CN1690211B

CN1690211B - 杂交春油料种子油菜及其生产方法

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Publication number: CN1690211B
Application number: CN2005100719970A
Authority: CN
Inventors: G·德博特; M·德博克勒尔
Original assignee: Bayer CropScience NV
Current assignee: Bayer CropScience LP
Priority date: 1999-12-08
Filing date: 2000-12-06
Publication date: 2010-05-12
Anticipated expiration: 2020-12-06
Also published as: CN1690211A; DE60027469T2; CN1409594A; PL356533A1; EP1244348A1; DK1244348T3; US6506963B1; US20100248232A1; US20010029620A1; HK1051295A1; CZ20022367A3; ATE323404T1; AU783406B2; US6563026B2; US7659095B2; UA88861C2; HU225433B1; HUP0203347A3; AU3013301A; PL205071B1

Abstract

本发明涉及转基因春油料种子油菜(springoilsed rape；SOSR)植物、植物材料和种子，其特征在于拥有特异的转化事件。它涉及春油料种子油菜植物，更具体地涉及一对尤其适于产生杂交种子的春油料种子油菜植物。更具体地，一种植物的特征为雄性不育，因为在它的基因组中存在雄性不育基因，而另一种植物的特征为携带育性恢复基因，可阻止雄性不育基因的活性。本发明进一步提供了产生杂交种子的方法、产生转基因SOSR植物油或植物的方法以及鉴定转基因植物、细胞或组织的方法。也描述了用于鉴定包含本发明的原种事件之转基因植物的试剂盒。本发明的SOSR植物将形成杂交种子的能力与最佳总体农业性能、遗传稳定性以及对不同遗传背景的适应性结合起来。

Description

杂交春油料种子油菜及其生产方法

本申请是申请日为2000年12月6日的发明名称为“杂交冬油料种子油菜及其生产方法”的中国专利申请00816880.6(PCT/EP00/12872)的分案申请。

发明领域

本发明涉及春油料种子油菜(spring oilseed rape；SOSR)植物，更具体地涉及一对尤其适于产生杂交种子的春油料种子油菜植物。更具体地，一种植物的特征为雄性不育，因为在其基因组中存在雄性不育基因，而另一种植物的特征为携带可阻止雄性不育基因活性的育性恢复基因。本发明的这对SOSR植物将形成杂交种子的能力与最佳总体农学性能、遗传稳定性以及对不同遗传背景的适应性相结合。

此处引用的所有文献皆列入本文作为参考。

发明背景

转基因在植物中的表型表达由该基因自身的结构及其在植物基因组中的位置来决定。同时转基因在基因组的不同位置存在时，可以不同方式影响植物的总体表型。通过遗传操作对植物从农业上或工业上成功导入商业感兴趣的性状是一个漫长的、受不同因素影响的过程。经遗传转化的植物的实际转化和再生只是一系列选择步骤的第一步，其中所述选择步骤包括广泛的遗传鉴定、育种及野外试验的评估。

油料种子油菜(Oilseed rape，OSR)(欧洲油菜(Brassiea napus)，AACC，2n＝38)为天然杂交产物，其来自油菜(甘蓝(Brassica Oleracea)，CC，2n＝18)和芜菁(芸苔，AA，2n＝20)的种间杂交。冬油料种子油菜在八月的最后10天及九月的前10天播种，并在来年七月收获，其需要一段气候温和的时期进行春化作用。较快生长的春油菜在三月末和四月初播种，并在八月中至九月收获。目前生长的OSR主要类型为低芥酸和高芥酸品种。双低(00)品种含低(通常少于1％)水平的芥酸(发现人类对其难于消化)和低水平的芥子油甙(其使油渣副产品难于被动物消化)。目前“00”品种的用途包括用于人类消耗的油及用于喂养动物的高蛋白质饲料。工业用途包括药物及液压油供给原料。高芥酸油菜(HEAR)品种因为其芥酸含量-在油中的含量一般为50-60％油而被专门种植。HEAR主要的最终用途为产生芥酸酰胺，后者为聚乙烷生产中使用的“增滑剂”。小部分用于产生山萮醇，将其加至蜡样的粗矿物油中以提高后者的流动性。

油料种子油菜植物为两性的，一般60-70％为自花传粉。作为选择基础，杂交体的产生和遗传变异的导入通常依赖于对自然发生现象(例如自身不相容性和细胞质雄性不育)的适应。在OSR育种中未广泛使用人工授粉控制法例如手工去雄或使用杀配子剂，分别是因为它们有限的实用性和高成本。

已开发了用于产生雄性或雌性不育植物的转基因方法，它们提供了有意义的常规技术替代方法。

EP 0,344,029描述了用于获得核雄性不育的体系，其中将植物用雄性不育基因转化，所述雄性不育基因包含例如在绒毡层特异启动子PTA29控制下的编码芽孢杆菌RNA酶的DNA，当该基因掺入植物中后，可选择性破坏绒毡层细胞.用此嵌合基因转化烟草及油料种子油菜植物可导致花粉形成完全受阻的植物(Mariani等，1990，自然(Nature)347：737-741).

为恢复雄性不育植物之子代的育性，开发了这样的体系，其中雄性不育植物与携带育性恢复基因的转基因植物杂交，当育性恢复基因表达时可抑制或阻止雄性不育基因的活性(US 5,689,041；US 5,792,929)。此育性恢复基因被置于指导其至少在表达雄性不育基因的细胞中表达的启动子的控制下。Mariani等(1992，自然357：384-387)表明由pTA29：芽孢杆菌RNA酶基因编码的不育性可被油料种子油菜中嵌合的pTA29：芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因恢复。

De Block和De Brouwer(1993，Planta 189：218-225)描述了欧洲油菜植物花药发育之细胞化学和组织化学分析，其中所述植物只包含嵌合pTA29：芽孢杆菌RNA酶基因或包含pTA29：芽孢杆菌RNA酶基因和pTA29：芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因。

已通过一些方法获得了对芸苔属种的成功转化，包括农杆菌感染(其描述见例如EP 0,116,718和EP 0,270,882)、微粒轰击法(其描述于例如Chen等，1994，理论与应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)88：187-192)及直接的DNA摄入(其描述于例如De Block等，1989，植物生理学(PlantPhysiol.)914：694-701；Poulsen，1996，植物育种(Plant Breeding)115：209-225)。

但前述文献对本发明未起到教导及提示作用。

发明概述

本发明涉及一对尤其适于产生杂交种子的WOSR植物。更具体地，本发明涉及第一种转基因WOSR植物或其种子、细胞或组织和第二种转基因WOSR植物或其种子、细胞或组织，其中前者含有整合入其基因组中的、包含雄性不育基因的表达盒，后者含有整合入其基因组中的、包含育性恢复基因的表达盒，本发明还涉及通过第一种和第二种植物杂交所得到的杂交种子，其含有整合入其基因组中的雄性不育基因和/或育性恢复基因。

在本发明的一个实施方案中，第一种WOSR植物或其种子、细胞或组织包含pTHW107表达盒。在本发明的优选实施方案中，第一种WOSR植物或其种子、细胞或组织包含事件MS-BN1。在本发明的另一个实施方案中，第二种WOSR植物或其种子、细胞或组织包含pTHW1118表达盒。在本发明的优选实施方案中，该WOSR植物或其种子、细胞或组织包含事件RF-BN1。在本发明的一个尤其优选的实施方案中，第一种WOSR植物包含事件MS-BN1，且第二种WOSR植物包含事件RF-BN1，且由它们获得的杂交种子包含事件MS-BN1和RF-BN1或只包含RF-BN1。

本发明涉及转基因WOSR种子或可由此类种子生长出的植物，其基因组DNA具有下列一个或两种特征：

a)基因组DNA可产生选自以下限制性片段组中的至少两组，优选地至少三组，更优选地至少四组，最优选地五组限制性片段组：

i)含两条EcoRI片段的组，一条的长度在2140和2450bp之间，优选地约2266bp，且一条的长度大于14kbp；

ii)含两条EcoRV片段的组，其中一条的长度在1159和1700bp之间，优选地约1.4kbp，且另一条的长度大于14kbp；

iii)含两条Hpal片段的组，一条的长度在1986和2140bp之间，优选地长度约1990bp，且一条的长度在2140和2450bp之间，优选地约2229bp；

iv)含三条AflIII片段的组，一条的长度在514和805bp之间，优选地长度约522bp，且一条的长度在2140和2450bp之间，优选地约2250bp，且一条的长度在2450和2838bp之间，优选地约2477bp；

v)含两条NdeI片段的组，两者的长度均在5077和14057bp之间，优选地一条约为6500bp，且另一条约为10kbp；

其中每一条限制性片段在标准的严紧条件下可与包含PTA29-芽孢杆菌RNA酶序列的3942bp长的片段杂交，其中所述3942bp长的片段可通过用HindIII消化此处描述的质粒pTHW107获得；和/或

b)基因组DNA可产生选自以下限制性片段组中的至少两组，优选地至少三组，更优选地至少四组限制性片段组：

i)含三条BamHI片段的组，其中一条长度在805和1099bp之间，优选地约为814bp，一条长度在1700和1986bp之间，优选地约为1849bp，一条长度在2450和2838bp之间，优选地约为2607bp，且一条长度在5077和14057bp之间，优选地约为6500bp；

ii)含四条EcoRI片段的组，一条片段在805和1159bp之间，优选地约为1094bp，一条长度在1986和2450bp之间，优选地约为2149bp，以及两条长度在5077和14057bp之间，优选地一条约为7000bp，且一条长度约为10kbp；

iii)含两条EcoRV片段的组，其中两者长度均在5077和14057bp之间，优选地一条长度约为5.4kbp，且另一条长度约为8kbp；

iv)含三条HindIII片段的组，其中一条片段的长度在1700和2140bp之间，优选地约为1969bp，且两条长度在2450和2838bp之间，优选地一条长度约为2565bp，且一条长度约为2635bp；

其中每一条限制性片段在标准的严紧条件下可与包含PTA29-芽孢杆菌RNA酶抑制剂序列的2182bp长的片段杂交，其中所述2182bp长的片段可通过用HpaI消化此处描述的质粒pTHW118获得。

本发明涉及WOSR植物的种子或可由此类种子生长出的植物、或其细胞或组织，其基因组DNA具有下列一个或两个特征：

a)基因组DNA可产生至少两组，优选地至少三组，例如至少四组，更优选五组限制性片段组，所述片段组选自在上述a)中描述的、包含在上述a)i)，ii)，iii)，iv)和v)中的限制性片段组，因而选择可包括上述a)中描述的i)，ii)，iii)，iv)和v)的任一组合；和/或

b)基因组DNA可产生至少两组，优选地至少三组，最优选地四组限制性片段组，所述片段组选自在上述b)中描述的、包含在上述b)i)，ii)，iii)和iv)中的限制性片段组，因而选择可包括在上述b)中描述的i)，ii)，iii)和iv)的任一组合。

本发明进一步涉及WOSR种子或可由此类种子生长出的植物，其基因组DNA具有下列一个或两个特征：

c)可以使用基因组DNA，经用聚合酶链反应扩增出长度在260和300bp之间，优选地约为280bp的DNA片段，两条引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No 12和SEQ ID No 19，和/或

d)可以使用基因组DNA，经聚合酶链反应扩增出长度在195和235bp之间，优选地约为215bp的DNA片段，两条引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No 23和SEQ ID No 41。

本发明进一步涉及WOSR种子或可由此类种子生长的植物，其基因组DNA具有上述a)和c)中的特征和/或上述b)和d)中的特征。

本发明涉及WOSR植物的种子或可由此类种子生长出的植物，其基因组DNA具有下列一个或两个特征：

c)可使用基因组DNA，经用聚合酶链反应扩增出长度在260和300bp之间，优选地约为280bp的DNA片段，两条引物分别具有SEQ ID No12和SEQ ID No 19的核苷酸序列。

本发明涉及WOSR植物，优选为雄性不育植物的种子，或可由此类种子生长出的植物，或其细胞或组织，其基因组DNA具有：可产生至少两组，优选地至少三组，更优选地五组限制性片段组，所述片段组选自上述的、包含在上述i)，ii)，iii)，iv)和v)中的限制性片段组，因而选择可包括上述i)，ii)，iii)，iv)和v)的任一组合。

本发明进一步涉及WOSR植物的种子，或可由此类种子生长出的植物，其基因组DNA具有下列一个或两个特征：

b)基因组DNA可产生选自以下限制性片段组中的至少两组，优选地至少三组，更优选地四组限制性片段组：

其中每一条限制性片段在标准的严紧条件下可与包含PTA29-芽孢杆菌RNA酶抑制剂序列的2182bp长的片段杂交，其中所述2182bp长的片段可通过用HpaI消化此处描述的质粒pTHW118获得；和/或

d)可使用基因组DNA，经聚合酶链反应扩增出长度在195和235bp之间，优选地约为215bp的DNA片段，两条引物分别具有SEQ ID No 23和SEQ ID No 41的核苷酸序列。

本发明涉及WOSR植物，优选为育性恢复植物的种子，或可由此类种子生长出的植物、或其细胞或组织，其基因组DNA可产生选自上述的、包含在上述b)i)，ii)，iii)和iv)中的限制性片段组中的至少两组，优选地至少三组，最优选地四组限制性片段组，因而选择可包括上述b)中描述的i)，ii)，iii)和iv)的任一组合。

本发明涉及转基因WOSR植物、细胞、组织或种子，其优选地分别具有上述b)和/或d)这两者的特性。

本发明进一步涉及转基因植物，优选为杂交的育性得以恢复的WOSR植物、细胞、组织或种子，它们是通过将雄性不育植物与具有上述特征的、本发明的育性恢复植物杂交而获得的，因而育性得以恢复的植物、细胞组织或种子具有雄性不育的分子特征和上述育性恢复WOSR植物的特征。本发明进一步涉及转基因植物，优选为杂交WOSR植物、细胞、组织或种子，它们是通过将雄性不育植物与具有上述分子特征的、本发明之育性恢复植物杂交而获得的，因而杂交植物、细胞组织或种子具有上述育性恢复WOSR植物的分子特征。

本发明也涉及保藏于ATCC保藏号为PTA-730的种子、由该种子生长出的植物以及该种子长出的植物之细胞或组织。本发明进一步涉及可通过由保藏于ATCC保藏号为PTA-730的种子长出的WOSR植物的繁殖和/或育种而获得的植物。

本发明进一步涉及产生杂交WOSR种子的方法，其包括将本发明的雄性不育WOSR植物与本发明的育性恢复植物杂交。

本发明进一步涉及包含重组DNA的WOSR植物、植物细胞、植物组织或种子，其中所述重组DNA含有整合入部分染色体DNA的至少一种序列为SEQ ID No 22的转基因和/或至少一种序列为SEQ ID No 34的转基因。

本发明进一步提供了产生WOSR植物的转基因细胞或由其获得的植物的方法，该方法包括将序列特征为SEQ ID No 22的重组DNA分子插入WOSR细胞的部分染色体DNA，并且任选地，由转化的WOSR细胞再生WOSR植物。

本发明进一步提供了产生WOSR植物的转基因细胞或由其获得的植物的方法，该方法包括将序列特征为SEQ ID No 34的重组DNA分子插入WOSR细胞的部分染色体DNA，并且任选地，由转化的WOSR细胞再生WOSR植物。

