CZ296164B6

CZ296164B6 - Epothilony D, E a F, zpusob jejich výroby a jejich pouzití jako cytostatik a prostredku pro ochranurostlin

Info

Publication number: CZ296164B6
Application number: CZ0175099A
Authority: CZ
Priority date: 1996-11-18
Filing date: 1997-11-18
Publication date: 2006-01-11
Also published as: ES2221692T5; EP0941227B2; IL129558A; EP0941227B1; US20110136185A1; PT941227E; ES2221692T4; DE59712968D1; KR20000053308A; HU229833B1; ATE267197T1; CN1680370A; HUP0000497A2; DE59711647D1; PL333435A1; CA2269118A1; ES2312695T3; CN1196698C; PT1367057E; US20050090535A1

Abstract

Predlozené resení se týká epothilonu D, E a F obecných vzorcu, jejich výroby, jakoz i jejich pouzití k príprave terapeutických prostredku pro pouzitíjako cytostatikum a prostredku pro ochranu rostlin.

Description

Epothilony D, E a F, způsob jejich výroby a jejich použití jako cytostatik a prostředků pro ochranu rostlin

Oblast techniky

Předložený vynález se týká epothilonů D, E a F, jejich výroby, jakož i jejich použití ke zhotovení terapeutických prostředků a prostředků k ochraně rostlin.

Dosavadní stav techniky

Dosud byla vyvinuta řada epothilonů, viz například Nicolaou et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., (1996) 35(20), 2399-2401. V mezi národní patentové přihlášce WO-A-93 10121 jsou popsány epothilony A a B, od nichž se epothilon D liší chybějícím epoxidovým kruhem a epothilony E a F hydroxymethylskupinou na thiazolovém zbytku. Jak bylo zjištěno, tyto odlišnosti vedou k překvapivě lepším vlastnostem uvedených sloučenin.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je epothilon D vzorce

Tuto sloučeninu lze získat tím, že se (a) Sorangium cellulosum DSM 6773 o sobě známým způsobem kultivuje v přítomnosti adsorpční pryskyřice, (b) adsorpční pryskyřice se oddělí od kultury a promyje směsí voda/methanol, (c) promytá adsorpční pryskyřice se eluuje methanolem a eluát se zahustí na surový extrakt, (d) získaný koncentrát se extrahuje ethylacetátem, extrakt se zahustí a rozdělí mezi methanol a hexan, (e) methanolická fáze zahustí na rafínát a tento koncentrát se frakcionuje na sloupci Sephadexu, (f) získá se frakce s produkty metabolismu použitého mikroorganismu, (g) získaná frakce chromatografuje se směsí methanol/voda na C18-reverzní fázi a v časovém pořadí postupně

- po první frakci s epothilonem A a druhé frakci s epothilonem B se získá třetí frakce s prvním dalším epothilonem a

- čtvrtá frakce s druhým dalším epothilonem a izoluje se (hl) epothilon z první další frakce a/nebo (h2) epothilon z druhé další frakce.

Předmětem vynálezu je dále epothilon D sumárního vzorce C₂7H₄₁NO₅S, charakterizovaný 'H- a ¹³C-NMR spektrem podle tabulky 1.

-1 CZ 296164 B6

Epothilon D může být použit pro přípravu sloučenin následujícího vzorce 1, přičemž pro jeho derivatizace se může odkazovat na derivatizačním metody, které jsou popsány

(1) v uvedeném vzorci 1 značí:

R = H, C_b4-alkyl;

R¹, R², R³, R⁴, R⁵ = H, C| ₆-alkyl, C]_₆-acyl-benzoyl, C_{( 4}—trialkylsilyl, benzyl, fenyl, C]_6-alkoxy-, C₆-alkyl, hydroxy- halogenem substituovaný benzyl resp. fenyl;

přičemž také dva ze zbytků R¹ až R⁵ mohou být spojeny se seskupením -(CH₂)_n-, kde η = 1 až 6, a u zbytků obsažených alkyl- nebo acylskupin se jedná o zbytky s přímým nebo rozvětveným řetězcem;

Y a Z jsou buď stejné nebo rozdílné a představují vodík, halogen jako F, Cl, Br nebo I, pseudohalogen jako -NCO, -NCS, nebo N₃, OH, O-(Ci_₆)-acyl, O-(Ci_₆)-alkyl, O-benzoyl. Y a Z mohou být také kyslíkovým atomem epoxidu, přičemž to neplatí u epothilonu A nebo B, nebo jedna z C-C vazeb tvoří dvojnou vazbu C=C.

