CN102218138A

CN102218138A - 免疫原性组合物

Info

Publication number: CN102218138A
Application number: CN2011101438611A
Authority: CN
Inventors: R·L·比曼斯; D·布特里奥; C·卡皮奥; P·德内尔; P·迪维维耶; J·普尔曼
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2005-06-27
Filing date: 2006-06-23
Publication date: 2011-10-19
Also published as: HRP20100211T1; CA2611960A1; KR20080018226A; KR101359953B1; MA29993B1; EP1896063A1; SI3009146T1; DK1896063T3; NO345305B1; US20090041802A1; WO2007000343A2; ES2621780T3; NO345422B1; EP1896065B2; US20130004532A1; CY2012027I1; JP5037503B2; US20080199490A1; MX2007016403A; MY148110A

Abstract

本发明公开了包含Hib糖缀合物、至少一种额外的细菌如脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物和选自全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的另一抗原的免疫原性组合物，其中Hib糖缀合物的糖剂量小于5μg。

Description

免疫原性组合物

本申请是2006年6月23日提交的题为“免疫原性组合物”的国家申请号为200680023057.7(PCT/EP2006/006220)的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及免疫原性组合物和疫苗，其包含Hib糖缀合物和至少一种额外的细菌糖缀合物，其与包括全细胞百日咳和/或乙型肝炎表面抗原的其他抗原组合，涉及制备此类免疫原性组合物和疫苗的方法，和使用所述免疫原性组合物和疫苗免疫的用途和方法。

发明背景

已经表明细菌多糖是用于疫苗的有效免疫原，尤其当缀合到载体蛋白时。可以得到抗b型流感嗜血杆菌(

Wyeth-Lederle)、肺炎球菌多糖(

-Wyeth-Lederle)和脑膜炎球菌多糖(

-Wyeth-Lederleand

-Sanofi)的商业缀合疫苗。

还描述了包含Hib缀合物、脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物、全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的免疫原性组合物和疫苗。例如，WO 02/00249公开了7价免疫原性组合物，其包含白喉类毒素、破伤风类毒素、全细胞百日咳、乙型肝炎表面抗原、Hib缀合物、MenA缀合物和MenC缀合物。呈送的临床试验结果使用5μg糖剂量的每种细菌糖缀合物。

发明内容

本发明涉及提供组合疫苗，其包含Hib缀合物、额外的细菌糖缀合物(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物)和其他抗原，包括全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原中的一种或两种。使用的糖剂量允许产生抗Hib和额外的细菌糖以及抗百日咳组分和/或乙型肝炎表面抗原组分的良好的免疫应答。

本发明人已经令人惊奇地发现在包含全细胞百日咳和/或乙型肝炎表面抗原的组合疫苗中，通过降低Hib和/或额外的细菌缀合物的糖剂量到低于每剂5μg，保持对糖缀合物的良好的免疫应答并且全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的免疫原性得到增强(例如，使得如通过ELISA测量的Pw和/或乙型肝炎的GMC高于用含有5μg糖剂量的每种缀合物的免疫原性组合物免疫后实现的水平)。

因此，本发明的第一方面提供了免疫原性组合物，其包含Hib糖缀合物、至少一种额外的细菌糖缀合物，和选自全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的另一抗原，其中Hib糖缀合物的糖剂量小于每剂5μg。

本发明的免疫原性组合物包含Hib糖缀合物，和/或至少或刚好1、2、3或4种细菌糖缀合物，例如，脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物，和选自全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的另一抗原，其中Hib糖缀合物的糖剂量小于5μg或小于4μg，或者在1-4μg或1-3μg，或2-4μg或2-3μg之间，或者约或者刚好2.5μg，任选地，至少或刚好1、2、3或4种额外的细菌糖缀合物(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物)的全部或其每一种的糖剂量小于10μg、9μg、8μg、7μg、6μg、5μg or 4μg，或1-10μg、1-8μg、1-6μg、1-5μg、1-4μg、1-3μg、或2-4μg或2-3μg之间或约或刚好2.5μg。

术语“糖”包括多糖或者寡糖。将多糖从细菌分离或从细菌分离并通过已知的方法(见例如EP497524和EP497525)并任选通过微流化按大小分级到某种程度。可以按大小分级多糖以便减小多糖样品中的粘性和/或提高缀合产物的滤过率。寡糖具有低数目的重复单位(通常5-30个重复单位)并且通常是经水解的多糖。

以施用于人的免疫原性组合物或者疫苗的量测量“糖剂量”。

Hib糖是聚核糖基磷酸酯(PRP)荚膜多糖或者b型流感嗜血杆菌的寡糖。

“至少一种额外的细菌多糖缀合物”是指连接到载体蛋白的任一种细菌糖类的缀合物。细菌糖类任选地是来自脑膜炎奈瑟氏球菌菌株、肺炎链球菌(S.pneumoniae)菌株、伤寒沙门氏菌(S.typhi)菌株的荚膜多糖或者本文所述的任一种细菌糖类。

“至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物”是指脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌W135荚膜糖(MenW)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B荚膜糖(MenB)、血清群C和Y荚膜糖(MenCY)、血清群C和A荚膜糖(MenAC)、血清群C和W135荚膜糖(MenCW)、血清群A和Y荚膜糖(MenAY)、血清群A和W135荚膜糖(MenAW)、血清群W135和Y荚膜糖(MenWY)、血清群A、C和W135荚膜糖(MenACW)、血清群A、C和Y荚膜糖(MenACY)、血清群A、W135和Y荚膜糖(MenAWY)、血清群C、W135和Y荚膜糖(MenCWY)或者血清群A、C、W135和Y荚膜糖(MenACWY)、血清群B和C荚膜糖(MenBC)、血清群B、C和Y荚膜糖(MenBCY)、血清群B、C和A荚膜糖(MenABC)、血清群B、C和W荚膜糖(MenBCW)、血清群A、B和Y荚膜糖(MenABY)、血清群A、B和W荚膜糖(Men ABW)、血清群B、W135和Y荚膜糖(MenBWY)、血清群A、B、C和W135荚膜糖(MenABCW)、血清群A、B、C和Y荚膜糖(MenABCY)；血清群A、B、W135和Y荚膜糖(MenABWY)、血清群B、C、W135和Y荚膜糖(MenBCWY)；或血清群A、B、C、W135和Y荚膜糖(MenABCWY)。

例如，上面所列的加入或者不加入Hib糖缀合物的脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物的任一组合可以以小于5μg或小于4μg、或1-4μg或1-3μg、或2-4μg或2-3μg或约或刚好2.5μg的糖剂量存在。

为了本发明的目的，“约”或“大约”被定义为给定数字的10％上下。

在一个实施方案中，Hib的糖剂量可以与脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物的糖剂量相同、更大或更少。Hib糖缀合物的糖剂量可以为例如至少一种额外细菌(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌)糖缀合物的平均或最低糖剂量的100％或小于90％、80％、75％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％。Hib糖的糖剂量为例如至少一种额外细菌(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌)糖缀合物的平均或最低糖剂量的20％到60％、30％到60％、40％到60％或约或刚好50％。

在本发明的一个实施方案中，所述至少一种额外细菌(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌)糖或者其每一种的剂量相同或者大约相同。

本发明的免疫原性组合物的实例是由下面组成的或包含下面的组合物：

Hib缀合物和MenA缀合物和MenC缀合物，任选地，糖剂量比为2∶2、1∶2∶1、1∶4∶2、1∶6∶3、1∶3∶3、1∶4∶4、1∶5∶5、1∶6∶6(w/w)。任选地，MenA的糖剂量大于MenC的糖剂量。

Hib缀合物和MenC缀合物和MenY缀合物，任选地，糖剂量比为1∶2∶2、1∶2∶1、1∶4∶2、1∶4∶1、1∶8∶4、1∶6∶3、1∶3∶3、1∶4∶4、1∶5∶5、1∶6∶6(w/w)。任选地，MenC的糖剂量大于MenY的糖剂量。

Hib缀合物和MenC缀合物和MenW缀合物，任选地，糖剂量比为1∶2∶2、1∶2∶1、1∶4∶2、1∶4∶1、1∶8∶4、1∶6∶3、1∶3∶3、1∶4∶4、1∶5∶5、1∶6∶6(w/w)。任选地，MenC的糖剂量大于MenW的糖剂量。

Hib缀合物和MenA缀合物和MenW缀合物，任选地，糖剂量比为1∶2∶2、1∶2∶1、1∶4∶2、1∶4∶1、1∶8∶4、1∶6∶3、1∶3∶3、1∶4∶4、1∶5∶5、1∶6∶6(w/w)。任选地，MenA的糖剂量大于MenW的糖剂量。