本发明进一步涉及鉴定包含本发明之原种事件MS-BN1的转基因植物、或其细胞或组织的方法，该方法包括建立的转基因植物或其细胞或组织的基因组DNA的下列一个或两个特征：

c)可使用基因组DNA，根据本文所述的PCR鉴定方法，扩增出长度在260和300bp之间，优选地约为280bp的DNA片段，两条鉴定原种事件的引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No 12和SEQ ID No 19。

本发明进一步涉及鉴定包含本发明之原种事件RF-BN1的转基因植物、或其细胞或组织的方法，该方法包含建立转基因植物或其细胞或组织的基因组DNA的下列一个或两个特征：

其中每一条限制性片段在标准的严紧条件下可与包含PTA29-芽孢杆菌RNA酶抑制剂序列的2182bp长的片段杂交，其中所述2182bp长的片段可通过用HpaI消化此处描述的质粒pTHW118获得，和/或

d)可使用基因组DNA，用此处描述的PCR鉴定方法扩增出长度在195和235bp之间，优选地约为215bp的DNA片段，鉴定该原种事件的两条引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No 23和SEQ ID No 41。

本发明也涉及用于鉴定包含本发明原种事件MS-BN1的植物的试剂盒，所述试剂盒包含核苷酸序列为SEQ ID No.12和SEQ ID No.19的PCR探针。

本发明进一步涉及用于鉴定包含本发明原种事件RF-BN1的植物的试剂盒，所述试剂盒包含核苷酸序列为SEQ ID No.23和SEQ ID No.41的PCR探针。

本发明也涉及用于鉴定生物样本中的原种事件MS-BN1和/或RF-BN1的试剂盒，该试剂盒包含至少一条特异引物或探针，其具有的序列对应于(或互补于)与MS-BN1特定区域具有80％至100％序列同一性的序列，和/或包含至少一条特异引物或探针，其具有的序列对应于(或互补于)与RF-BN1特定区域具有80％至100％序列同一性的序列。优选的探针序列对应于包含MS-BN1和/或RF-BN15’或3’侧翼区部分的特定区域。最优选地，该特异探针具有(或互补于)这样的序列，对于MS-BN1而言，它与SEQ ID No.36或SEQ ID No.38的植物DNA序列具有80％至100％序列同一性或与RF-BN1而言，它与SEQ ID No.39或SEQ ID No.40的植物DNA序列具有80％至100％序列同一性。

优选地，本发明的试剂盒除了包含一条特异性识别MS-BN1和/或RF-BN1的5’或3’侧翼区的引物外，还包含第二条特异性识别MS-BN1和/或RF-BN1的外源DNA序列的引物，以用于PCR鉴定方法。优选地，本发明的试剂盒包含两条(或多条)特异引物，其中一条识别MS-BN1和/或RF-BN1的5’或3’侧翼区中的序列，最优选地，MS-BN1SEQ ID No.36或SEQ ID No.38的植物DNA区域的序列，或对于RF-BN1SEQ ID No.39或SEQ ID No.40的植物DNA区域的序列，且另一条识别MS-BN1和/或RF-BN1的外源DNA中的序列。特别优选地，识别MS-BN15’侧翼区植物DNA序列的引物包含SEQ ID No.19的核苷酸序列。尤其是，识别MS-BN15’侧翼区的植物DNA序列的引物包含SEQ ID No.19的核苷酸序列，识别MS-BN1的外源DNA的引物包含此处描述的SEQ ID No.12的核苷酸序列。尤其优选地，识别RF-BN15’侧翼区的植物DNA序列的引物包含SEQ ID No.41的核苷酸序列。尤其地，识别RF-BN15’侧翼区的植物DNA序列的引物包含SEQ ID No.41的核苷酸序列且识别RF-BN1的外源DNA的引物包含此处描述的SEQ ID No.23的核苷酸序列。

本发明包含的方法和试剂盒可用于不同的目的，例如但不限于下列目的：用于鉴定植物、植物材料或产品中的MS-BN1和/或RE-BN1，其中所述产品例如但不限于包含或衍生于植物材料的食物或饲料产品(新鲜或加工过的)；另外，本发明的方法和试剂盒可用于鉴定转基因植物材料，目的在于将转基因材料和非转基因材料分开；另外，本发明的方法和试剂盒可用于确定含MS-BN1和/或RF-BN1的植物材料之质量(即纯材料百分比)。

应理解本文提及的从属权利要求描述了本发明具体的实施方案。

附图简述

下文以实例方式进行的详述不用于将本发明限制于所述的具体实施方案，其可通过结合附图来理解，附图于此处引用作为参考，其中：

图1：pVE113的质粒图谱

图2：MS-BN1基因组DNA消化后得到的限制性图谱

用Southern印迹分析凝胶的加样顺序：泳道1，用EcoRI消化MS-BN1DNA，泳道2，用EcoRV消化MS-BN1DNA，泳道3，用HpaI消化MS-BN1DNA，泳道4，用AflIII消化MS-BN1DNA，泳道5，用NdeI消化MS-BN1DNA，泳道6，用BamHI消化非转基因WOSR DNA，泳道7，用BamHI消化非转基因WOSR+用BamHI消化对照质粒pTHW1O7DNA.

图3.RF-BN1基因组DNA消化后得到的限制性图谱

用Southern印迹分析凝胶的加样顺序：泳道1，用BamHI消化RF-MS1DNA，泳道2，用EcoRI消化RF-BN1DNA，泳道3，用EcoRV消化RF-BN1DNA，泳道4，用HindIII消化RF-BN1DNA，泳道5，用BamHI消化非转基因WOSR DNA，泳道6，用BamHI消化非转基因WOSR+用BamHI消化对照质粒pTHW118DNA。

图4.用MS-BN1PCR鉴定方法对不同品系的PCR分析

凝胶的加样顺序：泳道1，DNA样本来自包含转基因事件MS-BN1的OSR植物，泳道2，DNA样本来自包含另一转基因事件的OSR植物，泳道3，DNA样本来自野生型OSR，泳道4，阴性对照(水)，泳道5，分子量标志物(100bp梯带)。

图5.用RF-BN1PCR鉴定方法对不同品系的PCR分析

凝胶的加样顺序：泳道1，DNA样本来包含转基因事件RF-BN1的OSR植物，泳道2，DNA样本来自包含另一转基因事件的OSR植物，泳道3，DNA样本来自野生型OSR，泳道4，阴性对照(水)，泳道5，分子量标志物(100bp梯带)。

发明详述

此处所用的术语“基因”指的是任一DNA序列，其包含一些可操作连接的DNA片段，例如启动子和5’非翻译区(5’UTR)，它们一起形成启动子区域，编码区(其编码或不编码蛋白质)以及包含聚腺苷酸化位点的3’非翻译区(3’UTR)。在植物细胞中通常5’UTR、编码区和3’UTR转录为RNA，其在为蛋白质编码基因的情况下被翻译为蛋白质。基因可包括额外的DNA片段，例如内含子。如此处所用，基因座为某个指定基因在植物基因组中的位置。

当提到基因或DNA序列时所用的术语“嵌合”是指这样的基因或DNA序列，其包含至少两种相互间为非天然连接的，且例如来自不同来源的、功能相关的DNA片段(例如启动子、5’UTR、编码区、3’UTR、内含子)。谈到某植物种的“外源”基因或DNA序列指的是在该植物中该基因或DNA序列为非天然发现的，或在该植物种的该基因座中该基因或DNA序列为非天然发现的。此处所用术语“外源DNA”指作为转化的结果而掺入植物基因组的DNA序列。此处所用“转化DNA”指用于转化的重组DNA分子。转化DNA通常包含可将一种或多种特异的特性赋予被转化植物的至少一种“目标基因”(例如嵌合基因)。术语“重组DNA分子”用于例证和可包含分离的核酸分子，其可为DNA且其可通过重组或其它方法获得。

此处所用的术语“转基因”指掺入植物基因组的目的基因。“转基因植物”指在其所有细胞的基因组中包含至少一种转基因的植物。

在本发明的植物中存在的外源DNA优选地包含两种目的基因，更具体地，或为雄性不育基因和除草剂抗性基因，或为育性恢复基因和除草剂抗性基因。

此处所用术语“雄性不育基因”指的是这样的基因，其在植物中表达后，使植物不能产生能育的、能活的花粉。雄性不育基因的实例为包含编码芽孢杆菌RNA酶之DNA序列的基因，其中编码芽孢杆菌RNA酶的DNA序列处于介导其于绒毡层细胞中表达的启动子的控制下。更具体地，本发明的雄性不育基因为此处描述的“TA29-芽孢杆菌RNA酶”。

此处所用的“育性恢复基因”指的是这样的基因，其在含有雄性不育基因的植物中表达后，可阻止雄性不育基因的表型表达，使该植物恢复育性.更具体地，育性恢复基因包含编码可阻止雄性不育基因表型表达的蛋白质或多肽的DNA，其中所述DNA处于介导其至少在表达雄性不育基因的细胞中表达的启动子的控制下.更具体地，本发明的育性恢复基因为此处所述的“TA29-芽孢杆菌RNA酶抑制剂”.

植物基因组中重组DNA分子的掺入通常来自细胞或组织的转化(或来自另一种遗传操作)。掺入的具体位点或是随机的或是事先决定的位置(如果用靶向整合方法的话)。

外源DNA可表征为重组DNA分子在植物基因组中掺入位点的位置和构型。重组DNA在植物基因组中的插入位点也称为“插入位点”或“目标点”。植物基因组中转基因的插入与植物DNA的缺失相关，称为“目标位点缺失”。此处所用的“侧翼区”或“侧翼序列”指的是这样的序列，其为植物基因组的至少20bp序列，优选地至少50bp序列，以及高达5000bp的序列，其位于紧挨着外源DNA的上游且邻近于外源DNA，或位于紧挨着外源DNA的下游且邻近于外源DNA。导致外源DNA随机整合的转化步骤会产生具有不同侧翼区的转化子，对每一次转化而言它们是特有的和唯一的。当转基因通过常规的杂交导入植物时，其在植物基因组中的插入位点或其侧翼区一般不改变。此处所用的“插入区”指的是对应于至少40bp，优选地至少100bp，以及高达超过10000bp的区域，其包含在(未转化的)植物基因组中转基因的上游和下游侧翼区中且包括插入位点(以及可能的目标位点缺失)。考虑到由于种内突变引起的小差异，插入区与包含那个种中指定植物的外源DNA上游和下游侧翼区的序列保持至少85％，优选地90％，更优选地95％，且最优选地100％序列同一性。

目的基因的表达指的是：通过转化，将重组DNA分子-转化DNA-导入(基于部分或全部目的基因的结构和功能)，而赋予植物一个或多个表型特征(例如除草剂抗性)。

“事件”定义为作为遗传操作结果的(人工的)基因座，其携带包含至少一拷贝目的基因的外源DNA。一个事件的一般等位基因状态为外源DNA的存在或缺失。此处所用的“MS”事件和“RF”事件分别指携带“TA29-芽孢杆菌RNA的特征为一个或多个转基因的表达。在基因水平上，事件是植物基因组成的一部分。在分子水平上，事件的特征在于转基因的限制性酶切图谱(例如通过Southern印迹确定)和/或转基因的上游和/或下游侧翼序列，和/或转基因的分子构型。通常用包含至少一种目的基因的转化DNA转化植物，导致多个事件，其中每一个均为唯一的。

此处所用的“原种事件”为基于转基因的表达和稳定性以及与含有它的植物之最佳农艺学特性的相容性而从一组事件选择的事件，其通过用同一转化DNA转化或通过与此类转化所获得的植物回交而获得。因此原种事件选择的标准为一种或多种，优选地两种或多种，有利地为所有下列标准：

a)转基因的存在不降低其它所期望有的植物特性，例如那些与农学特性或商业价值相关的特性；

b)事件的特征在于充分定义的稳定遗传之分子构型，且可开发用于鉴定对照的合适诊断工具；

c)在事件的杂合(或半合子)和纯合子的情况下，转基因中的目标基因在一系列的环境条件下以商业可接受水平显示正确、合适且稳定的空间和时间表型表达，其中携带事件的植物可能处于常规的农业用途；

优选外源DNA与植物基因组的某个位置有关，其中所述位置允许基因掺入所期望的商业遗传背景。

事件作为原种事件的情形通过将原种事件掺入不同的相关遗传背景并且观察例如上述a)，b)和c)中的一个、两个或所有标准而证实.

另外，对于此处描述的编码雄性不育和育性恢复的转基因，对原种事件的选择也取决于这些事件间的相容性，更具体地携带雄性不育事件的植物与携带育性恢复事件的植物杂交所产生的子代中存在两种事件，所述子代具有以下特征：

a)育性恢复表型即雄性育性的充分表型表达，以及

b)在一系列的环境条件下，表型表达为商业可接受的水平，其中携带两个事件的植物可能处于常规的农业用途；

因此“原种事件”指的是包含转基因的基因座，其满足上述标准。植物、植物材料或子代例如种子可在其基因组中包含一个或多个原种事件。

开发用于鉴定原种事件或鉴定包含原种事件的植物或植物材料之“诊断工具”是基于原种事件的特定基因组特性，例如包含外源DNA的基因组区域之特定的限制性图谱和/或转基因侧翼区的序列。此处所用的“限制性图谱”指的是用特定的限制性酶或一组限制性酶酶切植物基因组DNA并在标准的严紧条件下与探针杂交后获得的一组Southern印迹模式，其中所述探针与转基因具有序列相似性。此处所用标准严紧条件指的是此处所述的用于杂交的条件或由Sambrook等(1989)(分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，纽约(Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Second Edition，Cold Spring Harbour Laboratory Press，NY))描述的常规杂交条件，其例如包括以下步骤：1)将植物基因组DNA固定在滤膜上，2)将滤膜用50％甲酰胺，5X SSPE，2X Denhardt’s试剂和0.1％SDS，42℃预杂交1至2小时，或用6X SSC，2X Denhardt’s试剂和0.1％SDS，68℃预杂交1至2小时，3)加入已标记的杂交探针，4)孵育16至24小时，5)用1X SSC，0.1％SDS室温洗滤膜20分钟，6)洗滤膜三次，20分钟，每次在68℃于0.2X SSC，0.1％SDS，以及7)用增感屏将滤膜于-70℃暴露于X-射线胶片24至48小时。

由于(内源)限制性位点在外源DNA掺入之前已存在于植物基因组中，外源DNA的插入将改变基因组的特定限制性图谱。这样由其衍生的特定转化子或子代可通过一种或多种特定的限制性模式鉴定。决定事件的限制性图谱的条件在“限制性图谱鉴定方法”中给出。另外，一旦已对转基因的一个或两个侧翼区进行了测序，可在“PCR鉴定方法”中开发特异性识别这种(这些)序列的PCR-探针。包含原种事件的植物或植物材料可用这些特异引物按照PCR方法通过试验鉴定。

如此处所用“生物样本”为植物、植物材料或含有植物材料的产品之样本。术语“植物”包含在任一成熟阶段的WOSR(欧洲油菜)植物组织以及取自或衍生于任一此类植物的任一细胞、组织或器官，包括(但不限于)任一种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。此处所用的“植物材料”指的是来自或衍生于植物的材料。包含植物材料的产品涉及到食物、饲料或其它用植物材料产生的或可被植物材料污染的产品。应该明白在本发明的上下文中，此类生物材料优选地用于测试MS-BN1和/或RF-BN1特异核酸的存在，暗示样本中存在核酸。因此此处所指的用于鉴定生物样本中的原种事件MS-BN1和/或RF-BN1的方法优选地涉及鉴定包含原种事件生物样本中的核酸。

此处所用的“试剂盒”指的是：以本发明方法实施为目的的一套试剂，更具体地，指的是鉴定生物样本中原种事件MS-BN1和/或RF-BN1的一套试剂.更具体地，本发明试剂盒的一个优选的实施方案包含如上所述的至少一条或两条特异引物.任选地，试剂盒可进一步包含此处PCR鉴定方法中描述的任一其它试剂.另外，根据本发明的另一个实施方案，该试剂盒可包括如上所述的一条特异探针，其与生物样本的核酸特异性杂交以鉴定其中MS-BN1和/或RF-BN1的存在.任选地，该试剂盒可进一步包含任一其它试剂(例如但不限于杂交缓冲液、标记物)，用于用特异探针鉴定生物样本中MS-BN1和/或RF-BN1.

