MX2007016405A

MX2007016405A - Proceso para fabricar vacunas.

Info

Publication number: MX2007016405A
Application number: MX2007016405A
Authority: MX
Inventors: Ralph Leon Biemans; Pierre Duvivier
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 2005-06-27
Filing date: 2006-06-23
Publication date: 2008-03-07
Also published as: HRP20100211T1; CA2611960A1; KR20080018226A; KR101359953B1; MA29993B1; EP1896063A1; SI3009146T1; DK1896063T3; NO345305B1; US20090041802A1; WO2007000343A2; ES2621780T3; NO345422B1; EP1896065B2; US20130004532A1; CY2012027I1; JP5037503B2; US20080199490A1; MX2007016403A; MY148110A

Abstract

La presente solicitud describe un metodo mejorada para realizar reacciones de conjugacion de sacarido-proteina usando quimica de condensacion por carbodiimida. Dependiendo de la naturaleza del portador sacarido o proteina involucrando, la calidad del conjugado puede mejorarse anadiendo lentamente a la mezcla de reaccion uno de los componentes de la reaccion. Tambien se proporciona composiciones inmunogenas que contienen los conjugados de sacarido-proteina elaborados mediante los metodos descritos.

Description

PROCESO PARA FABRICAR VACUNAS La presente invención se refiere a métodos mejorados para realizar reacciones de condensación por carbodiimida. En particular, se refiere a la conjugación de sacáridos y proteínas usando condensación por carbodiimida. También se refiere a composiciones inmunógenas que se pueden elaborar para que contengan el conjugado sacárido-proteínas de la invención. El uso de polisacáridos capsulares bacterianos ha sido aplicado ampliamente en inmunología durante muchos años para la prevención de enfermedades bacterianas. Un problema con este uso, sin embargo, es la naturaleza independiente de T de la respuesta inmunitaria. Estos antígenos por lo tanto son poco inmunógenos en los niños pequeños. Este problema ha sido superado conjugando los antígenos polisacáridos con un portador proteína (una fuente de epítopos T auxiliares) los cuales se pueden usar entonces para producir una respuesta inmunitaria dependiente de T, aún en el primer año de vida. En la materia se conocen diversas técnicas de conjugación, los conjugados se pueden preparar mediante métodos de aminación reductiva directa según se describe en US 4365170 (Jennings) y US 4673574 (Anderson). Otros métodos se describen en EP-0-161-188, EP-208375 y EP-0-477508. El método de conjugación alternativamente se puede apoyar en activación de grupos hidroxilo del sacárido con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilam¡no piridinio (CDAP) para formar un éster cianato. El sacárido activado puede ser acoplado de esta forma directamente o por medio de un grupo separador (enlazante) a un grupo amino en la proteína portadora. Por ejemplo, el éster cianato puede ser acoplado con hexano diamina o dihidrazida de ácido adípico (ADH o AH) y el sacárido derivado de amino se conjuga con la proteína portadora usando usando química con carbodiimida (por ejemplo EDAC o EDC) por medio de un grupo carboxilo en el portador proteína. Estos conjugados están descritos en la solicitud del TCP publicada WO 93/15760 Uniformed Services University y WO 95/08348 y WO 96/29094. Véase también Chu C. et al. Infect. Immunity, 1983 245 256. En general los siguientes tipos de grupos químicos en un portador proteína se pueden usar para acoplamiento / conjugación: A) Carboxilo (por ejemplo por medio de ácido aspártico o ácido glutámico) el cual puede estar conjugado con grupos amino naturales o derivados en porciones sacárido usando química con carbodiimída; B) Grupo amino (por ejemplo por medio de lisina) el cual puede estar conjugado con grupos carboxilo naturales o derivados en porciones sacárido usando química con carbodiimida; C) Sulfhidrilo (por ejemplo por medio de cisteína); D) Grupo hidroxilo (por ejemplo por medio de tirosina); E) Grupo imidazolilo (por ejemplo por medio de histidina); F) Grupo guanidilo (por ejemplo por medio de arginina); y G) Grupo indolilo (por ejemplo por medio de triptófanó).

