, pueden emplearse secuencias promotoras idénticas o diferentes en los componentes b) , e) y/o g) y en el componente i) . Ejemplos de estas secuencias promotoras, además de las secuencias promotoras que se han citado ya en las Realizaciones A) a J) , son: promotores y secuencias activadoras que pueden ser acti- vadas de manera no restringida el promotor III de ARN-polimerasa el promotor II de ARN-polímerasa el promotor de CMV y el intensificador de CMV el promotor de SV40 - secuencias promotoras víricas y secuencias de activación, tales como HBV HCV HSV . HPV EBV HTLV HIV Cuando se utiliza el promotor HIV, la secuencia LTR entera que incluye la secuencia TAR (posición = -453 = +80, Rosen et al., Cell 41, 813 (1985) se emplea como el promotor específico del virus. Secuencias promotoras o secuencias intensificadoras que pueden ser activadas metabólicamente, tales como un intensificador o promotor que es inducible por hipoxia. Promotores que pueden ser activados de una manera específica del ciclo celular, tales como el promotor del gen cdc25C, el promotor del gen de ciclina A, el promotor del gen cdc2, el promotor del gen B-myb, el promotor del gen DHFR o el promotor E2F-1 o bien secuencias de fijación para proteínas de factores de transcripción que parecen ser activadas o son activadas durante la proliferación celular. Estas secuencias de fijación incluyen, por ejemplo, secuencias de fijación para proteínas c-myc . Estas secuencias de fijación incluyen también monómeros o multímeros de la secuencia nucleotídica que se conoce como caja myc E, p.ej. [5 ' -GGAAGCAGACCACGTGGTCTG-CTTCC-3', Blackwood y Eisenmann, Science 251, 1211 (199-1)] . Promotores que pueden ser activados por tetraciclina, tales como el operador tetraciclina en combinación con un represor correspondiente. Promotores quiméricos. Un promotor quimérico constituye la combinación de una secuencia activadora de aguas arriba, que puede ser activada de manera específica por las células, metabóli-camente o específicamente por virus, con un módulo promotor de aguas abajo que puede fijar las proteínas de factor de transcripción de las familias CDF y CHF o E2F y CHF, y es por consiguiente capaz de inhibir la activación de la secuencia activadora de aguas arriba en las fases GO y Gl del ciclo celular. Promotores híbridos, por ejemplo en la forma en la que la caja TATA de un promotor se muta, siendo contrarrestada esta mutación por una mutación correspondiente en el gen de la proteína de fijación de TATA y encontrando-se esta proteína de fijación de TATA bajo el control de un promotor adicional . Promotores que pueden ser activados de manera específica por las células. Estos promotores incluyen preferiblemente promotores o secuencias de activación procedentes de genes que codifican preferiblemente proteínas en células seleccionadas.

Por ejemplo, dentro del significado de la invención, debe hacerse uso preferiblemente de promotores para las proteínas siguientes en las células siguientes: Secuencias promotoras o secuencias activadoras que se activan en células endoteliales transportador de glucosa 1 endotelial, específico del cerebro endoglina receptor 1 de VEGF (flt-1) . receptor 2 de VEGF (flk-1, KDR) til-1 o til-2 receptor D61 (receptor ?ck) B61 endotelina, especialmente . endotelina D endotelina- 1 receptores de endotelina, en particular el receptor de endotelina B IL-la y IL-l/S . molécula de adhesión vascular a las células (VCAM-1) secuencias activadoras sintéticas Como alternativa a los promotores específicos endoteliales naturales, puede hacerse también uso de secuencias activadoras sintéticas que comprenden sitios de fijación oligomerizados para proteínas de factores de transcripción que son preferente o selectivamente activos en células endoteliales. Un ejemplo de estas proteínas de factores de transcripción es la proteína de factor de transcripción GATA-2, cuyo sitio de fijación se encuentra en el gen de endotelina-1, por ejemplo, es 5'-TTATCT- 3' . - Promotores o secuencias de activación que son activados en células en la proximidad de células endoteliales activadas VEGF Las secuencias reguladoras génicas para el gen VGEF son la región flanqueante 5 ' , o la región flanqueante 3 ' , o el gen c-Src, o el gen v-Scr Receptores de hormonas esteroidales y sus elementos promotores (Truss y Beato, Endocr. Rev. 14, 459 (1993)), en particular el promotor del virus de tumor mamario del ratón Promotores por secuencias activadoras que se activan en células musculares, en particular células de la musculatura lisa tropomiosina Qf-actina a-miosina receptor para PDGF receptor para FGF MRF-4 fosfofructoquinasa A fosfoglicerato-mutasa troponina C miogenina receptores para endotelina A desmina VEGF Las secuencias reguladoras génicas para el gen VEGF han sido ya enumeradas en la sección titulada "Promotores que son activados en células en la proximidad de células endoteliales activadas" (véase anteriormente) . Promotores "artificiales" Se ha informado que los factores de la familia hélice-anillo-hélice (HLH) (MyoD) , Myf-5, miogenes y MRF4) son activadores de la transcripción específicos del músculo. Los activa- dores de la transcripción específicos del músculo incluyen asimismo la proteína de dedo de zinc GATA-4 y los grupos de factor de transcripción MEF. Las proteínas HLH, y también GATA-4, exhiben transcripción específica del músculo no sólo con promotores de genes específicos del músculo sino también en un contexto heterólogo, es decir también con promotores artificiales. Ejemplos de estos promotores artificiales son: . copias múltiples del sitio de ADN para fijación de las proteínas HLH específicas del músculo, tales como la caja E (Myo D) (p.ej. 4x AGCAGGTGTTGGGAG- GC) . copias múltiples del sitio de ADN para fijación de GATA-4 de los genes de la cadena pesada de alfa- miosina (p.ej. 5 ' -GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATA- GAGG-3' ) Promotores y secuencias de activación que son activados en células de glía. Estos instruyen, en particular, secuencias o elementos reguladores génicos, respectivamente, procedentes de genes que, por ejemplo, codifican las proteínas siguientes: la proteína periaxina, específica de las células de Schwann glutamina- sintetasa la proteína específica de las células de glía (proteína acida fibrilar glial = GFAP) la proteína SlOOb de las células de glía . IL-6 (CNTF) receptores de 5-HT TNFa IL-10 receptores I y II de factor de crecimiento afín a la insulina VEGF Las secuencias reguladoras génicas para el gen VEGF han sido ya enumeradas anteriormente. Promotores y secuencias activadoras que se activan en las células hematopoyéticas Estas secuencias reguladoras génicas incluyen secuencias promotoras para genes de una citoquina o su receptor, genes que se expresan en células hematopoyéticas o en célulae adyacentes tales como el estroma. Estas secuencias incluyen secuencias promotoras para, a modo de ejemplo, las citoquinas siguientes y sus receptores : receptor de factor de las células primordiales (stem) factor de las células primordiales IL-lc. , receptor de IL-l IL-3 receptor de IL-3 (subunidad ) receptor de IL-3 (subunidad ß) IL-6 receptor de IL-6 GM-CSF receptor de GM-CSF (cadena a) factor 1 regulador de interferón (IRF-1) El promotor de IRF-1 es activado en la misma proporción por IL-6 que por IFN-a, y IFN-3 o IFN-?. eritropoyetina receptor de eritropoyetina Promotores y secuencias de activación que se activan en linfocitos y/o macrófagos Estos incluyen, por ejemplo, las secuencias promotoras y secuencias activadoras de los genes para cito-quinas, receptores de citoquina y moléculas de adhesión y receptores para el fragmento Fe de anticuerpos . Ejemplos de estos últimos son: receptor de IL-1 IL-la IL-10 IL-2 receptor de IL-2 IL-3 receptor de IL-3 [subunidad a) receptor de IL-3 [subunidad ß ) IL-4 receptor de IL-4 IL-5 IL-6 factor 1 regulador de interferón (IRF-1) (El promotor de IRF-1 es activado en la misma proporción por IL-6 que por IFN-a o IFN-/3) . Promotor sensible a IFN-? IL-7 IL-8 IL-10 IL-11 IFN-? GM-CSF receptor de GM-CSF (cadena a) IL-13 LIF receptor de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) receptores de macrófagos de barrido tipo I y II MAC-1 (antígeno funcional de leucocitos) LFA-la (antígeno funcional de leucocitos) tl50,95 (antigeno funcional de leucocitos) Secuencias promotoras y secuencias activadoras que son activadas en células sinoviales Estas incluyen las secuencias promotoras para metalopro-teinasas de la matriz (MMP) , por ejemplo para MMP-l (colagenasa intersticial) MMP-3 (lisina/transina del estroma) Estas incluyen adicionalmente las secuencias promotoras para inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP) , por ejemplo TIMP-l . TIMP-2 TIMP-3 Secuencias promotoras y activadoras que se activan en células de leucemia Estas incluyen, por ejemplo, promotores para . c-myc HSP-70 bcl-i/ciclina D-i bcl-2 IL-6 . 