可使用本发明的试剂盒，试剂盒的组分可特异地调节，以用于质量控制(例如种子批次的纯度)，检测植物材料或包含或衍生于植物材料的材料中(例如但不限于食物或饲料产品)的原种事件。

本发明涉及在WOSR中产生一组原种事件，MS-BN1和RF-BN1，包含这些事件的植物，这些植物杂交所获得的子代，衍生于这些事件的植物细胞或植物材料。包含原种事件MS-BN1的植物通过如实施例1所述，用pTHW107转化而获得。包含原种事件RF-BN1的植物也通过如实施例1所述的转化pTHW118而获得。

用于产生原种事件MS-BN1的重组DNA分子包含编码芽孢杆菌RNA酶分子的DNA序列，其在介导其选择性地于绒毡层细胞中表达的启动子的控制下(称为“TA29-芽孢杆菌RNA酶”)。该TA29启动子在OSR中具有“绒毡层选择的”表达模式(De Block和Debrouwer，Planta189：218-225，1993)。TA29-芽孢杆菌RNA酶基因在WOSR植物的表达导致绒毡层被破坏，使植物雄性不育(Mariani等，1990，见上)。用于产生原种事件RF-BN1的重组DNA分子包含编码芽孢杆菌RNA酶抑制剂分子的DNA序列，其在绒毡层特异的启动子的控制下(称为“TA29-芽孢杆菌RNA酶抑制剂”)。在植物中存在“TA29-芽孢杆菌RNA酶”基因时，TA29-芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因在WOSR植物中的表达可阻止芽孢杆菌RNA酶在植物的绒毡层细胞中的活性，阻止了对绒毡层的破坏，并因此在这些植物中恢复育性(Mariani等，1992，见上)。

用于产生原种事件MS-BN1和RF-BN1的重组DNA两者均额外包含编码膦丝菌素乙酰转移酶以及花椰菜花叶病毒(Cauliflower Mosaic Virus)35S启动子的DNA序列，其中编码膦丝菌素乙酰转移酶的序列在35S启动子的控制下(称为“35S-bar”)。该35S启动子在OSR中为“组成型”表达模式，指的是它在大多数植物的生活周期中在大多数细胞类型中显著表达。35S-bar基因在OSR植物的表达赋予其对除草剂化合物的抗性，如膦丝菌素或双丙氨酰膦或草铵膦，或更通常是谷氨酰胺合成酶抑制剂或其盐类或旋光异构体。

包含MS-BN1的WOSR植物或植物材料可根据此处的实施例5中描述的MS-BN1限制性图谱鉴定方法来鉴定。简而言之，WOSR基因组DNA用所选择的下列限制性酶(优选地2至5种)：EcoRI、EcoRV、Ndel、Hpal、AflIII消化，然后转移至尼龙膜并与质粒pTHW107(或包含在其中的T-DNA)的3942bp HindIII片段杂交。然后确定所用的每一种限制性内切酶是否可鉴定出下列片段：

-EcoRI：一个片段在2140和2450bp之间，优选地约2266bp，且一个片段大于14kbp；

-EcoRV：一个片段在1159和1700bp之间，优选地约1.4kbp，且一个片段的长度大于14kbp；

-Hpal：一个片段在1986和2140bp之间，优选地长度约1990bp，且一个片段在2140和2450bp之间，优选地约2229bp；

-AflIII：一个片段在514和805bp之间，优选地长度约522bp，且一个片段在2140和2450bp之间，优选地约2250bp，且一个片段在2450和2838bp之间，优选地约2477bp；

-Ndel：两条片段的长度均在5077和14057bp之间，优选地一条约为6500bp，且另一条约为10kbp；

DNA片段的长度通过与一组已知长度的DNA片段，尤其是与噬菌体λDNA的PstI片段比较来确定。当按照Dellaporta等(1983，PlantMolecular Biology Reporter，1，第3卷，19-21页)的方法提取DNA时，估计大于14kbp的片段的长度在14kbp和40kbp之间。

如果用至少两种，优选地至少三种，尤其是至少四种，更尤其是用所有这些限制性酶消化植物材料后，产生具有上述同样长度的DNA片段，则该WOSR植物确定为拥有原种事件MS-BN1。

包含MS-BN1的植物或植物材料也可用此处实施例5描述的MS-BN1PCR鉴定方法进行鉴定。简而言之，WOSR基因组DNA用引物进行PCR扩增，其中一条引物特异性识别MS-BN1的侧翼序列，优选地识别此处描述的MS-BN1之5’或3’侧翼序列，尤其是引物具有SEQ ID No 19的序列，另一条引物识别转基因中的序列，尤其是引物具有SEQ ID No 12的序列。内源的WOSR引物用作对照。如果植物材料产生在260和300bp间的片段，优选地约280bp，该WOSR植物确定为拥有原种事件MS-BN1。

拥有MS-BN1的植物表型特征为：当它们的基因组中缺乏恢复基因时，它们为雄性不育。雄性不育植物被定义为不能产生能育的、能活的花粉。

拥有MS-BN1的植物例如，可从含有MS-BN1的种子获得，其中所述种子保藏在ATCC，保藏号为PTA-730。此类植物可进一步繁殖以将本发明的原种事件导入相同植物种的其它栽培品种

包含RF-BN1的WOSR植物或植物材料可根据此处的实施例5中描述的RF-BN1限制性图谱的鉴定方法来鉴定。简而言之，WOSR基因组DNA用所选择的下列限制性酶(优选地2至4种)：BamHI、EcoRI、EcoRV和HindIII消化，然后转移至尼龙膜并与质粒pTHW118(或包含在其中的T-DNA)的2182bp Hpal片段杂交。然后确定所用的每一种限制性内切酶是否可鉴定出下列片段：

-BamHI：一个片段在805和1099bp之间，优选地约为814bp，一个片段在1700和1986bp之间，优选地约为1849bp，一个片段在2450和2838bp之间，优选地约为2607bp，且一个片段在5077和14057bp之间，优选地约为6500bp；

-EcoRI：一个片段在805和1159bp之间，优选地约为1094bp，一个片段在1986和2450bp之间，优选地约为2149bp，以及两个片段在5077和14057bp之间，优选地一条约为7000bp，且一条长度约为10kbp；

-EcoRV：两个片段均在5077和14057bp之间，优选地一条长度约为5.4kbp，且另一条长度约为8kbp；

-HindIII：一个片段的长度在1700和2140bp之间，优选地约为1969bp，且两个片段在2450和2838bp之间，优选地一条长度约为2565bp，且一条长度约为2635bp；

DNA片段的长度通过与一组已知长度的DNA片段，尤其是与噬菌体λDNA的PstI片段比较来确定。

如果用至少两种，优选地至少三种，更尤其是用所有这些限制性酶消化植物材料后，产生具有上述同样长度的DNA片段，则该WOSR植物确定为拥有原种事件RF-BN1。

包含RF-BN1的植物或植物材料也可用此处实施例5描述的RF-BN1PCR鉴定方法进行鉴定。简而言之，WOSR基因组DNA用引物进行PCR扩增，其中一条引物特异性识别RF-BN1的侧翼序列，优选地识别此处描述的RF-BN1之5’或3’侧翼序列，尤其是引物具有SEQ ID No 41的序列，另一条引物识别转基因中的序列，尤其是引物具有SEQ ID No 23的序列。内源的WOSR引物用作对照。如果植物材料产生在195和235bp间的片段，优选地约215bp，该WOSR植物确定为拥有原种事件RF-BN1。

拥有RF-BN1的植物特征为：在绒毡层细胞中表达芽孢杆菌RNA酶抑制剂。在植物的绒毡层细胞中芽孢杆菌RNA酶抑制剂的产生显示出对花粉的产生既无益处也无害处(Mariani等，1992，见上)。这样当植物基因组中缺乏雄性不育基因时，该TA29-芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因将不导致可观察到的表型。当植物基因组中存在雄性不育基因时，该TA29-芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因将导致育性恢复，即能育的表型。将具有育性恢复表型的植物定义为这样的植物，尽管在其基因组中存在雄性不育基因，该植物能产生能育的、能活的花粉。

拥有RF-BN1的植物例如可从种子获得，其中所述种子保藏在ATCC，保藏号为PTA-730。此类植物可进一步繁殖和/或用于常规育种方案以将本发明的原种事件导入相同植物种的其它载培品种。

拥有MS-BN1和/或RF-BN1的植物的特征还在于它们的草铵膦耐受性，在本发明的上下文中它们包括耐受除草剂Liberty^TM的植物。Liberty^TM耐受性的定义标准为：在3至4叶阶段(3V to 4V)用至少200克活性成分/公顷(g.a.i./ha)，优选地400g.a.i./ha，也可能高达1600g.a.i./ha喷洒植物时，不杀死该植物。拥有MS-BN1和/或RF-BN1的植物的特征还在于用PAT测定法测出它们的细胞中存在膦丝菌素乙酰转移酶(DeBlock等，1987，见前)。

本发明的WOSR植物可用常规方法培育。35S-bar基因的存在使它们对草铵膦具耐受性。因此在生长此类WOSR植物的田间可通过使用包含草铵膦作为活性成分的除草剂(例如Liberty ^TM)控制杂草。

拥有MS-BN1和/或RF-BN1的植物的特征还在于具有与在美国市售的WOSR品种相当的农学特征。相关的农学特征为：植物高度、杆的强度或硬度、倒伏倾向、冬季顽强度、抗碎性、耐干旱性、抗病性(Black leg，Light leafspot，Sclerotinia)以及谷物生产和产量。

已观察到此处描述的欧洲油菜WOSR植物基因组的插入区存在外源DNA，更具体地在欧洲油菜WOSR植物基因组的这些插入位点处存在外源DNA时，可赋予包含这些事件之植物特别感兴趣的表型和分子特征。更具体地，在这些植物基因组的特定区存在外源DNA可导致转基因稳定的表型表达，而没有显著性危及到植物的任一其它理想的农学特性方面，使得它们尤其适于产生杂交WOSR。这样，对应于SEQ ID No 22和SEQID No 34的插入区，更具体地为其中的MS-BN1和RF-BN1插入位点，显示为尤其适于目的基因的导入。更具体地，MS-BN1(SEQ ID No 22)的插入区和RF-BN1(SEQ ID No 34)的插入区，或其中的MS-BN1和RF-BN1各自的插入位点，尤其适于分别导入包含雄性不育基因和育性恢复基因的质粒，可确保植物中这些基因的每一个或两者的最佳表达，同时不危及到植物的农学特性。

重组DNA分子可通过靶向插入方法特定插入插入区.此类方法为本领域技术人员公知，包含例如用重组酶进行同源重组，其中重组酶例如但不限于来自酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)的FLP重组酶(美国专利5,527,695)，来自大肠杆菌噬菌体P1的CRE重组酶(已公开的PCT专利申请WO 9109957)，来自鲁氏糖酵母(Saccharomyces rouxii)pSRI的重组酶(Araki等，1985，分子生物学杂志(J Mol Biol)182：191-203)，或如美国专利4,673,640中描述的λ噬菌体重组系统。

此处所用关于核苷酸序列(DNA或RNA)的“序列同一性”指的是：具有的相同核苷酸的位置数除以两个序列中的较短序列的核苷酸数目。两个核苷酸序列的排列用Wilbur和Lipmann算法(Wilbur和Lipmann，1983)进行，所用窗口大小为20个核苷酸，字长为4个核苷酸且缺口罚分为4。例如可用IntelligeneticsTM Suite程序(Intelligenetics Inc.，CA)方便地进行计算机辅助分析并解释序列数据，包括上述的序列排列。当此类序列的序列同一性为至少约75％，尤其是至少约80％，更尤其是至少约85％，更尤其是约90％，特别是约95％，更特别是约100％，更特别是完全一致时，序列被表示为“基本相似”。这样当RNA序列被说成是与DNA序列基本相似或具有某种程度的序列同一性时，应清楚DNA序列中的胸腺嘧啶(T)认为与RNA序列中的尿嘧啶(U)是相同的。

此处所用的“包含”可解释为使所述特征、整数、步骤或组成的存在如所指的具体化，但不排除另外的一个或多个特征、整数、步骤、组成或组的存在。这样例如包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质可包含较实际所引用的要多的核苷酸或氨基酸，即包括在较大的核酸或蛋白质中。包含功能上或结构上确定的DNA序列之嵌合基因可包含额外的DNA序列等。

下列实例描述了拥有原种事件MS-BN1和RF-BN1的WOSR植物的产生及特征。

除非另外指出，所有的重组DNA技术均按照描述的标准方法进行，描述见Sambrook等(1989)，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，纽约以及Ausubel等，(1994)分子生物学最新方法(CurrentProtocols in Molecu1ar Biology)，第1和2卷，最新方法，美国。植物分子研究的标准材料和方法的描述见BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK R.D.D.Croy出版的植物分子生物学(Plant Molecular Biology)Labfax(1993)。

在描述和实施例中，参照以下序列：

SEQ ID No 1：质粒pTHW107

SEQ ID No 2：质粒pTHW118

SEQ ID No 3：引物248

SEQ ID No 4：引物249

SEQ ID No 5：引物247

SEQ ID No 6：引物250

SEQ ID No 7：引物251

SEQ ID No 8：引物254

SEQ ID No 9 引物258

SEQ ID No 10：引物SP6

SEQ ID No 11：引物T7

SEQ ID No 12：引物201(BNA01)

SEQ ID No 13：包含MS-BN15’侧翼区的序列

SEQ ID No 14：引物611

SEQ ID No 15：引物259

SEQ ID No 16：引物260

SEQ ID No 17：引物24

SEQ ID No 18：包含MS-BN13’侧翼区的序列

SEQ ID No 19：引物51(BNA02)

SEQ ID No 20：引物48

SEQ ID No 21：包含MS-BN1目标位点缺失的序列

SEQ ID No 22：插入区MS-BN1

SEQ ID No 23：引物193(BNA03)

SEQ ID No 24：包含RF-BN15’侧翼区的序列

SEQ ID No 25：引物286

SEQ ID No 26：引物314

SEQ ID No 27：引物315

SEQ ID No 28：引物316

SEQ ID No 29：引物288

SEQ ID No 30：包含RF-BN13’侧翼区的序列

SEQ ID No 31：引物269

SEQ ID No 32：引物283

SEQ ID No 33：引物284

SEQ ID No 34：整合区RF-BN1

SEQ ID No 35：引物57

SEQ ID No 36：包含WOSR中MS-BN15’侧翼区的序列

SEQ ID No 37：引物68

SEQ ID No 38：包含WOSR中MS-BN13’侧翼区的序列

SEQ ID No 39：包含WOSR中RF-BN15’侧翼区的序列

SEQ ID No 40：包含WOSR中RF-BN13’侧翼区的序列

SEQ ID No 41：引物268(BNA04)

SEQ ID No 42：引物BNA05

SEQ ID No 43：引物BNA06

实施例

实施例1.用雄性不育基因和恢复基因转化欧洲油菜

a)构建包含在绒毡层特异启动子控制下的芽孢杆菌RNA酶基因的嵌合DNA(pTHW107)

质粒pTHW107(SEQ ID No.1)基本上衍生自中间载体pGSV1.PGSV1自身衍生自pGSC1700(Cornelissen和Vandewieue，1989)，但包含人工T-区，该人工T-区由pTiB6S3的TL-DNA之左和右边界序列和多接头克隆位点组成，允许在T-DNA边界重复序列之间插入嵌合基因.pGSV1载体在质粒的主框架上提供芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因并提供用于在E.coli中表达的调节信号.