En un sacárido, en general los siguientes grupos se pueden usar para un acoplamiento: O H , COOH o N H2. Los grupos aldeh ido se pueden generar después de diferentes tratamientos conocidos en la técnica tales como: periodato, hidrólisis acida, peróxido de hidrógeno, etc. Enfo ues para acoplam iento directo: Sacárido-OH + CNBr o CDAP - - > éster cianato + N H2-Prot -> conjugado Sacárido-aldeh ído + N H2-Prot > base Schiff + NaCNBH3--> conjugado Sacárido-COOH + NH2-Prot + EDAC — > conjugado Sacárido-N H2 + COOH-Prot + EDAC > conjugado Enfoques para acoplamiento indirecto por medio de separador (enllazante): Sacárido-OH + CN Br o CDAP — -> éster cianato + NH2 NH2 — > sacárido — N H2 + COOH-Prot + EDAC > conjugado Sacárido-OH + CNBr o CDAP > éster cianato + NH2 SH > sacárido SH + SH-Prot (proteína natural con una cisteína expuesta u obtenida después de modificación de grupos amino de la proteína medíante SPDP por ejemplo) — > sacárido-S-S-Prot Sacárido-OH + CN Br o CDAP > éster cianato + NH2 SH — > sacárido — SH + maleimida-Prot (modificación de grupos amino) > conjugado Sacárido-COOH + EDAC + N H2 -— N H2 — -> sacárido N H2 + EDAC + COOH- Prot ----> conjugado Sacárido-COOH + EDAC+ NH2 — - SH — -> sacárido — - SH + SH-Prot (proteína natural con una cisteína expuesta u obtenida después de modificación de grupos amino de la proteína mediante SPDP por ejemplo) > sacárido-S-S-Prot Sacárido-COOH + EDAC+ NH2 — - SH ----> sacárido SH + maleimida-Prot (modificación de grupos amino) — > conjugado Sacárido-Aldehído + NH2 NH2 — -> sacárido— NH2 + EDAC + COOH-Prot - - > conjugado Como se puede observar la química con carbodiimida (por ejemplo usando EDAC) es muy conveniente para reacciones de conjugación dado que hace uso de grupos en el sacárido y/o proteína que pueden estar presentes de manera natural o pueden ser insertados fácilmente por derivación. También enlaza convenientemente las fracciones mediante un enlace péptido. Las carbodiimidas (RN = C = NR') son compuestos insaturados con una estructura aleño (Nakajima y Ikada 1995 Bioconjugate Chem. 6:123-130; Hoare y Koshland 1967 JBC 242:2447-2453). La química es relativamente inestable en su pH (4.5-6.5) de reacción, y en consecuencia en la técnica se tiende a añadir juntos todos los componentes de la reacción de conjugación saca rido/proteína/carbodiim ida. Los inventores de la presente han encontrado que dependiendo de la naturaleza del sacárido y profeína que van a ser conjugados, se puede lograr mejores características del conjugado final para uso en la vacuna añadiendo cierto componente de la reacción lentamente a la mezcla. Haciéndolo de esta forma se puede obtener uno o más beneficios o mejoras, tales como: rendimiento de sacárido en el conjugado, capacidad del conjugado de ser filtrado de manera estéril, mejor control de la conjugación, reproducibilidad más fácil, y/o prevención de enlaces cruzados entre porciones. De acuerdo con esto, en una modalidad se proporciona un método para conjugar un sacárido con un portador proteína usando química de condensación por carbodiimida, en donde el sacárido contiene (por ejemplo como parte de su unidad de repetición), o ha sido derivado para que contenga, grupos grupos amino y/o grupos carboxilo, y en donde el portador proteína contiene, o ha sido derivado para que contenga, grupos grupos amino y/o grupos carboxilo, el método comprende los pasos de: I) - si el portador proteína contiene tanto grupos amino como grupos carboxilo y el sacárido contiene ya sea grupos amino o grupos carboxilo: a) mezclar el sacárido y la alícuota de carbodiimida requerida para realizar la conjugación, y b) añadir la alícuota de portador proteína requerida durante un periodo de 35 segundos hasta 6 horas; II) - si el sacárido contiene tanto grupos amino como grupos carboxilo y el portador proteína contiene ya sea grupos amino o grupos carbo?ilo: a) mezclar el portador proteína y la alícuota de carbodíimida requerida para realizar la conjugación, y b) añadir la alícuota de sacárido requerida durante un periodo de 35 segundos hasta 6 horas; lll) - si el sacárido contiene tanto grupos amino como grupos carboxilo y el portador proteína contiene tanto grupos amino como grupos carboxilo: a) mezclar el portador proteína y sacárido, y b) añadir la alícuota de carbodiimida requerida para realizar la conjugación durante un periodo de 35 segundos hasta 6 horas. Descripción detallada de la invención Se puede usar cualquier carbodiimida apropiada siempre que sea capaz de conjugar sacáridos y proteínas en un medio acuoso. En una modalidad la carbodiimida puede ser EDAC (1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida) [también conocida como EDC] o puede ser una carbodiimida distinta de EDAC. El término "sacárido" en esta especificación puede indicar polisacárido o oligosacárido e incluye a ambos. Puede indicar lipopolisacárído (LPS) o lipooliogosacárido (LOS). Antes de su uso, los polisacáridos (tales como polisacáridos bacterianos) pueden ser aislados de una cepa fuente (por ejemplo de bacterias) o aislados de la cepa fuente y ajustados en tamaño en algún grado mediante métodos conocidos (véase por ejemplo EP497524 y EP497525; Shousun Chen Szu et al. - Carbohydrate Research Vol 152 p7-20 (1986)) por ejemplo por microfluidización. Los polisacárídos se pueden ajustar en tamaño con el fin de reducir la viscosidad en muestras de polisacárido y/o mejorar la capacidad de ser filtrados de los productos conjugados. Los oligosacáridos tienen una baja cantidad de unidades de repetición (comúnmente 5-30 unidades de repetición) y comúnmente son polisacáridos hidrolizados. El término "portador proteína" pretende cubrir tanto péptidos pequeños como polipéptidos grandes (>10 kDa). Claramente es más probable que los polipéptidos grandes contengan tanto grupos amino como grupos carboxilo reactivos sin ninguna modificación. Para los propósitos de la invención, "polisacárido natural" se refiere a un sacárido que no ha sido sometido a un proceso, cuyo propósito es reducir el tamaño del sacárido. Un polisacárido puede reducirse de tamaño ligeramente durante procedimientos normales de purificación. Este tipo de sacárido es natural todavía. Solamente si el polisacárido ha sido sometido a técnicas de ajuste de tamaño el polisacárido podría no ser considerado natural. Para los propósitos de la invención, "ajustado en tamaño en un factor de hasta x2" significa que el sacárido está sometido a un proceso para reducir el tamaño del sacárido pero que conserva un tamaño de más de la mitad del tamaño del polisacárido natural. X3, x4 etc. se deben interpretar de la misma forma, es decir, el sacárído está sometido a un proceso para reducir el tamaño del polisacárido pero conserva un tamaño de más de la mitad del tamaño del polisacárido natural. El periodo de tiempo de 35 segundos a 6 horas en el paso b) del método para la adición de la alícuota completa del componente final puede ser 50 segundos hasta 5 horas, 1 minuto hasta 4 horas, 2 minutos hasta 3 horas, 3 minutos hasta 2 horas, 4 hasta 60 minutos, 5 hasta 50 minutos, 6 hasta 40 minutos, 7 hasta 30 minutos o 8 hasta 20 minutos. Puede ser 1 minuto hasta 5 horas, 10 minutos hasta 4 horas, 20 minutos hasta 3 horas, 30 minutos hasta 2 horas, 40 hasta 90 minutos, o 50 hasta 70 minutos. Este tiempo se puede ajustar de acuerdo con el sacárido y la proteína precisos que van a ser conjugados. En una modalidad, la alícuota del componente final (por ejemplo of carbodiimida, sacárido o proteína) se le añade a la mezcla de la reacción a una velocidad constante durante el periodo de tiempo (esto se logra convenientemente usando una bomba que funciona a una velocidad constante). Alternativamente se puede añadir en etapas durante el periodo de tiempo. Si bien esto se puede hacer en muchas formas, en general se debe añadir partes de la alícuota durante el periodo. Por ejemplo al menos un cuarto de la alícuota se puede añadir durante la primera mitad del periodo, al menos un cuarto de la alícuota durante la segunda mitad del periodo. La cantidad total de la alícuota 'a' medida, por ejemplo, en mL o mg se puede añadir en 4-100 etapas ('s') durante el periodo. En una modalidad las etapas se programan de tal forma que se introduzca una cantidad igual (a/s) en todas las etapas. En una modalidad, las etapas están separadas uniformemente durante el periodo 'p' (en segundos). De esta forma, si una etapa tiene lugar en el momento cero del periodo 'p1, entonces cada etapa subsiguiente podría tener lugar en un momento que es p/(s-1 ). El volumen de la alícuota del componente final añadido en el paso b) puede ser ajustado en términos de facilidad de adición de la alícuota a la reacción dentro del periodo de tiempo deseado. La carbodiimida puede ser añadida como una solución acuosa (comúnmente comúnmente amortiguada a un pH de 7.5 antes de ser añadida a la reacción) o como polvo sólido (EDAC por ejemplo es altamente soluble en medios acuosos). Por supuesto, si la carbodiimida es el último componente añadido a la reacción (situación lll paso b)), se puede usar una carbodiimida de disolución lenta de tal forma que la alícuota completa de polvo sea añadida a la reacción de una sola vez, pero que se disuelva a una velocidad consistente con el periodo deseado durante el cual se va a hacer disponible la alícuota para la reacción. Si la proteína y/o sacárido no tiene grupos amino o carboxilo (o solamente tiene uno de ellos), puede ser derivado(a) para proporcionarle uno (o para proporcionarle el otro que aún no tiene). Por ejemplo para un sacárido que solamente contiene grupos hidroxilo reactivos (por ejemplo sacárido capsular meningocóccico del serogrupo A), este grupo se debe utilizar para la derivación de grupos amino o carboxilo de tal forma que se pueda llevar a cabo la condensación de EDAC. Esta puede tener lugar dentro de una sub unidad de repetición, o puede ser un grupo que solamente está presente al final de la molécula de sacárido. Se debe tener en cuenta que cuando tiene lugar la derivación, ésto puede ser beneficioso para derivar la fracción sólo parcialmente. Para los sacáridos con subunidades de repetición, el epítopo objetivo puede estar presente en cada repetición. En consecuencia si tiene lugar la derivación parcial (por esto se quiere decir que 0.5-20, 1-15, 3-12, o 5-10% del grupo reactivo deseado es derivado realmente) esto puede tener el beneficio de conservar la mayoría de los epítopos, y de evitar que haya demasiado entrecruzamiento. Si un sacárido o proteína ya tiene grupos amino o carboxilo solamente (por ejemplo sacárido Vi de Salmonella typhi el cual de manera natural tiene grupos carboxilo pero no grupos amino), la derivación puede tener lugar para proporcionarle el otro tipo de grupo (es decir grupos amino para Vi). Se debe tener en cuenta, sin embargo, que como la derivación puede ser parcial, esta acción puede cambiar la reacción preferida de la invención de tipo I a tipo lll. Por ejemplo si sacárido Vi se conjuga con un portador proteína tanto grupos amino como grupos carboxilo, la situación I añade la alícuota de proteína lentamente en el paso b). Si el grupo carboxilo sacárido Vi es derivado parcialmente con grupos amino éste tendrá tanto grupos carboxilo como grupos amino, por ello, en la situación lll añadir la alícuota de carbodiimida lentamente en el paso b) se hace más relevante. La derivación puede ocurrir mediante la adición de un enlazante hetero- u homo-bifuncional. Ésta puede tener lugar con química similar a la descrita arriba para el paso de conjugación de sacárido-proteína (por ejemplo CDAP o química con carbodiimida). El enlazante puede tener entre 4 y 20, 4 y 12, o 5 y 10 átomos de carbono. Puede tener dos grupos amino reactivos, dos grupos carboxilo reactivos, o uno de cada uno (por ejemplo hexano diamina, ácido 6-aminocaproico, o dihidrazida de ácido adípico). Comúnmente la derivación tiene lugar haciendo reaccionar un gran exceso del enlazante con el sacárido y/o portador proteína que va a ser derivado. Esto permite que la derivación tenga lugar con mínimo grado de entrecruzamiento entre fracciones (lo que si no, sería posible si por ejemplo a carboxilo grupo en un sacárido estuviera siendo derivado con grupos amino usando condensación por carbodiimida). El enlazante en exceso se puede eliminar fácilmente usando técnicas tales como diafiltración. En una modalidad, el sacárido comprende un grupo hidroxilo reactivo como parte de su unidad de repetición la cual es derivada parcialmente por medio de un grupo amino en el enlazante (por ejemplo con química CDAP). En otra modalidad el sacárido incluye un grupo amino reactivo como parte de su unidad de repetición, la cual es derivada parcialmente por medio de un grupo carbo?ilo en el enlazante (por ejemplo con química con carbodiimida). En una modalidad adicional el sacárido incluye un grupo carboxilo reactivo como parte de su unidad de repetición, el cual es derivado parcialmente por medio de un grupo amino en el enlazante (por ejemplo con química con carbodiimida). La alícuota de carbodümida requerida para realizar la conjugación (si está presente en el paso a) o b) de la reacción de la invención) es desde 0.01 hasta 3, desde 0.05 hasta 2, o desde 0.09 hasta 1 mg de carbodiimida/mg de sacárido. Si bien estos números se calculan con respecto a la EDAC que es la carbodiimida, estas cifras pueden ser ajustadas si se usa cualquier otra carbodiimida, multiplicando las cantidades en el rango por: (peso molecular de la otra carbodiimida)/(peso molecular de EDAC). En general, el sacárido puede estar presente en los métodos de la invención en una concentración final de 0.5-50 mg/ml en el paso b). Esto dependerá del tamaño y naturaleza del sacárido, y de la extensión de cualquier derivación. Por ejemplo, para los oligosacáridos se requerirá una concentración mayor, pero para polisacáridos grandes será mucho más apropiada una concentración menor. Si está hacia el extremo alto de derivados parcialmente con grupos amino o carboxilo, puede ser apropiada una concentración menor para reducir la posibilidad de cualquier entrecruzamiento. El portador proteína puede estar presente en una concentración final de 1-50 mg/ml en el paso b). La proporción inicial de portador proteína con respecto a sacárido en los métodos de la invención puede ser desde 5:1 hasta 1:5, 4:1 hasta 1:1, o 3:1 hasta 2:1 (p/p). De nuevo, esto dependerá del tamaño y naturaleza del sacárido, y de la extensión de cualquier derivación. Las condiciones de sal (por ejemplo NaCI) también pueden variarse de acuerdo con la naturaleza del sacárido/proteína. Usualmente alrededor de NaCI 0.2 M puede estar presente en el paso b) de los métodos de la invención, pero puede ser 0-2, 0.1-1 o 0.2-0.5 M. En términos de pH en el paso b) de los métodos de la invención, el pH de la reacción puede ser cualquier pH en el cual la carbodiimida se active - por ejemplo pH 4.5-6.5, 4.7-6.0, o 5-5.5. Este pH comúnmente se mantiene en toda la reacción mediante la adición de ácido/base según se requiera. La EDAC usualmente es estable con un pH de 7.5, pese a que si se requiere hacer la conjugación también pueden estar presentes compuestos que se sabe que mantienen la reacción intermedia estable (tales como N-hidroxisuccinimida) en la reacción, en el paso b), en cuyo caso el pH de la reacción en el paso b) puede ser mantenido en un pH de 4.5-7.5. La temperatura de la reacción durante paso b) de los métodos de la invención puede ser 4-37, 10- 32, 17-30, o 22-27 °C, y y comúnmente se mantiene en el transcurso de la reacción. En los métodos de la invención, una vez que la alícuota completa ha sido añadida en el paso b) la reacción comúnmente se mantiene durante 10 minutos adicionales hasta 72 horas, 20 minutos hasta 48 horas, 30 minutos hasta 24 horas, 40 minutos hasta 12 horas, 50 minutos hasta 6 horas, o 1-3 horas. Una vez que está terminada la reacción, el pH es ajustado a 7.5-9 (hacia el extremo más alto de éste si está presente N-hidroxisuccinimida) para regresar hacia el rango de pH estable de la carbodiimida. Una vez conjugado, el conjugado sacárido-proteína puede ser purificado a partir de: componentes que no reaccionaron, sacárido libre, etc. inyectándolo en una columna para cromatografía para exclusión por tamaño (por ejemplo Sephacryl S400HR, Pharmacia). Comúnmente, esto se lleva a cabo a 2-8 °C. El conjugado puede ser esterilizado por filtración y luego almacenado. Finalmente, se puede formular una dosis efectiva (por ejemplo 1-20, 2-15, o 3-10 pg sacárido /dosis) del conjugado sacárido-proteína con un excipiente aceptable farmacéuticamente (por ejemplo una sal o adyuvante) para fabricar una composición inmunógena o vacuna. En términos de los sacáridos de la invención, cualquier sacárido de fuente viral, fúngica, bacteriana o eucariótica puede ser conjugado usando los métodos de la invención. Éste puede ser el sacárido Vi de Salmonella typhi, o un sacárido distinto de Vi. Puede ser el sacárido capsular Hib de H. influenzae tipo b, o puede ser un sacárido distinto de Hib. En una modalidad el sacárido es un sacárido capsular bacteriano, por ejemplo derivado de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis serogrupo A (MenA), B (MenB), C (MenC), W135 (MenW) o Y (MenY), Streptococcus pneumoniae serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F o 33F, Streptococcus Grupo B grupo la, Ib, II, lll, IV, V, VI, o Vil, Staphylococcus aureus tipo 5, Staphylococcus aureus tipo 8, Salmonella typhi (sacárido Vi), Vibrio cholerae, o H. influenzae tipo b. El peso molecular promedio en peso del sacárido puede ser 1000-2000000, 5000-1000000, 10000-500000, 50000-400000, 75000-300000, o 100000-200000. El peso molecular o peso molecular promedio de un sacárido aquí se refiere peso molecular promedio en peso (PM) del sacárido medido antes de la conjugación y medido por MALLS. La técnica MALLS es bien conocida en la materia, y comúnmente se lleva a cabo según se describe en ejemplo 2. Para el análisis MALLS de sacáridos, se puede usar dos columnas (TSKG6000 y 5000PWxl) en combinación, y los sacáridos se eluyen en agua. Los sacáridos se detectan usando un detector de dispersión de luz (por ejemplo Wyatt Dawn DSP equipado con un láser de argón de 10 PM a 488nm) y un refractómetro inferométrico (por ejemplo Wyatt Otilab DSP equipado con una celda P100 y un filtro rojo a 498nm). En una modalidad, la polidispersidad del sacárido es de 1-1.5, 1-1.3, 1-1.2, 1- 1.1 o 1-1.05 y después de conjugación con una proteína portadora, la polidispersidad del conjugado es de 1.0-2.5, 1.0-2.0. 1.0-1.5, 1.0-1.2, 1.5-2.5, 1.7-2.2 o 1.5-2.0. Todas las mediciones de polidispersidad son por MALLS. El sacárido puede un polisacárido natural o puede haber sido ajustado en tamaño mediante un factor de no más de 2, 4, 6, 8, 10 o 20 veces (por ejemplo mediante microfluidización [por ejemplo mediante un aparato Emulsiflex C-50] u otra técnica conocida [por ejemplo métodos con calor, químicos, por oxidación, o por sonicación]). Los oligosacáridos pueden haber sido ajustado en tamaño de manera sustancialmente adicional [por ejemplo mediante métodos conocidos con calor, químicos o por oxidación].