Takto je možné 12,13-dvojnou vazbu selektivně

- hydrogenovat, například katalyticky nebo diiminem, přičemž se získá sloučenina vzorce 1, kde Y=Z=H; nebo

- epoxidovat, například dimethyldioxiranem nebo peroxykyselinou, přičemž se získá sloučenina vzorce 1, kde Y se Z = O; nebo

- převést na dihalogenidy, dipseudohalogenidy nebo diazidy, přičemž se získá sloučenina vzorce 1, kde Y a Z = halogen, pseudohalogen nebo N₃.

Předmětem vynálezu je rovněž epothilon E vzorce

Předmětem vynálezu je dále epothilon E sumárního vzorce C₂₆H₃₉NO₇S, mající následující

Ή-NMR spektrum (300 MHz, CDC1₃): delta = 2,38 (2-H_a), 2,51 (2-H_b), 4,17 (3-H), 3,19 (6-H),

3,74 (7-H), 1,30-1,70 (8-H, 9-H₂, 10-H₂, 11-H₂), 2,89 (12-H), 3,00 (13-H), 1,88 (14-H_a), 2,07 (14-H_b), 5,40 (15-H), 6,57 (17-H), 7,08 (19-H), 4,85 (21-H₂), 1,05 (22-H₃), 1,32 (23-H₃), 1,17 (24-H₃), 0,97 (25-H₃) 2,04 (27-H₃).

-2CZ 296164 B6

Epothiíon E je biotransformantem epothilonu A, který lze získat tak, že se (a) Sorangium cellulosum DSM 6773 o sobě známým způsobem kultivuje v přítomnosti adsorpční pryskyřice, oddělí od adsorpční pryskyřice a případně celé množství nebo část oddělené kultury se smísí s methanolickým roztokem epothilu A, (b) kultura smísená s epothilonem A se inkubuje a potom smísí s absorpční pryskyřicí, (c) adsorpční pryskyřice se oddělí od kultury, eluuje methanolem a eluát se zahustí na surový extrakt, (d) surový extrakt se rozdělí mezi ethylacetát a vodu, ethylacetátová fáze se oddělí a zahustí na olej, (e) olej se chromatografuje na reverzní fázi za následujících podmínek:

Materiál sloupce: Nucleosil 100 C-18 7 pm

Rozměry sloupce: 250 x 4 mm

Eluent: methanol/voda = 60:40

Průtok: l,2ml/min a frakce obsahující biotransformant, které se dají detegovat UV-zhášením při 254 mm, s R_t - dobou 5,0 min, se oddělí a izoluje se biotransformant.

Výhodné je, jestliže se v kroku (a) oddělí kultura, která se stará tři nebo čtyři anebo více dní.

Výhodné je rovněž, jestliže se v kroku (b) inkubuje jeden nebo dva anebo více dní.

Předmětem vynálezu je rovněž epothiolon F vzorce

Epothiíon F

Předmětem vynálezu je dále epothiíon F sumárního vzorce C₂₇H₄₁NO₇S, charakterizované následujícím ‘H-NMR spektrem (300 MHz, CDC1₃): delta = 2,37 (2-H_a), 2,52 (2-H_b), 4,20 (3-H), 3,27 (6-H), 3,74 (7-H), 1,30 - 1,70 (8-H, 9-H₂, 10-H₂, 11-H₂), 2,78 (13-H), 1,91 (14—H), 2,06 (14-H_b), 5,42 (15-H), 6,58 (17-H), 7,10 (19-H), 4,89 (21-H₂), 1,05 (22-H₃), 1,26 (23-H₃), 1,14 (24-H₃), 0,98 (25-H₃), 1,35 (26-H₃), 2,06 (27-H₃).

Epothiolon F je biotransformantem epothilonu B, který lze získat tak, že se (a) Sorangium cellulosum DSM 6773 o sobě známým způsobem kultivuje v přítomnosti adsorpční pryskyřice, oddělí od adsorpční pryskyřice a případně celé množství nebo část oddělené kultury se smísí s methanolickým roztokem epothilonu B, (b) kultura smísená s epothilonem B se inkubuje a potom smísí s adsorpční pryskyřicí, (c) absorpční pryskyřice se oddělí od kultury, eluuje methanolem a eluát se zahustí na surový extrakt, (d) surový extrakt se rozdělí mezi ethylacetát a vodu, ethylacetátová fáze se oddělí a zahustí na olej, (e) olej na chromatografuje na reverzní fázi za následujících podmínek:

-3CZ 296164 B6

Materiál sloupce: Nucleosil 100 C-18 7 pm

Rozměry sloupce: 250 x 4 mm

Mobilní fáze: methanol/voda = 60:40

Průtok: l,2ml/min a frakce obsahující biotransformant, které se dají detegovat UV-zhášením při 254 nm, s R_t - dobou 5,4 min, se oddělí a izoluje se biotransformant.