11-10 NFa, TNFJ H0X-11 BCR-Abl E2A-PBX-1 . PML-RARA (leucemia promielocítica - receptor de ácido retinoico) c-myc las proteínas c-myc se fijan a, y activan, los multímeros de la secuencia nucleotídica que se designa como la caja myc E (p.ej. 5' -GGAAGCAGAC- CACGTGGTCTGCTTCC-3 ' ) Promotores o secuencias activadoras de células tumorales Una secuencia nucleotídica reguladora génica con la cual interaccionan las proteínas de factores de transcripción, que se forman o son activas en células tumorales, se considera como la secuencia promotora o secuencia activadora. Dentro del significado de esta invención, los promotores o secuencias activadoras preferidos incluyen secuencias o elementos reguladores génicos, respectivamente, procedentes de genes que codifican proteínas que se forman, en particular, en células de cáncer o células de sarcoma. Así, en el caso de carcinomas bronquiales de células pequeñas, se da preferencia a la utilización del promotor de la proteína N-CAM, en el caso de carcinomas de ovario a la utilización del promotor del receptor de factor de crecimiento de la hepatitis o de L-plastina, y en el caso de carcinomas pancreáticos a la utilización del promotor de L-plastina o de mucina epitelial polimórfica (PEM) . 4) Señales de exportación nuclear y factores de exportación nuclear Dentro del significado de la invención, las señales de exportación nuclear (NES) son preferiblemente las secuencias del elemento retrovírico rev-sensible (RRE) . En el caso de HIV-l, este RRE es una secuencia de 243 nucleótidos (nucleótidos 7362-7595; Muesing et al., Nature 313, 450 (1985)) en el gen env (Malim et al., Nature 338, 254 (1989); Kjems et al., PNAS 8Jj¡, 683 (1991)) . Sin embargo, dentro del significado de la invención, la señal de exportación nuclear (NES) puede ser también cualquier secuencia nucleotídica homologa y/o funcionalmente similar (análoga) tal como, por ejemplo, el elemento del virus HBV equivalente a RRE (Huang et al., Mol. Cell Biol. 13, 7476 (1993)). En los nuevos constructos de ácido nucleico, el factor de exportación nuclear (NEF) es una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que se fija al ARNm del NRS y media el transporte del ARNs premensajero o ARNs que contiene NRS mensajero fuera del núcleo celular y al interior del citoplasma (o fuera del citoplasma y al interior del núcleo celu-lar) . Dentro del significado de la invención, se hace uso, en particular, del gen rev de retrovirus, especialmente del virus HIV-l o HIV-2 (Daly et al., Nature 34_2, 816 (1989); Emerman et al., Cell ¿7, 1155 (1989) ; Felber et al., PNAS 86, 1495 (1989); Fischer et al., EMBO J. 13, 4105 (1994). La proteína rev del gen retrovírico rev se fija, por su dominio N-terminal (Zapp et al., Nature 342. 7154 (1989); Malim et al., Cell 65, 241 (1991)) al RRE en el pre-ARNm (Iwai et al., Nucí. Acids Rex. 20, 6465 (1992)). La fijación entre el RRE y la proteína rev facilita el transporte del ARN premensajero no sometido empalmado, así como de cualquier otro ARN que contenga un RRE, fuera del núcleo celular y al interior del citoplasma (Fischer et al., EMBO J. 13, 4105 (1994); Fischer et al., Cell 82, 475 (1995)) y mejora con ello sustancialmente la traducción. Dentro del significado de la invención, puede hacerse también uso, como NEF, de secuencias nucleotídicas que codi-fican proteínas que son homologas y funcionalmente similares, a la proteína rev de HIV-l (Bogerd et al., Cell 82., 485 (19-95)), tales como el gen rev del virus visna-maedi (VMV) ; Tiley et al., J. Virol. 65, 3877 (1991)) o el gen rev del virus de la artitris-encefalitis caprina (CAEV; Tiley et al., J. Virol. 65, 3877 (1991)). Sin embargo, dentro del significado de la invención, puede hacerse también uso de aquellos genes que codifican proteínas que, tanto si poseen únicamente una ligera homología como si no poseen homología alguna con la proteína rev, son funcionalmente similares a la proteína rev de HIV-l. Estos genes incluyen, por ejemplo, el gen rev de HTLV-1 (Cullen, Microbiol. Rev. .56, 375 (1992)) y el gen rev del virus de la anemia infecciosa de los equinos (EIAV) y del virus de la inmunodeficiencia de los felinos (FIV) (Manusco et al., J. Virol. 68, 1988 (1994)). En una realización alternativa, los NEFs pueden ser también secuencias nucleotídicas correspondientes a proteínas que efectúan la secreción de ARN fuera del núcleo incluso sin que este ARN sea retenido en el núcleo por medio de un NRS . Estas proteínas incluyen, por ejemplo, la proteína de factor de transcripción TFIIIa (Gaddat et al., Cell 6¿, 619 (1990); Drew et al., Gene 159, 215 (1995)) o la ribonucleoproteína nuclear heterogénea Al (proteína hnRNPAl) Pinol-Roma et al., Nature 355, 730 (1992)). En un sentido más general, las proteínas de transporte nuclear incluyen también la proteína del choque térmico 70 (hsp70; Mandell et al., J. Cell Biol. ül, 1775 (1990)) o el inhibidor de la proteína-quinasa CPKI (Fantozzi et al., J. Biol. Chem. 2£9, 2676 (1994); Wen et al . , J. Biol. Chem. 269, 32214 (1994) ) . Características que son poseídas en común por el NEF y sus proteínas homologas y análogas son la presencia de un dominio localizado más cerca del terminal amino para fijación de la proteína monómera al ARN de NRS (J. Virol. 64, 881 (1990); Kjems et al., EMBO J. 11, 119 (1992)) y un dominio que es usualmente rico en leucina (hnRnPAl es una excepción a esto) y que es necesario para la función de transporte del NEF (Wen et al., Cell 82, 463 (1995); Fischer et al., Cell 82, 475 (1995); Malim et al., J. Virol. 65, 4248 (1991); Venkatesh et al., Virol. 178, 327 (1990)). Dentro del significado de esta invención, la expresión del gen de NEF está bajo el control de una secuencia promotora [componente b''')] que está localizada aguas arriba en el extremo 5' del gen de NEF (véanse las Figs. 2 y 7, y como ya se ha descrito anteriormente) o del módulo promotor farmacológicamente controlable (véanse Figs. 8 y 9) . 5) Sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) Un sitio de entrada de ribosoma interno hace que sea posible expresar dos secuencias de ADN que están enlazadas una a otra ("enlazadas mutuamente") por medio de un IRES. IRES de esta naturaleza han sido descritos, por ejemplo, por Montford y Smith TIG 11, 179 (1995) ; Kaufman et al., Nucí. Acids Res. 19, 4485 (1991); Morgan et al., Nucí. Acids Res. 20, 1293 (1992); Dirks et al., Gene 128, 247 (1993); Pelletier y Sonenberg, Nature 334, 320 (1988) y Sugitomo et al., BioTechn. 12, 694 (1994). Así, por ejemplo, el ADNc de la secuencia IRES del po-liovirus (posición = 140 a = 630 del UTR 5' (Pelletier y Sonenberg, Nature 334, 320 (1988)) puede utilizarse para enlazar el ADN del componente c) al ADN del componente d) . 6) Genes estructurales Dentro del significado de la invención, los genes estructurales [componente c) ] codifican un compuesto activo para la profilaxis y para o terapia de una enfermedad. Los genes estructurales y las secuencias promotoras deben seleccionarse con relación a la naturaleza de la terapia de la enfermedad y teniendo en cuenta la célula diana que deba someterse a transducción. Por ejemplo, las combinaciones siguientes de secuencias promotoras (ejemplos, véase la Sección 3) y genes estructurales deben seleccionarse en asociación con las enfermedades siguientes .-a) Terapia de tumores - Células diana: células endoteliales proliferantes, o células de estroma y células musculares que son adyacentes a la célula endotelial, o células tumorales o células de leucemia - Promotores : específico de las células endoteliales y específico del ciclo celular, o inespecífico de las células o específico de las células musculares y específico del ciclo celular, o específico de las células tumorales (tumores sólidos y leucemias) Genes estructurales para inhibidores de la proliferación celular, por ejemplo para . la proteína del retinoblastoma (pRb=pllO) o las proteínas afines pl07 y pl30 la proteína p53 la proteína p2i (WAF-1) la proteína pl6 . otros inhibidores de cdk la proteína GADD45 la proteína bak. La proteína del retinoblastoma (pRb/pllO) y las proteínas afines pl07 y pl30 se desac- tivan por fosforilación. Se da preferencia a la utilización de tales genes para estos inhibidores del ciclo celular que exhiben muta- ciones para los sitios de desactivación de las proteínas expresadas sin que la función de estas proteínas se vea deteriorada por ello. Ejemplos de estas mutaciones han sido descritos en el caso de pllO. La secuencia de ADN para la proteína pl07 o la proteína pl30 se somete a mutación de manera análoga. En la célula, la proteína pl53 se desactiva sea por fijación a proteínas especiales, tales como MDM2 o por oligomerización de la p53 por la vía de la serina 392 desfosforilada del terminal C. Se da preferencia, por consiguiente, a la utilización de una secuencia de ADN para una proteína p53 que ha sido truncada en el término C por eliminación de la serina 392. Genes estructurales para factores inductores de la coagulación e inhibidores de la angiogénesis, por ejemplo: inhibidor- 1 del activador del plasminógeno (PAI-l) PAl -2 PAl -3 angiostatina interferones, en particular * IFNa * IFN/3 * IFN? factor 4 de las plaquetas IL-12 TIMP-l TIMP-2 TIMP-3 factor inhibidor de la leucemia (LIF) factor tisular (TF) y sus fragmentos activos en la coagulación Genes estructurales para proteínas citostáticas y citotóxicas, por ejemplo para perforina granzima IL-2 IL-4 IL-12 interferones, tales como * IFNa * IFN/J * IFN? TNF, en particular * TNFa * TNFjß oncostatina M esfingomielinasa magainina y derivados de magainina Genes estructurales para anticuerpos citostáticos o citotóxicos y para proteínas de fusión entre fragmentos de anticuerpo fijadores de antígeno y proteínas o enzimas citostáticas, citotóxicas o inductoras de inflamación Los anticuerpos citostáticos o citotóxicos incluyen aquéllos que están dirigidos contra estructuras de membrana de células endoteliales, como ha sido descrito, por ejemplo, por Burrows et al. (Pharmac. Ther., 6 , 155 (1994)), Hughes et al., (Cáncer Res. 49, 6214 (1989)) y Maruyama et al., (PNAS USA 87, 5744 (1990)). Estos anticuerpos incluyen, en particular, anticuerpos contra los receptores VEGF. Estos anticuerpos incluyen adicionalmente anticuerpos citostáticos o citotóxicos que están dirigidos contra estructuras de membrana en células tumorales. Anticuerpos de esta naturaleza han sido revisados, por ejemplo, por Sedlacek et al., Con- trib. to Oncol. 