Las estructuras de la mayoría de estos sacáridos son conocidas (y en consecuencia si de manera natural tienen grupos amino o carboxilo para química con carbodiimida, o cualquier otro grupo reactivo que puede ser derivado con grupos amino o carboxilo (véase la tabla siguiente).

El sacárido puede ser u n lipooligosacárido o lipopolisacárido bacteria no (véase la tabla anterior) , por ejemplo derivado de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis, H. influenzae, E. coli, Salmonella o M. catarrhalis. El LOS puede ser meningocóccico del immunotipo L2, L3 o L10. Puede estar destoxificado mediante tratamiento alcalino de su fracción lípida A. En una modalidad, el sacárido capsular MenA, está al menos parcialmente O-acetilado de tal forma que al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las unidades de repetición estén O-acetiladas en al menos una posición. O-acetilación por ejemplo está presente en al menos la posición 0-3 de al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las unidades de repetición. En una modalidad, el sacárido capsular MenC, está al menos parcialmente O-acetilado de tal forma que al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las unidades de repetición NeuNAc (a2 ?9)-ligadas, están O-acetiladas en al menos una o dos posiciones. La O-acetilación por ejemplo está presente en la posición O-7 y/u O-8 de al menos 30%. 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las unidades de repetición. En una modalidad, el sacárido capsular MenW, está al menos parcialmente O-acetilado de tal forma que al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las unidades de repetición están O-acetiladas en al menos una o dos posiciones. La O-acetilación por ejemplo está presente en la posición O-7 y/u O-9 de al menos 30%.40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las unidades de repetición. En una modalidad, el sacárido capsular MenY, está al menos parcialmente O-acetilado de tal forma que al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las unidades de repetición están O-acetiladas en al menos una o dos posiciones. La O-acetilación está presente en la posición 7 y/o 9 de al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las unidades de repetición. El porcentaje de O-acetilación se refiere al porcentaje de las unidades de repetición que contienen O-acetilación. Éste puede ser medido en el sacárido antes de ser conjugado y/o después de la conjugación. El portador proteína puede ser cualquier péptido o proteína. Éste puede contener uno o más epítopos T auxiliares. En una modalidad de la invención, el portador proteína se selecciona del grupo que consiste en: TT, DT, CRM197, fragmento C de TT, proteína D de H. influenzae, PhtD neumocóccica, y neumolisina neumocóccica. La proteína portadora puede ser toxoide tetánico (TT), toxoide tetánico fragmento C, mutantes no tóxicos de toxina tetánica [nótese que todas estas variantes de TT se consideran del mismo tipo de proteína portadora para los propósitos de esta invención], toxoide diftérico (DT), CRM197, otros mutantes no tóxicos de toxina diftérica [tales como CRM176, CRM 197, CRM228, CRM 45 (Uchida et al. J. Biol. Chem.218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 y CRM107 y otras mutaciones descritas por Nicholls y Youle en Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; deleción o mutación de Glu-148 en Asp, Gln o Ser y/o Ala 158 en Gly y otras mutaciones que se describen en US 4709017 o US 4950740; mutación de al menos uno o más residuos de Lys 516, Lys 526, Phe 530 y/o Lys 534 y otras mutaciones que se describen en US 5917017 o US 6455673; o fragmento que se describen en US 584371 1] (nótese que todas estas variantes de DT se considera que son del mismo tipo de proteína portadora para los propósitos de esta invención), neumolisina neumocóccica (Kuo et al (1995) Infecí Immun 63; 2706-13), OMPC (proteína meningocóccica de membrana exterior -usualmente extraída de N. meningitidis serogrupo B - EP0372501), péptidos sintéticos (EP0378881, EP0427347), proteínas de choque por calor (WO 93/17712, WO 94/03208), proteínas de tosferina (WO 98/58668, EP0471177), citocinas, linfocinas, factores de crecimiento u hormonas (WO 91/01146), proteínas artificiales que contienen múltiples epítopos de células T CD4+ humanas de diversos antígenos derivados de patógenos (Falugi et al (2001 ) Eur J Immunol 31 ; 3816-3824) tales como proteína N19 (Baraldoi et al (2004) Infecí Immun 72; 4884-7) proteína superficial neumocóccica PspA (WO 02/091998), proteínas de absorción de hierro (WO 01/72337), toxina A o B de C. difficile (WO 00/61761 ), Proteína D de H. influenzae (EP594610 y WO 00/56360), PhtA neumocóccica (WO 98/18930, también denominada Sp36), PhtD neumocóccica (que se describe en WO 00/37105, y también se denomina SpO36D), PhtB neumocóccica (que se describe en WO 00/37105, y también se denomina SpO36B), o PhtE (que se describe en WO00/30299 y se denomina BVH-3). En un aspecto adicional de la invención se proporciona conjugado de sacárido-portador proteína (o una composición inmunógena o vacuna) obtenible u obtenida medíante el método de la invención. Un uso de la composición inmunógena o vacuna de la invención en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de una enfermedad, y también se proporciona un método para prevenir o tratar una enfermedad que comprende el paso de administrar una dosis efectiva de la composición inmunógena o vacuna de la invención a un paciente que necesita de ello. El uso o método puede ser tal que la enfermedad es causada por una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis, Streptococcus pneumoniae, M. catarrhalis, Streptococcus Grupo B, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, E. coli, y H. influenzae. Las composiciones inmunógenas de la invención también pueden incluir una vacuna DTPa o DTPw (por ejemplo una que contiene DT, TT, y ya sea una vacuna de célula entera de tosferina (Pw) o una vacuna acelular de tosferina (Pa) (que contiene por ejemplo toxoide de tosferina, FHA, pertactina, y, opcionalmente aglutinógenos 2 y 3). Estas combinaciones también pueden incluir una vacuna contra hepatitis B (por ejemplo puede contener antígeno superficial de hepatitis B [HepB], opcionalmente adsorbido en fosfato de aluminio). En una modalidad la composición inmunógena de la invención contiene Hib, conjugados de sacárido MenA y MenC, o conjugados de sacárido Hib y MenC, o conjugados de sacárido Hib, MenC y MenY, o conjugados de sacárido MenA, MenC, MenW y MenY, en donde al menos uno, dos, o todos los conjugados de sacárido se elaboran de acuerdo con el método de la invención. Las composiciones inmunógenas de la invención opcionalmente contienen antígenos virales adicionales confiriendo protección contra la enfermedad producida por sarampión y/o paperas y/o rubéola y/o varicela. Por ejemplo, la composición inmunógena de la invención contiene antígenos de sarampión, paperas y rubéola (MMR) o sarampión, paperas, rubéola y varicela (MMRV). En una modalidad, estos antígenos virales están presentes opcionalmente en el mismo envase que el conjugado o conjugados meningocóccicos y/o de sacárido Hib presentes en la composición. En una modalidad, estos antígenos virales están liofilizados. En una modalidad, la composición inmunógena de la invención contiene además un antígeno de N. meningitidis serogrupo B. El antígeno es opcionalmente una preparación de vesícula de membrana exterior de N. meningitidis serogrupo B según se describe en EP301992, WO 01/09350, WO 04/14417, WO 04/14418 y WO 04/14419. En general, la composición inmunógena de la invención puede contener una dosis de cada conjugado sacárido de entre 0.1 y 20 µg, 2 y 10 µg, 2 y 6 µg o 4 y 7 µg de sacárido. "Alrededor de" o "apro?imadamente" se definen como valores dentro de 10% más o menos de la cifra proporcionada para los propósitos de la invención. En una modalidad, la composición inmunógena de la invención está ajustada o amortiguada hasta, o ajustada a un pH de entr© 7.0 y 8.0, pH 7.2 y 7.6 o a un pH de alrededor o exactamente de 7.4. La composición inmunógena o vacunas de la invención opcionalmente están liofilizadas en la presencia de un agente estabilizante, por ejemplo un poliol tal como sacarosa o trehalosa. Opcionalmente, la composición inmunógena o vacuna de la invención contiene una cantidad de un adyuvante suficiente para mejorar la respuesta inmunitaria al inmunógeno. Los adyuvantes apropiados incluyen, sin limitarse a ellos, sales de aluminio (fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio), mezclas de escualeno (SAF-1 ), péptido muramilo, derivados de saponina, preparaciones de pared celular de micobacteria, lípido A monofosforilo, derivados de ácido micótico, agentes tensoactivos de copolímeros en bloque no iónicos, Quil A, sub unidad B de la toxina del cólera, polifosfaceno y derivados, y complejos inmunoestimulantes (ISCOM) tales como los descritos por Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875. Para las combinaciones de N. meningitidis o HibMen, puede ser ventajoso no utilizar ningún adyuvante de sal de aluminio o cualquier adyuvante. Tal como con todas las composiciones inmunógenas o vacunas, las cantidades efectivas inmunológicamente de los inmunógenos tienen que ser determinadas empíricamente. Los factores que debe considerarse incluyen la inmunogenicidad, ya sea que el inmunógeno esté formando complejos o unido covanlentemente a un adyuvante o proteína portadora u otro portador, vías de administración y la cantidad de dosis de inmunización que se van a administrar.