Výhodné je, jestliže se v kroku (a) oddělí kultura, která je stará tři nebo čtyři anebo více dní.

Výroba a prostředky

Sloučeniny podle vynálezu, resp. epothilony lze získat ze shora uvedených opatření.

Vynález se dále týká prostředků pro ochranu rostlin v zemědělství, lesnictví a/nebo zahradnictví, sestávajících z jednoho nebo více shora uvedených epothilonů D, E a F, respektive sestávající z jednoho nebo více shora uvedených epothilonů vedle jednoho nebo více obvyklých nosičů a/nebo ředidel.

Konečně se vynález týká terapeutických prostředků, sestávajících z jedné nebo více shora uvedených sloučenin nebo jedné nebo více shora uvedených sloučenin vedle jednoho nebo více obvyklých nosičů a/nebo ředidel. Tyto prostředky mohou vykazovat zejména cytotoxickéaktivity a/nebo imunosupresi a/nebo mohou být nasazovány k potírání maligních tumorů, přičemž je zvlášť preferováno jejich používání jako cytostatika.

Vynález je v následujícím popisem několika vybraných příkladů provedení blíže objasněn a popsán.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1: HPLC analýza XAD eluátu na konci fermentace.

Obrázek 2: Obohacení epothilonů E a F ve fermentační směsi po doplnění směsi epothilonů A a B, analyzováno po inkubaci 48 hodin.

Obrázek 3: Kinetika biotransformace epothilonů A na epothilon E pomocí Sorangium cellulosum SO ce90.

Obrázek 4: Biotransformace epothilonů A na epothilon E.

Obrázek 5: Biotransformace epothilonů B na epothilon F.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Epothilon D spolu s epothilonem C

A. Produkční kmen a podmínky kultury odpovídající základnímu patentu epothilonů DE-B-41 38 042

B. Produkce s DSM 6773

Bylo vzato 75 1 kultury jak je popsáno v základním patentu a použito k naočkování produkčního fermentoru se 700 1 produkčního média z 0,8 % škrobu, 0,2 % glukózy, 0,2 % sojové moučky,

0,2 % extraktu kvasnic, 0,1 % CaCl, 2H₂O, 0,1 % MgSO₄. 7H₂O, 8 mg/1 Fe-EDTA, pH = 7,4 a

-4CZ 296164 B6 případně 15 1 absorpční pryskyřice Amberlite XAD-16. Fermentace trvala 7—10 dní při 30 °C, provzdušňování s 0,1 N 1/m³. Regulací počtu otáček byl pO₂ udržován na 30 %.

C. Izolace

Adsorpční pryskyřice byla od kultury oddělena pomocí 0,7 m², mesh procesního filtru a promytím 3 objemy směsi voda/methanol 2:1 byla zbavena polárních příměsí. Eluováním se 4 objemy methanolu se získal surový extrakt, který byl ve vakuu až po výstupu vodní fáze odpařen. Tato byla třikrát extrahována stejným objemem ethylacetátu. Zhuštění organické fáze poskytlo 240 g surového extraktu, který byl rozdělen mezi methanol a heptan, aby se oddělily lipofilní příměsi. Zahuštěním methanolické fáze ve vakuu bylo získáno 180 g rafínátu, který byl ve třech podílech frakcionován na Sephadexu LH-20 (sloupec 20 x 100 cm, 20 ml/min methanolu). Epothilony jsou v množství 72 g obsaženy ve frakci eluované s retenční dobou 240—300 min. K oddělení Epothilonů bylo ve třech podílech chromatografováno na Lichrosorbu RP-18 (15 pm, sloupec 10x40 cm, mobilní fáze 180 ml/min směsi methanol/voda 65:35). Po Epothilonů A a B byl eluován Epothilon C s R_t = 90 - 95 min a Epothilon D sR_t= 100- 110a po odpaření ve vakuu byly nakonec získány jako bezbarvé oleje ve výtěžku 0,3 g.

D. Fyzikální vlastnosti

Epothilon C, R = H

Epothilon D, R = CH₃

Epothilon C

C₂₆H₂₉NO₅S [477]

ESI-MS: (pozitivní ionty): 478,5 pro [M+H]⁺ ’H- a ¹³C-NMR viz Tabulka 1

DC:R_f=0,82

DC-Alufolie 60 F 254 Měrek, mobilní fáze: dichlormethan/methanol = 9:1

Detekce: UV-zhášení při 254 nm. Postřik činidlem vanilin-kyselina sírová, modrošedé zabarvení při zahřátí na 120 ;C.