表1对包含在pTHW107边界重复序列之间的DNA进行了充分描述：

表1：质粒pTHW107的T-DNA

nt位置	方向	描述及参考文献
nt位置	方向	描述及参考文献	1-25		来自pTiB6S3的TL-DNA之右边界重复序列(Gielen等(1984)The EMBO Journal 3：835-846).
26-97		合成的多接头衍生序列	1-25
26-97		合成的多接头衍生序列	309-98	逆时针	pTiB6S3的TL-DNA基因7的3′非翻译末端(3′g7)(Velten和Schell.(1985)核酸研究(Nucleic AcidsResearch)13：6981-6998；Dhaese等(1983)TheEMBO Journal 3：835-846).
310-330		合成的多接头衍生序列	309-98	逆时针
310-330		合成的多接头衍生序列	882-331	逆时针	吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的双丙氨酰膦抗性基因(bar)的编码序列(Thompson等(1987)The EMBO Journal 6：2519-2523)。野生型bar基因编码区N-末端的两个密码子已分别用密码子ATG和GAC替换。
2608-883	逆时针	拟南芥(Arabidopsis thaliana)的atS1A核酮糖-1，5-磷酸氢盐羧化酶小亚单位基因的启动子(PssuAra)(Krebbers等(1988)植物分子生物学11：745-759)。	882-331	逆时针
2608-883	逆时针		2609-2658		合成的多接头衍生序列
2919-2659	逆时针	来自pTiT37中T-DNA的胭脂碱合成酶基因3′非翻译末端(3′nos)的260bp TaqI片段并包含植物聚腺苷酸化信号(Depicker等(1982)，分子和应用遗传学杂志(Journal of Molecular and Applied Genetics)1：561-573).	2609-2658		合成的多接头衍生序列
2919-2659	逆时针		2920-3031		解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的芽孢杆菌RNA酶编码序列的3′非翻译区下游

nt位置	方向	描述及参考文献
nt位置	方向	描述及参考文献	3367-3032	逆时针	解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶基因编码区(Hartley(1988)分子生物学杂志202：913-915).
4877-3368	逆时针	来自烟草(Nicotiana tabacum)的花药特异基因TA29的启动子区。该启动子包含从ATG起始密码子起始的1.5kb上游序列(Seurinck等(1990)核酸研究18：3403).	3367-3032	逆时针	解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶基因编码区(Hartley(1988)分子生物学杂志202：913-915).
4877-3368	逆时针		4878-4921		合成的多接头衍生序列
4922-4946		来自pTiB6S3的TL-DNA之左边界重复序列(Gielen等(1984)The EMBO Journal 3：835-846).	4878-4921		合成的多接头衍生序列

b)构建包含在组成型启动子控制下的芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因的嵌合DNA(pTHW118)

质粒pTHW118(SEQ ID No.2)也基本上衍生自中间载体pGSV1(描述见上)。表2给出了包含在pTHW118边界重复序列之间的DNA的充分描述：

表2：质粒pTHW118的T-DNA

nt位置	方向	描述及参考文献
nt位置	方向	描述及参考文献	1-25		来自pTiB6S3之TL-DNA的右边界重复序列(Gielen等(1984)The EMBO Journal 3：835-846).
26-53		合成的多接头衍生序列	1-25
26-53		合成的多接头衍生序列	54-90		TL-DNA在右边界重复序列的残留序列。
91-97		合成的多接头衍生序列	54-90		TL-DNA在右边界重复序列的残留序列。
91-97		合成的多接头衍生序列	309-98	逆时针	pTiB6S3的TL-DNA基因7的3′非翻译末端(3′g7)(Velten和Schell.(1985)核酸研究13：6981-6998；Dhaese等(1983)The EMBO Journal 3：835-846).
310-330		合成的多接头衍生序列	309-98	逆时针

nt位置	方向	描述及参考文献
nt位置	方向	描述及参考文献	883-331	逆时针	吸水链霉菌的双丙氨酰膦抗性基因(bar)的编码序列(Thompson等(1987)The EMBO Journal 6：2519-2523)。野生型bar编码区N-末端的两个密码子已分别用密码子ATG和GAC替换。
2608-883	逆时针	拟南芥的atS1A核酮糖-1，5-磷酸氢盐羧化酶小亚单位基因的启动子(PssuAra)(Krebbers等(1988)植物分子生物学11：745-759).	883-331	逆时针
2608-883	逆时针		2609-2658		合成的多接头衍生序列
2919-2659	逆时针	来自pTiT37中T-DNA的胭脂碱合成酶基因3′非翻译区末端(3′nos)的260bp TaqI片段并包含植物聚腺苷酸化信号(Depicker等人(1982)分子和应用遗传学杂志1：561-573).	2609-2658		合成的多接头衍生序列
2919-2659	逆时针		2920-2940		合成的多接头衍生序列
2941-2980		解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶抑制剂编码序列下游的3′非翻译区	2920-2940		合成的多接头衍生序列
2941-2980		解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶抑制剂编码序列下游的3′非翻译区	3253-2981	逆时针	解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因的编码区(Hartley(1988)分子生物学杂志202：913-915).
4762-3254	逆时针	烟草花药特异基因T29的启动子区。该启动子包含从ATG起始密码子起始的1.5kb上游序列(Seurinck等人(1990)核酸研究18：3403)。	3253-2981	逆时针	解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因的编码区(Hartley(1988)分子生物学杂志202：913-915).
4762-3254	逆时针		4763-4807		合成的多聚接头衍生序列
4808-4832		来自pTiB6S3的TL-DNA之左边界重复序列(Gielen等(1984)The EMBO Journal 3：835-846).	4763-4807		合成的多聚接头衍生序列

c)欧洲油菜的转化

转化欧洲油菜所用载体系统如Deblaere等(1985，1987)所述。该载体系统由农杆菌菌株和两个质粒成分组成：1)非致瘤性Ti-质粒(pGV4000)和2)基于质粒pGSV1的中间克隆载体。已缺失T-区的非致瘤性Ti-质粒携带vir基因，它是将克隆在第二个质粒上的人工T-DNA转移至植物基因组所需要的。由这些成分之间三亲杂交形成的农杆菌菌株可用于植物转化。

除小植株再生外，所有阶段均用膦丝菌素(PPT)进行选择，缺乏PPT时进行小植株再生可促进其生长。这样产生了一组原初转化体(T₀代植物)。

实施例2.事件的产生

2.1.转基因事件的鉴定

2.1.1.MS事件的Southern印迹分析

用标准的Southern印迹分析检查转基因的存在和基因插入数。按照Dellaporta(1983，植物分子生物学报告者(Plant Molecular BiologyReporter)，1，第3卷，19-21页)或Doyle等，1987，植物化学通讯(Phytochem.Bull.)19：11)从1g发芽组织分离总基因组DNA并用限制性酶SacI消化。在T-DNA片段中SacI具有唯一的限制性酶切位点，位于芽孢杆菌RNA酶和bar构建体之间。用以下两条探针进行Southern分析：

“芽孢杆菌RNA酶”探针：质粒pVE113的478bp PstI-EcoRI片段

“bar”探针：质粒pDE110的546bp NcoI-BglII片段

质粒pVE113和pDE110分别如图1和WO 92/09696所述。

MS事件与芽孢杆菌RNA酶探针杂交产生一条12Kb条带，而与bar探针杂交产生一条14Kb条带。

相关条带的深浅提供了植物是否与转基因位置同源或异源的指征。发现这两个事件为简单插入。这一点可通过以下事实证实：转基因的分离模式可用简单基因瘤的孟德尔遗传解释。

2.1.2.RF事件的Southern印迹分析

用标准的Southern印迹分析检查转基因的存在和基因插入数。从1g发芽组织分离总基因组DNA(按照Doyle等1987，植物化学通讯19：11)并用限制性酶SacI消化。在T-DNA片段中SacI具有唯一的限制性酶切位点，位于芽孢杆菌RNA酶和bar构建体之间。用以下两条探针进行Southern分析：

“芽孢杆菌RNA酶抑制剂”探针：质粒pVE113的436bpHindIII-PstI片段

“bar”探针：质粒pDE110的546bp NcoI-BglII片段

RF事件与芽孢杆菌RNA酶抑制剂探针杂交产生一条3Kb条带，而与bar探针杂交产生一条14Kb片段。

相关条带的深浅提供了植物是否与转基因位置同源或异源的指征。发现一些事件为简单插入。这一点可通过以下事实证实：转基因的分离模式可用简单基因瘤的孟德尔遗传解释。

2.1.3.总体的植物表型及农业特性

用一系列的表型性状评估含MS and RF事件的T₁植物，包括高度、杆的强度或硬度、倒伏倾向、冬季顽强度、抗碎性、耐干旱性、抗病性(Blackleg，Light leafspot，Sclerotinia)以及谷物生产和产量。

与未转化的品种及一系列油料种子油菜栽培品种比较，该品系所显示出的农学特征被评估为相似(或有所改变)。在一些情况下，植物分离用于对一个或多个上述性状进行体细胞克隆变异。除非这导致商业上感兴趣的表型性状的导入，否则弃去这些植物。

2.2.携带MS或RF性状之品系的产生

从组织培养物过渡成不同的T₀半合子小植株(“Ms/-“或“Rf/-“)，转移至温室土壤.用southern印迹分析检查转基因的存在及拷贝数(如上所述).允许植物开花，并分别评估花的不育或育性.T₀植物与野生型植物(-/-)杂交以产生T1种子(MsT1和RfT1)。在温室中种植并生长T1种子。评估植物对草铵膦铵盐的耐受性。也评估Ms-T1植物的不育/育性分离(在未经喷洒的植物中)，同时检查Rf-T1植物的育性花。

使包含转基因的Ms-T1植物与育性恢复基因纯合的试验植物(Rf/Rf)杂交，以产生MsRf-F1种子。在温室种植该种子(Ms/-，Rf/-以及-/-，Rf/-)并喷洒Liberty^TM。评估剩下的F1子代育性/不育分离，以测试在欧洲油菜中是否雄性不育特性可被足够地恢复(育性接近100％)。

选择最佳事件用于进一步试验。Ms-T₁植物与纯合的育性恢复植物杂交，并在田间种植种子。评估植物对Liberty^TM除草剂的耐受性(以800克活性成分/公顷(g.a.i./ha)，给农民的推荐剂量为400g.a.i./ha)，评估育性/不育分离及评估总体的表型特征。与野生型同基因的对照比较，选择育性100％恢复的且其表型或农学特性未观察到负罚分(详见(d))的品系。

使包含转基因的Rf-T1植物与包含雄性不育基因的试验植物(Ms/-)杂交，以产生F1种子。将该种子于温室种植，喷洒Liberty^TM并评估育性的恢复(接近100％)。

同时使Rf-T1植物自花授粉以产生S1。该S1植物于温室生长，喷洒Liberty^TM并再次自花授粉以产生S2；从S2选择纯合子个体。

2.3.MS和RF事件的结合

在温室中，将已选择的Ms-T1植物与已选择的Rf-S2事件杂交，进行育性恢复试验。将种子重新种植在温室，植物喷洒Liberty^TM并检查花的育性。

2.4.在不同的遗传背景及在不同位置上试验MS和RF事件

将已选择的事件导入两个杂合差异的不同遗传背景，以证实在任一受试背景下MS和RF事件均可发挥作用并对产量和质量无负罚分。

同时对已选择的MS和RF事件在四个或五个不同的环境中测试，以确保环境和MS或RF事件之间没有消极的相互作用。

在下一阶段，在田间进行了更深入的试验，用已选择的MS和RF事件产生杂交种子。使已选择的MS事件在其最初背景以及在两个不同的和杂合差异的背景下与已选择的RF事件杂交。评估F1杂种对Liberty^TM的抗性、育性以及总的农学特性(产量和质量)。

2.5.原种事件的选择

在产生转基因MS品系的过程中，上述选择步骤产生了一些原种事件，其可显示转基因的最佳表达，即对草铵膦铵盐的抗性、雄性不育表型以及对于用纯合恢复品系更具体地已选择的RF原种事件完全恢复育性的易感性。

在产生转基因RF品系的过程中中，上述选择步骤产生了一些原种事件，其可显示转基因的最佳表达，即对草铵膦铵盐的抗性以及F1与携带雄性不育基因，更具体地为已选择的MS原种事件的植物杂交后恢复育性的能力。

实施例3：将已选择的候选原种事件导入WOSR

如上所述于欧洲油菜中产生的一些MS和RF原种事件通过反复与Drakkar品种植物回交而导入WOSR栽培品种。

检查植物并确定：

a)外源DNA的存在并不降低其它所期望有的植物特性，例如那些与农学特性或商业价值相关的特性；

b)事件的特征在于分定义的稳定遗传之分子构型；

c)在事件杂合(或半合)和纯合的情况下，外源DNA中的目标基因在一系列的环境条件下以商业可接受水平显示正确、合适且稳定的空间和时间表型表达，其中携带事件的植物可能处于常规的农业用途；

进一步地，与野生型WOSR种类比较来评估该植物的农学特性和性能。

在田间的广泛试验表明：当某些春油料种子油菜的候选原种事件导入WOSR植物时，可使植物表现出与最佳农学性能相结合的、外源DNA中目的基因的充分表达。这些事件被选作WOSR中的MS和RF原种事件，并被分别命名为MS-BN1和RF-BN1。

实施例4.原种事件MS-BN1和RF-BN1的鉴定

一旦MS-BN1和RF-BN1事件被鉴定为每个转基因的表达及总体农学性能均为最佳的原种事件，则于分子水平上详细分析转基因的位置。这包括详细的Southern印迹分析(用多个限制性酶)以及对转基因侧翼区的测序。

4.1.使用多个限制性酶的Southern印迹分析

从转基因植物及对照植物收获叶组织。按照Dellaporta等(1983，植物分子生物学报告者，1，第3卷，19-21页)，从叶组织分离总基因组DNA。用分光光度计在波长为260nm处测定光密度来确定每种制品的DNA浓度。

用限制性酶消化10μg基因组DNA，终反应体积为40μl，所用条件为厂商推荐条件。调节限制性酶的消化时间和/或量以确保基因组DNA样本的完全消化且无非特异性降解。消化后，将4μl加样染料加至已消化的DNA样本，并将它们加样至1％琼脂糖凝胶上。

将下列对照DNA也加样至凝胶上：

-阴性对照，由非转基因芸苔属植物制备的基因组DNA。该阴性对照用于证实不存在背景杂交。

-DNA阳性对照：由将杂合的单拷贝转基因整合入欧洲油菜基因组，10μg基因组DNA与±19皮克的来自pTHW118DNA的1501bpPvuI-HindIII片段具有相同分子当量数(欧洲油菜二倍体基因组大小：0.8x109bp)。将代表每个基因组一个质粒拷贝的量加至1μg消化的非转基因欧洲油菜DNA中。该重建样本用于显示杂交是在允许探针与靶序列杂交的条件下进行的。

将PstI消化的噬菌体λDNA(CIind 1ts 857Sam 7株，LifeTechnologies)用作大小标准。

电泳后，用毛细管印迹将DNA样本(消化的芸苔属基因组DNA，对照和大小标准DNA)经12至16小时转移至尼龙膜。

通过用HindIII限制性酶切消化PTW107制备用作MS-BN1事件探针制品的DNA模板。产生了一条包含转化DNA相关部分的3942bp DNA片段(PSSUARA的部分，3’nos，芽孢杆菌RNA酶，PTA29)。

通过用Hpal限制性酶切消化PTW118制备用作RF-BN1事件探针制品的DNA模板。产生了一条包含转化DNA相关部分的2182bp DNA片段(PSSUARA部分，3’nos，芽孢杆菌RNA酶抑制剂，PTA29)。

纯化后，按照标准步骤标记DNA片段，并用于与膜杂交。

在标准的严紧条件下进行杂交：在95℃至100℃水浴中加热5至10分钟变性标记探针，并于冰上冷却5至10分钟，加至杂交液中，其中杂交液为(6X SSC(20X SSC为3.0M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH 7.0)、5XDenhardt′s(100X Denhardt’s＝2％Ficoll，2％聚乙烯吡咯烷酮，2％牛血清白蛋白)、0.5％SDS和20μg/ml变性载体DNA(平均长度为120-3000个核苷酸的单链鱼精DNA)。于65℃过夜杂交。用洗液(2X SSC，0.1％SDS)于65℃洗膜三次，持续20至40分钟。

电子扫描放射自显影。

4.1.1.MS-BN1

用不同的限制性酶消化MS-BN1基因组DNA后得到的限制性酶切模式于图2中给出，并总结在表3中。

表3：MS-BN1的限制性图谱

(^＊)这些片段的长度为从质粒pTHW107的限制性图谱预测的长度。

4.1.2.RF-BN1

用不同的限制性酶消化RF-BN1基因组DNA后得到的限制性酶切模式于图3中给出，并总结在表4中.