El agente activo puede estar presente en concentraciones variables en la composición farmacéutica o vacuna de la invención. Comúnmente, la concentración mínima de la sustancia es una cantidad necesaria para obtener su uso pretendido, mientras que la concentración máxima es la cantidad máxima que permanecerá en solución o suspendida homogéneamente dentro de la mezcla inicial. Por ejemplo, la cantidad mínima de un agente terapéutico opcionalmente es una que proporcionará una sola dosis efectiva terapéuticamente. Para las sustancias bioactivas, la concentración mínima es una cantidad necesaria para bioactividad con la reconstitución y la concentración máxima está en el punto en el cual no se puede mantener una suspensión homogénea. En el caso de unidades de una sola dosis, la cantidad es la de una sola aplicación terapéutica. Generalmente, se espera que cada dosis contenga 1-100 µg de antígeno de proteína, opcionalmente 5-50 µg o 5-25 µg. Por ejemplo, las dosis de sacáridos bacterianos son de 10-20 µg, 5-10 µg, 2.5-5 µg o 1-2.5 µg de sacárido en el conjugado. Las preparaciones para vacuna de la presente invención se pueden usar para proteger o tratar a un mamífero (por ejemplo un paciente humano) susceptible a infección, por medio de administrar dicha vacuna por vía sistémica o por vía mucosa. Un paciente humano opcionalmente es un infante (de menos de 12 meses), un niño pequeño (12-24, 12-16 o 12-14 meses), un niño (2-10, 3-8 o 3-5 años) un adolescente (12-21, 14-20 o 15-19 años) o un adulto. Estas administraciones pueden incluir inyección por medio de las vías intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o por medio de administración en las mucosas para lost ractos oral/alimenticio, respiratorio, genitourinario. La administración intranasal administration de vacunas para el tratamiento de pneumonía o de otitis media se prefiere (dado que el transporte nasofaríngeo de los neumococos puede evitarse de manera más efectiva, atenuando así la infección en su etapa más temprana). Si bien la vacuna de la invención puede ser administrada como una sola dosis, sus componentes también pueden ser coadministrados juntos al mismo tiempo o en diferentes momentos (por ejemplo si en una vacuna están presentes sacáridos, estos podrían ser administrados por separado, al mismo tiempo o 1-2 semanas después de la administración de una vacuna de proteína bacteriana para la coordinación óptima de las respuestas inmunitarias con respecto a cada uno de los otros). Además de una sola vía de administración, se puede usar 2 vías de administración diferentes. Por ejemplo, se puede adminsitrar antígenos virales ID (intradérmico), mientras que las proteínas bacterianas se pueden administrar IM (intramuscular) o EN (intranasal). Si están presente sacáridos, se pueden administrar IM (o ID) y las proteínas bacterianas se pueden administrar EN (o ID). Además, las vacunas de la invención se pueden administrar IM para dosis de sensibilización y EN para dosis de refuerzo. La preparación de vacunas se describe en general en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (Ed. Powell M. F. y Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). La encapsulación con liposomas es descrita por Fullerton, patente estadounidense 4,235,877. Un aspecto adicional de la invención es un proceso para elaborar la composición inmunógena o vacuna de la invención, que comprende el paso de mezclar los sacáridos MenA y MenC de la invención elaborados mediante el método de la invención, con MenW y MenY que no han sido elaborados de acuerdo con la invención, y con un excipiente aceptable farmacéuticamente. Los términos "que comprende", "incluye" y "contiene" como se usan aquí, tienen la intención por parte de los inventores, de ser sustituibles opcionalmente con los términos "consiste en" "está constituido por" y "que consiste en", respectivamente, en cada caso. Todas las referencias o solicitudes de patente citadas dentro de esta especificación de patente están incorporadas aquí mediante referencia. La invención se ilustra en los ejemplos siguientes. Los ejemplos que siguen se llevan a cabo usando técnicas estándar, las cuales son bien conocidas, así como también la rutina para las personas hábiles en la técnica, e?cepto cuando se describe en detalle otra cosa. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la ¡nvención. Ejempios Ejemplo 1 - Preparación de conjugados de poBisacárñdo Ej?mplo 1a - Preparación de conjugado de poBisaeérido caosolar men?ngoóccico MenA y RflenC de acuerdo con Ha invención Se produjeron conjugados MenC-TT se produjeron usando polisacáridos naturales (de más de 150 kDa medido mediante MALLS) o se microfluidizaron ligeramente. Se produjeron conjugados MenA-TT usando polisacárido natural o polisacárido ligeramente microfluidizado de más de 60 kDa medido mediante el método MALLS para el ejemplo 2. El ajuste de tamaño fue por microfluidización usando un aparato homogenizador Emulsifle? C-50. Los polisacáridos se filtraron entonces a través de un filtro de 0.2 µm. Con el fin de conjugar polisacárido capsular MenA con to?oide tetánico por medio de un separador, se usó el método siguiente. El enlace covalente del polisacárido y el separador (ADH) se lleva a cabo mediante una química de acoplamiento mediante la cual el polisacárido es activado bajo condiciones controladas por un agente cianilante, tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino-piridinio (CDAP). El separador reacciona con el PS cianilado mediante sus grupos hidrazino, para formar un enlace isourea estable entre el separador y el polisacárido. Se trató 10mg/ml de una solución de MenA (pH 6.0) [3.5 g] con 100 mg/ml de una solución recién preparada de CDAP en acetonitrilo/agua (50/50 (v/v)) para obtener una proporción CDAP/MenA de 0.75 (p/p). Después de 1.5 minutos, se elevó el pH hasta un pH de 10.0. Tres minutos después, se añadió ADH para obtener una proporción de ADH/MenA de 8.9. Se disminuyó el pH de la reacción hasta 8.75 y la reacción prosiguió durante 2 horas manteniendo este pH (manteniendo la temperatura a 25 °C). La solución de PSAAH se concentró hasta un cuarto de su volumen inicial y luego se diafiltró con 30 volúmenes de NaCI 0.2 M usando una membrana Filtron Omega con un corte de 10 kDa, y se filtró el retenido. Antes de la reacción de conjugación (condensación por carbodiimida), la solución TT purificada y la solución de PSAAH se diluyeron hasta alcanzar una concentración de 10 mg/ml para PSAAH y 10mg/ml para TT. Se le añadió EDAC (1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida) a la solución de PSAH (2g de sacárido) con el fin de alcanzar una proporción final de 0.9 mg EDAC/mg PSAAH. Se ajustó el pH hasta 5.0. Se le añadió to?oide tetánico purificado con una bomba peristáltica (en 60 minutos) hasta alcanzar 2 mg TT/mg PSAAH. La solución resultante se dejó 60 min a +25°C bajo agitación para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 min. Se neutralizó la solución mediante la adición de Tris-HCl 1 M con pH de 7.5 (1/10 del volumen final) y se dejó 30 minutos a +25°C, luego durante la noche a +2°C hasta +8°C. El conjugado se clarificó usando un filtro de 10 µm y se purificó usando una columna Sephacryl S400HR (Pharmacia, Suecia). Se equilibró la columna en 10 mM Tris-HCl (pH 7.0), 0.075 M NaCI y el conjugado (apro?. 660 mL) se cargó en la columna (+2 °C hasta + 8CC). El grupo para elución se seleccionó como una función de densidad óptica a 280 nm. La recolección comenzó cuando la absorbancia aumentó a 0.05. La recolección continuó hasta que la Kd alcanzó 0.30. El conjugado se esterilizó por filtración a +20 °C, luego se almacenó a +2 °C hasta +8 °C. El conjugado resultante tuvo una proporción polisacárido:proteína de 1:2-1:4 (p/p). Con el fin de conjugar el polisacárido capsular MenC con toxoide tetánico por medio de un separador, se usó el método siguiente. El enlace covalente del polisacárido y el separador (ADH) se lleva a cabo mediante una química de acoplamiento mediante la cual el polisacárido es activado bajo condiciones controladas por un agente cianilante, tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino-piridinio (CDAP). El separador reacciona con el PS cianilado mediante sus grupos hidrazino, para formar un enlace isourea estable entre el separador y el polisacárido. Se trató 20mg/ml de una solución de MenC (pH6.0) (3.5 g) con 100 mg/ml de una solución recién preparada de CDAP en acetonitrilo/agua (50/50 (v/v)) para obtener una proporción de CDAP/MenC de 1.5 (p/p). Después de 1.5 minutos, se elevó el pH hasta un pH de 10.0. En el pH de activación se le añadió NaCI 5 M hasta obtener una concentración final de NaCI 2 M. Tres minutos después, se le añadió ADH para obtener una proporción de ADH/MenC de 8.9. Se disminuyó el pH de la reacción hasta 8.75 y la reacción prosiguió durante 2 horas (mantenida a 25 °C). La solución de PSCAH se concentró hasta un mínimo de 150 mL y luego se diafiltró con 30 volúmenes de NaCI 0.2 M usando una membrana Filtron Omega con un corte de 10 kDa, y se filtró el retenido. Antes de la reacción de conjugación, la solución TT purificada y la solución de PSCAH (2g en báscula) se diluyeron en NaCI 0.2 M hasta alcanzar una concentración de 15 mg/ml para PSCAH y 20mg/ml para TT. Se le añadió el to?oide tetánico purificado a la solución de PSCAH con el fin de alcanzar 2 mg de TT/mg PSCAH- Se ajustó el pH hasta 5.0. Se le añadió EDAC (16.7 mg/ml en Tris 0.1 M pH 7.5) con una bomba peristáltica (en 10 minutos) hasta alcanzar una proporción final de 0.5 mg EDAC/mg PSCAH. La solución resultante se dejó 110 min a +25°C bajo agitación y regulación de pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 min. Luego se neutralizó la solución mediante la adición de Tris-HCl 1 M con pH de 9.0 (1/10 del volumen final) y se dejó 30 minutos a +25°C, luego durante la noche a +2°C hasta +8°C. El conjugado e clarificó usando un filtro de 10 µm y se purificó usando una columna Sephacryl S400HR (Pharmacia, Suecia). Se equilibró la columna en 10 mM Tris-HCl (pH 7.0), 0.075 M NaCI y el conjugado (apro?. 460 mL) se cargó en la columna (+2 °C hasta +8°C). El grupo para elución se seleccionó como una función de densidad óptica a 280 nm. La recolección comenzó cuando la absorbancia aumentó a 0.05. La recolección continuó hasta que la Kd alcanzó 0.20. El conjugado se esterilizó por filtración a +20°C, luego se almacenó a +2°C hasta +8°C. El conjugado resultante tuvo una proporción polisacárido:proteína de 1 :2-1 :4 (p/p).

Se llevaron a cabo diversos e?perimentos para añadir EDAC durante 10-45 minutos - en cada caso el resultado fue Conjugados MenC de buena calidad. Si a pesar de que el portador TT se añadió de último lentamente a la mezcla de MenC-ADH + EDAC, esto condujo a un gel- un conjugado que no pudo ser purificado. También se llevaron a cabo e?perimentos para añadir el EDAC de una sola vez a la reacción, pero la proporción final de TT/PS (2.771) (p/p) del conjugado fue más baja que la del conjugado obtenido por medio de la reacción en donde se añadió EDAC durante 10 minutos (3.3/1); adicionalmente, las antigenicidades de aTT y aPS fueron ambas menores que la medida con respecto al conjugado elaborado mediante la reacción en donde se añadió EDAC durante 10 minutos. Nota sobre el % aproximado de derivación de los polisacáir?dos MenCAH: después de tratamiento de CDAP con ADH apro?imadamente 3.47% de los grupos hidro?ilo fueron derivados con ADH (con una estimación de dos grupos hidro?ilo disponibles por subunidad de repetición). Para MenA: apro?imadamente 11.5% de grupos hidro?ilo derivados con ADH (considerando que solamente hay un grupo hidro?ilo por unidad de repetición). Ejemplo 1 b - preparación de polisacárñdo conjugado capsular neupnocóccico PS 3 1) Proceso PS03-TTAH: PS03-TTAH208 Ajuste d® tamaño con Eroulsiflex Se pesó el PS sobre la base de 10% de contenido teórico de humedad. El PS natural se disolvió durante la noche en NaCI 2 M a una concentración inicial de 3 mg/ml. Antes del ajuste de tamaño, la solución de PS natural se clarificó en corte de filtro de 5 µm. Se usó un aparato homogenizador Emulsifle? C-50 para reducir el peso molecular y la viscosidad del polisacárido antes del paso de activación. La eficiencia del ajuste de tamaño depende de la presión del circuito, la presión de alimentación del émbolo y del número total de ciclos. Con el fin de mejorar la eficiencia del ajuste de tamaño (y en consecuencia reducir la cantidad total de ciclos), la celda de homogenización del Emulsifle? fue reemplazada con una celda con una geometría fija (Cámara de interacción Microfluidics F20Y-0.75µm). El objetivo del ajuste de tamaño fue reducir el peso molecular y la viscosidad del PS sin una disminución crítica de su antigenicidad. La reducción de tamaño se realizó a 41.36 ± 3.4 MPa (6000 ± 500 psi) y se le hizo seguimiento en proceso mediante una medición de viscosidad. El ajuste de tamaño se detuvo cuando se alcanzó el objetivo de 2.0 ± 0.2 cp. Filtración de PS con tamaño ajustado en 0.22 u Se filtró PS con tamaño ajustado en una membrana Millipak 40 (corte 0.22 mm) a una velocidad de flujo de 10 ml/min. Derivación de TT El paso de derivación se realizó a 25°C bajo agitación continua en un baño de agua con temperatura controlada. TT se diluyó en NaCI 0.2M para obtener una concentración final de TT de 25mg/ml.