Hib缀合物和MenA缀合物和MenY缀合物，任选地，糖剂量比为1∶2∶2、1∶2∶1、1∶4∶2、1∶4∶1、1∶8∶4、1∶6∶3、1∶3∶3、1∶4∶4、1∶5∶5、1∶6∶6(w/w)。任选地，MenA的糖剂量大于MenY的糖剂量。

Hib缀合物和MenW缀合物和MenY缀合物，任选地，糖剂量比为1∶2∶2、1∶2∶1、1∶1∶2、1∶4∶2、1∶2∶4、1∶4∶1、1∶1∶4、1∶3∶6、1∶1∶3、1∶6∶3、1∶3∶3、1∶4∶4、1∶5∶5、1∶6∶6(w/w)。任选地，MenY的糖剂量大于MenW的糖剂量。

“其他抗原”包括全细胞百日咳(Pw)和乙型肝炎表面抗原(HepB)中的一种或两种。在一个实施方案中，所述其他抗原还包括白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、无细胞百日咳(Pa)和/或脊髓灰质炎病毒(IPV)。在一个实施方案中，所述其他抗原包含DT、TT、百日咳抗原(Pa或Pw)和HepB或由其组成。在一个实施方案中，所述其他抗原包含或DT、TT、百日咳抗原(Pa或Pw)、HepB和IPV其由组成。

包括在本发明的免疫原性组合物中的Hib和/或脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合到载体蛋白如破伤风类毒素、破伤风类毒素片段C、破伤风毒素的无毒突变体、白喉类毒素、CRM197、白喉毒素的其他无毒突变体[如CRM176，CRM197，CRM228，CRM45(Uchida et al J.Bio1.Chem.218；3838-3844，1973)；CRM9，CRM45，CRM102，CRM103和CRM107，和Nicholls和Youle在遗传工程化的毒素(Genetically Engineered Toxins)，Ed：Frankel，Maecel Dekker Inc，1992中描述的其他突变；US 4709017或US 4950740中公开的Glu-148向Asp、Gln或Ser和/或Ala 158向Gly的缺失或突变和其他突变；US 5917017或US 6455673中公开的至少一个或多个残基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突变或者其他突变；或者US 5843711中公开的片段]、肺炎球菌的肺炎球菌溶血素、OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白-通常从脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B提取-EP0372501)、合成肽(EP0378881、EP0427347)、热休克蛋白(WO93/17712、WO 94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668、EP0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(WO 91/01146)、包含来自多种病原体来源的抗原的人CD4+T细胞表位的人工蛋白质(Falugi等人(2001)Eur J Immunol 31；3816-3824)，如N19蛋白(Baraldoi等人(2004)Infect Immun 72；4884-7)肺炎球菌表面蛋白PspA(WO 02/091998)肺炎球菌溶血素(Kuo等人(1995)Infect Immun 63；2706-13)、铁摄取蛋白(WO01/72337)、难辨梭状芽孢杆菌(C.difficile)的毒素A或B(WO 00/61761)或蛋白D(EP594610和WO 00/56360)。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在Hib缀合物和至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物中，任选在Hib缀合物和每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物(任选免疫原性组合物中存在的所有糖缀合物)中使用相同的载体蛋白。

在一个实施方案中，所述免疫原性组合物任选地包含Hib糖缀合物和Men多糖缀合物、Hib糖缀合物和MenC糖缀合物、Hib糖缀合物和MenW糖缀合物、Hib糖缀合物和MenY糖缀合物、Hib糖缀合物和Men和MenC糖缀合物、Hib糖缀合物和Men和MenW糖缀合物、Hib糖缀合物和Men和MenY糖缀合物、Hib糖缀合物和MenC和MenW糖缀合物、Hib糖缀合物和MenC和MenY糖缀合物、Hib糖缀合物和MenW和MenY糖缀合物、Hib糖缀合物和MenA、MenC和MenW糖缀合物、Hib糖缀合物和MenA、MenC和MenY糖缀合物、Hib糖缀合物和MenA、MenW和MenY糖缀合物、Hib糖缀合物和MenC、MenW和MenY糖缀合物或Hib糖缀合物和MenA、MenC、MenW和MenY糖缀合物。

在一个实施方案中，单一载体蛋白可以携带一种以上的糖抗原(WO04/083251)。例如，单一载体蛋白可以缀合到Hib和MenA、Hib和MenC、Hib和MenW、Hib和MenY、MenA和MenC、MenA和MenW、MenA和MenY、MenC和MenW、MenC和MenY或MenW和MenY。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含缀合到载体蛋白的Hib糖，所述载体蛋白选自TT、DT、CRM197、TT的片段C和蛋白D。

其中对于Hib，所述载体蛋白是TT或者其片段和至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖，载体的总剂量为2.5-25μg、3-20μg、4-15μg、5-12.5μg、15-20μg、16-19μg或17-18μg。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含缀合到载体蛋白的至少1、2、3、或4种脑膜炎奈瑟氏球菌细菌糖，所述载体蛋白选自TT、DT、CRM197、TT的片段C和蛋白D。

本发明的免疫原性组合物任选地包含Hib糖缀合物，其Hib与载体蛋白的比例为1∶5至5∶1；1∶2至2∶1；1∶1至1∶4；1∶2至1∶3.5；或约或刚好1∶2.5或1∶3(w/w)。

本发明的免疫原性组合物任选包含至少一种脑膜炎球菌糖(例如，MenA和/或MenC和/或MenW和/或MenY)缀合物，其Men糖与载体蛋白的比例为1∶5到5∶1、1∶2到5∶1、1∶0.5到1∶2.5或1∶1.25到1∶2.5(w/w)。

使用灭菌的缀合物可以测定缀合物中糖与载体蛋白(w/w)的比例。使用Lowry测定法(例如Lowry等人(1951)J.Biol.Chem.193，265-275或Peterson等人，Analytical Biochemistry 100，201-220(1979))测定缀合物中糖与载体蛋白(w/w)的比例((w/w))并将ICP-OES(电感耦合的等离子体-光学发射光谱法)用于MenA，DMAP测定法用于MenC和间苯二酚测定法用于MenW和MenY(Monsigny等人(1988)Anal.Biochem.175，525-530)以测定糖的量。

在本发明的免疫原性组合物的一个实施方案中，Hib糖通过接头，如双功能接头缀合到载体蛋白。接头任选地是异双功能的或者同双功能的，具有例如一个活性氨基和一个活性羧酸基团、2个活性氨基或2个活性羧酸基团。接头具有例如4到20、4到12、5到10个碳原子。可能的接头是ADH。其他接头包括B-丙酰氨基(WO 00/10599)、硝基苯基-乙胺(Gever等人(1979)Med.Microbiol.Immunol.165；171-288)、卤代烷基卤(US4057685)糖苷键(US4673574，US4808700)和6-氨基己酸(US4459286)。

在本发明的免疫原性组合物中存在的糖缀合物可以通过任何已知的偶联技术制备。例如，可以通过硫醚键将糖偶联。缀合方法可以依赖于用四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶活化糖以形成氰酸酯。从而，活化的糖可以直接或者通过间隔基(接头)被偶联到载体蛋白上的氨基。任选地，用己二胺或者ADH将氰酸酯偶联并且使用涉及硫醚键形成的杂连接化学将氨基衍生的糖缀合到载体蛋白，或者使用碳二亚胺(例如，EDAC或EDC)化学将其缀合到载体蛋白。此类缀合物在PCT公布的申请WO 93/15760 Uniformed Services University和WO 95/08348和WO 96/29094中描述。

其他合适的技术使用碳酰亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。许多在WO 98/42721中描述。缀合可以涉及羰基接头，其可以通过糖的游离羟基与CDI反应(Bethell等人J.Biol.Chem.1979，254；2572-4，Heam等人J.Chromatogr.1981.218；509-18)，接着通过与蛋白质反应形成氨基甲酸酯键而形成。这可以涉及将异头末端还原成伯羟基，任选地保护/去保护伯羟基，使伯羟基与CDI反应形成CDI氨基甲酸酯中间体并将CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白质上的氨基反应。

通过如US 4365170(Jennings)和US 4673574(Anderson)中描述的直接还原胺化方法也可以制备缀合物。其他方法在EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中描述。

另一方面涉及通过碳化二亚胺缩合(Chu C.等人Infect.Immunity，1983 245 256)，例如使用EDAC，将用己二酸酰肼(ADH)衍生的溴化氰(或CDAP)活化的糖偶联到载体蛋白(Chu C.等人Infect.Immunity，1983 245 256)。