HPLC: R_t 11,5 min

Sloupec: Nucleosil 100 C-18 7 pm, 125 x 4 mm

Mobilní fáze: methanol/voda 65:35

Průtok: 1 ml/min

Detekce: diodový systém

Epothilon D

C₂₇H₄₁NO₅S [491]

-5CZ 296164 B6

ESI-MS: (pozitivní ionty): 492,5 pro [M+H]⁺

Ή- a ^l3C-NMR viz Tabulka 1

DC: R_f=0,82

DC-Alufolie 60 F 254 Měrek, mobilní fáze: dichlormethan/meťhanol = 9:1

Detekce: UV-zhášení při 254 nm. Postřik činidlem vanilin-kyselina sírová, modrošedé zabarvení při zahřátí na 120 °C.

HPLC: R_t= 15,3 min

Sloupec: Nucleosil 100 C-18 7 pm, 125 x 4 mm

Mobilní fáze: methanol/voda 65:35

Průtok: 1 ml/min

Detekce: diodový systém

Tabulka 1 ¹H- a ^í3C-NMR data Epothilonu C a Epothilonu D v [O₆] DMSO při 300 MHz

Epothilon C	Epothilon D
H-atom	δ (ppm)	C-atom	δ (ppm)	δ (ppm)	C-atom	δ (ppm)
		1	170,3		1	170,1
2-H_a	2,38	2	38,4	2,35	2	39,0
2-Hb	2,50	3	71,2	2,38	3	70,8
3-H	3,97	4	53,1	4,10	4	53,2
3-OH	5,12	5	217,1	5,08	5	217,4
6-H	3,07	6	45,4	3,11	6	44,4
7-H	3,49	7	75,9	3,48	7	75,5
7-OH	4,46	8	35,4	4,46	8	36,3
8-H	1,34	9	27,6	1,29	9	29,9
9-H_a	1,15	10	30,0	1,14	10	25,9
9-Hb	1,40	11	27,6	1,38	11	31,8'
10-Ha	1,15	12	124,6	1,14*	12	138,3
10-Hb	1,35'	13	133,1	1,35'	13	120,3
11-H_a	1,90	14	31,3	1,75	14	31,6’
11 -H_b	2,18	15	76,3	2,10	15	76,6
12-H	5,38	16	137,3		16	137,2
13-H	5,44	17	119,1	5,08	17	119,2
14-Ha	2,35	18	152,1	2,30	18	152,1
14-Hb	2,70	19	117,7	2,65	19	117,7
15-H	5,27	20	164,2	5,29	20	164,3
17-H	6,50	21	18,8	6,51	21	18,9
19-H	7,35	22	20,8	7,35	22	19,7
21-H3	2,65	23	22,6	2,65	23	22,5
22-Ha	0,94	24	16,7	0,90	24	16,4
23-H₃	1,21	25	18,4	1,19	25	18,4
24-H₃	1,06	27	14,2	1,07	26	22,9
25-H₃	0,90			0,91	27	14,1
26-H₃				1,63
27-H3	2,10			2,11

zaměnitelné přiřazení

-6CZ 296164 B6

Příklad 2

Epothilon A a 12,13-Bisepi-epothilon A z Epothilonu C mg epothilonu A bylo rozpuštěno v 1,5 ml acetonu a smíseno s 1,5 ml 0,07 molámího roztoku dimethyldioxaranu v acetonu. Po 6 hodinách stání při teplotě místnosti bylo odpařeno ve vakuu a produkty byly odděleny pomocí preparativní HLPC (mobilní fáze: methyl-terc-butylether/petrolether/methanol 33:66:1).

Výtěžek:

mg Epothilon A,

R_t = 3,5 min (analytická HPLC, 7 μηι, sloupec 4 x 250 mm, mobilní fáze viz nahoře, průtok 1,5 ml/min) a

mg 12,13-Bisepi-epothilonu A,

R_t = 3,7 min, ESI-MS (pozitivní ionty) m/z = 494 [M+H]⁺, ’Η-NMR v [D₄] methanolu, vybrané signály: delta = 4,32 (3-H), 3,79 (7-H), 3,06 (12-H), 3,16 (13—H), 5,54 (15—H), 6,69 (17-H), 1,20 (22-H), 1,45 (23-H).

12,13-Bisepi-epothilon A, R = H

Příklad 3

Epothilon E a F, nové produkty biotransformace Epothilonů A a B

Produkční kmen:

Produkční kmen Sorangium cellulosum So ce90 byl izolován v červenci 1985 na GBF ze vzorku půdy z břehů Zambezi a 28. 10. 1991 uložen v Německé sbírce pro mikroorganismy (Deutsche Sammlung fůr Mikroorganismem) pod číslem DSM 6773.

Charakterizace producenta jakož i podmínky kultury jsou popsány v: Hófle, G.; N. Bedord, K. Gerth & H. Reichenbach. Epothilone, deren Herstellungsverfahren sowie sie ethaltende Mittel. DE 41 38 042 Al, zveřejněno 27. května 1993.