Se le añadió ADH en forma sólida a la solución de TT hasta alcanzar una concentración final de 0.2 M. Después de completar la disolución de ADH, se estableció la solución a un pH de 6.2+/- 0.1 con HCl.

Luego se le añadió EDAC a la solución de TT/ADH hasta alcanzar una concentración final de 0.02 M. Se estableció el pH en 6.2+/-0.1 con HCl y se mantuvo bajo regulación de pH durante 1 hora.

Después del paso de derivación, se elevó el pH hasta un pH de 9.5 con NaOH para detener la reacción. La solución se dejó durante 2 horas bajo regulación de pH antes del paso de diafiltración. Diafiltración Se diafiltró el derivado TTAH con el fin de eliminar los subproductos de ADH y EDAC que no reaccionaron. Se realizó la diafiltración en una membrana Centramate (0.09 m2, corte 10 kDa). La solución fue dializada contra 20 volúmenes de NaCI 0.2 M. El seguimiento del paso de diafiltración se realizó mediante una cuantificación de ADH (análisis TBNS) en el permeado después de 5, 10, 15 y 20 volúmenes de diafiltración. Filtración en 0.22 um TTAH se filtró finalmente en una membrana con corte de 0.22 µm (Millipack 40) a una velocidad de flujo de 10 ml/min. El TTAH filtrado se almacenó entonces a -70 °C Conjugado PS3-TTAH Las condiciones del proceso fueron las siguientes: Una concentración inicial de PS3 de 2 mg/ml en NaCI 2 M, una proporción inicial de TTAH/PS3 de 1.5/1 (p/p), una concentración de EDAC de 0.5 mg/mg PS, y una concentración de TT de 10 mg/ml en NaCI 0.15 M. Se diluyeron 50 mg de PS3 en NaCI 2 M para obtener una concentración final de PS de 2 mg/ml. La solución de TTAH purificada se diluyó en NaCI 0.2 M hasta alcanzar una concentración de 10 mg/ml. La solución de PS3 se ajustó hasta un pH de 5 con HCl. Se añadió EDAC en forma sólida a la solución de PS3 con el fin de alcanzar una concentración final de 0.5 mg EDAC/ mg PS. Se ajustó el pH hasta 5.0 ± 0.05 con HCl y TTAH se añadió manualmente en 11 minutos (alícuotas/min). Se incubó la solución resultante 109 min a + 25°C con agitación y regulación de pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 min. Luego se neutralizó la solución mediante la adición de Tris-HCl 1 M con pH de 7.5 y se dejó 30 min a +25°C. Se clarificó el conjugado finalmente en una membrana de 5 µm y se inyectó en una Columna Sephacryl S400HR. 2) Proceso PS03-TTAH: PS03AH-TT215 Ajuste de tamaño por Emulsiflex Como se indicó en lo anterior. Filtración de PS ajustado en tamaño en 0.22 y Como se indicó en lo anterior. Derívaciión de PS3 El paso de derivación se realizó a 25°C bajo agitación continua en un baño de agua con temperatura controlada. Se diluyó PS3 en NaCI 2M para obtener una concentración final de PS de 3mg/ml. La solución de PS se fijó con un pH de 6.0 antes de la adición de CDAP (0.25mg/mg PS, disolución a 100mg/ml en una mezcla de acetonitrilo/ WFI). Se aumentó el pH hasta pH9.5 con NaOH antes de la adición de ADH (8.9mg ADH/mg PS, disolución en 100 mg/ml en NaCI 0.2 M). El pH se mantuvo en 9.5 y se reguló durante 60 minutos. El porcentaje de derivación correspondió a 2.4% (2.4 mg ADH/ 100 mg PS). Ésta puede ser medida con técnicas conocidas: TNBS para la estimación de ADH; y DMAB o resorcinol (Monsigny et al (1988) Anal. Biochem. 175, 525-530) para la cuantificación de PS. En este caso, la dosis de TNBS fue de 228 µg/ml y la dosis de PS: 5250 µg/ml. Dado que el PM de ADH es de 174.2, y el PM de la unidad de repetición de PS3 es de 338.27 (con 1 COOH y 4 grupos OH), hay 1.3 µmoles de ADH / 15.52 µmol de unidad de repetición, o 1.3 µmoles de ADH / 62.08 µmol de grupo hidro?ilo reactivo. 2.09% de los grupos hidro?ilo PS3 fueron grupos hidroxilo modificados con ADH. Diafiltración Se diafiltró el derivado PS3AH con el fin de eliminar los subproductos ADH y CDAP que no reaccionaron. Se realizó la diafiltración en una membrana UFP-30-C-H24LA (42 cm2, corte 30 kDa). La solución fue dializada contra 20 volúmenes de NaCI 0.2 M. El seguimiento del paso de diafíltración se realizó mediante una cuantificación de ADH (análisis TBNS) en el permeado después de 5, 10, 15 y 20 volúmenes de diafiltración. Filtración en 0.22 µm Se filtró finalmente PSAH en membrana con corte de 0.22 µm (Millipack 40) a una velocidad de flujo de 10 ml/min. El PS3AH filtrado se almacenó entonces a 4°C. Conjugado PS3AH-TT Las condiciones del proceso fueron las siguientes: Una concentración inicial de PS3 de 2 mg/ml en NaCI 2 M, una proporción inicial de TT/PS3AH de 1.5/1 (p/p), una concentración de EDAC de 0.5 mg/mg PS, y una concentración de TT de 10 mg/ml en 0.15M NaCl. Se diluyó 50 mg de PS3AH en NaCI 0.2 M para obtener una concentración final de PS de 2 mg/ml. La solución TT purificada se diluyó en NaCI 0.2 M hasta alcanzar una concentración de 10 mg/ml. La solución de PS3AH se ajustó hasta un pH de 5 con HCl. Se añadió EDAC en forma sólida a la solución de PS3AH con el fin de alcanzar una concentración final de 0.5 mg EDAC/ mg PS. Se ajustó el pH hasta 5.0 ± 0.05 con HCl y se le añadió TT en 10 minutos usando una bomba peristáltica. Se incubó la solución resultante 110 min a + 25°C con agitación y regulación de pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 min. Luego se neutralizó la solución mediante la adición de Tris-HCl 1 M con pH de 7.5 y se dejó 30 min a +25°C. Se clarificó el conjugado finalmente en una membrana de 5 µm y se inyectó en una Columna Sephacryl S400HR. 3) Proceso PS03AH-TT: PS3AH-TT217 Ajuste de tamaño por Emulsiflex Como se indicó en lo anterior. Filtración de PS ajustado en tamaño en 0.22 u Como se indicó en lo anterior. Derivación de PS3 Igual que para el conjugado 215. Diafiltración Igual que para el conjugado 215. Filtración en 0.22 um Igual que para el conjugado 215. Conjugado PS3AH-TT Las condiciones del proceso fueron las siguientes: Una concentración inicial de PS3 de 2 mg/ml en NaCI 2 M, una proporción inicial de TT/PS3AHde 1.5/1 (p/p), una concentración de EDAC de 0.5 mg/mg PS, y una concentración de TT de10 mg/ml en 0.15M NaCl. Se diluyó 50 mg de PS3AH en NaCI 0.2 M para obtener una concentración final de PS de 2 mg/ml. La solución TT purificada se diluyó en NaCI 0.2 M hasta alcanzar una concentración de 10 mg/ml.

Las soluciones de PS3AH y TT se mezclaron y se ajustó el pH hasta 5 con HCl. Se disolvió EDAC en un amortiguador Tris 1M con pH de 7.5. Se añadió 40 µl de EDAC cada minuto (10 minutos hasta alcanzar la proporción EDAC/PS (0.5 mg EDAC/ mg PS)). Se incubó la solución resultante 110 min a + 25 °C bajo agitación y regulación de pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 min. Luego se neutralizó la solución mediante la adición de Tris-HCl 1 M con pH de 7.5 y se dejó 30 min a +25°C. Se clarificó el conjugado finalmente en una membrana de 5 µm y se inyectó en una Columna Sephacryl S400HR. 4) Proceso PS03AH-TT: PS3AH-TT218 Ajuste de tamaño por Emulsiflex Como se indicó en lo anterior. Filtración de PS ajustado en tamaño en 0.22 urn Como se indicó en lo anterior. Derivación de PS3 El paso de derivación se realizó a 25°C con agitación continua en un baño de agua con temperatura controlada. Se diluyó PS3 en NaCI 2M para obtener una concentración final de PS de 3mg/ml. Se añadió EDAC en forma sólida hasta alcanzar una proporción de EDAC/ PS de 0.1 mg/mg PS. Después de disolución completa, se estableció el pH de la solución en 5. Luego se le añadió ADH (8.9mg ADH/mg PS, disolución a 100 mg/ml en NaCI 0.2 M) usando una bomba peristáltica en 44 minutos (pese a que estuvo presente un e?ceso de ADH como tal, la adición directa también pudo haber sido apropiada). El pH se mantuvo en 5.0+/-0.1 y se reguló durante 120 minutos (44' + 76'). Se detuvo la reacción aumentando el pH hasta 7.5 usando hidró?ido de sodio. El porcentaje de derivación correspondió a 3.7% (mg ADH/ mg PS). La dosis de TNBS fue de 220 µg/ml y la dosis de PS fue de 5902 µg/ml, de esta manera hay 1.26 µmoles de ADH / 17.44 µmol de unidad de repetición ( = µmol de grupo COOH reactivo). Así, 7.22% de los grupos carbo?ilo PS3 fueron grupos COOH modificados con ADH. Diafiltración Se diafiltró derivado PS3AH con el fin de eliminar los subproductos de ADH y EDAC que no reaccionaron. Se realizó la diafiltración en una membrana UFP-30-C-H24LA (42 cm2, corte 30 kDa). La solución fue dializada contra 23 volúmenes de NaCI 0.2 M. El seguimiento del paso de diafiltración se realizó mediante una cuantificación de ADH (análisis TBNS) en el permeado después de 5, 10, 15 y 20 volúmenes de diafiltración Filtración en 0.22 µm Se filtró PSAH finalmente en membrana en corte de 0.22 µm (Millipack 40) a una velocidad de flujo de 10 ml/min. El PS3AH filtrado se almacenó entonces a 4°C. Conjugado PS3AH-TT Las condiciones del proceso fueron las siguientes: Una concentración inicial de PS3AH de 2 mg/ml en NaCI 2 M, una proporción inicial de TT/PS3AH de 1.5/1 (p/p), una concentración de EDAC de 0.5 mg/mg PS, y una concentración de TT de10 mg/ml en 0.15M NaCl. Se diluyó 50 mg de PS3AH en NaCI 0.2 M para obtener una concentración final de PS de 2 mg/ml.