在一个实施方案中，将糖上的羟基直接或间接(通过接头)地连接到蛋白质上的氨基或羧基。当存在接头时，任选地例如使用CDAP缀合，将糖上的羟基连接到接头上的氨基。接头(例如ADH)上的另一氨基可以被缀合到蛋白质上的羧酸基团，例如，通过使用碳化二亚胺化学，例如，通过使用EDAC。在一个实施方案中，在接头被缀合到载体蛋白前，首先将Hib或者至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合到接头。

在一个实施方案中，当Hib糖存在时，其被使用CNBr、或者CDAP，或者CDAP和碳化二亚胺化学(如EDAC)的组合，或CNBr和碳化二亚胺化学(如EDAC)的组合缀合到载体蛋白。任选地，使用CNBr和碳化二亚胺化学(任选EDAC)缀合Hib。例如，用CNBr连接糖和接头，然后用碳化二亚胺化学连接接头和蛋白质载体。

在一个实施方案中，至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖中的至少一种被直接缀合到载体蛋白。任选地，将MenW和/或MenY和/或MenC和/或MenA糖直接缀合到载体蛋白。例如，将MenW；MenY；MenC；MenA；MenW和MenY；MenW和MenC；MenY和MenC；或MenW，MenY和MenC直接连接到载体蛋白。任选地，通过CDAP将至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖中的至少一种直接缀合。例如，将MenW；MenY；MenC；MenW和MenY；MenW和MenC；MenY和MenC；或MenW、MenY和MenC通过CDAP直接连接到载体蛋白(见WO 95/08348和WO96/29094)。

任选地，MenW和/或Y糖与载体蛋白的比例为1∶0.5到1∶2(w/w)或者MenC糖与载体蛋白的比例为1∶0.5和1∶2或1∶1.25和1∶1.5或1∶0.5和1∶1(w/w)，特别任选地使用CDAP将这些糖直接连接到蛋白质。

在一个实施方案中，通过接头，如双功能接头将至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合到载体蛋白。接头任选地是异双功能的或者同双功能的，具有例如一个活性氨基和一个活性羧酸基团、2个活性氨基或2个活性羧酸基团。接头具有例如4到20、4到12和5到10个碳原子。可能的接头是ADH。

在一个实施方案中，通过接头将MenA；MenC；或MenA和MenC缀合到载体蛋白。

在一个实施方案中，使用CDAP和EDAC，通过接头将脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合到载体蛋白。例如，使用如上述的CDAP和EDAC，通过接头(例如，在其末端具有两个氨基，如ADH)将MenA；MenC；或MenA和MenC缀合到蛋白质。例如，用CDAP将糖缀合到接头并用EDAC将接头缀合到蛋白质。任选地，对于MenA；MenC；或MenA和MenC，通过接头的缀合导致糖与载体蛋白的比例为1∶0.5到1∶6；1∶1到1∶5或1∶2到1∶4。

在本发明的一个实施方案中，免疫原性组合物包含缀合到载体蛋白的来自血清群A、C、W和Y中的至少1、2、3或4种的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖，其中至少1、2、3或4种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌多糖是天然多糖或者被最高达x1.5、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9、x10或x20的系数按大小分级。例如，至少1、2、3或4种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌多糖的平均大小为约50kDa、60kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa或130kDa。

“天然多糖”是指还没有接受目的是减小该多糖的大小的处理的多糖。

“被最高达x2的系数按大小分级”是指对该多糖进行一种处理，该处理的目的是减小多糖的大小但是保留超过天然多糖大小的一半的尺寸。X3、x4等以相同的方式被解释，即，对多糖进行处理，其目的是减小多糖的大小但是保留超过天然多糖大小1/3、1/4等等的大小。

在本发明的一方面，免疫原性组合物包含缀合到载体蛋白的来自血清群A、C、W和Y的至少1、2、3或4种的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖，其中至少1、2、3或4种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌多糖是天然多糖。

在本发明的一个方面中，免疫原性组合物包含缀合到载体蛋白的来自血清群A、C、W和Y的至少1、2、3或4种的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖，其中至少1、2、3或4种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌多糖被最高达x1.5、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的系数按大小分级。

在一个实施方案中，至少1、2、3或4种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌多糖的平均大小如通过MALLS测定的，为50KDa到1500kDa、50kDa到500kDa、50kDa到300KDa、101kDa到1500kDa、101kDa到500kDa、101kDa到300kDa。

在一个实施方案中，当MenA糖存在时，其具有如通过MALLS测定的50-500kDa、50-100kDa、100-500kDa、55-90KDa、60-70kDa或70-80kDa或60-80kDa的分子量。

在一个实施方案中，当MenC糖存在时，其具有如通过MALLS测定的100-200kDa、50-100kDa、100-150kDa、101-130kDa、150-210kDa或180-210kDa的分子量。

在一个实施方案中，当MenY糖存在时，其具有如通过MALLS测定的60-190kDa、70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa或110-140kDa、50-100kDa、100-140kDa、140-170kDa或150-160kDa的分子量。

在一个实施方案中，当MenW糖存在时，其具有如通过MALLS测定的60-190kDa、70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa、110-140kDa、50-100kDa或120-140kDa的分子量。

糖的分子量是指在缀合之前并且通过MALLS测定的多糖的分子量。

在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌糖是天然多糖或者在正常提取物过程中大小减小的天然多糖。

在一个实施方案中，将脑膜炎奈瑟氏球菌糖通过机械断裂，如通过微流化或者超声处理按大小分级。微流化和超声处理具有降低较大的天然多糖的大小而足以提供可滤过的缀合物的优点。

在一个实施方案中，糖的多分散性是1-1.5、1-1.3、1-1.2、1-1.1或1-1.05并且在缀合到载体蛋白后，缀合物的多分散性为1.0-2.5、1.0-2.0、1.0-1.5、1.0-1.2、1.5-2.5、1.7-2.2或1.5-2.0。所有多分散性都通过是MALLS测量的。

对于脑膜炎球菌糖的MALLS分析，可以组合使用两个柱子(TSKG6000和5000PWxl TOSOH Bioscience)并用水洗脱糖。使用光散射检测器(例如，装备10mW氩激光器的Wyatt Dawn DSP在488nm下)和干涉测量折射计(例如，装备P100测定池和红色滤光器的Wyatt Otilab DSP在498nm下)检测糖类。

在一个实施方案中，当存在时MenA糖，其被至少部分地O-乙酰化，使得至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的重复单位在至少一个位置被O-乙酰化。O-乙酰化例如存在于至少O-位。

在一个实施方案中，当存在时MenC糖，其被至少部分地O-乙酰化，使得至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的(2→9)-连接的NeuNAc重复单位在至少一个或两个位置被O-乙酰化。O-乙酰化例如存在于O-7和/或O-8位。

在一个实施方案中，当存在时MenW糖，其被至少部分地O-乙酰化，使得至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的重复单位在至少一个或两个位置被O-乙酰化。O-乙酰化例如存在于O-7和/或O-9位。

在一个实施方案中，当存在时MenY糖，其被至少部分地O-乙酰化，使得至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的重复单位在至少一个或两个位置被O-乙酰化。O-乙酰化存在于7和/或9位。

O-乙酰化的百分比是指含有O-乙酰化的重复单位的百分比。这可以在缀合之前和/或缀合后在糖中测量。

本发明的另一方面是包含本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂的疫苗。

任选地，免疫原性组合物或疫苗含有足够增强对免疫原的免疫应答量的佐剂。合适的佐剂包括，但不限于，铝盐(磷酸铝或氢氧化铝)、角鲨烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽、皂苷衍生物、分枝杆菌细胞壁制备物、单磷酰脂质A、霉酚酸衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱毒素B亚基、聚磷腈和衍生物，和免疫刺激复合物(ISCOMs)，如Takahashi等人(1990)Nature 344：873-875描述的那些。

对于上文讨论的HibMen组合，有利的是Hib和Men糖缀合物不被吸附到铝盐佐剂或者任何佐剂上。

在一个实施方案中，免疫原性组合物是无佐剂的。对于本发明，“无佐剂的”是指自身不作是抗原性组分的佐剂组分不存在于免疫原性组合物中。

在本发明的一个实施方案中，HepB被吸附到磷酸铝(WO93/24148)。

在一个实施方案中，免疫原性组合物包含通过接头缀合到破伤风类毒素的Hib糖和直接或通过接头缀合到破伤风类毒素的MenC糖和直接或通过接头缀合到破伤风类毒素的MenA糖。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物被缓冲在、或调节到pH 7.0到8.0，pH 7.2到7.6或约或刚好pH 7.4。