Tvorba Epothilonu E a F během fermentace:

Typická fermentace probíhá následovně: 100 1 bioreaktor se naplní 60 1 média (0,8 % škrobu,

0,2 % glukózy, 0,2 % sojové moučky, 0,2 % extraktu kvasnic, 0,1 % CaCl₂, 2H₂O, 0,1 % MgSO₄.

7H₂O, 8 mg/1 Fe-EDTA, pH = 7,4). Dodatečně se přidají 2 % absorpční pryskyřice (XAD-16,

Rohm & Haas). Autoklávováním se médium sterilizuje (2 hod., 120 °C). Naočkuje se 10 1 ve stejném médiu (dodatečně 50 mM HEPES-pufru pH 7,4) v třepačce upravené předkultury (160 otáček/min, 30 °C). Fermentuje se při 32 °C s rychlostí míchadla 500 otáček/min a provzdušňováním 0,2 N1 na m³ a hodinu, pH se udržuje na 7,4 přídavkem KOH. Fermentace trvá 7 až 10 dní. Vytvořené Epothilony se během fermentace kontinuálně vážou na adsorpční pryskyřici. Po oddělení kultivačního roztoku (např. prosátím na procesní filtru) se pryskyřice promyje 3 objemy vody a eluuje se 4 objemy methanolu. Eluát se zahustí do sucha a rozpustí v 700 ml methanolu.

HLPC-Analýzy XAD-eluátu:

Proti výchozímu objemu v reaktoru (70 1) byl eluát zkoncentrován 100 : 1. Analýza byla provedena na HPLC zařízení 1090 firmy Hewlett Packard. K dělení obsažených látek byl použit nukleosilový sloupec (125/2 Nucleosil 125-5 Cj₈) firmy Machery-Nagel (Duřen). Eluováno bylo směsí voda/acetonitril s gradientem od počátečních 75:25 až do 50:50 po 5,5 minutách. Tento poměr byl dodržován až do 7.minuty, aby pak až k lO.minutě stoupl na 100% acetonitrilu.

Měřeno bylo při vlnové délce 250 nm a šíři pásu 4 nm. Spektra při diodovém uspořádání byla měřena ve vlnovém rozsahu 200 nm až 400 nm. V XAD-eluátu jsou nápadné dvě nové substance s R_t 5,29 a R_t 5,91, jejichž adsorpční spektra jsou identická se spektry Epothilonů A respektive B (Obrázek 1; E odpovídá A, F odpovídá B). Za udaných fermentačních podmínek se tyto substance tvoří jen ve stopách.

Biotransformace Epothilonů A a B na Epothilon E a F:

Pro cílenou biotransformaci bylo použito 500 ml kultury So ce90 staré 4 dny a uchovávané s adsorpční pryskyřicí. Z té bylo do sterilní 11 Erlenmeyerovy baňky přeneseno 250 ml za ponechání XAD. Potom byla k methanolickému roztoku přidána směs celkem 36 mg Epothilonů a 14 mg Epothilonů B a baňka byla na třepací stolici dva dny při 30 °C a 200 ot/min inkubována. Tvoření Epothilonů E a F bylo analyzováno přímo z 10 μΐ centrifugovaného vzorku kultury (Obrázek 2). Přeměna probíhá pouze za přítomnosti buněk a je závislá na hustotě vložených buněk a čase. Kinetika přeměny je pro Epothilon A znázorněna na obrázku 3.

Izolace Epothilon E a F:

Pro izolaci Epothilonů E a F byly spojeny tři násady z třepacích baněk z biotransformace (viz shora) a byly 1 h třepány s XAD-16. XAD bylo získáno odsátím a bylo eluováno 200 ml methanolu. Eluát byl ve vakuu odpařen na 1,7 g surového extraktu. Tento byl rozdělen mezi 30 ml ethylacetátu a 100 ml vody. Z ethylacetátové fáze bylo po odpaření ve vakuu získáno 330 mg olejovitého zbytku a ty byly v pěti cyklech chromatografovány přes 250 x 20 mm RP-18 sloupec (mobilní fáze: methanol/voda 58:42, detekce 254 nm).

Výtěžek: Epothilon E 50 mg

Epothilon F 10 mg

Biologické působení Epothilonů E:

V buněčných kulturách byla stanovena koncentrace, která redukuje růst o 50 % (IC₅₀) a byla porovnána s hodnotami pro Epothilon A.