32., Karger Verlag, Munich (1988) y Contrib. to Oncol, 43, Karger Verlag, Munich (1992). Otros ejemplos son anticuerpos contra: sialil Lewis péptidos en tumores que son reconocidos por las células T proteínas que son expresadas por oncogenes gangliosidos tales como GD3 , GD2 , GM2 , 9-0- acetil GD3, fucosil GM1 antígenos de grupo sanguíneo y sus precursores antígenos de la mucina epitelial polimórfica antígenos de las proteínas del choque térmico Estos anticuerpos incluyen adicionalmente anticuerpos que están dirigidos contra estructuras de membrana de células de leucemia. Un gran número de anticuerpos monoclonales de esta naturaleza han sido ya descritos para métodos de diagnóstico y terapéuticos (revisiones en Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 3.8, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cáncer Invest. 1, 69 (1991)). Dependiendo del tipo de leucemia, los anticuerpos monoclonales siguientes, o sus fragmentos de anticuerpo fijadores de antígeno, son, por ejemplo, adecuados para uso como ligandos: La humanización de los anticuerpos murinos, y la preparación y optimización de los genes para los fragmentos Fab y Fv recombinantes se efectúan en analogía con los métodos, que han sido ya descritos, para preparación de fragmentos recombinantes Fv (véase la Sección 2) . Los fragmentos recombinantes Fv se fusionan con genes para proteínas o enzimas citostáticas, citotóxicas o induc- toras de la información de acuerdo con la técnica anterior que es conocida por las personas expertas . Genes estructurales para proteínas de fusión entre ligandos de fijación de células diana y proteínas citostáticas y citotóxicas. Estos incluyen todas las sustancias que se fijan a las estructuras de membrana o receptores de membrana en células endoteliales. Por ejemplo, incluyen IL-1 o factores de crecimiento, o sus fragmentos o secuencias parciales de los mismos, que se fijan a receptores que son expresados por células endoteliales, tales como PDGF, bFGF, VEGF y TGF/S (Pusztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)). Incluyen adicionalmente moléculas de adhesión que se fijan a células endoteliales activadas y/o pro- liferantes. Moléculas de adhesión de esta naturaleza, tales como Slex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA- 4 o vitronectina, han sido ya descritas (revisiones en Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119 , 483 (1992), Pauli et al., Cáncer Metast . Rev. 9, 175 (1990), Honn et al., Cáncer Metast. Rev. 11, 353 (1992) y Varner et al., Cell Adh. Commun. 3 , 367 (1995) ) . Incluyen adicionalmente sustancias que se fijan a estructuras de membrana o receptores de membrana de células tumorales o células de leucemia. Por ejemplo, incluyen factores de crecimiento o sus fragmentos o secuencias parciales de los mismos, que se fijan a receptores que son expresados por células de la leucemia o células tumorales. Factores de crecimiento de esta naturaleza han sido ya descritos (revisiones en Cross et al., Cell 64, 271 (1991), Aulitzky et al., Drugs 48, 667 (1994), Moore, Clin. Cáncer Res. 1, 3 (1995) y Van Kooten et al., Leuk. Lymph. 12, 27 (1993)). . Los genes para estos ligandos que se fijan a la célula diana se fusionan con genes para proteínas o enzimas citostáticas, citotóxicas o inductoras de la inflamación de acuerdo con la técnica anterior utilizando los métodos que son conocidos por las personas expertas. Genes estructurales para inductores de inflamaciones, por ejemplo para RANTES MC-2 factor quimiotáctico y activador de los monocitos (MCAF) IL-8 proteína 1 inflamatoria de los macrófagos (MIP-la - ß ) proteína 2 de activación de los neutrófilos (NAP-2) IL-3 IL-5 factor inhibidor de la leucemia humana (LIF) IL-7 IL-ll IL-13 GM-CSF G-CSF M-CSF factor de veneno de cobra (CVF) , o secuencias parciales de CVF, que corresponden funcionalmente al factor C3b del complemento humano, es decir que son capaces de fijarse al factor B del complemento y que constituyen una convertasa C3 después de la escisión por el factor D. Factor C3 del complemento humano o su secuencia parcial C3b . Productos de escisión de factor C3 del complemento humano que se asemejan a CVF funcional y estructuralmente . Proteínas bacterianas que activan el complemento o provocan inflamaciones, tales como porinas de Salmonella typhimurium, factores de aglomeración de Staphylococcus aureus, modulinas, en particular las de bacterias Gram-negativas, proteína principal de la membrana exterior de legionellas o de Haemophilus influenza tipo B o de klebsiellas, o moléculas M de estreptocos del grupo G. Genes estructurales de enzimas para precursores de la activación de agentes citostáticos, por ejemplo para enzimas que escinden las sustancias precursoras desactivas (profármacos) formando de este modo agentes citostáticos activos (fármacos) .

Las sustancias de esta naturaleza, y los profármacos y fármacos con los cuales están asociadas en cada caso, han sido ya revisadas por Deonarain et al., (Br. J. Cáncer 2SL, 686 (1994)), por Mullen (Pharmac. Ther. 63, 199 (1994)) y por Harris et al. (Gene Ther. 1, 170 (1994)). Por ejemplo, debe utilizarse la secuencia de ADN para una de las enzimas siguientes: timidina-quinasa del virus del herpes símplex timidina-quinasa del virus zóster de la varicela nitrorreductasa bacteriana jß-glucuronidasa bacteriana 3-glucuronidasa vegetal de Sécale cereale /,-glucuronidasa humana carboxipeptidasa humana (CB) , por ejemplo * CB-A de mastocitos CB-B pancreática carboxipeptidasa bacteriana jß-lactamasa bacteriana citosina-desaminasa bacteriana catalasa o peroxidasa humana fosfatasa, en particular fosfatasa alcalina humana * fosfatasa de próstata acida humana * fosfatasa acida tipo 5 * oxidasa, en particular * lisil-oxidasa humana * ácido-D-aminooxidasa humana peroxidasa, en particular * peroxidasa de glutatión humano * peroxidasa de eosinófilos humanos * peroxidasa de tiroides humana 3-galactosidasa Terapia de enfermedades autoinmunes e inflamaciones Células diana: células endoteliales proliferantes, o macrófagos y/o linfocitos, o células sinoviales Promotores : específico de las células endoteliales y específico del ciclo celular, o específico de macrófagos y/o específico de linfocitos y/o específico del ciclo celular específico de las células sinoviales y/o específico del ciclo celular Genes estructurales para la terapia de las alergias, por ejemplo para IFN-? IL-10 anticuerpos o fragmentos de anticuerpo contra IL-4 receptores de IL-4 solubles IL-12 TGFS Genes estructurales para prevenir el rechazo de órganos trasplantados, por ejemplo para IL-10 TGF0 receptores de IL-1 solubles receptores de IL-2 solubles antagonistas de los receptores de IL-1 receptores de IL-6 solubles anticuerpos inmunosupresores o sus fragmentos que contienen VH y VL, o sus fragmentos VH y VL que están conectados por vía de un enlazador, que se preparan, por ejemplo, de acuerdo con el método descrito por Marasco et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 7889 (1993)). Ejemplos de anticuerpos inmunosupresores son anticuerpos que son específicos para el receptor de las células T o su complejo CD3 que están dirigidos contra CD4 o CD8, y adicionalmente que están dirigidos contra el receptor de IL-2, el receptor de IL-1 o el receptor de IL-4, o * que están dirigidos contra las moléculas de adhesión CD2, LFA-1, CD28 o CD40. Genes estructurales para la terapia de enfermedades autoinmunes mediadas por anticuerpos, por ejemplo para TFG. lFN-a IFN-jS IFN-? IL-12 receptores de IL-4 solubles receptores de IL-6 solubles anticuerpos inmunosupresores o sus fragmentos que contienen VH y VL Genes estructurales para la terapia de enfermedades autoinmunes mediadas por células, por ejemplo para IL-6 IL-9 IL-10 IL-13 TNFa IL-4 TNF/3 un anticuerpo inmunosupresor o sus fragmentos que contienen VH y VL Genes estructurales para inhibidores de la proliferación celular, proteínas citostáticas o citotóxicas y enzimas para activar precursores de los agentes citostáticos. Ejemplos de genes codificantes de proteínas de esta naturaleza han sido citados ya en la sección titulada "Genes estructurales para la terapia de tumores". Dentro del significado de la invención, puede hacerse uso, de la misma forma que se ha descrito ya en dicho punto, de genes estructurales que codifican proteínas de fusión que comprenden antibióticos, o fragmentos Fab o fragmentos recombinantes Fv de estos anticuerpos, o sus ligandos, que son específicos para la célula diana, y las citoquinas, factores de crecimiento, receptores, proteínas citostáticas o citotóxicas y enzimas mencionadas anteriormente. Genes estructurales para la terapia de la artritis Dentro del significado de la invención, se seleccionan aquellos genes estructurales cuya proteína expresada inhibe directa o indirectamente la inflamación, por ejemplo en una articulación, y/o promueve la reconstitución de la matriz extracelular (cartílago y tejido conjuntivo) en la articulación. Ejemplos de estas proteínas son antagonista del receptor de IL-1 (IL-l-RA); IL-l-RA inhibe la fijación de IL-la e IL-1/3 receptor de IL-1 soluble; el receptor de IL-1 soluble fija e desactiva IL-1; IL-6; IL-6 aumenta la secreción