表4：RF-BN1的限制性图谱

(^＊)这些片段的长度为根据BamHI酶切pTHW118载体所得的限制性图谱而预测的长度。

4.2.侧翼区的鉴定

首先鉴定已产生了原种事件MS-BN1和RF-BN1之春OSR中这些事件之侧翼区，然后检查WOSR。

4.2.1.MS-BN1侧翼区的鉴定

4.2.1.1.右(5’)侧翼区

对MS-BN1右边界侧翼区序列，使用具延伸捕获的(等，1993，NAR 20：5487-5488)由连接反应介导的聚合酶链反应(Mueller等，1989，科学780-786；Maxine等，1994，PCR方法和应用(PCR Methods andApplications)，71-75)。

用作接头制品的寡核苷酸为：

MDB248：(SEQ ID No.3)

5′CAT.GCC.CTG.ACC.CAG.GCT.AAG.TAT.TTT.AAC.TTT.AAC.CAC.TTT.GCT.CCG.ACA.GTC.CCA.TTG

MDB249：(SEQ ID No.4)

5′CAA.TGG.GAC.TGT.CGG.AGG.ACT.GAG.GGC.CAA.AGC.TTG.GCT.CTT.AGC.CTG.GGT.CAG.GGC.ATG

接头制备后，用生物素化的基因特异引物，由经NcoI消化的基因组MS-BN1DNA合成第一链：

然后将接头连接至第一链DNA，再将接头与磁珠偶联，从其上洗脱非生物素化的链。用下列引物对该DNA进行大规模PCR扩增：

该PCR产生一条约1150bp的片段。从琼脂糖凝胶洗脱该右边界片段，

用下列引物对该DNA的100倍稀释物进行巢式PCR：

该反应产生一条约1000bp的片段，从琼脂糖凝胶洗脱该片段、纯化，并连接至pGem-T载体。用下列引物进行标准PCR反应来筛选重组质粒DNA：

上述反应产生下列片段：SP6-T7：1224bp

SP6-MDB201：1068bp

T7-MDB201：1044bp

纯化右边界片段并测序(SEQ ID No.13)，得到953bp，其中的bp1-867对应于植物DNA且bp 868至953对应于pTHW107的T-DNA。

4.2.1.2.MS-BN1的左(3’)侧翼区

在MS-BN1事件中插入的转基因之侧翼的左边界区序列用Liu等(1995，植物杂志(The Plant Journal)8(3)：457-463)所述的热不对称交错(TAIL-)PCR法测定.该方法采用三条巢式特异引物与一条短的任意简并(AD)引物连续反应，从而可热控制特异和非特异产物的相对扩增效力.特异引物选择为与转基因的边界退火，并基于它们的退火条件.在1％琼脂糖凝胶上分析小量(5μl)来纯化的第二次和第三次PCR产物.第三次PCR产物用于制备性扩增，纯化并用DyeDeoxy Terminator循环试剂盒在自动测序仪上测序。

所用引物如下：

其中：N＝A，C，T或g；S＝C或g；W＝A或T

用HCA24-MDB611扩增的片段大约540bp，其中的537bp已测序(3’侧翼：SEQ ID No 18)。在bp 1和bp 180之间的序列包含pTHW107DNA，而bp 181和bp 537之间的序列对应于植物DNA。

4.2.1.3.靶位点缺失的鉴定

用对应于转基因侧翼区的序列作为引物，以野生型欧洲油菜品种Drakkar作为模板，鉴定转基因的插入位点。

所用引物如下：

在5’侧翼中的位置在3’侧翼中的位置

序列(5’→3’) (SEQ ID No 13) (SEQ ID No 18)

VDS51 TgA.CAC.TTT.gAg.CCA.CTC.g 733→751 -----

(SEQ ID No.19)

HCA48 GgA.ggg.TgT.TTT.Tgg.TTA.TC ----- 189←208

(SEQ ID No.20)

反应产生一条178bp片段(SEQ ID No 21)，其中bp 132至150对应于靶位点的缺失。

4.2.1.4.MS-BN1插入区的鉴定

基于侧翼区的鉴定及靶位点的缺失，可确定MS-BN1的插入区(SEQ IDNo 22)：

1-822：5’侧翼区 SEQ ID No 13的bp 46-867

823-841靶位点缺失 SEQ ID No 21的bp 132-150

842-1198：3’侧翼区 SEQ ID No 18的bp 181至537

4.2.2.RF-BN1侧翼区的鉴定

用Vectorette-PCR确定RF-BN1边界侧翼区(使用Vectorette和Subvectorette PCR以分离转基因侧翼DNA，Maxine J.Allen，Andrew Collick和Alec J.Jeffreys PCR方法和应用-1994(4)，71-75页)，以经过HindIII消化的RF-BN1基因组DNA作为模板。用上述的MDB248(SEQ ID No.3)引物和MDB249(SEQ ID No.4)引物制备Vectorette接头。

4.2.2.1.BN-RF1的右(5’)侧翼区

所用引物如下：

反应产生了一条1077bp片段(SEQ ID No.24)，其中bp 46-881对应于植物DNA，且bp 882-1060对应于pTHW118的T-DNA。

4.2.2.2.BN-RF1的左(3’)侧翼区

为鉴定原种事件BN-RF1的3’侧翼区，如上所述进行TAIL PCR，使用了一条任意简并引物和多条位于T-DNA中的左边界附近的引物。

所用引物为：

任意简并引物：

MDB286 NTg.CgA.SWg.ANA.WgA.A (SEQ ID No.25)

其中：N＝A，C，T或g；S＝C或g；W＝A或T

T-DNA引物：

MDB314 gTA.ggA.ggT.Tgg.gAA.gAC.C(SEQ ID No.26)

MDB315 ggg.CTT.TCT.ACT.AgA.AAg.CTC.TCg.g(SEQ IDNo.27)

MDB316 CCg.ATA.ggg.AAg.TgA.TgT.Agg.Agg(SEQ ID No.28)

得到了一条约2000bp片段。将该片段克隆入pGem

-T载体，并用作使用以下引物的PCR反应的模板：

植物DNA引物：

MDB288 ATg.CAg.CAA.gAA.gCT.Tgg.Agg SEQ ID No.29)

T-DNA引物：

MDB314 gTA.ggA.ggT.Tgg.gAA.gAC.C (SEQ ID No.26)

反应产生一条约1500bp(SEQ ID No.30)的片段，其中bp 17-182对应于质粒pTHW118的T-DNA，且bp 183-1457对应于植物DNA。

4.2.2.3.靶位点缺失的分子分析

用TAIL-PCR方法克隆靶位点缺失(见上述)，用T-DNA插入物上游的指向该插入物的野生型基因组DNA特异引物和植物DNA特异引物：

任意简并引物：

MDB286 NTg.CgA.SWg.ANA.WgA.A(SEQ ID No.25)

其中：N＝A，C，T或g；S＝C或g；W＝A或T

植物DNA引物：

MDB269 ggTTTTCggAggTCCgAgACg(SEQ ID No.31)

MDB283 CTTggACCCCTAggTAAATgC(SEQ ID No.32)

MDB284 gTACAAAACTTggACCCCTAgg (SEQ ID No.33)

得到了一条约1068bp(SEQ ID No.34)的片段，其中：

53-83：5’侧翼区

84-133：靶位点缺失

134-1055：3’侧翼区

通过插入T-DNA，51bp的靶位点被缺失。比较野生型基因瘤序列与Rf3基因瘤序列显示在右边界连接点存在填充DNA。在右边界的该填充

TCTCG序列的5′末端侧翼为TCA，3′末端侧翼为CGA。在靶位点缺失的断点和T-DNA的断点也分别发现存在这些三联体。在亲属关系较远的植物序列中搜寻显示了该填充DNA的可能起源。该TCA.TCTCG.CGA序列也位于植物DNA中靶位点缺失的3′末端。它是位于靶位点缺失的断点下游209bp处两个相同的13bp重复的核心序列。

RF-BN1插入区可被定义为包含如下的左侧翼区、靶位点缺失和右侧翼区：

1-836：5’侧翼区(SEQ ID No 24的bp 46-881)

837-887：靶位点缺失(SEQ ID No.34的bp 84-133)

888-21623’侧翼区(SEQ ID No.30的bp 183-1457)

4.3.基因瘤的遗传分析

对子代植物的多代进行分子和表型分析，以检查两个事件插入的遗传稳定性。

T₀，T₁和T₂代植物的Southern印迹分析比较事件MS-BN1和RF-BN1。对每个事件而言，所得到的模式在不同的代中是相同的。这表明该转基因的分子构型在含有MS-BN1和RF-BN1的植物中是稳定的。

MS-BN1和RF-BN1事件显示了，它们各自的转基因在至少接下来的三代中作为单一的基因瘤的孟德尔分离，表明插入是稳定的。

基于上述结果，MS-BN1和MS-RF1被鉴定为原种事件。

4.4.鉴定WOSR中MS-BN1和RF-BN1的侧翼序列

用引物确定WOSR中原种事件MS-BN1和RF-BN1，其中所述引物是以春油料种子油菜中这些事件的侧翼序列为基础开发的。

用T-DNA引物(SEQ ID No.12)和位于MS-BN1右边界植物DNA的引物确定MS-BN1WOSR右(5’)侧翼序列：

VDS57：5’-gCA.TgA.TCT.gCT.Cgg.gAT.ggC-3’(SEQ ID No.35)

反应产生一条约909bp的片段(SEQ ID No.36)，其序列基本上与SEQID No.13序列类似(从第98位核苷酸开始)。

用T-DNA引物(SEQ ID No.17)和位于MS-BN1左边界植物DNA的引物确定MS-BN1WOSR左(3’)侧翼序列：

HCA68：5’-CCA.TAT.Acg.CCA.gAg.Agg.AC-3’(SEQ ID No.37)

反应产生一条约522bp的片段(SEQ ID No.38)，其序列基本上与SEQID No.18序列类似。

用T-DNA引物(SEQ ID No.12)和位于RF-BN1右边界植物DNA的引物(SEQ ID No.31)确定RF-BN1WOSR右(3’)侧翼序列。反应产生一条约694bp的片段(SEQ ID No.39)，其序列基本上与SEQ ID No.24序列类似(从第293至980位核苷酸)。

用T-DNA引物(SEQ ID No.26)和位于RF-BN1左边界植物DNA的引物(SEQ ID No.29)确定RF-BN1WOSR左侧翼序列。反应产生一条约1450bp的片段，其中的1279bp已测序(SEQ ID No.40)。该序列基本上与SEQ IDNo.30序列类似(从第141至1421位核苷酸)。

由此证实SOSR和WOSR中，原种事件MS-BN1和RF-BN1之左和右边界序列基本上类似。

实施例5：开发用于鉴定对照的诊断工具

开发下列方法以鉴定任一包含原种事件MS-BN1的WOSR植物材料。

5.1.MS-BN1和RF-BN1原种事件限制性图谱鉴定方法

包含原种事件MS-BN1的WOSR植物可用与实施例4.1.中所述的基本相同步骤进行Southern印迹鉴定。这样WOSR基因组DNA，1)用下列限制性酶：EcoRI，EcoRV，Ndel，Hpal，AflIII中的至少两种，优选地至少三种，尤其是用至少四种，更尤其是用所述的全部限制性酶消化，2)转移至尼龙膜，以及3)与质粒pTHW107的3942bp HindIII片段杂交.如果使用了至少两种限制性酶，用与实施例4.1.1.表3中所列出的相同长度的片段鉴定DNA片段，该WOSR植物可确定为拥有原种事件MS-BN1.