任选地在稳定剂如多元醇如蔗糖或者海藻糖存在下冻干本发明的免疫原性组合物或者疫苗。

对于所有免疫原性组合物或疫苗，必须通过经验确定免疫原的免疫学有效量。待考虑的因素包括免疫原性、免疫原是否将与佐剂或载体蛋白或其他蛋白质复合或者共价连接、施用途径和待施用的免疫剂量数。此类因素是疫苗领域已知的并且免疫学家完全可以不用过度实验来做出此类确定。

活性剂可以以不同的浓度存在于本发明的药物组合物或疫苗中。通常，物质的最小浓度是实现它的预期用途必须的量，尽管最大浓度是将保持在溶液中或者均匀悬浮在最初混合物中的最大量。例如，治疗剂的最小量任选地为将提供单一治疗有效剂量的量。对于生物活性物质，最小浓度是重构时生物活性必需的量，并且最大浓度是不能保持均匀悬浮液时的浓度。对于单次剂量单位，所述量是单次治疗应用的量。通常，预期每剂将包含1-100μg蛋白质抗原，任选地5-50μg或5-25μg。本发明的疫苗制剂可以用于保护或治疗对感染敏感的哺乳动物(例如，人类患者)，可以通过全身或粘膜途径施用所述疫苗。人类患者任选地为婴儿(12个月以下)、初学走路的孩子(12-24、12-16或12-14个月)、儿童(2-10、3-8或3-5岁)和青少年(12-25、14-21或15-19岁)或成人(12、15、18或21岁以上)。这些施用可以包括通过肌内、腹膜内、皮内或者皮下途径注射；或者通过粘膜施用到口腔/食道、呼吸道、生殖泌尿道。优选鼻内施用疫苗以治疗肺炎或者中耳炎(如可以有效预防肺炎双球菌的鼻粘膜携带，从而减轻它的最早阶段的感染)。尽管本发明的疫苗可以作为单次剂量施用，但是其组分也可以一起或者在不同的时间共同施用(例如，如果糖存在于疫苗中，那么这些可以在同时分开施用或者在细菌蛋白质疫苗施用后1-2周施用以最佳地协调相互的免疫应答)。除了单一施用途径外，还可以使用2种不同的施用途径。例如，病毒抗原可以ID(皮内)施用，而细菌蛋白质可以IM(肌内)或者IN(鼻内)施用。如果存在糖类，那么它们可以IM(或ID)施用并且病毒蛋白质可以IN(或ID)施用。此外，本发明的疫苗可以被IM施用用作引发剂量，以及IN施用用作加强剂量。

疫苗制剂一般被描述于疫苗设计(“The subunit and adjuvant approach”(Powell M.F.和Newman M.J.著)(1995)Plenum Press New York)。Fullerton，美国专利4,235,877描述了在脂质体内的包裹。

本发明的另一方面是用于相伴或者顺序施用的疫苗试剂盒，其包含两种多价免疫原性组合物，用于在宿主中赋予抗百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)引起的疾病的保护。例如，该试剂盒任选地包含第一个容器和第二容器，第一容器包含一种或多种：

破伤风类毒素(TT)，

白喉类毒素(DT)，和

全细胞百日咳组分和

任选地还包含乙型肝炎表面抗原，

第二个容器包含

Hib糖缀合物，和

至少1、2、3或4种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物，

其中Hib缀合物的糖剂量小于5μg或4μg，或1-4μg或1-3μg，或2-4μg或2-3μg或者约或刚好2.5μg，任选地至少或刚好1、2、3或4种额外的细菌糖缀合物(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物)或其每一种的糖剂量小于10μg、9μg、8μg、7μg、6μg、5μg或4μg、或1-10μg、1-8μg、1-6μg、1-5μg、1-4μg、1-3μg、或2-4μg或2-3μg之间或约或刚好2.5μg。

Hib缀合物和至少一种额外的细菌糖(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌糖)缀合物的实例如上述。上述缀合物的任一种性质可以存在于疫苗试剂盒中。

任选地，本发明的疫苗试剂盒包含第三种组分。例如，本发明的试剂盒任选地包含第一个容器和第二个容器以及第三个容器，第一个容器包含一种或多种：

破伤风类毒素(TT)，

白喉类毒素(DT)，和

全细胞百日咳组分，和

任选包含乙型肝炎表面抗原；

第二个容器包含：

载体蛋白和来自肺炎链球菌的荚膜糖的一种或多种缀合物[其中荚膜糖任选来自选自1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的肺炎球菌血清学]，

而第三个容器包含：

Hib糖缀合物，和

至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物，

其中Hib缀合物的糖剂量小于5μg或4μg，或1-4μg或1-3μg，或2-4μg或2-3μg或者约或刚好2.5μg，并且任选地至少或刚好1、2、3或4种额外的细菌糖缀合物(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物)或其每一种的糖剂量小于10μg、9μg、8μg、7μg、6μg、5μg或4μg、或1-10μg、1-8μg、1-6μg、1-5μg、1-4μg、1-3μg、或2-4μg或2-3μg之间或约或刚好2.5μg。

包含脑膜炎球菌缀合物，如HibMenC、HibMenAC、HibMenAW、HibMenAY、HibMenCW、HibMenCY、HibMenWY、MenAC、MenAW、MenAY、MenCW、MenCY、MenWY或MenACWY的免疫原性组合物，包括与上述那些相似组分的试剂盒任选地包含来自麻疹和/或腮腺炎和/或风疹和/或水痘的抗原。例如，脑膜炎球菌免疫原性组合物含有来自麻疹、腮腺炎和风疹或麻疹、腮腺炎、风疹和水痘的抗原。在一个实施方案中，这些病毒抗原任选地存在于与脑膜炎球菌和/或Hib糖缀合物相同的容器中。在一个实施方案中，将这些病毒抗原冻干。

本发明的另一方面是制备本发明的免疫原性组合物的方法，其包括将Hib糖缀合物与至少一种额外的细菌(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌)糖缀合物和选自全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的另一抗原混合而形成组合物的步骤，其中Hib缀合物的糖剂量小于5μg或4μg，或1-4μg或1-3μg，或2-4μg或2-3μg之间或者约或刚好2.5μg，并且任选地，至少或刚好1、2、3或4种额外的细菌(如脑膜炎奈瑟氏球菌)糖缀合物或其每一种的糖剂量小于10μg、9μg、8μg、7μg、6μg、5μg或4μg、或1-10μg、1-8μg、1-6μg、1-5μg、1-4μg、1-3μg、或2-4μg或2-3μg之间或约或刚好2.5μg。

本发明另一方面是免疫人宿主以抗流感嗜血杆菌和任选地脑膜炎奈瑟氏球菌感染的方法，其包括对宿主施用免疫保护剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒。

本发明的另一方面是本发明的免疫原性组合物，其用于治疗或预防由流感嗜血杆菌和/或脑膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病。

本发明的另一方面是本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒用于生产治疗或预防由流感嗜血杆菌和/或脑膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的药物的用途。

如本文所用的术语“包含”和“包括”被发明人意在与术语“由...组成”和“组成为”在每一方面可以任选地替代。

本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请都引入本文作为参考。

在附随的实施例中阐明本发明。除了另外详细描述的之外，使用本领域技术人员公知和常规的标准技术进行下面的实施例。这些实施例是举例说明性的，并且不限定本发明。

具体实施方案

实施例

实施例1-多糖缀合物的制备

通过Chu等人(Infection and Immunity 1983，40(1)；245-256)开发的偶联化学方法进行流感嗜血杆菌(Hib)PRP多糖与TT的共价结合。通过加入CNBr并在pH10.5温育6分钟活化Hib PRP多糖。将pH降低到pH8.75并加入己二酸二酰肼(ADH)并继续温育90分钟。使用1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳化二亚胺(EDAC)通过碳化二亚胺缩合将活化的PRP偶联到纯化的破伤风类毒素。加入EDAC到活化的PRP以达到0.6mg EDAC/mg活化的PRP的最终比例。调节pH到5.0并加入纯化的破伤风类毒素至达到2mg TT/mg活化的PRP。将所得溶液在温和搅拌下放置3天。通过0.45μm膜过滤后，在用0.2M NaCl平衡的聚丙烯酰胺葡聚糖S500HR(Pharmacia，Sweden)柱上纯化缀合物。