La solución TT purificada se diluyó en NaCI 0.2 M hasta alcanzar una concentración de 10 mg/ml. Las soluciones de PS3AH y TT fueron mezcladas juntas. Se ajustó el pH hasta 5.0 ± 0.05 con HCl y EDAC se añadió manualmente en 10 minutos (alícuotas en partes iguales añadidas cada minuto). Se incubó la solución resultante 110 min a + 25°C con agitación y regulación de pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 min. Luego se neutralizó la solución mediante la adición de Tris-HCl 1 M con pH de 7.5 y se dejó 30 min a +25°C. Se clarificó el conjugado finalmente en una membrana de 5 µm y se inyectó en una Columna Sephacryl S400HR. Conclusiones: Se elaboraron diferentes conjugados usando química con carbodiimida en el paso de conjugación. El último componente añadido en la solución de la reacción puede ser la proteína TT o el reactivo EDAC. El tiempo de adición puede tener un efecto sobre los conjugados resultantes. Conjugados PS3AHTT215 y 217: Se usaron los mismos componentes y condiciones para preparar ambos conjugados. La forma en la cual se añadió el último componente fue diferente. El conjugado PS3AHTT217 condujo a un producto que cumplió los criterios in-vitro. Éste se elaboró añadiendo EDAC en 10 minutos. El conjugado PS3AHTT215, sin embargo, no se pudo filtrar en membrana estéril. Para este, el último componente añadido en el medio de la reacción fue el TT (en 10 minutos). Las proporciones finales de TT/PS fueron grandemente diferentes para amos conjugados (0.98/1 contra 0.50/1). Si el EDAC es añadido primero al PSAH (que tiene tanto grupos amino como grupos carbo?ilo reactivos) esto puede conducir a entrecruzamiento entre hidrazina y grupos ácido carbo?ílico presentes en el polisacárido, y por ello podría conducir a un conjugado más entrecruzado con una proporción final más débil después de la adición de TT en 10 minutos. Este efecto no se observa para el conjugado PS3AHTT217. La incorporación de TT funcionó mejor mediante la incorporación de EDAC en 10 minutos, quizás debido a un menor grado de entrecruzamiento, y a un mejor entrecruzamiento entre los grupos hídrazina del los grupos PS3AH y carbo?ílicos de la proteína. En el caso del conjugado 218, dado que la derivación de PS3 EDAC solamente deriva parcialmente el polisacárido (para mantener la mayoría de los epítopos polisacáridos intactos), de nuevo están presentes tanto grupos amino como grupos carbo?ilo reactivos, razón por la cual la adición lenta de EDAC en un paso final de conjugación también es beneficiosa. La adición lenta de TT en el paso de conjugación final fue beneficiosa (sin embargo) para el conjugado 208 en donde el TT fue derivado con ADH (y contiene grupos amino y grupos carbo?ilo), mientras que el PS3 se dejó con sus grupos reactivo naturales -OH y -COOH como parte de su sub unidad de repetición. La adición de EDAC al PS 3 no tuvo el efecto de enlace cruzado anterior, y la adición lenta del TT derivado produjo conjugado con buenas características in vitro - véase lo siguiente. Caracterización in vitro.

Adición de Conj. Deri ación/ Química Conjugación/Química componente final TTAH añadido en 11 208 TT/ADH ->EDAC PS-TTAH ?> EDAC minutos TT añadido en 10 215 PS3/ADH ?- CDAP PSAH-TT -» EDAC minutos EDAC añadido en 217 PS3/ADH - CDAP PSAH-TT ?> EDAC 10 minutos EDAC añadido en 218 ' PS3/ADH -» EDAC PSAH-TT ?> EDAC 10 minutos Proporción Tiempo [PS] [TT] [EDAC] (PS Conj. PS In. TT/PS acopl. (mg/mL) (mg/mL) mg/mg) (p/p) (min) 10 208 C6E02 2.0 (TTAH) 1.5/1 0.5/1 120 bomba 3AH001 10 215 2.0 1.5/1 0.5/1 120 (CDAP) bomba FTT/PS Rendimiento Rendimiento PS libre Antigenicidad Antigenicidad Conj. proporción PS rec (%) filtr. Rec (%) (%) aPS/aPS (%) aTT/aPS (%) (p/p) 103 208 1 .84/1 69 95 1 0.2 99 100* 215 0.50/1 17 27 - - - 103 217 0.98/1 66 100 0.7 17 100* 222 218 0.88/1 74 101 1 1.0 34 216* * con relación al conjugado 208 Ejemplo 1 c - preparación de conjugado de polisacárido V5 de S de la invención Ajuste de tamaño por Emulsiflex Se pesó el PS sobre la base de 15% de contenido teórico de humedad . El PS natural se disuelve durante la noche en WFI a una concentración inicial de 7 mg/ml. Antes del ajuste de tamaño, la solución de PS natural es clarifica en filtro en corte de 10 µm a una velocidad de flujo de 50 ml/min . Se usó un aparato homogenizador Emulsiflex C-50 para reducir el peso molecular y la viscosidad del polisacárido antes del paso de activación. La eficiencia del ajuste de tamaño depende de la presión del circuito, la presión de alimentación del émbolo y del número total de ciclos. Con el fin de mejorar la eficiencia del ajuste de tamaño (y en consecuencia reducir la cantidad total de ciclos), la celda de homogenización de Emulsiflex fue reemplazada por una celda con una geometría fija (Cámara de interacción Microfluidics F20Y-0.75 µm). El objetivo del ajuste de tamaño es reducir el peso molecular y la viscosidad del PS sin una disminución crítica de su antigenicidad. El ajuste de tamaño se realizó a 103.4 ± 3.4 MPa (15000 ± 500 psi) y se le hizo seguimiento en proceso mediante una medición de la viscosidad. El ajuste de tamaño se detiene cuando se alcanza el objetivo de 5.0 ± 0.3 cp. Filtración de PS ajustado en tamaño en 0.22 ym Se filtra PS ajustado en tamaño en una membrana Millipak 40 (corte 0.22 mm) a una velocidad de flujo de 10 ml/min. El PS ajustado en tamaño, filtrado, se almacena a -20 °C. Derivación de polisacárido Vi Se disolvió 1.5 g de PS Vi a 25°C en EPI bajo agitación (5 mg/ml). Se le añade 13.35 g de ADH (8.9 mg ADH/mg PS) a la solución de PS. Después de disolución completa se ajustó el pH a un pH de 5.0 ± 0.05 con HCl 1 N. Se le añadió EDAC (0.1 mg/mg PS) en forma sólida. La solución se dejó 60 min a 25°C. Luego se neutralizó la solución mediante la adición de Tris-HCl 1 M con un pH de 7.5 y se dejó al menos 30 min a 25°C (máximo 2 horas). Se estimó que el nivel de derivación es de 4.55% usando la dosis de TNBS (mg ADH/ 100 mg PS). La dosis de TNBS fue de 200 µg/ml y la dosis de PS fue de 4034 µg/ml; así, 0.0697 µmoles de ADH / 16.46 µmol de unidad de repetición (PM 245). 1.3 µmoles de ADH / 16.46 µmol de grupo COOH reactivo en Vi, así 7% de grupos COOH Vi fueron grupos COOH modificados con ADH. Diafiltración Se diafiltró el derivado PSV¡AH con el fin de eliminar los subproductos de ADH y EDAC que no reaccionaron. Se realizó la diafiltración en una membrana Centramate (0.09 m2, corte 10 kDa). La solución fue dializada contra 20 volúmenes de NaCI 0.2 M. El seguimiento del paso de diafiltración se realizó mediante una cuantificación de ADH (análisis TBNS) en el permeado después de 3, 5, 10 y 20 volúmenes de diafiltración Filtración en 0.22 µm Se filtró PSViAH finalmente en membrana en corte de 0.22 µm (Millipack 40) a una velocidad de flujo de 10 ml/min. El PSViAH filtrado se almacenó a +2/+8°C durante un má?imo de 4 días. Conjugados PSVUµ-TT Las condiciones del proceso fueron las siguientes: Una concentración inicial de PSViAH de 2 mg/ml en 0.2 M NaCI, una proporción inicial de TT/PSViAH de 2.5/1 (p/p), una concentración de EDAC de 0.25 mg/mg PS y una concentración de TT de10 mg/ml en NaCI 0.2 M.

Se diluyó 1g of PSViAH se diluyó en NaCI 0.2 M para obtener una concentración final de PS de 2 mg/ml (dosis de ácido urónico). La solución TT purificada se diluyó en NaCI 0.2 M hasta alcanzar una concentración de 10 mg/ml. Se añadió TT a la solución de PSViAH con el fin de alcanzar una proporción final de 2.5 mg TT/ mg PS. El pH es ajustado a 5.0 ± 0.05 con HCl 1 N. Luego se le añadió la solución de EDAC (7.5 mg/ml en 0.1 M Tris pH 7.5) (en 10 minutos con una bomba peristáltica) hasta alcanzar 0.25 mg EDAC/ mg PSViAH- Se incubó la solución resultante 50 min a + 25°C con agitación y regulación de pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 60 min. Luego se neutralizó la solución mediante la adición de Tris-HCl 1 M con pH de 7.5 y se dejó 30 min a +25 °C. Se transfirió el conjugado a 4°C y se dejó durante la noche bajo agitación lenta continua antes del paso de cromatografía Purificación Antes de la elución en Sephacryl S400HR, el conjugado se clarificó usando un filtro Kleenpak de 10 µm. La velocidad de flujo se fijó en 100 ml/min. Luego se inyectó el conjugado en Sephacryl S400HR y el grupo de recolección se basó en un valor de Kd. Se usaron los siguientes criterios para la recolección del grupo: desde OD= 0.05 a 280 nm comenzó la recolección, y finalizó cuando Kd = 0.22. Filtración por esterilización Antes de la filtración, el producto en bruto se llevó de nuevo a temperatura ambiente. Luego el conjugado se filtró en una membrana esterilizante Opticap de 10 cm (4"). La velocidad de flujo se fijó en 30 ml/min. Análisis El conjugado resultante tuvo una proporción final TT/PS (p/p) de 2.44/1, un contenido de PS libre de 3.7% y una antigenicidad aPS/aPS de 58%. Ejemplo 1d - preparación de otros conjugados de polisacár?do El enlace covalente del polisacárido PRP de Haemophilus influenzae (Hib) con TT se llevó a cabo mediante una química de acoplamiento desarrollada por Chu et al (Infection and Immunity 1983, 40 (1 ); 245-256). El polisacárido Hib PRP se activó añadiendo CNBr e incubando con un pH de 10.5 durante 6 minutos. Se disminuyó el pH hasta un pH de 8.75 y dihidrazida de ácido adípico (ADH) se añadió y la incubación continuó durante otros 90 minutos. El PRP activado se acopló a un to?oide tetánico purificado por medio de condensación por carbodiimida usando 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)carbodiimida (EDAC). Se añadió EDAC al PRP activado hasta alcanzar una proporción final de 0.6 mg de EDAC/mg de PRP activado. Se ajustó el pH hasta 5.0 y se le añadió toxoide tetánico purificado hasta alcanzar 2mg de TT/mg de PRP activado. La solución resultante se dejó durante tres días con agitación suave. Después de filtración a través de una membrana de 0.45 µm, se purificó el conjugado en una columna Sephacryl S500HR (Pharmacia, Suecia) equilibrada en NaCI 0.2 M.