包含原种事件RF-BN1的WOSR植物可用与实施例4.1.中所述的基本相同步骤进行Southern印迹鉴定。这样WOSR基因组DNA，1)用下列限制性酶：BamHI，EcoRI，EcoRV，HindIII中的至少两种，优选地至少三种，更优选地用所述的全部限制性酶消化，2)转移至尼龙膜，以及3)与质粒pTHW118的2182bp HpaI片段杂交。如果使用了至少两种限制性酶，用与实施例4.1.2.表4中所列出的相同长度片段鉴定DNA片段，该WOSR植物可确定为拥有原种事件RF-BN1。

5.2.MS-BN1和RF-BN1原种事件聚合酶链反应鉴定方法

在尝试筛选未知对象前，进行具有所有适当对照的试验。已有的方法可能需要优化在不同的实验室间可能不同的组分(模板DNA制品，TaqDNA聚合酶，引物性质，dNTP’s，热循环仪等)。

内源序列的扩增在方法中起到关键作用。必须达到的PCR和热循环条件为：对已知的转基因基因组DNA模板，可扩增等摩尔量的内源序列和转基因序列。在同样的溴化乙锭染色强度下用琼脂糖凝胶电泳判断时，当目标内源片段未被扩增或目标序列未被扩增时，需要优化PCR条件。

5.2.1.模板DNA

按照Edwards等，(核酸研究，19，1349页，1991)用叶钻孔器或单种子制备模板DNA。当所用的DNA是用其它方法制备而得时，需要用不同量的模板进行试验。通常50ng基因组模板DNA可产生最佳结果。

5.2.2.指定阳性和阴性对照

在PCR运行中应包括以下阳性和阴性对照：

-基本的混合物对照(DNA阴性对照)。此为反应中未加入DNA的PCR。当观察到预期结果即无PCR产物时，表明该PCR混合物未污染靶DNA。

-DNA阳性对照(已知含有转基因序列的基因组DNA样本)。该阳性对照的成功扩增表明PCR是在允许靶序列扩增的条件下运行的。

-野生型DNA对照。此为PCR反应中所提供的模板DNA为制备自非转基因植物制备的基因组DNA的PCR。当观察到预期结果，即转基因PCR产物未被扩增而内源PCR产物被扩增时，表明在基因组DNA样本中无可检测到的转基因背景扩增。

5.2.3.引物

使用下列特异识别转基因和MS-BN1侧翼序列的引物：

BNA01：5’-gCT.Tgg.ACT.ATA.ATA.CCT.gAC-3’(SEQ ID 12)

(MDB201)(靶：转基因)

BNA02：5’-TgA.CAC.TTT.gAg.CCA.CTC.g-3’(SEQ ID 19)

(VDS51)(靶：植物DNA)

为鉴定包含RF-BN1的植物材料，使用下列特异识别转基因和RF-BN1侧翼序列的引物：

BNA03：5’-TCA.TCT.ACg.gCA.ATg.TAC.CAg.C-3’(SEQ ID 23)

(MDB193)(靶：转基因)

BNA04：5’-Tgg.ACC.CCT.Agg.TAA.ATg.CC-3’(SEQ ID 41)

(MDB268)(靶：植物DNA)

靶向内源序列的引物总是包含在PCR混合物中。这些引物可用作未知样本以及DNA阳性对照中的内部对照。内源引物对的阳性结果表明在基因组DNA制品中有质量足够好的样本DNA，以产生PCR产物。所用的内源引物为：

BNA05：5’-AAC.gAg.TgT.CAg.CTA.gAC.CAg.C-3’(SEQ ID42)

BNA06：5’-CgC.AgT.TCT.gTg.AAC.ATC.gAC.C-3’(SEQ ID 43)

5.2.4.扩增片段

PCR反应中预期的扩增片段为：

引物对BNA05-BNA06：394bp(内源对照)

引物对BNA01-BNA02：280bp(MS-BN1原种事件)

引物对BNA03-BNA04：215bp(RF-BN1原种事件)

5.2.5.PCR条件

50μl反应体系的PCR混合物包含：

5μl模板DNA

5μl 10x扩增缓冲液(与Taq聚合酶同时提供)

1μl 10mM dNTP’s

1μl BNA01(MS-BN1)或BNA03(RF-BN1)(10pmoles/μl)

1μl BNA02(RF-BN1)或BNA04(RF-BN1)(10pmoles/μl)

0.5μl BNA05(10pmoles/μl)

0.5μl BNA06(10pmoles/μl)

0.2μl Taq DNA聚合酶(5个单位/μl)

加水至50μl

为得到最佳结果，应遵循下列热循环参数：

95℃ 4分钟

然后：95℃ 1分钟

57℃ 1分钟

72℃ 2分钟

进行5个循环

然后92℃ 30秒

57℃ 30秒

72℃ 1分钟

进行22至25个循环

然后：72℃ 5分钟

5.2.6.琼脂糖凝胶分析

将10至20μl的PCR样本及合适的分子量标志物(例如100bp梯度PHARMACIA)上样于1.5％琼脂糖凝胶(Tris-硼酸盐缓冲液)。

5.2.7.结果验证

转基因植物DNA样本的单一PCR循环和单一PCR混合物的数据不可采用，除非1)DNA阳性对照显示预期的PCR产物(转基因和内源片段)，2)PCR扩增的DNA阴性对照为阴性(没有片段)以及3)野生型DNA对照显示预期结果(内源片段扩增).

显示可见量的如预期大小的转基因和内源PCR产物的泳道表明其对应的植物(由其制备的基因组模板DNA)已遗传了MS-BN1和/或RF-BN1原种事件。未显示可见量的转基因PCR产物之一且显示可见量的内源PCR产物的泳道表明其对应的植物(由其制备的基因组模板DNA)不包含原种事件。未显示可见量的内源和转基因PCR产物的泳道表明基因组DNA的质和/或量不能产生PCR产物。这些植物不予以评价。应重复基因组DNA的制备，且必须进行具备合适对照的新一轮PCR循环。

5.2.8.使用识别PCR法鉴定MS-BN1和RF-BN1

按照上述方法对来自包含MS-BN1，RF-BN1或另一转基因事件之植物的WOSR叶材料进行试验。来自WOSR野生型的样本用作阴性对照。

PCR分析结果于图4和5中阐述。

图4阐述了用原种事件PCR鉴定法对两种WOSR样本中MS-BN1的鉴定结果(泳道1和2)。认为泳道1包含原种事件，因为检测到了280bp的条带，而泳道2的样本不包含MS-BN1。

图5阐述了用原种事件PCR鉴定法对两种WOSR样本中RF-BN1的鉴定结果(泳道1和2)。认为泳道1包含原种事件，因为检测到了215bp的条带，而泳道2的样本不包含RF-BN1。

实施例6：用在WOSR中的MS-BN1和RF-BN1产生杂交种子

将包含MS-BN1的雄性不育WOSR植物与RF-BN1纯合的WOSR植物杂交。收集来自MS-BN1的杂交种子，并保藏在ATCC，其ATCC保藏号为PTA-730。

将该杂交种子种植在田地中。发现植物100％可育，且显示最佳农学特性。杂交植物或包含MS-BN1和RF-BN1两者，或只包含RF-BN1事件。

实施例7：将MS-BN1和RF-BN1导入优选的WOSR栽培品种

通过将包含事件MS-BN1或RF-BN1的植物反复回交，分别将原种事件MS-BN1和RF-BN1导入许多农业上重要的WOSR栽培品种。

观察到原种事件基因掺入这些栽培品种未显著影响后者任一想要的表型或农学特性(非连锁妨碍)，而通过草铵膦耐受性测定，转基因的表达满足商业可接受水平。这证实事件MS-BN1和RF-BN1作为原种事件的地位。

除非另外明确指出，在下列权利要求中所用的术语“植物”包含在任一成熟阶段的植物组织，以及取自或衍生于此类植物的任一细胞、组织或器官，没有限制地包括任一种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。

包含原种事件MS-BN1和原种事件RF-BN1的种子或只包含原种事件RF-BN1保藏在美国组织培养物保藏中心(American Tissue CultureCollection)，保藏号为PTA-730。

序列表

<110>阿温提斯作物科学公司

<120>杂交冬油料种子油菜及其生产方法

<130>EE-BN1

<140>

<141>

<160>43

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>4946

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：质粒pTHW107的T-DNA

<220>

<221>misc_特征

<222>(964)..(4906)

<223>Hind III片段

<400>1

aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga actcggccgt cgagtacatg 60

gtcgataaga aaaggcaatt tgtagatgtt aattcccatc ttgaaagaaa tatagtttaa 120

atatttattg ataaaataac aagtcaggta ttatagtcca agcaaaaaca taaatttatt 180

gatgcaagtt taaattcaga aatatttcaa taactgatta tatcagctgg tacattgccg 240

tagatgaaag actgagtgcg atattatgtg taatacataa attgatgata tagctagctt 300

agctcatcgg gggatcctag acgcgtgaga tcagatctcg gtgacgggca ggaccggacg 360

gggcggtacc ggcaggctga agtccagctg ccagaaaccc acgtcatgcc agttcccgtg 420

cttgaagccg gccgcccgca gcatgccgcg gggggcatat ccgagcgcct cgtgcatgcg 480

cacgctcggg tcgttgggca gcccgatgac agcgaccacg ctcttgaagc cctgtgcctc 540

cagggacttc agcaggtggg tgtagagcgt ggagcccagt cccgtccgct ggtggcgggg 600

ggagacgtac acggtcgact cggccgtcca gtcgtaggcg ttgcgtgcct tccaggggcc 660

cgcgtaggcg atgccggcga cctcgccgtc cacctcggcg acgagccagg gatagcgctc 720

ccgcagacgg acgaggtcgt ccgtccactc ctgcggttcc tgcggctcgg tacggaagtt 780

gaccgtgctt gtctcgatgt agtggttgac gatggtgcag accgccggca tgtccgcctc 840

ggtggcacgg cggatgtcgg ccgggcgtcg ttctgggtcc attgttcttc tttactcttt 900

gtgtgactga ggtttggtct agtgctttgg tcatctatat ataatgataa caacaatgag 960

aacaagcttt ggagtgatcg gagggtctag gatacatgag attcaagtgg actaggatct 1020

acaccgttgg attttgagtg tggatatgtg tgaggttaat tttacttggt aacggccaca 1080

aaggcctaag gagaggtgtt gagaccctta tcggcttgaa ccgctggaat aatgccacgt 1140

ggaagataat tccatgaatc ttatcgttat ctatgagtga aattgtgtga tggtggagtg 1200

gtgcttgctc attttacttg cctggtggac ttggcccttt ccttatgggg aatttatatt 1260

ttacttacta tagagctttc ataccttttt tttaccttgg atttagttaa tatataatgg 1320

tatgattcat gaataaaaat gggaaatttt tgaatttgta ctgctaaatg cataagatta 1380

ggtgaaactg tggaatatat atttttttca tttaaaagca aaatttgcct tttactagaa 1440

ttataaatat agaaaaatat ataacattca aataaaaatg aaaataagaa ctttcaaaaa 1500

acagaactat gtttaatgtg taaagattag tcgcacatca agtcatctgt tacaatatgt 1560

tacaacaagt cataagccca acaaagttag cacgtctaaa taaactaaag agtccacgaa 1620

aatattacaa atcataagcc caacaaagtt attgatcaaa aaaaaaaaac gcccaacaaa 1680

gctaaacaaa gtccaaaaaa aacttctcaa gtctccatct tcctttatga acattgaaaa 1740

ctatacacaa aacaagtcag ataaatctct ttctgggcct gtcttcccaa cctcctacat 1800

cacttcccta tcggattgaa tgttttactt gtaccttttc cgttgcaatg atattgatag 1860

tatgtttgtg aaaactaata gggttaacaa tcgaagtcat ggaatatgga tttggtccaa 1920

gattttccga gagctttcta gtagaaagcc catcaccaga aatttactag taaaataaat 1980

caccaattag gtttcttatt atgtgccaaa ttcaatataa ttatagagga tatttcaaat 2040

gaaaacgtat gaatgttatt agtaaatggt caggtaagac attaaaaaaa tcctacgtca 2100

gatattcaac tttaaaaatt cgatcagtgt ggaattgtac aaaaatttgg gatctactat 2160

atatatataa tgctttacaa cacttggatt tttttttgga ggctggaatt tttaatctac 2220

atatttgttt tggccatgca ccaactcatt gtttagtgta atactttgat tttgtcaaat 2280

atatgtgttc gtgtatattt gtataagaat ttctttgacc atatacacac acacatatat 2340

atatatatat atatattata tatcatgcac ttttaattga aaaaataata tatatatata 2400

tagtgcattt tttctaacaa ccatatatgt tgcgattgat ctgcaaaaat actgctagag 2460

taatgaaaaa tataatctat tgctgaaatt atctcagatg ttaagatttt cttaaagtaa 2520

attctttcaa attttagcta aaagtcttgt aataactaaa gaataataca caatctcgac 2580

cacggaaaaa aaacacataa taaatttgaa tttcgaccgc ggtacccgga attcgagctc 2640

ggtacccggg gatcttcccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc 2700

tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta 2760

atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta 2820

acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt 2880

aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tctgcttcgg atcctctaga gccggaaagt 2940

gaaattgacc gatcagagtt tgaagaaaaa tttattacac actttatgta aagctgaaaa 3000

aaacggcctc cgcaggaagc cgtttttttc gttatctgat ttttgtaaag gtctgataat 3060

ggtccgttgt tttgtaaatc agccagtcgc ttgagtaaag aatccggtct gaatttctga 3120

agcctgatgt atagttaata tccgcttcac gccatgttcg tccgcttttg cccgggagtt 3180

tgccttccct gtttgagaag atgtctccgc cgatgctttt ccccggagcg acgtctgcaa 3240

ggttcccttt tgatgccacc cagccgaggg cttgtgcttc tgattttgta atgtaattat 3300

caggtagctt atgatatgtc tgaagataat ccgcaacccc gtcaaacgtg ttgataaccg 3360

gtaccatggt agctaatttc tttaagtaaa aactttgatt tgagtgatga tgttgtactg 3420

ttacacttgc accacaaggg catatataga gcacaagaca tacacaacaa cttgcaaaac 3480

taacttttgt tggagcattt cgaggaaaat ggggagtagc aggctaatct gagggtaaca 3540

ttaaggtttc atgtattaat ttgttgcaaa catggactta gtgtgaggaa aaagtaccaa 3600

aattttgtct caccctgatt tcagttatgg aaattacatt atgaagctgt gctagagaag 3660

atgtttattc tagtccagcc acccacctta tgcaagtctg cttttagctt gattcaaaaa 3720

ctgatttaat ttacattgct aaatgtgcat acttcgagcc tatgtcgctt taattcgagt 3780

aggatgtata tattagtaca taaaaaatca tgtttgaatc atctttcata aagtgacaag 3840

tcaattgtcc cttcttgttt ggcactatat tcaatctgtt aatgcaaatt atccagttat 3900

acttagctag atatccaatt ttgaataaaa atagctcttg attagtaaac cggatagtga 3960

caaagtcaca tatccatcaa acttctggtg ctcgtggcta agttctgatc gacatggggt 4020

taaaatttaa attgggacac ataaatagcc tatttgtgca aatctcccca tcgaaaatga 4080

cagattgtta catggaaaac aaaaagtcct ctgatagaag tcgcaaagta tcacaatttt 4140

ctatcgagag atagattgaa agaagtgcag ggaagcggtt aactggaaca taacacaatg 4200

tctaaattaa ttgcattcgc taaccaaaaa gtgtattact ctctccggtc cacaataagt 4260

tattttttgg cccttttttt atggtccaaa ataagtgagt tttttagatt tcaaaaatga 4320

tttaattatt tttttactac agtgcccttg gagtaaatgg tgttggagta tgtgttagaa 4380

atgtttatgt gaagaaatag taaaggttaa tatgatcaat ttcattgcta tttaatgtta 4440

aaatgtgaat ttcttaatct gtgtgaaaac aaccaaaaaa tcacttattg tggaccggag 4500

aaagtatata aatatatatt tggaagcgac taaaaataaa cttttctcat attatacgaa 4560

cctaaaaaca gcatatggta gtttctaggg aatctaaatc actaaaatta ataaaagaag 4620

caacaagtat caatacatat gatttacacc gtcaaacacg aaattcgtaa atatttaata 4680

taataaagaa ttaatccaaa tagcctccca ccctataact taaactaaaa ataaccagcg 4740

aatgtatatt atatgcataa tttatatatt aaatgtgtat aatcatgtat aatcaatgta 4800

taatctatgt atatggttag aaaaagtaaa caattaatat agccggctat ttgtgtaaaa 4860

atccctaata taatcgcgac ggatccccgg gaattccggg gaagcttaga tccatggagc 4920

catttacaat tgaatatatc ctgccg 4946

<210>2

<211>4832

<2t2>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：质粒pTHW118的T-DNA

<220>

<221>misc_特征

<222>(1883)..(4065)