使用(通过MALLS测量在150kDa以上的)天然多糖或者通过温和微流化产生MenC-TT缀合物。使用天然多糖或者如通过实施例2的方法测量的60kDa以上温和微流化的多糖产生MenA-TT缀合物。使用如通过MALLS测量的约100-200kDa的按大小分级的多糖产生MenW和MenY-TT缀合物(见实施例2)。使用匀浆器Emulsiflex C-50装置通过微流化进行按大小分级。然后通过0.2μm滤器过滤多糖。

如WO96/29094和WO 00/56360中所述的进行活化和偶联。简言之，将2M NaCl pH 5.5-6.0中10-20mg/ml浓度的多糖与CDAP溶液(用乙腈/WFI50/50新鲜制备的100mg/ml)混合至最终CDAP/多糖比例为0.75/1或1.5/1。1.5分钟后，用氢氧化钠升高pH到pH10.0。3分钟后，加入破伤风类毒素以达到糖/蛋白质比例对于MenW为1.5/1，对于MenY为1.2/1，对于MenA为1.5/1或对于MenC为1.5/1。反应持续1到2小时。

在偶联步骤之后，加入甘氨酸至甘氨酸/PS(w/w)最终比例为7.5/1并调节pH到pH9.0。将混合物放置30分钟。使用10μm Kleenpak滤器澄清缀合物，然后装载到聚丙烯酰胺葡聚糖S400HR柱上，使用150mMNaCl，10mM或5mM Tris pH7.5的洗脱液。在Opticap 4无菌膜上过滤临床批号。得到的缀合物的平均多糖∶蛋白质比例为1∶1-1∶5(w/w)。

为了通过间隔基将MenA荚膜多糖缀合到破伤风类毒素，使用下面的方法。通过偶联化学方法进行多糖和间隔基(ADH)的共价结合，通过该方法，在受控的条件下通过氰化(cyanylating)试剂四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶

(CDAP)活化多糖。使间隔基通过它的肼基与氰化的PS反应，在间隔基和多糖之间形成稳定的异脲。

用新鲜制备的乙腈/水(50/50(v/v))中的100mg/ml CDAP溶液处理10mg/ml MenA溶液得到CDAP/MenA比例为0.75(w/w)。1.5分钟后，升高pH到pH 10.0。3分钟后，加入ADH得到ADH/MenA比例为8.9。降低溶液的pH到8.75并且进行反应2小时。

在缀合反应前，将纯化的TT融合和将PSA_AH溶液稀释而达到10mg/ml的PSA_AH浓度和10mg/ml的TT浓度。

向PSA_AH溶液中加入EDAC以便达到0.9mg EDAC/mg PSA_AH的最终比例。调节pH到5.0。用蠕动泵(60分钟内)加入纯化的破伤风类毒素达到2mg TT/mg PSA_AH。将所得溶液在+25℃在搅拌下放置60分钟，得到120分钟的最终偶联时间。使用10μm滤器澄清缀合物并用聚丙烯酰胺葡聚糖S400HR柱进行纯化。

实施例2-使用MALLS测定分子量

将检测器连接到HPLC大小排阻柱，从其洗脱样品。一方面，激光散射检测器在16个角度处测量大分子溶液散射的光强度，另一方面，在线放置的干涉测量折射计允许测定洗脱的样品的量。从这些强度可以测定溶液中大分子的大小和形状。

以重量计的平均分子量(M_w)被定义为所有物种的重量乘以它们各自的分子量的和并除以所有物种重量之和。

a)重量-平均分子量：-Mw-

M_{w} = \frac{Σ W_{i} \cdot M_{i}}{Σ W_{i}} = \frac{m_{2}}{m_{1}}

b)数量平均分子量：-Mn-

M_{n} = \frac{Σ N_{i} \cdot M_{i}}{Σ N_{i}} = \frac{m_{1}}{m_{0}}

c)均方根半径：-Rw-和R²w是通过下面定义的平方半径：

R²w或

(r^{2}) w = \frac{Σ m_{i} \cdot r_{i}^{2}}{Σ m_{i}}

(-m_i-是散射中心i的质量，-r_i-是散射中心i和大分子重心之间的距离)。

d)多分散性被定义为比例-Mw/Mn-。

通过装载到组合使用的两个HPLC柱(TSKG6000和5000PWxl TOSOH Bioscience)上，通过MALLS分析脑膜炎球菌多糖。将25μl多糖装载到柱子上并用0.75ml过滤的水洗脱。使用光散射检测器(装备10mW氩激光器的Wyatt Dawn DSP在488nm)和干涉测量折射计(装备P100测量池和红色滤光器的Wyatt Otilab DSP在498nm下)检测多糖。

在Astra 4.72软件中，通过德拜方法使用一次多项式拟合计算所有样品的分子量多分散性和回收。

实施例3与DTPw-HepB混合的HibMenAC-TT缀合物疫苗的II 期临床试验

研究设计：使用5组进行的公开的、随机化的(1∶1∶1∶1∶1)单中心研究。5个组分别在6、10和14周年龄时接受下面的接种方案：

.Tritanrix^TM-HepB/Hib-MenAC 2.5/2.5/2.5：以后称作2.5/2.5/2.5

.Tritanrix^TM-HepB/Hib-MenAC 2.5/5/5：以后称作2.5/5/5

.Tritanrix^TM-HepB/Hib-MenAC 5/5/5：以后称作5/5/5

.Tritanrix^TM-HepB+Hiberix^TM：以后称作Hiberix

.Tritanrix^TM-HepB/Hiberix^TM+Meningitec^TM：以后称作Meningitec

在第一次疫苗剂量(Pre)时和第三次疫苗剂量后1个月(剂量后-3)采集血样。

Tritanrix^TM是GlaxoSmithKline Biologicals S.A上市的DTPw疫苗。

在5组的每一组中使用105名受试者，在该研究中总共使用525名受试者。

表1

*2.5/2.5/2.5疫苗是含有2.5μg每种PRP-TT、MenA-TT和MenC-TT的GSK Biologicals的Hib-MenAC 5/5/5疫苗的剂量稀释液。

将Hib-MenAC疫苗制剂与Tritanirix-HepB即时混合。GSK Biologicals的组合的白喉-破伤风-全细胞百日咳杆菌-乙型肝炎(DTPw-HB)疫苗(Tritanrix-HepB)含有不少于30国际单位(IU)白喉类毒素、不少于60IU破伤风类毒素、不少于4IU杀死的百日咳杆菌和10μg重组的乙型肝炎表面抗原。

参考治疗、剂量和施用方式，批号：

接种方案/部位：一组在6、10和14周年龄时在左股肌内接受Tritanrix.-HepB疫苗并在右股肌内接受Hiberix^TM。另一组在6、10和14周时在左股肌内接受Tritanrix^TM-HepB/Hiberix^TM疫苗和在右股肌内接受Meningitec^TM疫苗。

疫苗/组合物/剂量/批号：使用的Tritanrix^TM-HepB疫苗如下所述。

一剂(0.5ml)GSK Biologicals的b型流感嗜血杆菌缀合物疫苗：Hiberix^TM含有10μg缀合到破伤风类毒素的PRP。在Hiberix组中，将其与无菌稀释剂混合并在Meningitec组中将它与Tritanrix-HepB混合。

一剂(0.5ml)Wyeth Lederle的MENINGITEC^TM疫苗含有：10μg缀合到15μg白喉棒杆菌CRM197的脑膜炎球菌组C的荚膜多糖和铝盐。

结果-对Hib、MenA和MenC产生的免疫应答

表2a 抗-PRP(μg/ml)

表2b SBA-MenC

表2c SBA MenA

表2d 抗-PSC(μg/ml)

表2e 抗-PSA(μg/ml)

表2f 抗-BPT(EL.U/ml)

表2g 抗-HBs(mIU/ml)

结论

表2f和2g表明，当HibMenAC与DTPwHepB在疫苗中混合时，Hib/MenA/MenC的2.5/2.5/2.5剂量比2.5/5/5剂量产生更高的抗百日咳类毒素和乙型肝炎表面抗原的免疫应答，2.5/5/5剂量又比5/5/5剂量产生更高的抗百日咳类毒素和乙型肝炎表面抗原的免疫应答。表2a-e表明低剂量的HibMenA和MenC仍然实现对Hib、MenA和MenC的良好的免疫应答，99-100％的患者实现高于所选阈值的免疫应答。

实施例4 HibMenAC临床试验-用HibMenAC缀合物引发

进行II期公开的随机化研究以评估Tritanrix^TM-HepB/HibMenAC疫苗的初步接种过程诱导的免疫记忆，并评估在用Tritanrix^TM-HepB/Hib-MenAC引发的年龄为15到18个月的受试者中与GSK Biologicals的Hib-MenAC缀合疫苗或者GSK Biologicals的Hib_2.5疫苗混合的GSK Biologicals的Tritanrix^TM-HepB疫苗的加强剂量的免疫原性和反应原性。5组在6、10和14周时接受初步接种方案，如表3中列出。