Se produjeron conjugados MenC-TT usando pollsacáridos naturales (de más de 150 kDa medido mediante MALLS) o se microfluidizaron ligeramente. Se produjeron conjugados MenA-TT usando polisacárido natural o polisacárido ligeramente microfluidizado de más de 60 kDa, medido mediante el método MALLS para el ejemplo 2. Se produjeron conjugados MenW y MenY-TT usando polisacáridos ajustados en tamaño de alrededor de 100-200 kDa medido mediante MALLS (véase el ejemplo 2). El ajuste de tamaño fue por microfluidización usando un aparato homogenizador Emulsifle? C-50. Los polisacáridos se filtraron entonces a través de un filtro de 0.2 µm. Se realizó activación y acoplamiento directo según se describe en WO96/29094 y WO 00/56360. Brevemente, el polisacárido en una concentración de 10-20 mg/ml en NaCI 2M con pH 5.5-6.0 se mezcló con solución CDAP (100 mg/ml recién preparada en acetonitrilo/WFI, 50/50) para una proporción final de CDAP/polisacárido de 0.75/1 o 1.5/1. Después de 1.5 minutos, se elevó el pH con hidró?ido de sodio hasta un pH de 10.0. Después de tres minutos se le añadió to?oide tetánico hasta alcanzar una proporción proteína/polisacárido de 1.5/1 para MenW, 1.2/1 para MenY, 1.5/1 para MenA o 1.5/1 para MenC. La reacción continuó durante una a dos horas. Después del paso de acoplamiento, se añadió glicina hasta una proporción final de glicina/PS (p/p) de 7.5/1 y se ajustó el pH hasta pH9.0. La mezcla se dejó reposar durante 30 minutos. El conjugado se clarificó usando un filtro Kleenpak de 10 µm y luego se cargó en una Columna Sephacryl S400HR usando un amortiguador para elusión de NaCI 150 mM, Tris 10 mM o 5 mM con pH de 7.5. Se filtraron cantidades clínicas en una Membrana esterilizante Opticap 4. Los conjugados resultantes tuvieron una proporción promedio polisacárido:proteína ratio de 1 :1-1 :5 (p/p). Ejemplo 2 - Determinación de peso molecular usando MALLS Se acoplaron detectores a una columna para HPLC por e?clusión de tamaño a partir de la cual fueron eluidas las muestras. Por una parte, el detector de dispersión de luz láser midió las intensidades luminosas dispersadas en 16 ángulos por la solución macromolecular y por otra parte, un refractómetro interferométrico colocado en línea permitió la determinación de la cantidad de muestra eluida. A partir de estas intensidades, se puede determinar el tamaño y la forma de las macromoléculas en la solución. El peso molecular (PM) medio en peso se define como la suma de los pesos de todas las muestras multiplicados por su respectivo peso molecular y dividida por la suma de los pesos de todas las muestras. a) Peso molecular promedio en peso: -Mw- YWi.Mi m. Yw; m, b) Peso molecular promedio en número: -Mn N.-. m, Ai. = N: mn c) Raíz cuadrada media del radio: -Rvj- y R2w es el radio al cuadrado definido por: mi.? R2w o (?w = mi (-m¡ es la masa de un centro de dispersión i y -r¡- es la distancia entre el centro de dispersión i y el centro de gravedad de la macromolécula). d) La polidispersidad se define como la proporción -Mw/Mn-. Los polisacáridos meningocóccicos fueron analizados mediante MALLS cargándolos en dos columnas para HPLC (TSKG6000 y 5000PW?i) usadas en combinación. Se cargó 25 µl del polisacárido en la columna, y se eluyó con 0.75 ml de agua filtrada. Los polisacáridos se detectan usando un detector de dispersión de luz (Wyatt Dawn DSP equipado con un láser de argón de 10 PM a 488nm) y un refractómetro inferométrico (Wyatt Otilab DSP equipado con una celda P100 y un filtro rojo a 498nm). Las polidispersidades del peso molecular y las recuperaciones de todas las muestras fueron calculadas mediante el método Debye usando un orden de ajuste polinomial de 1 en el software Astra 4.72. Ejemplo 3 - Prueba clínica para evaluar el efecto de un enlazante en MenA en una vacuna de conjugado MenACWY Se administró una sola dosis de diferentes formulaciones de vacunas MenACWY a adolescentes de 15-19 años en 5 grupos de 25 sujetos en una prueba aleatoria 1:1:1:1:1. Las formulaciones sometidas a prueba fueron: F1 - Conjugado MenACWY con to?oide tetánico con el conjugado MenA que contiene un separador AH(ADH) (elaborado de acuerdo con el ejemplo 1 ) - 5/5/5/5 µg F2 - Conjugado MenACWY con to?oide tetánico con el conjugado MenA que contiene un separador AH (elaborado de acuerdo con el ejemplo 1) - 2.5/5/2.5/2.5 µg F3 - Conjugado MenACWY con to?oide tetánico con el conjugado MenA que contiene un separador AH (elaborado de acuerdo con el ejemplo 1) - 5/5/2.5/2.5 µg F4 - Conjugado MenACWY con to?oide tetánico sin separador en ningún conjugado - 5/5/5/5 µg Grupo control - Mencevax™ ACWY El día 30 después de la inoculación, se le tomó una muestra de sangre a los pacientes. Se usaron las muestras de sangre para evaluar el porcentaje de SBA-MenA, SBA-MenC, SBA- MenW135 y SBA-MenY respondedores un mes después de la dosis de vacuna. Una respuesta a la vacuna se definió como 1 ) para sujetos inicialmente seronegativos - un título de anticuerpo posterior a la vacunación > 1/32 a 1 mes o 2) para sujetos inicialmente seropositlvos - título de anticuerpo de > 4 veces el título de anticuerpo antes de la vacunación. Resultados Como se muestra en la Tabla siguiente, el uso de un separador en el conjugado MenA condujo a una respuesta inmunitaria aumentada contra MenA. El porcentaje de respondedores aumentó desde 66% hasta 90-95% cuando se añadió el separador AH. Esto se reflejó en un aumento en GMT SBA desde 4335 hasta 10000 y un aumento en GMC desde 5 hasta 20-40. Sorprendentemente, el uso de un separador AH también condujo a una respuesta inmunitaria aumentada contra MenC como se observa mediante un aumento en el porcentaje de respondedores y un aumento en GMT SBA. También se pudo observar un aumento en SBA-GMT contra MenY (6742-7122) y contra MenW (4621-5418) cuando se introdujo un separador. 10 % de MenA SBA SBA-Men A Anti -PSA GMC Formulación re sp ondedores GMT µg/ mL ELISA FI5AH/5/55 90.9 9805 20.38 F225AH/5/25/2 5 75 8517 29.5 15 F35AH/5/25/25 95.5 10290 47.83 F 5555 66.7 4335 5.46 * ~Mencevaxtm 85.7 8"022~ 27.39 ' % de MenA SBA SBA-Men Anti -PSA GMC Formulación 20 re sp ondedores GMT µg/ mL ELISA I5AH/5/5/5 69.6 3989 12.11 F225AH/5/25/25 81.8 3524 12.78 F3dAH/5/25/25 81.8 3608 8.4 - F45/5/5/5 73.9 2391" 8.84 ->? Mencevaxtm 90.0 5447 38.71 % de MenA SBA SBA-Men A Anti -PSA GMC Formulación re sp onded ores GMT µg/mL ELISA F15AH/5/5/5 95 5418 9.65 F22.5AH/5/25/2 5 85 4469 14.55 F35AH/5/25/2.5 95.5 4257 6.39 F45555 95.5 4621 10.7 Mencevaxtm 86.4 2714 13.57 • % de MenA SBA SBA-Men A Anti -PSA GMC Formulación re sp onded ores GMT µg/ mL ELISA FI5AH/5/5/5 91.3 7122 16.3 F22.5AH/5/2.5/2 5 87.5 5755 12.52 F35AH/5/25/25 80 5928 8.88 F455/55 91.3 6742 13.88 I Mencevax"11 91.7 4854 l 21.02 Ejemplo 4 - Prueba clínica para evaluar el efecto de un enlazante en Conjugados MenA y MenC en una vacuna de conjugado MenACWY Una sola dosis de diferentes formulaciones de Vacuna MenACWY se le administró a adolescentes de 15-19 años en 5 grupos de 25 sujetos en una prueba aleatoria 1:1:1:1:1. Las formulaciones sometidas a prueba fueron: F1 - Conjugado MenACWY con to?oide tetánico con los conjugados MenA y MenC que contienen un separador AH (elaborado de acuerdo con el ejemplo 1 ) - 2.5/2.5/2.5/2.5 µg F2 - Conjugado MenACWY con to?oide tetánico con los conjugados MenA y MenC que contienen un separador AH (elaborado de acuerdo con el ejemplo 1 ) - 5/5/2.5/2.5 µg F3 - Conjugado MenACWY con to?oide tetánico con los conjugados MenA y MenC que contienen un separador AH (elaborado de acuerdo con el ejemplo 1 ) - 5/5/5/5 µg F4 - Conjugado MenACWY con to?oide tetánico con el conjugado MenA que contiene un separador AH (elaborado de acuerdo con el ejemplo 1) - 5/5/5/5 µg Grupo control - ACWY Menceva?™ El día 30 después de la inoculación, se le tomó una muestra de sangre a los pacientes. Se usaron las muestras de sangre para evaluar el porcentaje de respondedores SBA-MenA, SBA-MenC, SBA-MenW135 y SBA-MenY un mes después de la dosis de vacuna. Una respuesta a la vacuna se definió como 1 ) para sujetos inícialmente seronegativos -un título de anticuerpo posterior a la vacunación > 1/32 a 1 mes o 2) para sujetos inicialmente seropositivos - título de anticuerpo de > 4 veces el título de anticuerpo antes de la vacunación. Resultados La introducción de un AH separador en el conjugado MenC condujo a un aumento en la respuesta inmunitaria contra MenC como se muestra en la Tabla siguiente. Esto se demuestra por un aumento en GMT SBA desde 1943 hasta 4329 y un aumento en GMC anti PSC de 7.65 hasta 13.13. Las buenas respuestas inmunitarias contra MenA, MenW y MenY se mantuvieron. % deMenA SBA SBA-MenA Anti-PSA GMC Formulación respondedores GMT µg/mL ELISA F125AH/2 5AH/2 5/2 5 75 8417 20.23 F25AH/5AH/25/25 72 6299 16.07 F35AH/5AH/5/5 87 9264 27.26 F45AH/5/5/5 77.3 9632 20.39 Mencevax"11 78.3 8284 12.93 % deMenA SBA SBA-MenA Anti-PSA GMC Formulación respondedores GMT µg/mL ELISA F125AH/25AH/2 5/25 88 3619 12.82 F25AH/5AH/25/25 88 2833 13.32 F35AH/5AH/5/5 95.8 4329 13.13 - F45AH/5/5/5 95.8 1943 7.65 Mencevaxtm 91.7 567 T6.55 % deMenA SBA SBA-MenA Anti-PSA GMC , Formulación respondedores GMT µg/mL ELISA F125AH/25AH/2 5/25 100 5656 7 F25AH/5AH/25/25 96 4679 5.4 REIVINDICACIONES 1. Un método para elaborar una composición inmunógena, que comprende conjugar un sacárido con un portador proteína usando química de condensación por carbodiimida, caracterizado porque el sacárido contiene (por ejemplo como parte de su unidad de repetición), o ha sido derivado para que contenga, grupos amino y/o grupos carbo?ilo, y caracterizado además porque el portador proteína contiene, o ha sido derivado para que contenga, grupos grupos amino y/o grupos carboxilo, el método comprende los pasos de: I) - si el portador proteína contiene tanto grupos amino como grupos carbo?ilo y el sacárido contiene ya sea grupos amino o grupos carbo?ilo: a) mezclar el sacárido y la alícuota de carbodiimida requerida para realizar la conjugación, y b) añadir la alícuota de portador proteína requerida durante un periodo de 35 segundos hasta 6 horas; II) - si el sacárido contiene tanto grupos amino como grupos carbo?ilo y el portador proteína contiene ya sea grupos amino o grupos carbo?ilo: a) mezclar el portador proteína y la alícuota de carbodiimida requerida para realizar la conjugación, y b) añadir la alícuota de sacárido requerida durante un periodo de 35 segundos hasta 6 horas;