de TIMP y superóxidos, y reduce la secreción de IL-1 y TNFa, por las células sinoviales y los condrocitos; receptor de TNF soluble; el receptor de TNF soluble fija e desactiva TNF IL-4; IL-4 inhibe la formación y secreción de IL-1, TNFa y MMP IL-10; IL-10 inhibe la formación y secreción de IL-1, TNFa y MMP, y aumenta la secreción de TIMP factor de crecimiento afín a la insulina (IGF-l) IGF-1 estimula la síntesis de la matriz extracelular TGF/S, especialmente TGFjSl y TGF.2 ; TGF)S estimula la síntesis de la matriz extracelular superóxido-dismutasa TIMP (inhibidores tisulares de metaloproteinasas) especialmente * TIMP-l * TIMP-2 * TIMP-3 c) Terapia de la hematopoyesis Deficiente Células diana: . células proliferantes inmaduras del sistema hema- topoyético, o células de estroma que están localizadas adyacentes a las células hematopoyéticas Promotores : . específicos para las células hematopoyéticas y/o específicos del ciclo celular inespecíficos para las células Genes estructurales para la terapia de la anemia, por ejemplo para . eritropoyetina Genes estructurales para la terapia de la leucopenia, por ejemplo para G-CSF GM-CSF - Genes estructurales para la terapia de la trombocitopenia, por ejemplo para IL-3 factor inhibidor de la leucemia (LIF) IL-11 . trombopoyetina d) Terapia del deterioro del sistema nervioso Células diana: células de glía, o células endoteliales proliferantes - Promotores: específicos de las células de glía, o específicos de las células endoteliales y específicos del ciclo celular, o inespecíficos, y específicos del ciclo celular - Genes estructurales para factores del crecimiento neuronal, por ejemplo FGF factor del crecimiento de los nervios (NGF) factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) neurotrofina-3 (NT-3) neurotrofina-4 (NT-4) . factor neurotrófico ciliar (CNTF) Genes estructurales para enzimas, por ejemplo para tirosina-hidroxilasa dopa-descarboxilasa Genes estructurales para citoquinas y sus inhibidores que inhiben o neutralizan el efecto neurotóxico de TNFc_, por ejemplo para TGF3 receptores de TNF solubles Los receptores de TNF neutralizan TNFa . IL-10; IL-10 inhibe la formación de IFN?, TNFa, IL-2 e IL-4 receptores de IL-l solubles receptor I de IL-l . receptor II de IL-1 los receptores de IL-1 solubles neutralizan la actividad de IL-1 antagonista de los receptores de IL-1 receptores de IL-6 solubles Terapia de las alteraciones del sistema de la coagulación de la sangre y el sistema de circulación de la sangre Células diana: células endoteliales, o . células endoteliales proliferantes, o células somáticas en la proximidad de células endoteliales y células de la musculatura lisa, o macrófagos Promotores : . inespecíficos de las células, o inespecíficos de las células y específicos del ciclo celular, o específicos para células endoteliales, células de la musculatura lisa o macrófagos, o específicos de las células endoteliales, células de la musculatura lisa o macrófagos y específicos del ciclo celular Genes estructurales para la inhibición de la coagulación o para la promoción de la fibrinólisis, por ejemplo para activador del plasminógeno tisular (tPA) activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (u- PA) híbridos de tPA y uPA proteína C hirudina inhibidores de la serina-proteinasa (serpinas) , tales como * inhibidor C-1S * antitripsina al * antitrombina III inhibidor del camino de los factores tisulares (TFPI) Genes estructurales para promoción de la coagulación, por ejemplo para F VIII F IX factor von Willebrand F XIII PAI-1 PAl-2 Genes estructurales para factores de la angiogénesis, por ejemplo para VEGF FGF Genes estructurales para disminución de la presión sanguínea, por ejemplo para kalicreína óxido nítrico-sintasa de las células endoteliales Genes estructurales para la inhibición de la proliferación de las células de la musculatura lisa después de la lesión de la capa endotelial, por ejemplo para una proteína antiproliferante, citostática o cito tóxica o para una enzima para la escisión de precursores de agentes citostáticos, formando con ello agentes citostáticos, como ya se ha indicado anteriormente (bajo el término tumor) , y proteínas de fusión de estos compuestos activos junto con anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que son específicos para las células musculares. Genes estructurales para otras proteínas del plasma sanguíneo, por ejemplo para albúmina . desactivador Cl colinesterasa sérica transferrina antitripsina orí Terapia de las enfermedades metabólicas y la enfermedad genética Células diana: células endoteliales células musculares células hepáticas . células epiteliales bronquiales células de estroma, o macrófagos Promotores : no específicos de las células diana, o . específicos de las células diana Genes estructurales, por ejemplo para: el regulador de la conductancia transmembrana (CF- TCR) en asociación con la fibrosis quística el gen de la anemia de Fanconi . sintetasa del uroporfirinógeno III iduronato-2-sulfatasa (mucopolisacaridosis tipo II) /3-glucuronidasa (mucopolisacaridosis VIII) glucocerebrosidasa (enfermedad de Gaucher) fenilalanina-hidroxilasa distrofina (distrofia muscular tipo Duchenne) receptor de insulina hormona del crecimiento humano proteína tensioactiva asociada a SP-A y SP-B receptor de LDL proteína editora de ARNm apolipoproteína B . adenosina-desaminasa g) Inoculaciones Células diana: células musculares, o macrófagos - Promotores : no específicos de las células diana, o específicos de células diana, o específicos de células diana y específicos del ciclo celular - Genes estructurales para la profilaxis de enfermedades infecciosas Las posibilidades de preparar vacunas eficaces convencionalmente son limitadas (Brown, Int. J. Technol . As- sessm. Health Care 10, 161 (1994) , Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 127, 263 (1992); Arnon et al., FASEB J. 6, 3265 (1992) ) . La tecnología de vacunas de ADN se desarrolló consiguientemente. Sin embargo, estas vacunas de ADN suscitan cuestiones con relación a la magnitud de su eficacia (Fynan et al., Int. J. Immunopharm. 17, 79 (1995); Don- nelly et al., Immunol . 2, 20 (1994)). De acuerdo con esta invención, el sistema de expresión autointensificador aumenta la eficacia de las vacunas de ADN. El ADN a seleccionar como sustancia activa es el ADN de una proteína que es formada por el agente infeccioso y que, mediante la provocación de una reacción inmune, es decir por medio de fijación de anticuerpos y/o por medio de los linfocitos T citotóxicos, conduce a la neutralización y/o destrucción del agente. Antígenos denominados de neutralización de esta naturaleza se emplean ya como antígenos para vacunación (véase la revisión en Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327. 263 (1992)). Los estudios siguientes proporcionan ejemplos de secuencias de ADN que codifican antígenos de neutralización: antígeno del virus A de la influenza (Ulmer et al., Science 259, 1745 (1993), Robinson et al., Vaccine 11, 957 (1993), Fynan et al., Int. J. Immunopharm. 17, 79 (1995)) antígenos HIV (Wang et al., PNAS USA 9_0, 4156 (1993)) . antígeno del virus de la rabia (Donnelly et al., Immunol . 2/1, 20 (1994)) antígeno de HSV (virus del herpes símplex) (Fleckenstein et al., Nature 274, 57 (1978)) antígeno de RSV (virus respiratorio sincitial) (Du et al., Bio/Tech. 12, 813 (1994), Hall, Science 265, 1393 (1993) ) antígeno del virus de la parainfluenza (Du et al., Bio/Techn. 12, 813 (1994)) antígeno de rotavirus (Albert et al., J. Clin. Microbiol. 25, 183 (1987), Anderson et al., J. Infect . Dis. 153, 823 (1986), Battaglia et al., J. Infect . Dis. 155, 140 (1987), Chanock et al., J. Infect . Dis. 148. 49 (1983), Dyall-Smith et al., J. Virol. ¿8, 1099 (1981), Glass et al., Science 265., 1389 (1994)) antígeno de VZV (virus zóster de la varicela) (Straus et al., Ann. Intern. Med. 109. 438 (1988), Gershon, Pediatr. Infect . Dis. 2, 171 (1991), Kinchington et al., J. Virol. 64 , 4540 (1990)) antígeno de CMV (citomegalovirus) (Plotkin, Science 2£5, 1683 (1994)) antígeno del virus del sarampión (Kaatz y Kellin, Science 165, 1391 (1994)) antígeno de HPV (papilomavirus humano) (Tindl y Frazer, Curr. Topics. Microbiol. Immunol . 186, 217 (1994)) antígeno de HBV (virus de la hepatitis B) (Valenzuela et al., Nature 280, 815 (1979), Heer-man et al., J. Virol. 52, 396 (1984)) antígeno de HCV (virus de la hepatitis C) (Cerny et al., Curr. Topics. Microbiol. Immunol . 189, 169 (1994), Esteban et al., Progr. Liver. Dis. 10, 253 (1992), Jung et al., Eur. J. Clin. Invest. 24, 641 (1994)) antígeno de HDV (virus de la hepatitis D) (Iwarson, Scand. J. Infect . Dis. 24, 129 (1992), Consolo et al., Nephron. 6_1, 251 (1992)) antígeno de HEV (virus de la hepatitis E) (Iwarson, Scand. J. Infect . Dis. 24, 129 (1992), Consolo et al., Nephron. 61, 251 (1992)) antígeno de HAV (virus de la hepatitis A) (d'Hondt, Vaccine 10., 48 (1992), Andre, J. Infect .

Dis. 171. 33 (1995), Lemon et al., Vaccine 10, 40 (1992), Melnick et al., Vaccine 10, 24 (1992), Flehmig, Baillieres Clin. Gastroenterol. 4, 707 (1990)) antígeno de Vibrio cholera (Levine y Kaper, Vaccine 11, 207 (1993)) antígeno de Borrelia burgdorferi Schaible et al., Immunol . Letters 36, 219 (1993), Wallich et al., Lab. Med. 17, 669 (1993)) antígeno de Helicobacter pylori (Crabtree et al., Lancet 338. 332 (1991), Blaser, J. Infect. Dis. 161. 626 (1990), Cover y Blaser, J. Biol. Chem. 2£7, 10570 (1993), Cover et al., Infect. Immunol. 51, 603 (1990), Dunn et al., J.