表3

在普通多糖(PS)加强时(即PS前-10月)和普通多糖加强后1个月(即PS后-11月)，从组1、3、5、7和9采集血样。

注意：已经给出了接受普通多糖加强(即，组1、3、5、7和9)的5个组中得到的免疫原性结果。

受试者数目：计划的：450(每组45个受试者)

参加的：在接受普通多糖加强的组1、3、5、7和9中，共193名受试者(组1中42名，组3中39名，组5中37名，组7中36名，组9中39名)参加。完成的：不适用

免疫原性：总共参加的人群＝193名受试者

注意：在该研究中，总共参加的人群＝总的接种的人群。

诊断和加入的标准：年龄为10个月的男性或女性受试者，其已经完成了在实施例1中描述的三剂初步接种过程，没有明显的健康问题，在初步研究的研究加入访问以来还没有接受以前的针对白喉、破伤风、百日咳、乙型肝炎、脑膜炎球菌血清群A或C和/或Hib疾病的加强接种。在研究进入前，从受试者的父母/监护人得到书面知情同意。

研究疫苗、剂量、施用方式、批号：该研究中使用的所有疫苗都由GSK Biologicals研究和生产。

接种方案/部位：组1、3、5、7和9中的受试者接受组合的多糖A和多糖C疫苗，1/5剂量的Mencevax^TM AC和10μg普通PRP作为10个月龄时分别在左和右前外侧股的肌内注射。

治疗的持续时间：整个研究的持续时间为每名受试者约6到9个月，其包括在15到18个月龄时施用的加强接种。在第11个月时进行中间分析(即在10个月时普通多糖加强施用后1个月)。

评估标准：在普通多糖加强施用前和施用后1个月，组1、3、5、7和9的评估标准如下：

-SBA-MenA抗体效价≥1∶8

-SBA-MenC抗体效价≥1∶8

-抗-PSA抗体浓度≥0.3μg/ml

-抗-PSC抗体浓度≥0.3μg/ml

-抗-PRP抗体浓度≥0.15μg/ml。

统计学方法：该中间分析是基于总的参加的人群。所有分析都是纯粹描述性的并且没有计算对任何终点的统计推断。仅对在10个月时接受普通多糖加强的5组(即组1、3、5、7和9)进行分析。尽管这5个组是初步研究中主要组的亚组，但是按照主要研究组分配给出结果。

免疫原性分析：已经在该实施例中给出了在三个时间点得到的结果，即主要接种研究中第三次疫苗剂量(实施例1)、在多糖加强施用前(即，10个月龄时)用以评估初步接种后免疫应答的持久性和施用多糖加强后1个月(即11个月龄时)用以评估初步接种诱导的免疫记忆。在每个时间点：为血清杀细菌测定法(GMCs or GMTs)列表显示具有95％置信区间(CIs)的几何平均抗体浓度或者效价(GMCs或GMTs)-MenC、SBA-MenA、抗-PSC、抗-PSA和抗-PRP。为每种抗体计算具有刚好95％ CI的血清阳性或者血清保护。针对每种抗原和血清学使用反向累加曲线(RCCs)研究多糖加强和多糖加强后一个月的抗体浓度或效价。

结果

人口统计结果：所有参加的人群的平均年龄为43.2周，标准差为6.5周。男性与女性比例为1.3(110/83)。所有受试者都属于东亚或者东南亚人种。

免疫原性结果：全部参加的人群的免疫原性结果在表4中列出。

表4a

表4b

结论

在SBA测定法中，含有较低量Hib的HibMenAC 2.5/5/5缀合物疫苗制剂倾向于比含有等量的所有三种缀合物的疫苗制剂产生针对MenA和MenC的更好的免疫记忆。这可以从POST-PS读数的比较看出。因此，在引发中使用2.5/5/5制剂导致较优的免疫记忆应答。

观察PIII(M3)数据，对于Hib(22.5 v 17)和MenC(通过SBA，76 v 48或56和5339 v 3342或3863)，用2.5/5/5制剂观察到较高的读数。

实施例5a：在2、4和6个月婴儿中使用与Infanrix penta和Prevenar 同时给予的HibMenCY的临床试验

研究设计：使用5个平行组进行的II期、公开的(部分双盲的*)、随机化的(1∶1∶1∶1∶1)、对照的多中心研究，所述平行组在2、4和6个月龄时接受如下的相伴疫苗作为3剂量初步接种：

～组Hib-MenCY 2.5/5/5：

～组Hib-MenCY 5/10/10：

～组Hib-MenCY 5/5/5：

～组Menjugate：

～组ActHIB：

*Hib-MenCY(2.5/5/5)和Hib-MenCY(5/10/10)以双盲的方式被施用。Hib-MenCY(5/5/5)制剂不能被双盲施用，因为它通过用1.0ml稀释剂重构Hib-MenCY(10/10/10)制备(半数溶液丢弃，并且施用剩余的0.5ml)，而Hib-MenCY(2.5/5/5)和Hib-MenCY(5/10/10)制剂在用0.5ml稀释剂重构后被施用。

**将给来自该组的受试者在加强研究792014/002结束时提供根据处方信息提供两剂许可的肺炎球菌缀合疫苗。

在初步接种过程之前和完成后一个月，从所有受试者得到血样(4.0ml)(研究月0和研究月5)。

研究计划为用400名受试者进行，5组中每组80名受试者。在研究中用共398名受试者完成(组Hib-MenCY 2.5/5/5：80组Hib-MenCY5/10/10：81；组Hib-MenCY 5/5/5：78；组Menjugate：81；组ActHIB：78)。

接种方案/部位：在约2、4和6个月龄时，如下所述，以两个月间隔肌内注射三次剂量：

表5：施用的疫苗和部位

表6：候选疫苗制剂和批号

*通过用1.0ml稀释剂溶解Hib-MenCY 10/10/10制剂来制备Hib-MenCY5/5/5；施用0.5ml并丢弃剩余的0.5ml。

评估标准：

免疫原性：在第一次剂量(第0个月)之前和第三次剂量后约1个月(第5个月)在所有受试者中测量针对每种疫苗抗原的抗体的效价/浓度。通过杀细菌测试(测定截断值：1∶8和1∶128的稀释度)测定针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C和Y(SBA-MenC和SBA-MenY)的杀细菌抗体效价，通过ELISA测定抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C和Y(抗-PSC和抗-PSY，测定截断值≥0.3μg/ml和≥2μg/ml)、Hib多糖PRP(抗-PRP，测定截断值≥0.15μg/ml和≥1.0μg/ml)、三种百日咳抗原(抗-PT、抗-FHA、抗-PRN，测定截断值≥5EL.U/ml)的抗体、抗乙型肝炎表面抗原(抗-HBs，测定截断值≥10mIU/mL)、白喉和破伤风类毒素(抗-白喉和抗-破伤风，测定截断值0.1IU/ml)；抗-1、2和3型脊髓灰质炎病毒(测定截断值1∶8)；7种肺炎球菌血清群抗-4，抗-6B，抗-9V，抗-14，抗-18C，抗-19F，抗-23F(测定截断值0.05μg/ml)的抗体。

对百日咳抗原的初级疫苗应答被定义为在以前检测不到抗体的受试者中在第三次剂量后为血清阳性(可检测的抗体)或者在最初血清阳性的受试者中至少维持接种前抗体浓度。

安全性(评估标准)：施用每种疫苗剂量后8天(第0到7天)随访，由受试者的父母/监护人在日记卡片上报告请求的局部(疼痛、发红、肿胀)和全身性(困倦、发热、易激惹和厌食)症状；和在整个研究期间严重的不利事件(SAE)。

统计学方法：

免疫原性

针对每种抗原将具有95％置信区间(CI)的几何平均抗体浓度或者效价(GMC/Ts)列成表。通过取log10浓度或者效价转换的平均值的底为10的反对数(反-log10)进行GMC/Ts的计算。低于测定法截断值的抗体浓度或者效价给出用于GMC/T计算目的的截断值一半的任意值。计算具有高于指定的测定法截断值的抗体浓度/效价或者具有刚好95％ CI的疫苗应答的受试者的百分比。接种后针对每种抗原使用反向累积抗体曲线研究抗体浓度/效价。将7种肺炎球菌抗原的抗体浓度分布制表。