Buněčná řada________________________________________________IC₅₀ (ng/ml)________________ ________________________________________________Epothilon E__________Epothilon A

HeLa. KB-3.1 (lidský) 5 1

Myší fibroblasty, L929 20 4

Epothilon E

C₂₆H₃₉NO₇S [509]

ESI-MS: (pozitivní ionty): 510,3 pro [M+H]⁺

-8CZ 296164 B6

DC:R_f=0,58

DC-Alufolie 60 F 254 Měrek, mobilní fáze: dichlormethan/methanol = 9:1

HPLC: R_t = 5,0 min

Sloupec: Nucleosil 100 C-18 7 pm, 250 x 4 mm

Mobilní fáze: methanol/voda 60:40

Průtok: 1,2 ml/min

Detekce: diodový systém 'H-NMR (30 MHz, CDC1₃): delta = 2,38 (2-H_a), 2,51 (2-H_b), 4,17 (3-H), 3,19 (6-H), 3,74 (7-H), 1,30-1,70 (8-H, 9-H₂, 10-H₂, 11-H₂), 2,89 (12-H), 3,00 (13-H), 1,88 (14-H_a), 2,07 (14-H_b), 5,40 (15-H), 6,57 (17-H), 7,08 (19-H), 4,85 (21-H₂), 1,05 (22-H₃), 1,32 (23-H₃), 1,17 (24-H₃), 0,97 (25-H₃), 2,04 (27-H₃).

Epothilon F

C₂₇H₄iNO₇S [523]

ESI-MS: (pozitivní ionty): 524,5 pro [M+H]⁺

DC:R_f=0,58

DC-Alufolie 60 F 254 Měrek, mobilní fáze: dichlormethan/methanol = 9:1

HPLC: R_t = 5,4 min

Sloupec: Nucleosil 100 C-18 7 pm, 250 x 4 mm

Mobilní fáze: methanol/voda 60:40

Průtok: 1,2 ml/min

Detekce: diodový systém

Ή-NMR (300 MHz, CDC1₃): delta = 2,37 (2-H_a) 2,52 (2-H_b), 4,20 (3-H), 3,27 (6-H), 3,74 (7-H), 1,30-1,70 (8-H, 9-H₂, 10-H₂, 11-H₂) 2,78 (13-H), 1,91 (14-H), 2,06 (14-H_b), 5,42 (15-H), 6,58 (17-H), 7,10 (19-H), 4,89 (21-H₂), 1,05 (22-H₃), 1,26 (23-H₃), 1,14 (24-H₃), 0,98 (25-H₃), 1,35 (26-H₃), 2,06 (27-H₃).

Příklad 4

Příprava Epothilonu E a F biotransformací pomocí Sorangium cellulosum SO ce90

1) Provedení biotransformace

Pro biotransformací byla použita kultura Sorangium cellulosum So ce 90, která byla v přítomnosti 2% adsorpční pryskyřice 16 XAD (Rohm a Haas, Frankfurt/M.) čtyři dny při 30 °C a 160 ot./min třepána. Kultivační médium mělo v g/litr destilované vody následující složení: bramborový škrob (Maizena), 8; glukóza (Maizena), 8; tuku zbavená sojová moučka, 2; kvasnicový výtěžek (Marcor), 2; železito-sodná sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové, 0,008; MgSO₄ . 7 H₂O, 1; CaCl₂ . 2 H₂O, 1; HEPES, 11,5. Před autoklávováním bylo pomocí KOH nastaveno pH na 7,4. XAD byla od kultury odsáta na sítu z ušlechtilé oceli (200 pm šířka ok). Bakterie byly sedimentovány centrifugováním 10 min při 10 000 ot./min. a sbalek byl znovu suspendován v 1/5 přesahu kultury. Ke koncentrované suspenzi bakterií byl nyní přidán Epothilon A respektive

-9CZ 296164 B6

Epothilon B v methanolickém roztoku o koncentraci 0,5 g/litr. Kultura byla dále kultivována jak je shora popsáno. Pro analýzu biotransformace bylo v požadovaných časových intervalech odebráno 1 ml vzorku, přidáno 0,1 ml XAD a vzorek byl 30 min třepán při 30 °C. Eluát byl zahuštěn do sucha a znovu rozpuštěn v methanolu. Tento vzorek byl podroben HLPC analýze.

Obrázek 4: Kinetika biotransformace Epothilonu A na Epothilon E.

Obrázek 5: Kinetika biotransformace Epothilonu B na Epothilon F.

2) Příprava Epothilonu E biotransformací 1 g Epothilonu A.

Kmen Sorangium cellulosum So ce90 byl v 8,5 1 nahoře uvedeného média (avšak bez přídavku XAD) na čtyři dny nanesen do 10 litrového bioreaktoru při 30 °C, s počtem otáček 150 ot./min a provzdušňováním 0,1 N 1/m³.

Na to byla kultura pomocí „cros flow“ filtrace zahuštěna na 3 1. K tomu bylo použito 0,6 m²membrány s velikostí pórů 0,3 pm.