Biol. Chem. 2££, 9464 (1990), Dunn et al., Infect . Immunol. 60, 1946 (1992), Lage et al., Acta Gras- troenterol . Belg. 56, (suppl.), 61 (1993), Moley et al., Scand. J. Gastroint. 26 (suppl.) 187) (1991) ) antígeno de la malaria (Nussenzweig y Long, Science 265, 1381 (1994), Maurice, Science 267, 320 (1995), Enders et al., Vaccines 10, 920 (1992), Knapp et al., Infec . Imm. £0, 2397 (1992) ) . Sin embargo, dentro del significado de la inven- ción, sustancias activas de esta naturaleza incluyen también el ADN para un anticuerpo anti-idioti- po, o sus fragmentos fijadores de antígeno, cuyas estructuras de fijación de antígeno (las reacciones determinantes de la complementariedad) consti- tuyen copias de la estructura de la proteína o estructura del carbohidrato del antígeno de neutralización del agente infeccioso. Anticuerpos anti-idiotipo de esta naturaleza pueden, en particular, reemplazar antígenos de car- bohidrato en el caso de agentes infecciosos bacterianos . Anticuerpos anti-idiotipo de esta naturaleza, y sus productos de escisión, han sido revisados por Hawkins et al . , (J. Immunother. 14., 273 (1993)) y Westerink y Apicella (Springer Semminars in Immu- nopathol. 1£, 227 (1993)). Genes estructurales para "vacunas contra tumores" Estos incluyen antígenos de células de tumor. An- tígenos de esta naturaleza han sido revisados, por ejemplo, por Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Munich (1988) y Contrib. to Oncol. 43., Karger Verlag, Munich (1992) . Otros ejemplos están constituidos por los genes para los antígenos siguientes o para anticuerpos anti-idiotípicos correspondientes a los antígenos siguientes: sialil Lewis péptidos de tumores que son reconocidos por las células T proteínas expresadas por oncogenes antígenos de grupo sanguíneo y sus precursores . antígenos de mucina epitelial polimórfica y otras mucinas asociadas a tumores antígenos de proteínas del choque térmico gangliosidos h) La terapia de las enfermedades infecciosas crónicas - Célula diana: célula hepática linfocito y/o macrófago célula epitelial célula endotelial - Promotores : específicos de virus específicos de células específicos de virus o específicos de células y específicos del ciclo celular - Genes estructurales, por ejemplo para una proteína que exhibe efectos citostáticos o citotóxicos. (Ejemplos de proteínas citotóxicas o citostáticas han sido ya citados en la sección titulada terapia tumoral.) . una enzima (a este respecto, véase la sección titulada terapia tumoral) que escinde un precursor de una sustancia antivírica o citotóxica, formando de este modo la sustancia activa. Genes estructurales para proteínas antivíricas . citoquinas y factores de crecimiento que poseen actividad antivírica. Ejemplos de éstos son * IFN-a * IFN- 3 * IFN-? * TNF/3 * TNFa; * IL-1 * TGF3 anticuerpo que tiene una especificidad que desactiva el virus pertinente, o sus fragmentos que contienen VH y VL, o sus fragmentos VH y VL que están conectados por un enlazador, fragmentos que pueden prepararse como se ha descrito ya en la Sección 2) . Ejemplos de anticuerpos contra antígenos víricos son: * anti-HBV * anti-HCV * anti-HSV * anti-HPV * anti-HIV * anti-EBV * anti-HTLV * anti -virus de Coxsackie * anti-virus de Hantaan una proteína de fijación de rev. Estas proteínas se fijan al ARN de rev e inhiben los pasos posteriores a la transcripción dependientes de rev en la expresión del gen retrovírico. Ejemplos de proteínas de fijación de rev son: * RBP9-27 * RBP1-8U * RBP1-8D * pseudogenes de RBP1-8 para ribozimas que digieren el ARNm de genes para proteínas de control del ciclo celular o el ARNm de virus. Ribozimas que son catalíticas para HIV han sido revisadas, por ejemplo, por Christoffer- sen et al., J. Med. Chem. 31, 2033 (1995). Genes estructurales para proteínas antibacterianas Ejemplos de las proteínas antibacterianas son anticuer-pos que neutralizan toxinas bacterianas o que opsonizan bacterias. Ejemplos de estos anticuerpos son anticuerpos contra meningococos C o B E. coli Borrelia Pseudomonas Helicobacter pylori Staphylococcus aureus 7) combíi n ción de genes estructurales idénticos o diferentes La invención se refiere adicionalmente a un sistema de expresión auto-intensificador, en caso apropiado farmacológicamente controlable, en el cual se combinan las secuencias de ADN de dos genes estructurales idénticos o dos genes estructurales diferentes [componentes c) y e')]. Para el propósito de expresar las dos secuencias de ADN, el ADNc de un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) se intercala preferiblemente, como elemento regulador, entre los dos genes estructurales . Ejemplos de secuencias IRES de esta naturaleza han sido descritos ya en la Sección C5) . Dentro del significado de la invención, los siguientes son ejemplos de combinaciones preferidas de genes estructurales para la terapia de tumores diferentes proteínas antiproliferantes, citostá- ticas, citotóxicas, inductoras de inflamación, o enzimas idénticas para escisión del precursor de un agente citostático la terapia de enfermedades autoinmunes diferentes citoquinas o receptores que tienen un efecto sinérgico para inhibir la reacción inmune celular y/o humoral , o TIMPs diferentes o idénticos la terapia de la hematopoyesis deficiente citoquinas diferentes, jerárquicamente consecu i- vas, tales como IL-1, IL-3, IL-6 o GM-CSF y eritropoyetina, G-CSF o trombopoyetina la terapia del deterioro de las células nerviosas un factor de crecimiento neuronal y una citoquina o el inhibidor de una citoquina la terapia de perturbaciones del sistema de coagulación de la sangre y el sistema de circulación de la sangre un agente antitrombótico y un agente fibrinolítico (tPA o uPA) o una proteína (o enzima) antiproliferante, citos- tática o citotóxica y un agente antitrombótico o un agente fibrinolítico vacunaciones un antígeno y una citoquina estimulante de la inmunidad, tal como * IL- lor * IL- 1/3 * IL-2 * GM-CSF * IL-3, o * receptor de IL-4 . antígenos diferentes * de un agente infeccioso o de agentes infecciosos diferentes, o * de un solo tipo de tumor o de tipos de tumores diferentes - terapia de enfermedades infecciosas víricas una proteína antivírica y una proteína citostática o citotóxica anticuerpos contra antígenos de superficie diferentes de un solo virus o de varios virus - terapia de enfermedades infecciosas bacterianas anticuerpos contra antígenos de superficie diferentes y/o toxinas de un organismo 8) Inserción de secuencias de señal v dominios *-?"«.m-»™^ - ___ - Con objeto de facilitar la secreción del producto de expresión del gen estructural, la secuencia de señal homologa que puede estar presente en la secuencia de ADN del gen estructural puede reemplazarse con una secuencia de señal heteróloga que mejora la secreción extracelular. Así, por ejemplo, pueden insertarse la secuencia de señal para inmunoglobulina (posición de ADN = 63 a = 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)) o la secuencia de señal para CEA (posición de ADN = 33 a = 134; Schrewe et al., Mol. Cell Biol. 10, 2738 (1990); Berling et al., Cáncer Res. 50, 6534 (1990) ) o la secuencia de señal de la glicoproteína del virus respiratorio sincitial humano (ADNc para los ami-noácidos = 38 a = 50 ó 48 a 65 ; Lichtenstein et al., J. Gen. Virol. 77, 109 (1996) ) . Alternativamente, o además de la secuencia de señal, puede insertarse una secuencia para un dominio transmembrana con objeto de anclar el compuesto activo en la membrana celular de la célula sometida a transducción que está formando el compuesto activo. Así, por ejemplo, la secuencia transmembrana de factor estimulante de colonias de macrófagos humano (posición de ADN = 1485 a = 1554; Cosman et al., Behring Inst. Mitt. i, 15 (1988)) o la secuencia de ADN para las regiones de señal y transmembrana de la glicoproteína G del virus sincitial respiratorio humano (RSV) (aminoácidos 1 a £3 o sus secuencias parciales, aminoácidos 11 a 61; Vijaya et al., Mol. Cell Biol. 1, 1709 (1988); Lichtenstein et al., J. Gen. Virol. 77, 109 (1996)), o la secuencia de ADN para regiones de señal y transmembrana de la neuraminidasa del virus de la influenza (aminoácidos 7 a 35 o la secuencia parcial de aminoácidos 7 a 27; Brown et al., J. Virol. 62, 3824 (1988)) puede insertarse entre la secuencia promotora y la secuencia del gen estructural . Con objeto de intensificar la traducción, la secuencia de nucleótidos GCCACC o GCCGCC puede, por ejemplo, insertarse en el extremo 3' de la secuen- cia promotora y directamente en el extremo 5' de la señal de iniciación (ATG) de la secuencia de señal o secuencia transmembrana (Kozak, j. Cell Biol. 111, 209 (1989) ) . Sin embargo, la secuencia nucleotídica para un anclaje de glicofosfolípido puede insertarse tam- bien con el propósito de anclar el compuesto activo en la membrana celular de las células sometidas a transducción que están formando el compuesto activo . Un anclaje de glicofosfolípido se inserta en el extremo 3' de la secuencia nucleotídica del gen estructural, siendo posible que esta inserción se efectúe además de la inserción de una secuencia de señal . Anclajes de tipo glicofosfolípido han sido descritos, por ejemplo, para CEA (posición de ADN = 893 a = 1089; Ber-ling et al., Cáncer Res. 50, 6534 (1990)), para N-CAM (Cun-ningham et al., Science 236, 799 (1987')) y para otras proteínas de membrana tales como Thy-1 (Clissold, Biochem. J. 281, 129 (1992)) o CD16 (Selvaray et al . , Nature 3_3_3, 565 (1988)). Ferguson et al., (Ann. Rev. Biochem. 57, 285 (1988)) han publicado una revisión de proteínas de membrana ancladas con glicofosfolípidos . Otra opción para anclaje de compuestos activos en la membrana celular, de acuerdo con la presente invención, es la de utilizar una secuencia de ADN para una proteína de fusión ligando/compuesto activo. La especificidad del ligando de esta proteína de fusión está dirigida contra una estructura de membrana en la membrana celular de la célula diana seleccionada. Ejemplos de ligandos que se fijan a la superficie de las células son anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que están dirigidos contra estructuras en la superficie de, por ejemplo: células endoteliales, con inclusión, en particu- lar, de anticuerpos contra receptores de VGF, o de células musculares, tales como * anticuerpos contra actina o * anticuerpos contra receptores de la angiotensina II, o * anticuerpos contra receptores de factores de crecimiento, por ejemplo contra * receptores de EGF * o contra receptores de PDGF * o contra receptores de FGF * o anticuerpos contra receptores de endotelina A Los anticuerpos monoclonales de múrido se emplearán preferiblemente en forma humanizada. Los fragmentos Fab y fragmentos recombinantes Fv, y sus productos de fusión, se preparan como se ha descrito ya con anterioridad. Los ligandos incluyen, adicionalmente, todos los compuestos activos, tales como citoquinas o moléculas de adhesión, factores de crecimiento, o sus fragmentos o secuencias parciales de los mismos, o mediadores, que se fijan a estruc-turas de membrana o receptores de membrana en la célula particular seleccionada. Ejemplos de estos ligandos son ligandos de células endoteliales, tales como IL-l, PDGF, bFGF, VEGF, TGG/S (Pusztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)) o kinina, y derivados o análogos de kinina. Los ligandos incluyen adi-cionalmente moléculas de adhesión. Moléculas de adhesión de esta naturaleza, tales como Slex, LFA-l, MAC-1, LeCAM-1, VLA-4 o vitronectina, y derivados o análogos de vitronectina, han sido ya descritos para células endoteliales (revisiones en Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119, 483 (1992); Pauli et al., Cáncer Metast. Rev. 1, 175 (1990); Honn et al., Cáncer Metast. Rev. 11, 353 (1992); Varner et al., Cell Ad. Commun. 1, 367 (1995) ) . Los ligandos incluyen también anticuerpos, o sus fragmentos, que están dirigidos contra antígenos específicos de tumores o asociados a tumores en la membrana de la célula tumoral. Anticuerpos de esta naturaleza han sido ya descritos en la Sección C6a) .