<223>HpaI限制性片段

<400>2

aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga actcggccgt cgagtacatg 60

gtcgataaga aaaggcaatt tgtagatgtt aattcccatc ttgaaagaaa tatagtttaa 120

atatttattg ataaaataac aagtcaggta ttatagtcca agcaaaaaca taaatttatt 180

gatgcaagtt taaattcaga aatatttcaa taactgatta tatcagctgg tacattgccg 240

tagatgaaag actgagtgcg atattatgtg taatacataa attgatgata tagctagctt 300

agctcatcgg gggatcctag acgcgtgaga tcagatctcg gtgacgggca ggaccggacg 360

gggcggtacc ggcaggctga agtccagctg ccagaaaccc acgtcatgcc agttcccgtg 420

cttgaagccg gccgcccgca gcatgccgcg gggggcatat ccgagcgcct cgtgcatgcg 480

cacgctcggg tcgttgggca gcccgatgac agcgaccacg ctcttgaagc cctgtgcctc 540

cagggacttc agcaggtggg tgtagagcgt ggagcccagt cccgtccgct ggtggcgggg 600

ggagacgtac acggtcgact cggccgtcca gtcgtaggcg ttgcgtgcct tccaggggcc 660

cgcgtaggcg atgccggcga cctcgccgtc cacctcggcg acgagccagg gatagcgctc 720

ccgcagacgg acgaggtcgt ccgtccactc ctgcggttcc tgcggctcgg tacggaagtt 780

gaccgtgctt gtctcgatgt agtggttgac gatggtgcag accgccggca tgtccgcctc 840

ggtggcacgg cggatgtcgg ccgggcgtcg ttctgggtcc attgttcttc tttactcttt 900

gtgtgactga ggtttggtct agtgctttgg tcatctatat ataatgataa caacaatgag 960

aacaagcttt ggagtgatcg gagggtctag gatacatgag attcaagtgg actaggatct 1020

acaccgttgg attttgagtg tggatatgtg tgaggttaat tttacttggt aacggccaca 1080

aaggcctaag gagaggtgtt gagaccctta tcggcttgaa ccgctggaat aatgccacgt 1140

ggaagataat tccatgaatc ttatcgttat ctatgagtga aattgtgtga tggtggagtg 1200

gtgcttgctc attttacttg cctggtggac ttggcccttt ccttatgggg aatttatatt 1260

ttacttacta tagagctttc ataccttttt tttaccttgg atttagttaa tatataatgg 1320

tatgattcat gaataaaaat gggaaatttt tgaatttgta ctgctaaatg cataagatta 1380

ggtgaaactg tggaatatat atttttttca tttaaaagca aaatttgcct tttactagaa 1440

ttataaatat agaaaaatat ataacattca aataaaaatg aaaataagaa ctttcaaaaa 1500

acagaactat gtttaatgtg taaagattag tcgcacatca agtcatctgt tacaatatgt 1560

tacaacaagt cataagccca acaaagttag cacgtctaaa taaactaaag agtccacgaa 1620

aatattacaa atcataagcc caacaaagtt attgatcaaa aaaaaaaaac gcccaacaaa 1680

gctaaacaaa gtccaaaaaa aacttctcaa gtctccatct tcctttatga acattgaaaa 1740

ctatacacaa aacaagtcag ataaatctct ttctgggcct gtcttcccaa cctcctacat 1800

cacttcccta tcggattgaa tgttttactt gtaccttttc cgttgcaatg atattgatag 1860

tatgtttgtg aaaactaata gggttaacaa tcgaagtcat ggaatatgga tttggtccaa 1920

gattttccga gagctttcta gtagaaagcc catcaccaga aatttactag taaaataaat 1980

caccaattag gtttcttatt atgtgccaaa ttcaatataa ttatagagga tatttcaaat 2040

gaaaacgtat gaatgttatt agtaaatggt caggtaagac attaaaaaaa tcctacgtca 2100

gatattcaac tttaaaaatt cgatcagtgt ggaattgtac aaaaatttgg gatctactat 2160

atatatataa tgctttacaa cacttggatt tttttttgga ggctggaatt tttaatctac 2220

atatttgttt tggccatgca ccaactcatt gtttagtgta atactttgat tttgtcaaat 2280

atatgtgttc gtgtatattt gtataagaat ttctttgacc atatacacac acacatatat 2340

atatatatat atatattata tatcatgcac ttttaattga aaaaataata tatatatata 2400

tagtgcattt tttctaacaa ccatatatgt tgcgattgat ctgcaaaaat actgctagag 2460

taatgaaaaa tataatctat tgctgaaatt atctcagatg ttaagatttt cttaaagtaa 2520

attctttcaa attttagcta aaagtcttgt aataactaaa gaataataca caatctcgac 2580

cacggaaaaa aaacacataa taaatttgaa tttcgaccgc ggtacccgga attcgagctc 2640

ggtacccggg gatcttcccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc 2700

tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta 2760

atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta 2820

acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt 2880

aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tctgcttcgg atcctctaga ccaagcttgc 2940

gggtttgtgt ttccatattg ttcatctccc attgatcgta ttaagaaagt atgatggtga 3000

tgtcgcagcc ttccgctttc gcttcacgga aaacctgaag cacactctcg gcgccatttt 3060

cagtcagctg cttgctttgt tcaaactgcc tccattccaa aacgagcggg tactccaccc 3120

atccggtcag acaatcccat aaagcgtcca ggttttcacc gtagtattcc ggaagggcaa 3180

gctccttttt caatgtctgg tggaggtcgc tgatacttct gatttgttcc ccgttaatga 3240

ctgctttttt catcggtagc taatttcttt aagtaaaaac tttgatttga gtgatgatgt 3300

tgtactgtta cacttgcacc acaagggcat atatagagca caagacatac acaacaactt 3360

gcaaaactaa cttttgttgg agcatttcga ggaaaatggg gagtagcagg ctaatctgag 3420

ggtaacatta aggtttcatg tattaatttg ttgcaaacat ggacttagtg tgaggaaaaa 3480

gtaccaaaat tttgtctcac cctgatttca gttatggaaa ttacattatg aagctgtgct 3540

agagaagatg tttattctag tccagccacc caccttatgc aagtctgctt ttagcttgat 3600

tcaaaaactg atttaattta cattgctaaa tgtgcatact tcgagcctat gtcgctttaa 3660

ttcgagtagg atgtatatat tagtacataa aaaatcatgt ttgaatcatc tttcataaag 3720

tgacaagtca attgtccctt cttgtttggc actatattca atctgttaat gcaaattatc 3780

cagttatact tagctagata tccaattttg aataaaaata gctcttgatt agtaaaccgg 3840

atagtgacaa agtcacatat ccatcaaact tctggtgctc gtggctaagt tctgatcgac 3900

atggggttaa aatttaaatt gggacacata aatagcctat ttgtgcaaat ctccccatcg 3960

aaaatgacag attgttacat ggaaaacaaa aagtcctctg atagaagtcg caaagtatca 4020

caattttcta tcgagagata gattgaaaga agtgcaggga agcggttaac tggaacataa 4080

cacaatgtct aaattaattg cattcgctaa ccaaaaagtg tattactctc tccggtccac 4140

aataagttat tttttggccc tttttttatg gtccaaaata agtgagtttt ttagatttca 4200

aaaatgattt aattattttt ttactacagt gcccttggag taaatggtgt tggagtatgt 4260

gttagaaatg tttatgtgaa gaaatagtaa aggttaatat gatcaatttc attgctattt 4320

aatgttaaaa tgtgaatttc ttaatctgtg tgaaaacacc aaaaaatcac ttattgtgga 4380

ccggagaaag tatataaata tatatttgga agcgactaaa aataaacttt tctcatatta 4440

tacgaaccta aaaacagcat atggtagttt ctagggaatc taaatcacta aaattaataa 4500

aagaagcaac aagtatcaat acatatgatt tacaccgtca aacacgaaat tcgtaaatat 4560

ttaatataat aaagaattaa tccaaatagc ctcccaccct atkacttaaa ctaaaaataa 4620

ccagcgaatg tatattatat gcataattta tatattaaat gtgtataatc atgtataatc 4680

aatgtataat ctatgtatat ggttagaaaa agtaaacaat taatatagcc ggctatttgt 4740

gtaaaaatcc ctaatataat cgcgacggat ccccgggaat tccggggaag cttagatcca 4800

tggagccatt tacaattgaa tatatcctgc cg 4832

<210>3

<211>60

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述：引物248

<400>3

catgccctga cccaggctaa gtattttaac tttaaccact ttgctccgac agtcccattg 60

<210>4

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物249

<400>4

caatgggact gtcggaggac tgagggccaa agcttggctc ttagcctggg tcagggcatg 60

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物247

<400>5

ccgtcaccga gatctgatct cacgcg 26

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物250

<400>6

gcactgaggg ccaaagcttg gctc 24

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物251

<400>7

ggatcccccg atgagctaag ctagc 25

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物254

<400>8

cttagcctgg gtcagggcat g 21

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物258

<400>9

ctacggcaat gtaccagctg 20

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物SP6

<400>10

taatacgact cactataggg cga 23

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物T7

<400>11

tttaggtgac actatagaat ac 22

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物201

<400>12

gcttggacta taatacctga c 21

<210>13

<211>953

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：包含MS-BN1的5’侧翼区的序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(24)

<223>pGEM

-T载体

<400>13

cccngccgcc atggccgcgg gattcttagc ctgggtcagg gcatgcatgg tgtgatccaa 60

agactttctc ggcccaaata ctaatcatca caagtcatgc atgatctgct cgggatggcc 120

aagaaaaatc gaacccatga caatattcac agttgtaagt tttttaccag tagacaaata 180

ccacttggtt taacatattg taaacttaat atatagaaga tgttcctatt cagaaaataa 240

tatatgtata tatataaaat tttattggcg actcgaggat gcacagaaat ataaaatgtt 300

ggtcgcttag accatctcca atgtatttct ctatttttac ctctaaaata aaggagctct 360

ataatagagg tgggttttgc tccaatgtat ttctttaaaa tagagatctc tacatataga 420

gcaaaatata gaggaatgtt atttcttcct ctataaatag aggagaaaat agcaatctct 480

attttagagg caaaaataga gatbsgttgg agtgattttg cctctaaatg ctattataga 540

ggtagaaata gaggtgggtt ggagatgctc ttactatttt catagtaggt gaaaacttga 600

aactagaaag ctttggagtg tacgagtgga aaacctctct ttgtagaaac atacacatgc 660

catttagtta actagttgac atagattttt gagtcagata actttaagaa tatatatgtt 720

tggatgagag tttgacactt tgagccactc gaaggacaaa ttttaaaaac ttgtgggatg 780

ctgtggccat aaaccttgag gacvstttga tcatattcta ttaactacag tacgaatatg 840

attcgacctt tgcaattttc tcttcaggta ctcggccgtc gaactcggcc gtcgagtaca 900

tggtcgataa gaaaaggcaa tttgtagatg ttaattccca tcttgaaaga aat 953

<210>14

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物611

<400>14

ngtcgaswgt ntwcaa 16

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物259

<400>15

gtgcagggaa gcggttaact gg 22

<210>16

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物260

<400>16

cctttggagt aaatggtgtt gg 22

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物24

<400>17

gcgaatgtat attatatgca 20

<210>18

<211>537

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：包含MS-BN1 3’侧翼区的序列

<400>18

gcgaatgtat attatatgca taatttatat attaaatgtg tataatcatg tataatcaat 60

gtataatcta tgtatatggt tagaaaaagt aaacaattaa tatagccggc tatttgtgta 120

aaaatcccta atataatcga cggatccccg ggaattccgg gggaagctta gatccatgga 180

tttgttatga taaccaaaaa caccctcctt tttattataa aggtagggat agctaatctg 240

ttattcggtt ttgattagag atattaatcc cgttttatca agtacagttt gatgtatttt 300

tttgttcgtt ttcattacaa tccaagacaa gttaggttta ttacatttta ccaaaaaaaa 360

aggtttggtt tattgtgaac attgctgcgg tttatttaaa tttgattcta ttcaaaggtc 420

aatccgtatt taacaagtaa actagtcttt atataatctt aaatctaacg atctttgatt 480

tttaaattgc atttanctat gtcctctctg gcgtatatgg tctctttgaa aacactc 537

<210>19

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物51

<400>19

tgacactttg agccactcg 19

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物48

<400>20

ggagggtgtt tttggttatc 20

<210>21

<211>178

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：包含MS-BN1靶位点缺失的序列

<400>21

gacactttga gccactcgaa ggacaaattt taaaaacttg tgggatgctg tggccataaa 60

ccttgaggac gctttgatca tattctatta actacagtac gaatatgatt cgacctttgc 120

aattttctct tgttttctaa ttcatatgga tttgttatga taaccaaaaa caccctcc 178

<210>22

<211>1198

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：MS-BN1插入区

<400>22

catggtgtga tccaaagact ttctcggccc aaatactaat catcacaagt catgcatgat 60

ctgctcggga tggccaagaa aaatcgaacc catgacaata ttcacagttg taagtttttt 120

accagtagac aaataccact tggtttaaca tattgtaaac ttaatatata gaagatgttc 180

ctattcagaa aataatatat gtatatatat aaaattttat tggcgactcg aggatgcaca 240

gaaatataaa atgttggtcg cttagaccat ctccaatgta tttctctatt tttacctcta 300

aaataaagga gctctataat agaggtgggt tttgctccaa tgtatttctt taaaatagag 360

atctctacat atagagcaaa atatagagga atgttatttc ttcctctata aatagaggag 420

aaaatagcaa tctctatttt agaggcaaaa atagagatbs gttggagtga ttttgcctct 480

aaatgctatt atagaggtag aaatagaggt gggttggaga tgctcttact attttcatag 540

taggtgaaaa cttgaaacta gaaagctttg gagtgtacga gtggaaaacc tctctttgta 600

gaaacataca catgccattt agttaactag ttgacataga tttttgagtc agataacttt 660

aagaatatat atgtttggat gagagtttga cactttgagc cactcgaagg acaaatttta 720

aaaacttgtg ggatgctgtg gccataaacc ttgaggacvs tttgatcata ttctattaac 780

tacagtacga atatgattcg acctttgcaa ttttctcttc aggttttcta attcatatgg 840

atttgttatg ataaccaaaa acaccctcct ttttattata aaggtaggga tagctaatct 900

gttattcggt tttgattaga gatattaatc ccgttttatc aagtacagtt tgatgtattt 960

ttttgttcgt tttcattaca atccaagaca agttaggttt attacatttt accaaaaaaa 1020

aaggtttggt ttattgtgaa cattgctgcg gtttatttaa atttgattct attcaaaggt 1080

caatccgtat ttaacaagta aactagtctt tatataatct taaatctaac gatctttgat 1140

ttttaaattg catttancta tgtcctctct ggcgtatatg gtctctttga aaacactc 1198

<210>23

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物193

<400>23

tcatctacgg caatgtacca gc 22

<210>24

<211>1077

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：包含RF-BN15’侧翼区的序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(45)

<223>pGEM

-T载体

<220>

<221>misc_特征

<222>(1061)..(1077)