Koncentrovaná kultura byla převedena do čtyřlitrového bioreaktoru a byl přidám methanolický roztok 1 g Epothilonu A v 10 ml methanolu. Potom byla kultura po dobu 21,5 h dále kultivována. Teplota obnášela 32 °C, počet otáček míchadla byl 455 ot./min a provzdušňováno bylo 6 1/min. Ke konci kultivace bylo přidáno 100 ml XAD a znovu inkubováno 1 hodinu. XAD byla od buněk oddělena odsátím a důkladně eluována methanolem. Eluát byl analyzován pomocí HLPC.

Bilance Biotransformace:

Epothilon A nasazeno:

Epothilon A po 21,5 h znovu nalezeno:

Epothilon E vytvořený po 21,5 h

Epothilon A úplně odbouraný

100 mg = 100 %

53,7 mg = 5,4 %

661,4 mg = 66,1 % = 28,5 %

Příklad 5

Epothilonu podle vynálezu byly testovány buněčnými kulturami (Tabulka 2) a na podporu polymerizace (Tabulka 3)

Tabulka 2

Testy Epothilonu s buněčnými kulturami

Epothilon	A 493	B 507	C 477	D 491	E 509	F 523
	IC-50	ng/ml]
Myší fibroblasty L 929	4	1	100	20	20	1,5
Řadv buněk lidských tumorů:
HL-60 (leukemie)	0,2	0,2	10	3	1	0,3
K-562 (leukemie)	0,3	0,3	20	10	2	0,5
U-937 (lymforn)	0,2	0.2	10	3	1	0,2
KB-3_Z1 (cervixkarcinom)	1	0,6	20	12	5	0,5
KB-V1 (cervixkarcinom multires)	0,3	0,3	15	3	5	0,6
A-498 (karcinom ledvin)	-	1.5	150	20	20	3
A-498 (karcinom plic)	0,7	0,1	30	10	3	0,1

-10CZ 296164 B6

Tabulka 3

Polymerizační test s Epothilony

Parametr: čas až do poloviny maximální polymerizace kontroly

Měření:	w	X	y	z	střed [s]	střed [%]
Kontrola	200	170	180	210	190	100
Epothilon A	95	60	70	70	74	39
Epothilon B		23	25	30	26	14
Epothilon C	125	76	95	80	94	49
Epothilon D	125	73	120		106	56
Epothilon E	80	60	50	45	59	31
Epothilon F	80	40	30	50	50	26

Standardní test s 0,9 mg Tubulin/ml a koncentrací vzorku 1 μΜ

Polymerizační test je in vitro test s čištěným Tubulinem z prasečího mozku. Vyhodnocení probíhá fotometricky. Polymerizaci podporující substance jako Epothilony zkracují čas, až dojde z poloviny maximální polymerizaci, tj. čím je kratší čas, tím je sloučenina účinnější, w, x, y a z jsou čtyři nezávislé pokusy, relativní účinnost je v posledním sloupci vyjádřena v % kontroly; nejlepší účinnost opět vykazují nejnižší hodnoty. Pořadí v seznamu odpovídá téměř přesně zjištěnému při buněčných kulturách.

Claims

NÁROKY

1. Epothilon D vzorce kde Me je methyl, R = CH₃.

2. Epothilon D podle nároku Ή- a ¹³C-NMR spektrum:

sumárního vzorce C27H41NO5S, mající následující

H-atom δ (ppm) C-atom δ (ppm) 1 170,1 2-H_a 2,35 2 39,0 2-H_b 2,38 3 70,8 3-H 4,10 4 53,2 3-OH 5,08 5 217,4 6-H 3,11 6 44,4 7-H 3,48 7 75,5

- 11 CZ 296164 B6

7-OH 4,46 8 36,3 8-H 1,29 9 29,9 9-H_a 1,14 10 25,9 9-H_b 1,38 11 31,8 10-H_a 1,14 12 138,3 10-H_b 1,35 13 120,3 ll-H_a 1,75 14 31,6 ll-H_b 2,10 15 76,6 12-H 16 137,2 13-H 5,08 17 119,2 14-H_a 2,30 18 152,1 14-H_b 2,65 19 117,7 15-H 5,29 20 164,3 17-H 6,51 21 18,9 19-H 7,35 22 19,7 21-H₃ 2,65 23 22,5 22-H₃ 0,90 24 16,4 23-H₃ 1,19 25 18,4 24-H₃ 1,07 26 22,9 25-H₃ 0,91 27 14,1 26-H₃ 1,63 27-H₃ 2,11

kde R=H.