La invención se refiere también a una composición que comprende un constructo nuevo de ácido nucleico y una sustancia de acoplamiento j) que tiene un sitio de fijación para la proteína A del componente f) y para la proteína B del compo-nente h) . La sustancia de acoplamiento j ) es preferiblemente una composición farmacéutica, en particular una sustancia que puede penetrar a través de la membrana celular y al interior de la célula, en particular rapamicina, FK506, ciclosporina A, metotrexato, ácido fólico, ácido retinoico, penicilina, 4-hidroxitamoxifeno, tamoxifeno o tetraciclina, o un conjugado tetraciclina/isopropil-/ß-D-tiogalactosido. La presente invención se refiere también a células, en particular células de levadura o células de mamífero, que alojan un constructo nuevo de ácido nucleico, y a un procedí -miento para preparar un nuevo constructo de ácido nucleico en el cual los componentes individuales 'están enlazados unos a otros . La presente invención se refiere también al uso de un nuevo constructo de ácido nucleico para preparar un fármaco destinado a administración local, p.ej. transdérmíca, nasal, oral, gastrointestinal, intrabronquial, intravesicular, intravaginal, intrauterina, subcutánea, intramuscular, intradérmica, periarticular o intraarticular, para administración al fluido cerebroespinal, al cerebro, al hígado, al riñon, al intestino o a la lengua, o para administración intraperitoneal, intrapleural o sistémica, p.ej. intravenosa, intraarte-rial, intraportal o intracardial , para la profilaxis y/o la terapia de tumores, leucemias, enfermedades autoinmunes, inflamaciones, deterioro del sistema nervioso, perturbaciones del sistema de la coagulación sanguínea y el sistema de la circulación sanguínea, enfermedades del metabolismo, deterioro genético, enfermedades infecciosas víricas o bacterianas, y/o hematopoyesis deficiente y/o para vacunación contra infecciones víricas, bacterianas o parasitarias y/o contra tumores, y al uso de una célula de acuerdo con la invención para preparar un fármaco destinado a administración local o sistémica para la profilaxis y/o la terapia de enfermedades.

Descripción de las figuras La Fig. 1 muestra un diagrama dei nuevo constructo de ácido nucleico en su forma más simple. La Fig. 2 muestra un diagrama del constructo de ácido nucleico representado en la Fig. 1 después de haber sido suplementado con el gen codificante de una señal de exportación nuclear (NES) y el gen codificante de un factor de exportación nuclear (NEF) . La Fig. 3 muestra un diagrama del enlace de los componentes c) y d) por medio de un IRES. La Fig. 4 muestra un diagrama del esquema por el cual reaccionan los componentes individuales representados en las Figs. 1-3. La Fig. 5 muestra un diagrama de la ampliación del constructo de ácido -nucleico con genes estructurales adicionales . La Fig. 6 muestra un diagrama de la ampliación del constructo de ácido nucleico con genes adi- cionales para la proteína de factor de transcripción. La Fig. 7 muestra un diagrama del constructo de ácido nucleico representado en la Fig. 3 después del suplemento con los genes codificantes de NES y NEF. La Fig. 8 muestra un diagrama de un módulo promotor farmacológicamente controlable en su forma más simple. La Fig. 9 muestra un diagrama del esquema por el cual reaccionan los componentes individuales representados en la Fig. 8. La Fig. 10 muestra un diagrama de un sistema de expresión autointensificador, farmacológicamente controlable . La Fig. 11 muestra un diagrama del reemplazamiento de los componentes a) y b) con el componente i) y el reemplazamiento del componente d) , junto con la región IRES, con el módulo promotor farmacéuticamente controlable que contiene los componentes e) , f) , g) y h) . La Fig. 12 muestra un diagrama del reemplazamiento de los componentes b' ' ' ) con el módulo promotor farmacéuticamente controlable que contiene componentes e) , f) , g) , h) e i) . La Fig. 13 muestra un diagrama de un sistema de expresión auto- intensificador para la expresión específica del ciclo celular y específica de la célula de 3-glucuronidasa . Las Figs. 14 y 15 muestran diagramas de dos sistemas de expresión que no son auto- intensificado- res . La Fig. 16 muestra un diagrama de un sistema de expresión auto-intensificador, farmacológicamente controlable para la expresión específica del ciclo celular y farmacológicamente controlable de /d-glucuronidasa. La invención se explica de manera más detallada con la ayuda de los ejemplos siguientes. EJEMPLOS 1. Construcción de un sistema de expresión auto-intensificador Se prepara un sistema de expresión auto-intensificador de acuerdo con el esquema representado en la Fig. 13, para el propósito de expresar /3-glucuronidasa de una manera específica del ciclo celular y específica de la célula. Las secuencias de ADN de los componentes individuales se unen entre sí, en la dirección 5' a 3', como sigue: componente a) : la secuencia [secuencia nucleotídica: 5' -CGGACAACTGT- TGACCG-3'] para fijación de la proteína Gal4 (Chasman y Kornberg, Mol. Cell Biol. lfl, 2916 (1990)) - componente b) : la secuencia promotora del gen cdc25C [ácidos nucleicos: -290 a +121; Lucibello et al., EMBO J. 14., 132 (1995); Zwicker et al., Nucí. Acids Res. .23, 3822 (1995); EMBO J. 14, 4514 (1995)) componente c) : la secuencia GCCACC (Kodak, J. Cell Biol. 108. 229 (1989)) el ADNc para el péptido de señal de inmunoglobulina [secuencia nucleotídica = 63 a = 107; Riechmann et al., Nature 122, 323 (1988)) el ADNc para jß-glucuronidasa humana [secuencia nu- cleotídica = 93 a = 1982; Oshima et al., PNAS USA 84, 685 (1987)) componente a' ) : la secuencia para fijación de la proteína Gal4 (Chas- man y Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)) - componente b' ) : la secuencia promotora del gen receptor de VEGF [ácidos nucleicos -1195 a + > 100; Morishita et al., J. Biol. Chem. 270, 27948 (1995)) componente d) : . el ADNc para el dominio de fijación de ADN de la proteína Gal4 [aminoácidos 1 a 147] ; Chasman y Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)) El ADNc para la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T grande de SV40; aminoácidos 126 a 132: PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) el ADNc para el dominio de transactivación de ácido (TAT) VP16 de HSV-l [aminoácidos 406 a 488] ; Triezenberg et al., Genes Developm. 2 , 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen Developm. 5, 190 (1995) ) Los componentes individuales del constructo están enlazados por sitios de restricción adecuados que se introducen concomitantemente en los extremos de los elementos diferentes durante la multiplicación por PCR. Los componentes se enlazan utilizando enzimas, que son específicas de los sitios de restricción, y ADN-ligasas que son conocidas por los expertos. Estas enzimas pueden obtenerse comercialmente.

Células endoteliales de cordón umbilical humano y fibroblastos (Wy-38) que se mantienen en cultivo se someten a transfección con el plásmido descrito utilizando el método conocido por los expertos (Lucibello et al., EMBO J. 14., 132 (1995)), y la cantidad de 3-glucuronidasa que es producida por las células endoteliales se mide utilizando como sustrato 4-metilumbeliferil---glucurónido. Para el propósito de comprobar la especificidad del ciclo celular, se sincronizan células endoteliales en G0/G1 por eliminación de metionina durante 48 horas. El contenido de ADN de las células se determina en un clasificador de células activado por fluorescencia después de ignición con Hoechst 33258 (Hoechst AG, Frankfurt) (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995) ) . Se obtienen los resultados siguientes: No es posible detectar aumento alguno en la .-glucuroni-dasa en los fibroblastos transfectados en comparación con los fibroblastos no transfectados. Las células endoteliales transfectadas expresan acusada-mente más jß-glucuronidasa que lo hacen las células endoteliales no transfectadas. Las células endoteliales proliferantes (ADN > 2S) secretan acusadamente más ß-glucuronidasa que lo hacen las células endoteliales que están sincronizadas en G0/G1 (ADN = 2S) . En consecuencia, el sistema de expresión auto-intensifi-cador que se ha descrito conduce a una expresión específica de las células, y dependiente del ciclo celular del gen estructural de /3-glucuronidasa. La intensidad de la expresión debida al nuevo sistema de expresión auto-intensificador se compara luego con la debida a dos sistemas de expresión que no son auto-intensificadores . Estos últimos sistemas se preparan de acuerdo con los esquemas representados en las Figs . 14 y 15. En este caso, los constituyentes de los componentes b) , b') y c) son idénticos, como se ha descrito ya para el esquema representado en la Fig. 13.