针对每种抗体以探索方式评估Hib-MenCY组之间与对照组相比的差异，只是SBA-MenY和抗-PSY除外，就(1)对照组(负的)和Hib-MenCY组之间，高于指定的截断值或者具有标准化的无症状95％ CI的疫苗应答的受试者的百分比的差异，(2)对照组相对于Hib-MenCY组的GMC或GMT比(95％ CI)来说。对于SBA-MenC和抗-PSC，对照组为Menjugate；对于所有其他抗原，对照组为组ActHIB。进行相同的比较以针对抗-PRP、SBA-MenC、抗-PSC、SBA-MenY、抗-PSY和抗-破伤风抗体评估每对Hib-MenCY制剂之间的差异。

血清保护/血清阳性率&GMC/Ts(免疫原性的ATP群)

表7a 抗-PRP(μg/m1)

表7b SBA-MenC(1/Dil)

表7c 抗-PSC(μg/ml)

表7d SBA-MenY(1/Dil)

表7e 抗-PSY(μg/ml)

结论

按照免疫原性和SBA结果，2.5/5/5和5/10/10制剂导致抗Hib、MenC和MenY的较高的效价。因此，组合的缀合疫苗中包括较低剂量的Hib缀合物得到较优的结果。

共同施用Hib-MenCY与Infanrix penta和Prevenar^TM得到令人满意的结果。

实施例5b 共同施用HibMenCY与Prevenar ^TM 对于对肺炎球菌多糖的应答的影响

实施例3的研究的另一方面是研究针对Prevenar^TM疫苗中存在的7种肺炎球菌多糖产生的抗体的水平，以便评估共同施用HibMenCY对针对肺炎球菌多糖产生的抗体效价的影响。

在表8中显示了对7种肺炎球菌血清群具有≥0.05μg/ml和≥0.2μg/ml的抗体的受试者的GMC和百分比。除了6B血清群之外，7vPn组分的血清阳性率在各组间为95.5-100％(抗体浓度≥0.05μg/ml)到93.9-100％(抗体浓度≥0.2μg/ml)。对于6B血清群，血清阳性率在各组间为88.4-98.6％(抗体浓度≥0.05μg/ml)和81.2-91.4％(抗体浓度≥0.2μg/ml)(ActHIB组：92.3％≥0.05μg/ml；86.2％≥0.2μg/ml)。

表8a 抗-4

表8b 抗-6B

表8c 抗-9V

表8d 抗-14

表8e 抗-18C

表8f 抗-19F

表8g 抗-23F

结论

共同施用所有三种剂型的HibMenCY与Prevnar导致针对7种肺炎球菌血清群的满意的免疫应答。血清群6B是难以引起针对其的应答的免疫原。对于6B，使用HibMenC的较低的Hib剂量制剂实现了较高的受试者的GMC和百分比达到了两个阈值水平。因此，使用较低剂量的Hib缀合疫苗以与肺炎球菌多糖缀合物共同施用导致抗6B抗原的较好的应答。

实施例6-根据2、3和4个月方案与Infanrix penta共同施用Hib MenCY的II期临床试验

研究设计：对使用接受如下疫苗的三次剂量初步方案的5个组进行II期公开的(部分双盲的*)随机化对照的多中心研究：

组Hib-MenCY 2.5/5/5：Hib-MenCY(2.5/5/5)+Infanrix^TM penta

组Hib-MenCY 5/10/10：Hib-MenCY(5/10/10)+Infanrix^TM penta

组Hib-MenCY 5/5/5：Hib-MenCY(5/5/5)+Infanrix^TM penta

组Hib-MenC：Hib-MenC(5/5)+Infanrix^TM penta

组Menjugate：Menjugate^TM**+Infanrix^TM hexa(对照)。

*将Hib-MenCY 2.5/5/5，Hib-MenCY 5/10/10和Hib-MenC以双盲方式施用而Hib-MenCY 5/5/5组和Menjugate组是公开的。

**Menjugate^TM是施用于组中所有受试者的疫苗。

在+/-2、3、4个月年龄时接种(研究第0月、第1月和第2月)，并在初步接种前和接种后一个月(研究第0月和第3月)从所有受试者收集血样(3.5ml)。

研究疫苗、剂量、施用方式、批号：在约2、3和4个月年龄时以1个月间隔肌内注射三种剂量，如下所述：

表8：施用的疫苗(研究和对照)、组和方案/部位和剂量

免疫原性：对每种疫苗抗原测量抗体效价/浓度：

在所有受试者中对于：SBA-MenC和SBA-MenY、抗-PSC和抗-PSY、抗-PRP、抗-T、抗-FHA、抗-PRN和抗-PT，在第一次剂量之前(第0月)和第三次剂量后约1个月(第3个月)。使用抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C和Y(SBA-MenC和SBA-MenY截断值：1∶8和1∶128)的血清杀细菌活性；对于抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C和Y多糖(抗-PSC IgG和抗-PSY IgG)，ELISA测定法具有截断值≥0.3μg/ml和≥2μg/ml；对于Hib多糖聚-核糖基-核糖醇-磷酸(抗-PRP IgG)≥0.15μg/ml和≥1.0μg/ml；对于抗-FHA、抗-PRN、抗-PT，为5EL.U/ml；≥0.1IU/ml抗-破伤风类毒素(抗-TT)。对于抗-D、抗-HBs和抗-脊髓灰质炎1、2和3，在所有受试者中在第三次剂量后仅一个月(第3个月)。使用ELISA测定法的截断值：对于抗白喉(抗-D)为0.1IU/ml；对于抗乙型肝炎病毒(抗-HBs)为≥10mIU/ml；和微量中和试验截断值：对于抗脊髓灰质炎1、2和3型(抗脊髓灰质炎1、2和3)为1∶8。

统计方法：

对于SBA-MenC、抗-PSC、SBA-MenY、抗-PSY、抗-PRP、抗-破伤风、抗-PT、抗-FHA和抗-PRN在接种之前和之后一个月，对于抗-白喉、抗-HBs、抗-脊髓灰质炎1、抗-脊髓灰质炎2和抗-脊髓灰质炎3在接种后一个月，计算每组具有95％置信区间(95％ CI)的血清保护/血清阳性率和几何平均浓度/效价(GMCs/GMTs)。在接种后一个月，还计算对于抗-PT、抗-PRN和抗-FHA具有95％ CI的疫苗应答(在最初血清阴性的受试者中出现抗体或者在最初血清阳性的受试者中至少保持抗体浓度)。还给出了第3个月时每种抗体的反向累积曲线(Reverse cumulative curve)。对于每种抗体，以外推的方式评估与Menjugate^TM对照组相比，在Hib-MenCY和Hib-MenC组之间的差异，只是SBA-MenY和抗-PSY除外，就(1)对于Menjugate^TM组(负的)和Hib-MenCY和Hib-MenC组之间高于指定的截断值或者具有标准化的无症状95％ CI的疫苗应答的受试者百分比之间的差异，(2)Menjugate^TM组相对于Hib-MenCY和Hib-MenC组(具有它们的95％ CI)的GMC或GMT比率。进行相同的比较以评估对于抗-PRP、SBA-MenC、抗-PSC、SBA-MenY、抗-PSY和抗-TT抗体，每对Hib-MenCY制剂之间的差异。

根据症状的类型、它们的强度和与接种的关系，按组计算局部和全身的症状的总体发生率(在接种后8天内报道全身、局部和任何引起的症状和它们的95％ CI的受试者百分数)。按组计算未引起的症状的发生率。对于第3级症状，提供了≤48小时的发作、医学观察、持续事件、与接种的关系。还完全描述了严重的不利事件。

血清保护/血清阳性率和GMC/Ts(免疫原性的ATP群)

表9a 抗-PRP(μg/ml)

表9b SBA-MenC(效价)

表9c 抗-PSC(μg/ml)

表9d SBA-MenY(效价)

表9e 抗-PSY(μg/ml)

表9e 抗-破伤风(IU/ml)

组Hib-MenCY 2.5/5/5：Hib-MenCY(2.5/5/5)+Infanrix^TM penta

组Hib-MenCY 5/10/10：Hib-MenCY(5/10/10)+Infanrix^TM penta

组Hib-MenCY 5/5/5：Hib-MenCY(5/5/5)+Infanrix^TM penta

组Hib-MenC：Hib-Men(5/5)+Infanrix^TM hexa

组Menjugate：Menjugate^TM+Infanrix^TM penta

N＝具有可得到的结果的受试者数目。％＝具有特定范围内的浓度/效价的受试者百分数。GMC/T：几何平均浓度/效价95％ CI＝95％置信区间；LL＝下限；UL＝上限。