Claims

lll) - si el sacárido contiene tanto grupos amino como grupos carbo?ilo y el portador proteína contiene tanto grupos amino como grupos carbo?ilo: a) mezclar el portador proteína y el sacárido, y b) añadir la alícuota de carbodiimida requerida para realizar la conjugación durante un periodo de 35 segundos hasta 6 horas.
2. El método de la reivindicación 1, caracterizado además porque en el paso b) el periodo es desde 50 segundos hasta 5 horas, desde 1 minuto hasta 4 horas, desde 2 minutos hasta 3 horas, desde 3 minutos hasta 2 horas, desde 4 hasta 60 minutos, desde 5 hasta 50 minutos, desde 6 hasta 40 minutos, desde 7 hasta 30 minutos o desde 8 hasta 20 minutos.
3. El método de la reivindicación 1, caracterizado además porque en el paso b) el periodo es desde 1 minuto hasta 5 horas, desde 10 minutos hasta 4 horas, desde 20 minutos hasta 3 horas, desde 30 minutos hasta 2 horas, desde 40 hasta 90 minutos, o desde 50 hasta 70 minutos.
4. El método de las reivindicaciones 1-3, caracterizado además porque la carbodiimida es EDAC (1 -etil-3-(3-dimetil-aminopropil)carbodiimida) o una carbodiimida distinta de EDAC.
5. El método de las reivindicaciones 1-4, caracterizado además porque la alícuota de carbodiimida requerida para realizar la conjugación es desde 0.01 hasta 3, desde 0.05 hasta 2 o desde 0.09 hasta 1 mg/mg de sacárido.
6. El método de las reivindicaciones 1-5, caracterizado además porque el sacárido y/o portador proteína ha sido derivado para que contenga grupos amino o carbo?ilo.
7. El método de la reivindicación 6, caracterizado además porque la derivación se lleva a cabo mediante la adición de un enlazante hetero- u homo-bifuncional.
8. El método de la reivindicación 7, caracterizado además porque el enlazante tiene entre 4 y 12 átomos de carbono.
9. El método de la reivindicación 7 u 8, caracterizado además porque el enlazante tiene dos grupos amino reactivos.
10. La composición inmunógena de las reivindicaciones 7-9 caracterizada además porque el enlazante es ADH.
11. El método de la reivindicación 7 u 8, caracterizado además porque el enlazante tiene dos grupos reactivos ácido carbo?ílico.
12. El método de la reivindicación 7 u 8, caracterizado además porque el enlazante tiene un grupo amino reactivo en un e?tremo y un grupo reactivo ácido carboxílico en el otro e?tremo.
13. El método de las reivindicaciones 7-12, caracterizado además porque la derivación tiene lugar haciendo reaccionar un exceso grande de enlazante con el sacárido y/o portador proteína que va a ser derivado.
14. El método de las reivindicaciones 7-13, caracterizado además porque el sacárido contiene un grupo hidro?ílo reactivo como parte de su unidad de repetición, el cual está derivado parcialmente por medio de un grupo amino en el enlazante.
15. El método de la reivindicación 14, caracterizado además porque el sacárido es derivado parcialmente con química CDAP.
16. El método de las reivindicaciones 7-13, caracterizado además porque el sacárido incluye un grupo amino reactivo como parte de su unidad de repetición, el cual está derivado parcialmente por medio de un grupo carboxilo en el enlazante.
17. El método de la reivindicación 16, caracterizado además porque el sacárido es derivado parcialmente con química de condensación por carbodiimida.
18. El método de las reivindicaciones 7-13, caracterizado además porque el sacárido incluye un grupo carboxilo reactivo como parte de su unidad de repetición, el cual está derivado parcialmente por medio de un grupo amino en el enlazante.
19. El método de la reivindicación 18, caracterizado además porque el sacárido es derivado parcialmente con química con carbodiimida.
20. El método de las reivindicaciones 1-19, caracterizado además porque en el paso b) la alícuota de carbodiimida, sacárido o portador proteína se añade a una velocidad constante usando una bomba.
21. El método de las reivindicaciones 1-19, caracterizado además porque en el paso b) la alícuota de carbodiimida, sacárido o portador proteína se añade por etapas durante el periodo.
22. El método de la reivindicación 21, caracterizado además porque al menos un cuarto de la alícuota se añade durante la primera mitad del periodo, y al menos un cuarto de la alícuota durante la segunda mitad del periodo.
23. El método de la reivindicación 21 o 22, caracterizado además porque la alícuota "a" se añade en 4-100 etapas "s".
24. El método de la reivindicación 23, caracterizado además porque a/s de la alícuota se añade en cada etapa.
25. El método de la reivindicación 23 o 24, caracterizado además porque si una etapa tiene lugar en el momento cero del periodo "p", cada etapa subsiguiente tiene lugar en un momento que es p/(s-1).
26. El método de las reivindicaciones 1-25, caracterizado además porque el sacárido está presente en una concentración final de 0.5-50 mg/ml en el paso b).
27. El método de las reivindicaciones 1-26, caracterizado además porque la proporción inicial de portador proteína respecto un sacárido es desde 5:1 hasta 1:5, desde 4:1 hasta 1:1, o desde 3:1 hasta 2:1 (p/p).
28. El método de las reivindicaciones 1-27, caracterizado además porque la concentración de sal, por ejemplo NaCI, presente en el paso b) es de 0-2, 0.1-1 o 0.2-0.5 M.
29. El método de las reivindicaciones 1-28, caracterizado además porque el portador proteína está presente en una concentración final de 1-50 mg/ml en el paso b).
30. El método de las reivindicaciones 1-29, caracterizado además porque el pH de la reacción en el paso b) se mantiene en un pH de 4.5-6.5, 4.7-6.0, o 5-5.5.
31. El método de las reivindicaciones 1-29, caracterizado además porque N-hidroxisuccinimida también está presente en la reacción en el paso b), y el pH de la reacción en el paso b) se mantiene en 4.5-7.5.
32. El método de las reivindicaciones 1-31, caracterizado además porque la temperatura de la reacción en el paso b) se mantiene a 4-37, 10-32, 17-30, o 22-27 °C.
33. El método de las reivindicaciones 1-32, caracterizado además porque después de que la alícuota ha sido añadida toda en el paso b) la reacción se mantiene por otros 10 minutos hasta 72 horas, 20 minutos hasta 48 horas, 30 minutos hasta 24 horas, 40 minutos hasta 12 horas, 50 minutos hasta 6 horas, o 1-3 horas.
34. El método de las reivindicaciones 1-33, caracterizado además porque una vez que está terminada la reacción el pH es ajustado a 7.5-9.
35. El método de las reivindicaciones 1-34, que además comprende un paso subsiguiente c), en donde el conjugado sacárido-proteína es purificado en una columna para cromatografía por exclusión de tamaño.
36. El método de las reivindicaciones 1-35, que además comprende un paso subsiguiente d), caracterizado además porque el conjugado sacárido-proteína es filtrado de manera estéril.
37. El método de las reivindicaciones 1-36, que comprende un paso subsiguiente e), caracterizado además porque una dosis efectiva del conjugado sacárido-proteína se formula con un e?cipiente aceptable farmacéuticamente para fabricar una composición inmunógena o vacuna.
38. El método de las reivindicaciones 1-37, caracterizado además porque el sacárido es un sacárido capsular bacteriano, por ejemplo derivado de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis serogrupo A, B, C, W135 o Y, Streptococcus pneumoniae serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F o 33F, Streptococcus Grupo B, grupo la, Ib, II, lll, IV, V, VI, o Vil, Staphylococcus aureus tipo 5, Staphylococcus aureus tipo 8, Salmonella typhi (sacárido Vi), Vibrio cholerae, o H. influenzae tipo b.
39. El método de las reivindicaciones 1-38, caracterizado además porque el peso molecular promedio en peso del sacárido es 1000-2000000, 5000-1000000, 10000-500000, 50000-400000, 75000-300000, o 100000-200000.
40. El método de las reivindicaciones 1-39, caracterizado además porque el sacárido es un polisacárido natural o está dimensionado por un factor de no más de ?10 (por ejemplo mediante microfluidización).
41. El método de las reivindicaciones 1-37, caracterizado además porque el sacárido es un lipooligosacárido o lipopolisacárido bacteriano, por ejemplo derivado de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis, H. influenzae, E coli, Salmonella o M. catarrhalis.
42. El método de las reivindicaciones 1-41, caracterizado además porque el portador proteína contiene uno o más epítopos T au?iliares.
43. El método de las reivindicaciones 1-42, caracterizado además porque el portador proteína se selecciona del grupo que consiste en: TT, DT, CRM197, fragmento C de TT, proteína D de H. influenzae, PhtD neumocóccico, y neumolisina neumocóccica.
44. Una composición inmunógena o vacuna que se puede obtener mediante el método de las reivindicaciones 1-43.
45. Uso de la composición inmunógena o vacuna de la reivindicación 44 en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de una enfermedad.
46. Método para prevenir o tratar una enfermedad que comprende el paso de administrar una dosis efectiva de la composición inmunógena o vacuna de la reivindicación 45 a un paciente que necesita de ello.
47. El uso o método de la reivindicación 45 o 46, caracterizado además porque la enfermedad es causada por una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis, Streptococcus pneumoniae, M. catarrhalis, Grupo B Streptococcus, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, E. coli, y H. influenzae.