Los componentes individuales del constructo se enlazan por la vía de sitios de restricción adecuados, que se introducen concomitantemente en los extremos de los diferentes elementos durante la multiplicación por PCR. Los componentes se enlazan utilizando enzimas, que son específicas de los sitios de restricción, y ADN-ligasas que son conocidas por los expertos. Estas enzimas pueden obtenerse comercialmente. El constructo nucleotídico que se ha preparado de esta manera se clona en pUC18/19 o vectores de plásmido derivados de Bluescript. Células endoteliales de cordón umbilical humano que se mantienen en cultivo se someten a transfección con los plásmidos descritos utilizando el método conocido por los expertos (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)), y la cantidad de 3-glucuronidasa que es producida por las células endoteliales se mide utilizando como sustrato 4-metilumbeliferil-3-glucurónido. Se obtienen los resultados siguientes: Las células endoteliales proliferantes que se someten a transfección con el plásmido que comprende el constructo de ácido nucleico representado en las Figs. 14) y 15) expresan acusadamente menos 3-glucuronidasa que lo hacen las células endoteliales proliferantes que se transfectan con el plásmido que comprende el nuevo constructo de ácido nucleico represen-tado en Fig. 13) . El sistema de expresión auto-intensificador que se ha descrito da lugar a una expresión notablemente incrementada del gen estructural de 5-glucuronidasa. 2. Construcción de un sistema de expresión auto-intensifi- cador, farmacológicamente controlable Se prepara un sistema de expresión auto-intensificador, farmacológicamente controlable, correspondiente a la estructura representada en el diagrama de la Fig. 11, para la expresión específica del ciclo celular y farmacológicamente controlable de /.-glucuronidasa, como se representa en la Fig. 16.

Las secuencias de ADN de los componentes individuales se unen entre sí en la dirección 5' a 3', como sigue: composición i) : la secuencia [secuencia nucleotídica 5 ' -CGGACAACTGT- TGACCG-3'] para fijación de la proteína Gal4 (Chasman y Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)) el promotor basal de SV40 [nucleótidos 48 a 5191; Tooze (compilador) , DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, N.Y., Cold Spring Harbor Labóratory) ] componente c) : la secuencia GCCACC (Kodak, J. Cell Biol. 108, 229 (1989) ) El ADNc para el péptido de señal de inmunoglobulina [secuencia nucleotídica = 63 a = 107; Riechmann et al., Nature, 332, 323 (1988))- El ADNc para 3-glucuronidasa humana [secuencia nucleotídica = 93 a = 1982; Oshima et al., PNAS USA 84., 685 (1987)) - componente e) : la secuencia para fijación de la proteína Gal (Chasman y Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)) la secuencia promotora del gen cdc25C [nucleótidos -290 a + 121; Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995); Zwicker et al., Nucí. Acids Res. 2_3, 3822 (1995); EMBO J. 14, 4514 (1995)] componente f) : el ADNc para el dominio de activación VP16 del virus de herpes (Greaves et al., J. Virol. 14, 2716 (1990); 65., 6705 (1991)) el ADNc para Fv (A) recombinante anti-ciclosporina A (proteína A) componente g) : corresponde al componente e) - componente h) : el ADNc para Fv (B) recombinante anti-ciclosporina A (proteína B) el ADNc para el dominio de fijación de ADN de la proteína Gal4 [aminoácidos 1 a 147; Chasman y Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990))] el ADNc para la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 [T grande de SV40; aminoácidos 126 a 132: PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)] el ADNc del dominio de transactivación de ácido (TAD) VP16 de HSV-l [aminoácidos 406 a 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2 , 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Developm. 5, 190 (1995)). Anticuerpos contra ciclosporina A se preparan como ha sido descrito por Cacalano et al., Mol. Immunol . 21, 107 (1992) . Para esto, se acopla ciclosporina A a sero-albúmina de bovino utilizando ácido 4-benzoilbenzoico y luz UV. El producto de acoplamiento se administra varias veces por vía subcutánea a ratones Balb/c. Las células del bazo se aislan 14 días después de la última inmunización. Se extrae el ARNm de estas células utilizando un estuche (kit) de extracción de ARNm (procedente de Pharmacia, Freiburg) . Se utiliza luego transcripción inversa para transcribir este ARNm en ADNc con la ayuda de un estuche de síntesis de ADNc y hexaoligonucleó-tidos aleatorios (procedentes de Pharmacia, Freiburg) . Este ADNc sirve como el material de partida para multiplicar la cadena pesada variable, o la cadena ligera variable, de las inmunoglobulinas por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (Saiki et al., Science 230, 1350 (1985)) utilizando iniciadores específicos (Clackson et al., Nature 352 , 624 (1991) ,- Sastry et al., PNAS USA 86, 5728 (1989) ; Ward et al., Nature 141, 544 (1989); Orlandi et al., PNAS USA 16, 3833 (1989) ) . Los iniciadores se utilizan para introducir, al mismo tiempo, sitios de escisión por restricción para clonación de los fragmentos al vector de expresión bacteriana pHENIS (que se deriva de pHENl; Hoogenboom et al., Nucí. Acids Res. Ü, 4133 (1991) ; (véase la Fig. 1) ) . Este vector comprende una secuencia de señal pelB para secreción periplásmica, un marcador myc para detección con el anticuerpo monoclonal 9E10, un marcador histidina para purificación por medio de cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC) así como una región de clonación para la cadena pesada y la cadena ligera, y una secuencia corta que codifica un enlazador gli-cina-serina de 14 aminoácidos de longitud. La fusión con la proteína del gen 3 (G3P) se efectúa también con el propósito de presentación en la superficie de bacteriófagos. Las cadenas pesada y ligera se digieren con las enzimas de restricción apropiadas (VH con Sfil y Shol; VL con ApaLi y Notl) y se clonan consecutivamente al vector. Esto da como resultado un fragmento Fv recombinante monocatenario que comprende la cadena pesada variable y la cadena ligera variable, que están enlazadas covalentemente por medio de una secuencia peptídica corta. En conformidad con la presentación en fago de fragmentos de anticuerpos, los dominios de fijación de antígeno se clonan en la forma de fragmentos scFv (McCafferty et al., Nature 348. 552 (1990) ) , como proteínas de fusión con la proteína de revestimiento filamentosa de bacteriófago g3P, en vectores de fagémido (Breitling et al., Gene 104, 147 (1994)). Se seleccionan fagos de fijación de antígeno en recipientes de plástico cargados con ciclosporina A ("lavado en batea") (Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)). Los fagos que se fijan a la ciclosporina A se clonan y multiplican, y después de ello se seleccionan una vez más sobre recipientes de plástico cargados con ciclosporina A. Después de realizar cuatro veces la selección, se eligen dos clones (proteínas A y B) que no inhiben su fijación mutua a la ciclosporina A. Los fragmentos Fv recombinantes de múrido (proteínas A y B) se humanizan reemplazando específicamente las regiones hipervariables de los anticuerpos humanos con las regiones correspondientes de este fragmento Fv recombinante de múrido (Jones et al., Nature 121, 522 (1987)). El constructo se enlaza por medio de sitios de restricción adecuados, que se introducen en los extremos de los diferentes elementos durante la multiplicación por PCR. En enlace se efectúa utilizando enzimas, que son específicas para los sitios de restricción, y ADN-ligasas que son conocidas por los expertos. Estas enzimas se pueden obtener comercialmente . El constructo nucleotídico que se ha preparado de este modo se clona en vectores de plásmido derivados de pUC18/19 o derivados de Bluescript . Células endoteliales de cordón umbilical humano que se mantienen en cultivo se someten a transfección con el plásmi-do descrito utilizando el método conocido por los expertos (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)), y la cantidad de ß-glucuronidasa que es producida por las células endoteliales, con y sin la adición de ciclosporina A (0,01 a 1,0 µg/ml de medio de cultivo) , se mide utilizando 4-metilumbeliferil- 3-glucurónido como sustrato. Para el propósito de comprobar la especificidad del ciclo celular, se sincronizan las células endoteliales en G0/G1 eliminando metionina durante 48 horas. El contenido de ADN de las células se determina en un clasificador de células activado por fluorescencia después de tinción con Hoechst 33258 (Hoechst AG, Frankfurt) (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995) ) . Se obtienen los resultados siguientes: En ausencia de ciclosporina A añadida, no es posible detectar aumento alguno de ß-glucuronidasa en las células endoteliales transfectadas en comparación con las células endoteliales no transfectadas. A continuación de la adición de ciclosporina A, las células endoteliales transfectadas expresan acusadamente más .-glucuronidasa que lo hacen las células endoteliales no transfectadas . Las células endoteliales proliferantes (ADN > 2S) secretan acusadamente más ß-glucuronidasa que lo hacen las células endoteliales que están sincronizadas en G0/G1 (ADN = 2S) . El sistema de expresión auto-intensificador que se ha descrito da como resultado una expresión del gen estructural de ß-glucuronidasa que es dependiente del ciclo celular y que puede controlarse por adición de ciclosporina A. La intensidad de la expresión conseguida por el nuevo sistema de expresión auto-intensificador y farmacológicamente controlable es mayor que la conseguida por el sistema de expresión no auto-intensificador que se preparó en el ejemplo 1) de acuerdo con el diagrama representado en la Fig. 14.

Claims

REIVINDICACIONES 1.- Un constructo de ácido nucleico que comprende: al menos un primer gen estructural que codifica un compuesto activo; al menos un segundo gen estructural que codifica una proteína de factor de transcripción; y al menos una secuencia de activación constituida por al menos una secuencia que se fija a la proteína de factor de transcripción y al menos una secuencia promotora; en el cual cada secuencia de activación activa la expresión de un gen estructural y la expresión de la proteína de factor de transcripción.