结论

使用具有降低剂量的Hib的两种制剂，针对Hib和MenC的免疫应答是较优的。对于MenY，使用2.5/5/5和5/10/10制剂与5/5/5制剂相比看到提高的SBA应答。

Claims

1.免疫原性组合物，其包含Hib糖缀合物、至少一种额外的细菌如脑膜炎奈瑟氏球菌的糖缀合物以及选自由全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原组成的组的另一抗原，其中Hib糖缀合物的糖剂量小于5μg。

2.权利要求1的免疫原性组合物，其中至少一种额外的细菌，例如，脑膜炎奈瑟氏球菌的糖缀合物或者其每一种的糖剂量小于6μg。

3.权利要求1的免疫原性组合物，其中至少一种额外的细菌，例如，脑膜炎奈瑟氏球菌的糖缀合物包含来自选自血清群A、B、C、W135和Y的菌株的脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖。

4.权利要求3的免疫原性组合物，其包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)。

5.权利要求3或4的免疫原性组合物，其包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)。

6.权利要求3-5中任一项的免疫原性组合物，其包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)。

7.权利要求3-6中任一项的免疫原性组合物，其包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖(MenW)。

8.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其包含DT、TT、Pw和HepB。

9.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B外膜泡制剂。

10.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其包含来自选自血清群1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的菌株的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖。

11.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其包含伤寒沙门氏菌荚膜糖。

12.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中相同的载体蛋白被用于Hib缀合物和所述的至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物或其每一种。

13.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中Hib糖被缀合到选自TT、DT、CRM197、TT的片段C、蛋白D、OMPC和肺炎链球菌溶血素的载体蛋白。

14.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖或其每一种被缀合到选自TT、DT、CRM197、TT的片段C、蛋白D、OMPC和肺炎链球菌溶血素的载体蛋白。

15.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中在Hib糖缀合物中Hib与载体蛋白的比例为1∶5到5∶1、1∶1到1∶4、1∶2到1∶3.5或约1∶3(w/w)。

16.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中Hib糖经由接头被缀合到载体蛋白。

17.权利要求16的免疫原性组合物，其中所述接头是双功能的。

18.权利要求17的免疫原性组合物，其中所述接头具有两个活性氨基。

19.权利要求17的免疫原性组合物，其中所述接头具有两个活性羧酸基团。

20.权利要求16的免疫原性组合物，其中所述接头在一端具有活性氨基并且在另一端具有活性羧酸基团。

21.权利要求16-20中任一项的免疫原性组合物，其中所述接头具有4到12个碳原子。

22.权利要求16或17的免疫原性组合物，其中所述接头是ADH。

23.权利要求1-22中任一项的免疫原性组合物，其中使用CNBr或CDAP将Hib糖缀合到载体蛋白或接头。

24.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中使用碳化二亚胺化学方法、任选地使用EDAC化学方法将载体蛋白缀合到Hib糖或接头。

25.前面权利要求任一项的免疫原性组合物，其中脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物或其每一种具有1∶5-5∶1或1∶1-1∶4(w/w)的糖∶载体比例。

26.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖被直接缀合到载体蛋白。

27.权利要求26的免疫原性组合物，其中至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖是MenW和/或MenY、MenW和/或MenC、MenY和/或MenC、或MenW和MenC和MenY。

28.权利要求26或27的免疫原性组合物，其中通过CDAP化学方法将至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖直接缀合。

29.权利要求26-28中任一项的免疫原性组合物，其中MenW和/或Y糖与载体蛋白的比例为1∶0.5到1∶2。

30.权利要求26-29中任一项的免疫原性组合物，其中MenC糖与载体蛋白的比例为1∶0.5到1∶2。

31.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中经由接头将一种或多种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合到载体蛋白。

32.权利要求31的免疫原性组合物，其中所述接头是双功能的。

33.权利要求32的免疫原性组合物，其中所述接头具有两个活性氨基。

34.权利要求32的免疫原性组合物，其中所述接头具有两个活性羧酸基团。

35.权利要求32的免疫原性组合物，其中所述接头在一端具有活性氨基并且在另一端具有活性羧酸基团。

36.权利要求31-35的免疫原性组合物，其中所述接头具有4到12个碳原子。

37.权利要求31或32的免疫原性组合物，其中所述接头是ADH。

38.权利要求31-37任一项的免疫原性组合物，其中通过CDAP化学方法将一种或多种脑膜炎奈瑟氏球菌糖或者其每一种缀合到接头。

39.权利要求31-38中任一项的免疫原性组合物，其中使用碳化二亚胺化学方法，任选地使用EDAC将所述载体蛋白缀合到接头。

40.权利要求31-39中任一项的免疫原性组合物，其中在载体蛋白被缀合到接头之前，将每种脑膜炎奈瑟氏菌糖或每一种缀合到接头。

41.权利要求31-40中任一项的免疫原性组合物，其中经由接头将MenA缀合到载体蛋白。

42.权利要求41的免疫原性组合物，其中MenA糖与载体蛋白的比例为1∶2到1∶5。

43.权利要求31-42中任一项的免疫原性组合物，其中通过接头将MenC缀合到载体蛋白。

44.权利要求43的免疫原性组合物，其中MenC糖与载体蛋白的比例为1∶2到1∶5。

45.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中当MenA糖存在时，其具有高于50kDa、75kDa、100kDa的分子量或者50-100kDa、55-90KDa或60-80kDa的平均大小。

46.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中当MenC糖存在时，其具有高于50kDa、75kDa、100kDa的分子量或者100-200kDa、100-150kDa或150-200kDa之间的平均大小。

47.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中当MenY糖存在时，其具有高于50kDa、75kDa、100kDa的分子量或者60-190kDa、70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa或110-140kDa之间的平均大小。

48.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中当MenW糖存在时，其具有高于50kDa、75kDa、100kDa的分子量或者60-190kDa、70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa或110-140kDa之间的平均大小。

49.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中当MenC存在时，其被至少部分地O-乙酰化，使得至少30％的重复单位在至少一个位置被O-乙酰化。

50.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中当MenY存在时，其被至少部分地O-乙酰化，使得至少20％的重复单位在至少一个位置被O-乙酰化。

51.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中当MenW存在时，其被至少部分地O-乙酰化，使得至少30％的重复单位在至少一个位置被O-乙酰化。

52.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中当MenA存在时，其被至少部分地O-乙酰化使得至少50％的重复单位在至少一个位置被O-乙酰化。

53.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中hib糖缀合物和至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物不被吸收到铝盐上。

54.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其是无佐剂的。

55.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其被缓冲在pH 7.0到8.0之间。

56.疫苗，其包含权利要求1-55中任一项的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂。

57.用于相伴或者顺序给药的疫苗试剂盒，其包含两种多价免疫原性组合物，该组合物用于在宿主中赋予抗由百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)引起的疾病的保护，所述试剂盒包含第一个容器和第二个容器，第一个容器包含：

破伤风类毒素(TT)，和

白喉类毒素(DT)，和

全细胞百日咳组分，和/或乙型肝炎表面抗原；

第二个容器包含含有权利要求1-55中任一项的免疫原性组合物的免疫原性组合物。

58.权利要求57的疫苗试剂盒，其中所述第一个容器还包含吸附到磷酸铝上的乙型肝炎表面抗原。

59.权利要求57或58的疫苗试剂盒，其中所述第一个或第二个容器还包含失活的脊髓灰质炎病毒(IPV)。

60.用于制备权利要求1-55中任一项的免疫原性组合物的方法，其包括将Hib缀合物与至少一种额外的细菌糖缀合物和选自全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的另一抗原混合以形成组合物的步骤，其中Hib糖缀合物的糖剂量小于5μg并且至少一种额外的细菌糖缀合物或者其每一种的糖剂量小于6μg。

61.免疫人宿主以抗脑膜炎的方法，其包括对该宿主施用免疫保护剂量的权利要求1-59中任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒。

62.免疫人宿主以抗由流感嗜血杆菌引起的疾病的方法，其包括对该宿主施用免疫保护剂量的权利要求1-59中任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒。

63.免疫人宿主以抗由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的方法，其包括对该宿主施用免疫保护剂量的权利要求1-59中任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒。

64.用于治疗或预防脑膜炎的权利要求1-59中任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒。

65.用于治疗或预防由流感嗜血杆菌引起的疾病的权利要求1-59中任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒。

66.用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的权利要求1-59中任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒。

67.权利要求1-59中任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒在生产用于治疗或预防脑膜炎的药物中的用途。

68.权利要求1-59中任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒在生产用于治疗或预防由流感嗜血杆菌引起的疾病的药物中的用途。

69.权利要求1-59任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒在生产用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的药物中的用途。