4. Epothilon E podle nároku 3 sumárního vzorce C₂₆H₃₉NO₇S, mající následující ’Η-NMR spektrum (300 MHz, CDC1₃): delta = 2,38 (2-H_a), 2,51 (2-H_b), 4,17 (3-H), 3,19 (6-H), 3,74 (7-H), 1,30-1,70 (8-H, 9-H₂, 10-H₂, 11-H₂), 2,89 (12-H), 3,00 (13-H), 1,88 (14—H_a), 2,07 (14-H_b), 5,40 (15-H), 6,57 (17-H), 7,08 (19-H), 4,85 (21-H₂), 1,05 (22-H₃), 1,32 (23-H₃), 1,17 (24-H₃), 0,97 (25-Hj) 2,04 (27-H₃).
5. Způsob přípravy epothilonu E, vyznačující se tím, že se (a) Sorangium cellulosum DSM 6773 o sobě známým způsobem kultivuje v přítomnosti adsorpční pryskyřice, oddělí od adsorpční pryskyřice a případně celé množství nebo část oddělené kultury se smísí s methanolickým roztokem epothilu A, (b) s epothilonem A smísená kultura inkubuje a potom smísí s adsorpční pryskyřicí, (c) adsorpční pryskyřice oddělí od kultury, eluuje methanolem a eluát se zahustí na surový extrakt, (d) surový extrakt rozdělí mezi ethylacetát a vodu, ethylacetátová fáze se oddělí a zahustí na olej, (e) olej se chromatografuje na reverzní fázi za následujících podmínek:

-12CZ 296164 B6

Materiál sloupce: Nucleosil 100 C-18 7 pm

Rozměry sloupce: 250 x 4 mm

Eluent: methanol/voda = 60:40

Průtok: 1,2 ml/min a frakce obsahující biotransformant, které se dají detegovat UV-zhášením při 254 nm, s R_t- dobou 5,0 min, se oddělí a izoluje se biotransformant.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se v kroku (a) oddělí kultura, která je stará alespoň tři dny.
7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že se inkubace v kroku (b) provádí alespoň po dobu jednoho dne.
8. Epothilon F vzorce kde R=CH₃.
9. Epothilon F podle nároku 8 sumárního vzorce C27H41NO7S, mající následujícím 'H-NMR spektrem (300 MHz, CDC1₃): delta = 2,37 (2-H_a), 2,52 (2-H_b), 4,20 (3-H), 3,27 (6-H), 3,74 (7-H), 1,30 - 1,70 (8-H, 9-H₂, 10-H₂, 11-H₂), 2,78 (13-H), 1,91 (14-H), 2,06 (14-H_b), 5,42 (15—H), 6,58 (17-H), 7,10 (19-H), 4,89 (21-H₂), 1,05 (22-H₃), 1,26 (23-H₃), 1,14 (24-H₃), 0,98 (25-H₃), 1,35 (26-H₃), 2,06 (27-H₃).
10. Způsob přípravy epothilonů F, vyznačující se tím, že se (a) Sorangium cellulosum DSM 6773 o sobě známým způsobem kultivuje v přítomnosti adsorpční pryskyřice, oddělí od adsorpční pryskyřice a případně celé množství nebo část oddělené kultury se smísí s methanolickým roztokem epothilonů B, (b) inkubuje s epothilonem B smísená kultura a potom smísí s absorpční pryskyřicí, (c) absorpční pryskyřice oddělí od kultury, eluuje methanolem a eluát se zahustí na surový extrakt, (d) surový extrakt rozdělí mezi ethylacetát a vodu, ethylacetátová fáze se oddělí a zahustí na olej, (e) olej chromatografuje na reverzní fázi za následujících podmínek:

Materiál sloupce: Nucleosil 100 C-18 7 pm

Rozměry sloupce: 250 x 4 mm

Mobilní fáze: methanol/voda - 60:40

Průtok: 1,2 ml/min a frakce obsahující biotransformant, které se dají detegovat UV-zhášením při 254 nm, s R_t - dobou 5,4 min, se oddělí a izoluje se biotransformant.
11. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se v kroku (a) oddělí kultura, která je stará alespoň tři dny.

-13CZ 296164 B6
12. Způsob podle nároku 9 nebo 10, vyznačující se tím, že se inkubace v kroku (b) provádí alespoň po dobu jednoho dne.
13. Prostředek pro ochranu rostlin v zemědělství a lesnictví a/nebo zahradnictví, vy znač e 5 n ý t í m , že se sestává z alespoň jedné sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, 8 nebo 9 a popřípadě alespoň jednoho nosiče a/nebo rozpouštědla.
14. Terapeutický prostředek, zvláště pro použití jako cytostatikum, vyznačený tím, že sestává z alespoň jedné sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, 8 nebo 9 a popřípadě ío alespoň jednoho nosiče a/nebo rozpouštědla.