<223>pGEM

-T载体

<400>24

gagctctccc atatggtcga cctgcaggcg gccgcactag tgattcttag cctgggtcag 60

ggcatggcat gtctgatggt acatgctaaa tgctatattt cctgtttaaa gtgttaaaat 120

cattttctga tggaactaaa tccagtttta agagtaactg acaagtacaa ttaagcacaa 180

caatataata gtagtaattg gcatctttga ttgttaaata tcaaaacagt aaagttacaa 240

aaaaaaatac caaaccaata atgaagactt ggcggagaca gtgccgtgcg aaggttttcg 300

gaggtccgag acgagttcaa aaatacattt tacataatat atttttcata tatatatata 360

tataacattc aaaagtttga attattacat aaacgttttc taaattttct tcaccaaaat 420

tttataaact aaatttttaa atcatgaaca aaaagtatga atttgtaata taaatacaaa 480

gatacaaatt tttgattgaa atattggtag ctgtcaaaaa agtaaatctt agaatttaaa 540

ttaactatag taaactatat attgaaaata ttataaattt ttatcaaatt ctcataaata 600

tataaaataa atctaactca tagcatataa aaagaagact aatgtggatc aaaatattta 660

cagtttttta gaagtagaat ctttatagtt ttatttaaaa tatagcaaaa atgatcacaa 720

acctagttay ttaaggagaa gtccaattca aaatcaaata aaaataaaat ctatctaaaa 780

aaatatgtta actaccatgc aaaagtattt tttttgtaat tagaaaccct gaaatttgta 840

caaaacttgg acccctaggt aaatgccttt ttcatctcgc gataagaaaa ggcaatttgt 900

agatgttaat tcccatcttg aaagaaatat agtttaaata tttattgata aaataacaag 960

tcaggtatta tagtccaagc aaaaacataa atttattgat gcaagtttaa attcagaaat 1020

atttcaataa ctgattatat cagctggtac atcgccgtag aatcccgcgc catggcg 1077

<210>25

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物286

<400>25

ntgcgaswga nawgaa 16

<210>26

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物314

<400>26

gtaggaggtt gggaagacc 19

<210>27

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物315

<400>27

gggctttcta ctagaaagct ctcgg 25

<210>28

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物316

<400>28

ccgataggga agtgatgtag gagg 24

<210>29

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物288

<400>29

atgcagcaag aagcttggag g 21

<210>30

<211>1501

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：包含RF-BN13’侧翼区的序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(16)

<223>pGEM

-T载体

<220>

<221>misc_特征

<222>(1458)..(1501)

<223>pGEM-T载体

<400>30

ccatggccgc gggattgtag gaggttggga agacaggccc agaaagagat ttatctgact 60

cgttttgtgt atagttttca atgttcataa aggaagatgg agacttgaga agtttttttt 120

ggactttgtt tagctttgtt gggcgttttt tttttttgat caataacttt gttgggctta 180

tggtcgataa gcgtgcgcat gtctgatggt acatgctaaa tgctatattt ctgtttaaag 240

tgttaaaatc attttctgat ggaactaaat ccagttttaa gagtaactga caagtacaat 300

taagcacaac aataaaatag tagtaattgg catctttgat tgttaaatat caaaacaata 360

aagttacaaa aaaaaatacc aaaccaataa tgaagacttg gcggagacag tgccgtgcga 420

aggttttcgg aggtccgaga cgagttcaaa aatacatttt acataatata tttttcatat 480

atatatatat atataacatt caaaagtttg aattattaca taaacgtttt ctaaattttc 540

ttcaccaaaa ttttataaac taaaattttt maatcatgaa caaaaagtat gaatttgtaa 600

tataaatacm aagatacaaa tttttgattg aaatattggt agctgtcaaa aaagtaaatc 660

ttagaattta aattaactat agtaaactat atatggaaaa tattataaat ttttatcaaa 720

ttctcataaa tatataaaat aaatctaact catagcatat aaaaagaaga ctaatgtgga 780

tcaaratatt tacagttttt tagaagtaga atctctatag ttttatttaa aatatagcaa 840

aaatgatcac aaacctagtt actttaacca gaagtccaat tcaaaatcaa ataaaaataa 900

aaatctatct aaaaaaatat gttaactacc atgcaaaagt attttttttt gtaattagaa 960

accctgaaat ttgtacaaaa cttggacccc taggtaaatt ccctagaaag tatcctatta 1020

gcgtcgacaa actgttgctc atatttttct ctccttactt tatatcatac actaatatan 1080

gnagatgatc taattaatta ttcatttcca tgctagctaa ttcaagaaaa agaaaaaaaa 1140

ctattatcta aacttatatt cgagcaacac ctcggagata acaggatata tgtcattaat 1200

gaatgcttga actcatctcg cgaactcatc tcgcatcgct tatagccaca aagatccaac 1260

ccctctcttc aatcatatat cagtagtaca atacaaatag atattgtgag cacatatgcc 1320

gtctagtact gatgtgtaca tgtagaggag ccgcaaatgt ttagtcactc caacaaatga 1380

gcatgaccac gcatcttctg atgatgtaca gccgtccctt ttgctctctc aaatatcctc 1440

caagcttctt gctgcataaa tcactagtgc ggccgcctgc aggtcgacca tatgggagag 1500

c 1501

<210>31

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物269

<400>31

ggttttcgga ggtccgagac g 21

<210>32

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物283

<400>32

cttggacccc taggtaaatg c 21

<210>33

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述引物284

<400>33

gtacaaaact tggaccccta gg 22

<210>34

<211>1068

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：包含RF-BN1靶位点缺失的序列

<400>34

cgcgttggga gctctcccat atggtcgacc tgcaggcggc cgcactagtg attcttggac 60

ccctaggtaa atgccttttt caaaagcctc taagcacggt tctgggcggg gagtcagcga 120

gaaaaaaaga tatttcccta gaaagtatcc tattagcgtc gacaaactgt tgctcatatt 180

tttctctcct tactttatat catacactaa tataaaaaga tgatctaatt aattattcat 240

ttccatgcta gctaattcaa gaaaaagaaa aaaactatta tctaaactta tattcgagca 300

acacctcgga gataacagga tatatgttat taatgaatgc ttgaactcat ctcgcgaact 360

catctcgcat cgcttatagc cacaaagatc caacccctct cttcaatcat atatcagtag 420

tacaatacaa atagatattg tgagcacata tgccgtctag tactgatgtg tatatgtaga 480

gganngcaaa tgtttagtca ctccaacaaa tgagcatgac nacgcatctt ctgatgatgt 540

acagccgtcc cttttgctct ctcaaatatc ctccaagctt cttgctgcat ggaatcttct 600

tcttggtgtc tttcatgata acaaaatcta acgagagaga aacccttagt caagaaaaaa 660

caaataaaac tctaacgaga gtgtgtgaga aagtagagag tatgtgtgag tgacggagag 720

aaagtgagac cataaagatg ttgtgcaaag agagcaagac ttaacctata tatactcaca 780

tacacgtaca catcataccc attanagata ataaaaagga aaaaggaaca actaacaagg 840

gaactgtatc ccatacttta tctcatcata catgatgcat aatatattct ttcgtatatc 900

aagaaaaatg agcctgatat ttttttattt cgaaactaaa agagtgtcta tttctctctc 960

ttagagatag tgccatgtca aatttctaag aagtagcaag atttacaaag gaatctaaag 1020

caaccccacg cgcattgtgt tcatttctct cgaccatccc gcggccat 1068

<210>35

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物57

<400>35

gcatgatctg ctcgggatgg c 21

<210>36

<211>909

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：包含WOSR中MS-BN15’侧翼区的序列

<400>36

tgcatgatct gctcgggatg gccaagaaaa atcgaaccca tgacaatatt cacagttgta 60

agttttttac cagtagacaa ataccacttg gtttaacata ttgtaaactt aatatataga 120

agatgttcct attcagaaaa taatatatgt atatatataa aattttattg gcgactcgag 180

gatgcacaga aatataaaat gttggtcgct tagaccatct ccaatgtatt tctctatttt 240

tacctctaaa ataaaggaac tctataatag aggtgggttt tactccaatg tatttcttta 300

aaatagagat ctctacatat agagcaaaat atagaggaat gttatttctt cctctataaa 360

tagaggagaa aatagcaatc tctattttag aggcaaaaat agagatgggt tggagtgatt 420

ttgcctctaa atgctattat agaggtagaa atagaggtgg gttggagatg ctcttactat 480

tttcatagta ggtgaaaact tgaaactaga aagctttgga gtgtacgagt ggaaaacctc 540

tctttgtaga aacatacaca tgccatttag ttaactagtt gacatagatt tttgagtcag 600

ataactttaa gaatatatat gtttggatga gagtttgaca ctttgagcca ctcgaaggac 660

aaattttaaa aacttgtggg atgctgtggc ccataaacct tgaggacgct ttgatcatat 720

tctattaact acagtacgaa tatgattcga cctttgcaat tttctcttca gtactcggcc 780

gtcgaactcg gccgtcgagt acatggtcga taagaaaagg caatttgtag atgttaattc 840

ccatcttgaa agaaatatag tttaaatatt tattggataa aataacaagt caggtattat 900

agtccaagc 909

<210>37

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物68

<400>37

ccatatacgc cagagaggac 20

<210>38

<211>522

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：包含WOSR中MS-BN13’侧翼区的序列

<400>38

gcgaatgtat attatatgca taatttatat attaaatgtg tataatcatg tataatcaat 60

gtataatcta tgtatatggt tagaaaaagt aaacaattaa tatagccggc tatttgtgta 120

aaaatcccta atataatcga cggatccccg ggaattccgg gggaagctta gatccatgga 180

tttgttatga taaccaaaaa caccctcctt tttattataa aggtagggat agctaatctg 240

ttattcggtt ttgattagag atattaatcc cgttttatca agtacagttt gatgtatttt 300

tttgttcgtt ttcattacaa tccaagacaa gttaggttta ttacatttta ccaaaaaaaa 360

aggtttggtt tattgtgaac attgctgcgg ttttatttaa atttgattct attcaaaggt 420

caatccgtat ttaacaagta aactagtctt tatataatct taaatctaac gatacttgga 480

tttttaaatt gcatttagct atgtcctctc tggcgtatat gg 522

<210>39

<211>694

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：包含WOSR RF-BN15’侧翼区的序列

<400>39

ggttttcgga ggtccgagac gagttcaaaa atacatttta cataatatat ttttcatata 60

tatatatata tataacattc aaaagtttga attattacat aaacgttttc taaattttct 120

tcaccaaaat tttataaact aaaattttta aatcatgaac aaaaagtatg aatttgtaat 180

ataaatacaa agatacaaat ttttgattga aatattggta gctgtcaaaa aagtaaatct 240

tagaatttaa attaactata gtaaactata tattgaaaat attataaatt tttatcaaat 300

tctcataaat atataaaata aatctaactc atagcatata aaaagaagac taatgtggat 360

caaaatattt acagtttttt agaagtagaa tctttatagt tttatttaaa atatagcaaa 420

aatgatcaca aacctagtta ctttaaccag aagtccaatt caaaatcaaa taaaaataaa 480

aatctatcta aaaaaatatg ttaactacca tgcaaaagta tttttttttg taattagaaa 540

ccctgaaatt tgtacaaaac ttggacccct aggtaaatgc ctttttcatc tcgcgataag 600

aaaaggcaat ttgtagatgt taattcccat cttgaaagaa atatagttta aatatttatt 660

gataaaataa caagtcaggt attatagtcc aagc 694

<210>40

<211>1279

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：包含WOSR中RF-BN13’侧翼区的序列

<400>40

gggggttttt ttttttgatc aataactttg ttgggcttat ggtcgataag cgtgcgcatg 60

tctgatggta catgctaaat gctatatttc tgtttaaagt gttaaaatca ttttctgatg 120

gaactaaatc cagttttaag agtaactgac aagtacaatt aagcacaaca ataaaatagt 180

agtaattggc atctttgatt gttaaatatc aaacaataaa gttcaaaaaa aaataccaac 240

ccaataatga agacttggcg gagacagtgc cgtgcgaagg ttttcggagg tccgagacga 300

gttcaaaaat acattttaca taatatattt ttcatatata tatatatata taacattcaa 360

aagtttgaat tattacataa acgttttcta aattttcttc accaaaattt tataaactaa 420

aatttttaaa tcatgaacaa aaagtatgaa tttgtaatat aaatacaaag atacaaattt 480

ttgattgaaa tattggtagc tgtcaaaaaa gtaaatctta gaatttaaat taactatagt 540

aaactatata ttgaaaatat tataaatttt tatcaaattc tcataaatat ataaaataaa 600

tctaactcat agcatataaa aagaagacta atgtggatca aaatatttac agttttttag 660

aagtagaatc tttatagttt tatttaaaat atagcaaaaa tgatcacaaa cctagttact 720

ttaaccagaa gtccaattca aaatcaaata aaaataaaaa tctatctaaa aaaatatgtt 780

aactaccatg caaaagtatt tttttttgta attagaaacc ctgaaatttg tacaaaactt 840

ggacccctag gtaaattccc tagaaagtat cctattagcg tcgacaaact gttgctcata 900

tttttctctc cttactttat atcatacact aatataaaaa gatgatctaa ttaattattc 960

atttccatgc tagctaattc aagaaaaaga aaaaaaactt attatctaaa cttatattcg 1020

agcaacacct cggagataac aggatatatg tcattaatga atgcttgaac tcatctcgcg 1080

aactcatctc gcatcgctta tagccacaaa gatccaaccc ctctcttcaa tcatatatca 1140

gtagtacaat acaaatagat attgtgagca catatgccgt ctagtactga tgtgtatatg 1200

tagaggagcc gcaaatgttt agtcactcca acaaatgagc atgaccacgc atcttctgat 1260

gatgtacagc cgtcccttt 1279

<210>41

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物268

(BNA04)

<400>41

tggaccccta ggtaaatgcc 20

<210>42

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物BNA05

<400>42

aacgagtgtc agctagacca gc 22

<210>43

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物BNA06

<400>43

cgcagttctg tgaacatcga cc 22

Claims

1.春油料种子油菜植物细胞，其特征在于可使用所述植物细胞的基因组DNA，经聚合酶链反应扩增出长度在195和235bp之间的DNA片段，两条引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No 23和SEQ ID No 41。

2.权利要求1的植物细胞，其特征在于可使用所述植物细胞的基因组DNA，经聚合酶链反应扩增长度为215bp的DNA片段，两条引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No 23和SEQ ID No 41。

3.权利要求1的植物细胞，其进一步的特征在于可使用所述植物细胞的基因组DNA，经聚合酶链反应扩增出长度在260和300bp之间的DNA片段，两条引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No 12和SEQ ID No19。

4.权利要求3的植物细胞，其特征在于可使用所述植物细胞的基因组DNA，经聚合酶链反应扩增出长度为280bp的DNA片段，两条引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No 12和SEQ ID No 19。

5.权利要求1至4中任意一项的植物细胞，其为杂交植物细胞。

6.春油料种子油菜植物细胞，其特征在于可使用所述植物细胞的基因组DNA，经聚合酶链反应扩增出长度在260和300bp之间的DNA片段，两条引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No 12和SEQ ID No 19。

7.权利要求6的植物细胞，其特征在于可使用所述植物细胞的基因组DNA，经聚合酶链反应扩增长度为280bp的DNA片段，两条引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No 12和SEQ ID No 19。

8.产生杂交种子的方法，所述方法包含：

a)将转基因、雄性不育的春油料种子油菜植物与育性恢复春油料种子油菜植物杂交，其中所述转基因、雄性不育春油料种子油菜植物的特点为可使用所述植物的基因组DNA，经聚合酶链反应扩增出长度在260和300bp之间的DNA片段，两条引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No 12和SEQ ID No 19；其中所述育性恢复春油料种子油菜植物包含稳定整合入基因组的育性恢复基因，其中育性恢复基因包含：

-编码核糖核酸酶抑制剂的DNA，和

-组成型启动子；其中所述DNA在同一转录单位中且在所述组成型启动子的控制下；并且

b)从该雄性不育春油料种子油菜植物收获该杂交种子。

9.权利要求8的方法，其中所述育性恢复植物的特征为可使用所述植物的基因组DNA，经聚合酶链反应扩增出长度为215bp的DNA片段，两条引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No 23和SEQ ID No 41。