2.- Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual una secuencia de activación está unida al extremo 5' del primer gen estructural, y una secuencia de activación está unida al extremo 5' del gen de la proteína de factor de transcripción.
3. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprende dos secuencias idénticas de fijación de proteína de factor de transcripción y dos promotores no idénticos.
4.- Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un sitio de entrada de ribosoma interno en el cual dicho sitio de entrada de ribosoma interno participa en la activación de la expresión de la proteína de factor de transcripción por la secuencia de activación.
5. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-4, que comprende adicionalmente: una secuencia de señal de exportación nuclear unida como apéndice al primer gen estructural ; un tercer promotor; y una secuencia génica de factor de exportación nuclear.
6.- Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-5, en el cual al menos dos de los genes estructurales están enlazados mutuamente por una secuencia IRES o por una secuencia de activación.
7. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, en el cual al menos dos genes de proteína de factor de transcripción están enlazados mutuamente por una secuencia IRES o por una secuencia de activación.
8. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual dichos genes de la proteína de factor de transcripción no son idénticos, y las proteínas de factor de transcripción producidas a partir de dichos genes se fijan a dichas secuencias de fijación de proteína de factor de transcripción en el constructo de ácido nucleico.
9.- Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-8, que comprende adicionalmente un módulo de control farmacológico que comprende, en orden sucesivo: al menos un promotor; al menos un gen de proteína de fusión que comprende un dominio de activación de una proteína de factor de transcripción, y una secuencia que se fija a una proteína de acopla- miento,- al menos un promotor; al menos un gen de proteína de fusión en el cual la proteína de fusión comprende una proteína de fijación de ADN y una proteína que se fija a una sustancia de aco- plamiento,- y al menos una secuencia de activación que comprende un sitio para la proteína de fijación de ADN.
10. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-9, que comprende: al menos un primer gen estructural que codifica un compuesto activo; al menos un segundo gen estructural que codifica una proteína de factor de transcripción y al menos una secuencia de activación constituida por al menos una secuencia que se fija a dicha proteína de factor de transcripción y al menos un módulo de control farmacológico que comprende, en orden sucesivo, al menos un promotor, al menos un gen de proteína de fusión que codifica un dominio de activación de una proteína de factor de transcripción y que codifica una proteína de sustancia de acoplamiento, al menos un promotor, al menos un gen de proteína de fusión que codifica una proteína de fijación de ADN y que codifica una segunda proteína de sustancia de acoplamiento, y al menos una secuencia de activación que comprende un sitio para la proteína de fijación de ADN, en el cual cada secuencia de activación activa la expresión de un gen estructural y la expresión de la proteína de factor de transcripción.
11.- Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las- reivindicaciones 1-10, que comprende: al menos un primer gen estructural que codifica un compuesto activo; al menos un segundo gen estructural que codifica al menos una primera proteína de fusión que comprende un dominio de activación de una proteína de factor de transcripción, y una secuencia que fija una sustancia de acoplamiento; al menos un tercer gen estructural que codifica al menos una segunda proteína de fusión que comprende una proteí- na que se fija a una sustancia de acoplamiento y una proteína de fijación de ADN; al menos una secuencia de activación constituida por al menos una secuencia que se fija a dicha segunda proteína de fusión acoplada a dicha primera proteína de fusión por una sustancia de acoplamiento y al menos una secuencia promotora; en el cual cada secuencia de activación activa la expresión de al menos uno de dichos genes estructurales .
12. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones l-ll, en el cual dicha secuencia de activación comprende una secuencia para fijación de una proteína de factor de transcripción, la secuencia seleccionada del grupo constituido por el gen de la proteína Gal4, el gen de la proteína LexA, el gen de la proteína del represor de lac I, el gen de la proteína del represor de tetraciclina, y el gen de la proteína ZFHD-l; una secuencia promotora seleccionada del grupo constituido por el promotor c-fos basal en combinación con el dominio de transactivación FP16 de HSV-l, el promotor de ARN U2 sn en combinación con una secuencia del dominio de activación Oct- 2, y el promotor TK de HSV; y un gen de proteína de factor de transcripción seleccionado del grupo constituido por el dominio de fijación de ADN de la proteína Gal4, el dominio de fijación de ADN de la proceína LexA, el dominio de la proteína del represor lac I, el gen de la proteína del represor de tetraciclina y el gen de la proteína ZFHD-l.
13. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual dicha proteína de factor de transcripción comprende la señal de localización nuclear de SV40 y el dominio de transactivación de ácido VP16 de HSV-l.
14. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 9-11, en el cual dicha secuencia codificante de la primera proteína de fusión se selecciona del grupo constituido por el dominio de transactivación VP16 del virus de herpes, la subunidad p65 de factor de transcripción NF-?B, y el dominio rico en glutamina del terminal N de Oct-2 que está enlazado directa o indirectamente al dominio Oct-2 rico en prolina del terminal C de Oct-2; dicha secuencia codificante de la segunda proteína de fusión se selecciona del grupo constituido por el dominio de fijación de ADN de la proteína Gal4, el dominio de fijación de ADN de la proteína LexA, la proteína del represor de lac I, la proteína del represor de tetraciclina y la proteína ZFHD1 ; dicha secuencia de activación que fija una proteína se selecciona del grupo constituido por la proteína Gal4, la proteína LexA, la proteína del represor de lac I, la proteína del represor de tetraciclina y la proteína ZFHDl ,• y en el cual la secuencia de activación que fija una proteína está enlazada a un promotor seleccionado del grupo constituido por el promotor basal de SV40, el promotor c-fos en combinación con el dominio de transactivación VP16 de HSV-1, el promotor U2 sn de ARN en combinación con el dominio de transactivación VP16 de HSV-l o con al menos una secuencia del dominio de activación de Oct-2, y el promotor TK de HSV.
15. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende adicionalmente una señal de localización nuclear de SV40 y un dominio de transactivación de ácido VP16 de HSV-l en el que la señal de localización nuclear de SV40 y el dominio de transactivación de ácido VP16 de HSV-l están presentes en un gen que codifica una proteína de fusión.
16.- Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 9-15, en el que al menos una proteína de fusión comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
17.- Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicho fragmento de anticuerpo comprende un fragmento Fv monocatenario que tiene una cadena variable y una cadena ligera en el que las cadenas variable y ligera están enlazadas covalentemente por una secuencia peptídica corta.
18. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 9-15, en el que al menos una proteína de fusión comprende un dominio de fijación de una proteína existente naturalmente.
19. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-18, en el que al menos un promotor se selecciona del grupo constituido por ARN-polimerasa III, ARN-polimerasa II, promotor e intensificador de CMV, promotor de SV40, un promotor de HBV, un promotor de HCV, un promotor de HSV, un promotor de HPV, un promotor de EPV, un promotor de HTLV, un promotor de HIV, un promotor de cdc25C, un promotor de ciclina A, un promotor de cdc2 , un promotor de bmyb, un promotor de DHFR y un promotor de E2F-1.
20.- Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la señal de exportación nuclear y el factor de exportación nuclear correspondiente se seleccionan de una proteína rev/elemento sensible a rev de un retrovirus seleccionado del grupo constituido por HIV-l, HIV-2, HTLV-l y HBV .
21.- Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-20, en el que el gen estructural codifica un compuesto seleccionado del grupo constituido por inhibidores de la proliferación celular, proteínas citostá-ticas o citotóxicas, enzimas para escisión de profármacos, anticuerpos, proteínas de fusión entre fragmentos de anticuerpo y otras proteínas, citoquinas, -factores de crecimiento, hormonas, receptores de citoquinas y factores de crecimiento, antagonistas de citoquinas, inductores de inflamación, factores inductores de la coagulación, inhibidores de la coagulación, proteínas inductoras de la fibrinólisis, inhibidores de la angiogénesis, factores de angiogénesis, péptidos hipotensores, proteínas del plasma sanguíneo, receptor de insulina, receptor de LDL, enzimas cuya ausencia conduce a enfermedades metabólicas o inmunosupresión, antíge-nos víricos, antígenos bacterianos, antígenos parasitarios o antígenos tumorales, anticuerpos anti-idiotipo para estos antígenos, y una proteína de fusión derivada de cualquier combinación de éstos .
22. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 9-21, en el que al menos dos genes estructurales están enlazados mutuamente por una secuencia IRES o por una secuencia de activación.
23. - Un vector que comprende el constructo de ácido nucleico de una de las reivindicaciones 1-22.
24.- Una composición farmacéutica que comprende un constructo de ácido nucleico de una de las reivindicaciones 1-22 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
25.- Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24, que comprende adicionalmente una sustancia de acoplamiento que se fija a una proteína de fusión.
26.- Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 25, en la que dicha sustancia de acoplamiento atraviesa las membranas celulares y entra en las células.
27.- Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 25, en la que dicha sustancia de acoplamiento se selecciona del grupo constituido por rapamicina, FK506, ciclosporina A, metotrexato, ácido fólico, ácido retinoico, penicilina, 4-hidroxi -tamoxifeno, tamoxifeno, tetraciclina, y un conjugado tetraciclina/isopropil-ß-D-tiogalactosido.
28.- Una célula que comprende un constructo de ácido nucleico como se describe en una de las reivindicaciones 1-22.
29.- Un procedimiento para preparar un constructo de ácido nucleico como se describe en una de las reivindicaciones 1-22, que comprende: enlazar una secuencia que fija una proteína de factor de transcripción a una secuencia promotora para formar una secuencia de activación; y enlazar la secuencia de activación a al menos un gen estructural y al menos un gen que codifica una proteína de factor de transcripción.
30.- El uso de un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-22, de un vector de acuerdo con la reivindicación 23, de una composición farmacéutica de acuerdo con una de las reivindicaciones 24-27 o de una célula de acuerdo con la reivindicación 28 para la prepa-ración de un fármaco con objeto de prevenir o mejorar una enfermedad.
31.- Un método para preparar una composición farmacéutica que comprende : transformar una célula con un constructo de ADN como se describe en una de las reivindicaciones 1-22 in vitro ,- cultivar la célula transformada para obtener copias múltiples del constructo de ADN; y purificar ADN a partir de las células cultivadas